CN109706247A - 利用微卫星技术对近交系小鼠进行遗传质量监测的方法 - Google Patents
利用微卫星技术对近交系小鼠进行遗传质量监测的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及利用微卫星技术对近交系小鼠进行遗传质量监测的方法。本发明提供了一系列分布于小鼠的不同染色体上、具有良好多态性的四碱基重复微卫星位点及其特异性引物，用于对常用近交系小鼠品系间的鉴定和遗传多态性的监测。本发明的方法操作简便快捷，成本低廉，易于推广使用。
Description
技术领域
本发明属于物种监测领域，更具体地，本发明涉及利用微卫星技术对近交系小鼠进行遗传质量监测的方法。
背景技术
实验动物的遗传背景和反应特性是影响实验结果的重要因素，遗传的变异，或者不同亚系之间的差异，都会造成实验结果的差异，甚至出现错误结果。此外，实验动物饲养繁殖中的操作管理失误，也会引起实验动物遗传背景的改变。随着生物医学的发展，对实验动物质量的要求越来越高，因而对实验动物质量的遗传监测方法也提出了更高的要求。在实验动物生产繁殖或科研使用过程中，对实验动物的遗传质量进行监测尤为必要。对于实验动物遗传质量的控制，目前国内标准中推荐的常用检测方法，如生化标志、免疫标志、形态学等多是对基因表型的检测，并不能直接反映遗传本质的变化。
近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，特别是人类基因组计划的深入研究，全基因组测序技术的成熟，分子标记手段在实验动物遗传质量检测方面显示出越来越多的优势。分子标记是DNA水平遗传信息的直接反映，微卫星标记比目前国标中推荐的生化位点检测法相比，具有信息含量高、灵敏性强、样品需要量少、检测快速准确等优势。国内外实验动物科研和生产单位越来越多使用分子标记进行遗传检测，美国The Jackson laboratory和Charles River公司采用SNP库和微卫星位点对小鼠品系进行遗传检测。
对近交系小鼠遗传质量的监测，多数使用者仅仅基于公共数据库中现有的位点信息来选择微卫星位点，或者从现有已发表文献中挑选已有位点以及有限的相应引物，且目前数据库中较多为二碱基重复序列位点。现有数据库微卫星位点数量固定，文献中记录的相应引物特异性和多态性不高；此外，二碱基重复序列的位点在结果判断时，由于影子带的影响，容易出现判断误差。
对近交系小鼠的鉴定，目前也存在较多的问题，本领域尚难以通过简单便捷的方法来实现较多品系小鼠的鉴定。
综上，本领域还有必要进行进一步的研究改进，以期获得更易于对近交系小鼠进行遗传分析以及鉴定的工具。
发明内容
本发明的目的在于提供利用微卫星技术对近交系小鼠进行遗传质量监测的方法。
本发明的目的还在于提供特异性鉴定近交系小鼠的方法。
在本发明的第一方面，提供一种对近交系小鼠的遗传分析的方法，所述方法包括：
以待测样品的DNA为模板，以选自下组的引物对进行PCR扩增：
核苷酸序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的引物；
将获得的扩增产物进行检测，获得遗传分析结果。
在一个优选例中，所述的遗传分析结果包括：Nei遗传距离及特性，遗传一致性分析结果，聚类关系。
在本发明的另一方面，提供一种特异性鉴定近交系小鼠的方法，所述方法包括：
(1)以待测样品的DNA为模板，以下组的引物对进行PCR扩增：
核苷酸序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物；和
核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物；
(2)获取扩增产物，从而特异性鉴定近交系小鼠。
在一个优选例中，所述的近交系小鼠包括：BALB/c小鼠，C57BL/6小鼠，CBA小鼠，DBA/1小鼠，DBA/2小鼠，FVB小鼠，C3H/He小鼠，NOD小鼠。
在另一优选例中，所述的特异性鉴定近交系小鼠方法包括：(a)以待测样品的DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物扩增，获得扩增产物1；鉴定扩增产物1的序列长度，若长度为282bp，则鉴定为Balb/c或C3H/He小鼠；若长度为294，则鉴定为C57BL/6小鼠；若长度为286bp，则鉴定为CBA或FVB/NJ小鼠；若长度为290bp，则鉴定为DBA/1、DBA/2或NOD小鼠；
(b)对于(a)中鉴定为Balb/c或C3H/He的小鼠，再以核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物，获得扩增产物2；鉴定扩增产物2的序列长度，若长度为185bp，则为Balb/c小鼠；若长度为193bp，则为C3H/He小鼠；或
对于(a)中鉴定为CBA或FVB/NJ的小鼠，再以核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ IDNO:46的引物，获得扩增产物2；鉴定扩增产物2的序列长度，若长度为181bp，则为CBA小鼠；若长度为185bp，则为FVB/NJ小鼠；或
对于(a)中鉴定为DBA/1、DBA/2或NOD的小鼠，再以核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物，获得扩增产物2；鉴定扩增产物2的序列长度，若长度为176bp，则为DBA/1小鼠；若长度为181bp，则为DBA/2小鼠；若长度为185bp，则为NOD小鼠。
在另一优选例中，所述的近交系小鼠还包括SJL/J小鼠，其以核苷酸序列如SEQ IDNO:43和SEQ ID NO:44的引物扩增，获得扩增产物长度为290，以核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物扩增，获得扩增产物长度为185；当将SJL/J与NOD小鼠进行区分时，所述方法还包括：以待测样品的DNA为模板，以选自下组的引物对之一扩增、获得扩增产物3：
核苷酸序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的引物；或
核苷酸序列如SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的引物；
若以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物扩增，且扩增产物3为248bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为240bp，则为NOD小鼠；
若以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物扩增，且扩增产物3为326bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为290bp，则为NOD小鼠；
若以SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的引物扩增，且扩增产物3为198bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为205bp，则为NOD小鼠；
若以SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的引物扩增，且扩增产物3为165bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为157bp，则为NOD小鼠；
若以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物扩增，且扩增产物3为212bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为187bp，则为NOD小鼠；
若以SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48的引物扩增，且扩增产物3为126bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为134bp，则为NOD小鼠；
若以SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的引物扩增，且扩增产物3为109bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为101bp，则为NOD小鼠；
若以SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的引物扩增，且扩增产物3为145bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为156bp，则为NOD小鼠。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断性以及非治疗性的方法。
在本发明的另一方面，提供一种用于对近交系小鼠进行遗传分析或特异性鉴定近交系小鼠的试剂盒，其中包括引物对，其选自下组：
核苷酸序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的引物。
在本发明的另一方面，提供一种特异性鉴定近交系小鼠的试剂盒，其中包括如下引物对：
核苷酸序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物；和
核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物。
在一个优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的试剂：
探针；
检测标准品；
DNA提取试剂；
Taq酶；
PCR缓冲液；
DNA聚合酶；和/或
说明鉴定方法的使用说明书。
在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于对近交系小鼠进行遗传分析或特异性鉴定近交系小鼠。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、不同品系间无多态性差异的位点。
图2、同一品系的个体间出现差异的溶解曲线。
图3、基于Nei遗传距离绘制聚类关系图。
图4、M6和M8引物的毛细管电泳图。其中，A为M6引物的结果，B为M8引物的结果。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，提供了一系列分布于小鼠的不同染色体上、具有良好多态性的四碱基重复微卫星位点及其特异性引物，用于对常用近交系小鼠品系间的鉴定和遗传多态性的监测。
如本文所用，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”或“包括”中。
引物
目前开发有效的鉴定近交系动物的难点在于各品系通常在繁育饲养过程中易于混淆，且在诸多表现型方面相似，基因组也较为相近，导致人们难以区分。即使采用一些基因或蛋白水平上的技术，也由于与亲缘关系上的较近，难以找到符合标准的、检测准确性高、实用性强的检测靶标。并且，由于物种具有多样性，且物种基因组中存在基因序列的数目是相当可观的，各种基因的DNA排列各异。因此，获得可特异性鉴定一种物种、不受其它类似物种干扰、准确性高的检测试剂是存在很大技术难度的，大量的筛选在所难免。
本发明人经过深入的研究和大量的筛选，找到了合适的检测靶标，设计了具有良好鉴定性能的引物，所述引物特异性和敏感性良好。基于此开发了聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测近交系小鼠的方法，具有方便、准确、快速的特点。
因此，本发明提供一系列用于对近交系小鼠进行遗传分析的引物，所述的引物选自下组：
核苷酸序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的引物。
本发明提供一系列用于特异性鉴定近交系小鼠的引物，所述的引物选自下组：
核苷酸序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物。
本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。
在提供上述引物的基础上，还可以设计适当的探针，来对扩增产物进行鉴定。例如Taqman探针，从而便于实时荧光检测。
利用本发明的引物，只需进行PCR反应和/或测序仪毛细管电泳，并通过软件精确读取相应的PCR产物的大小，就可以准确、快速地判断待测样品来自何种品系的小鼠，而且所需的样品量很少，灵敏度高。
鉴定方法
基于本发明所提供的适用于特异性引物，本发明还提供了一种对近交系小鼠的遗传分析的方法，所述方法包括：利用前面所述的引物进行PCR扩增，将获得的扩增产物进行检测，获得遗传分析结果。
所述的遗传分析结果包括但不限于：Nei遗传距离及特性，遗传一致性分析结果，聚类关系。
基于本发明所提供的适用于特异性引物，本发明还提供了一种特异性鉴定近交系小鼠的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:43和SEQID NO:44的引物，或核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物进行PCR扩增和/或测序仪毛细管电泳，并通过软件精确读取相应的PCR产物的大小，就可以准确、快速地判断待测样品来自何种品系的小鼠。
聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。
获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。
在本发明的具体实施例中，采用BamHI和EcoRI将小鼠的基因组序列酶切成短序列，利用生物信息学技术，依次逐个分析长度在100～600bp之间的短序列，查找序列中含有四碱基重复序列的片段。分析分布于18条染色体上(除X染色体)的四碱基重复位点，基于分析结果设计引物，利用高分辨率溶解曲线法(HRM)，经过多次筛选试验，最终筛选出溶解曲线单峰，对9个常见近交系品系间具有显著差异的四碱基重复序列微卫星靶位点。
相对于二碱基或者三碱基重复位点，四碱基重复微卫星位点显示了更高水平的等位基因多样性和观测杂合度；四碱基重复序列在PCR扩增过程中不容易产生影子带，因而四碱基重复微卫星更容易从凝胶电泳上读取等位基因，进行统计分析。四碱基重复类型的微卫星位点的筛选效率远高于二碱基重复微卫星位点，不受微卫星DNA家族的影响。
依据各位点两端特异性的保守序列，获得相应特异性引物12对，可对9个品系常用近交系小鼠进行日常遗传质量监测，判断品系间的遗传距离，绘制品系间聚类关系图。其中M6和M8两对引物结合使用，可一次性鉴别8个近交系小鼠品系BALB/c，C57BL/6，CBA，DBA/1，DBA/2，FVB，C3H/He，NOD。本发明的方法操作简便快捷，成本低廉，易于在实验动物生产使用单位推广使用。
本发明的方法，与目前国标中推荐的生化位点检测法相比，可直接反映DNA水平遗传信息，具有信息含量高、灵敏性强、样品需要量少、检测快速准确等优势。利用本发明中的方法技术测定遗传距离和进行聚类分析，是对实验动物遗传变异和各种群间遗传关系判断的有效技术手段。
试剂盒
本发明还提供了一种用于对近交系小鼠进行遗传分析或特异性鉴定近交系小鼠的试剂盒，所述试剂盒中含有前面所述的引物对。
此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定试剂，如(但不限于)：
(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或
(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或
(C)提取DNA的试剂盒。
此外，所述的试剂盒中还可含有说明鉴定方法的使用说明书和/或标准操作程序。
本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测的目的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、小鼠微卫星位点的查找
1、初步筛选
从GenBank小鼠数据库获取小鼠GRCm38.p2的全基因组序列。之后，本发明人利用BamHI和EcoRI将基因组序列酶切成短序列，依次逐个分析长度在100-600之间的短序列，查找、搜寻序列3、4、5、6个碱基的重复序列。统计结果如表1。
表1、小鼠微卫星位点的筛选统计
2、进一步筛选
依次在每条染色体上查找挑选含有“TATC”的四碱基重复序列的位点。本发明人发现仍有非常多的这种位点，需要进一步筛选。结合经验和分析，除了Y染色体，本发明人在每条染色体上挑选适合的位点，这些位点均是在Genbank数据库中没有涵盖的，针对这些位点初步设计出36对PCR引物(针对这些位点设计出引物的PCR产物大小在200bp左右，该大小有利于PCR反应及结果判断的准确性)，如表2。
表2用于初步筛选的36对引物序列
3、利用高分辨率溶解曲线法筛选
选用8个品系近交系小鼠，每品系雌雄各5只，共计80份小鼠基因组DNA样品，分别选用表2所列的36对引物进行荧光定量PCR反应。
反应总体系20ul：mix 10ul，上下游引物(10mmol/L)各0.5ul，DNA模板(100ng/ul)1ul，加水至20ul。
PCR扩增条件：95℃预变性10min，95℃变性10s，60℃退火延伸45s，40个循环。
利用ABI7500荧光定量PCR仪进行PCR反应，收集溶解曲线。
分析定量PCR反应溶解曲线，根据结果将针对不同品系间无多态性差异(如图1)的位点剔除；同时，将针对同一品系溶解曲线峰不单一(如图2)的位点剔除。
经多次地、反复地筛选，获得符合条件的位点和引物12对，如表3。用于进一步验证。
表3、微卫星位点位置及引物序列
实施例2、近交系小鼠鉴定
本实施例中，利用前述实施例1中筛选获得的引物对，进行近交系小鼠的鉴定，判断是否可以区分不同的近交系小鼠：BALB/c，C57BL/6，CBA，DBA/1，DBA/2，FVB，C3H/He，NOD，SJL/J。
采集9个小鼠品系，即BALB/c，C57BL/6，CBA，DBA/1，DBA/2，FVB，C3H/He，NOD，SJL/J的小鼠的鼠尾，分别提取它们的基因组DNA，DNA浓度调整至50ng/ul。
PCR反应体系总15ul)：
PCR反应程序：
首先，94℃预变性3min；
之后，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环。
ABI3730测序仪电泳：
10倍稀释的PCR产物1.5ul，与ROX500内标0.25ul混匀，95℃孵育5min后，迅速冰浴3min。置ABI3730测序仪进行毛细管电泳检测(采用测序仪电泳方式，精确读取PCR产物的大小)，结果采用Genemarker软件查看结果。
结果分析判断：
通过测序仪读出数据。12对微卫星标记引物在9个近交系小鼠品系中的遗传分析(allele：bp)的结果如表4。
表4(单位：bp)
| 位点\近交系 | Balb/c | C57BL/6 | CBA | DBA/1 | DBA/2 | FVB/NJ | C3H/He | NOD | SJL/J |
| M1 | 256 | 240 | 248 | 248 | 248 | 248 | 248 | 240 | 248 |
| M2 | 302 | 296 | 290 | 302 | 302 | 326 | 290 | 290 | 326 |
| M3 | 189 | 183 | 181 | 183 | 187 | 181 | 187 | 181 | 181 |
| M4 | 198 | 198 | 212 | 198 | 216 | 190 | 209 | 205 | 198 |
| M5 | 183 | 157 | 157 | 157 | 157 | 157 | 157 | 157 | 165 |
| M6 | 282 | 294 | 286 | 290 | 290 | 286 | 282 | 290 | 290 |
| M7 | 187 | 187 | 212 | 212 | 212 | 187 | 212 | 187 | 212 |
| M8 | 185 | 185 | 181 | 176 | 181 | 185 | 193 | 185 | 185 |
| M9 | 164 | 160 | 142 | 134 | 134 | 134 | 130 | 134 | 126 |
| M11 | 105 | 114 | 105 | 105 | 105 | 101 | 105 | 101 | 109 |
| M13 | 145 | 145 | 145 | 145 | 145 | 145 | 145 | 156 | 145 |
| M17 | 152 | 137 | 122 | 144 | 156 | 141 | 112 | 141 | 141 |
根据表4的结果，计算Nei遗传距离。9品系近交系小鼠间的Nei遗传距离及特性的测定结果如表5。
表5
根据表5结果，运用UPGMA绘制聚类图等，用以监测近交系小鼠遗传质量。基于Nei遗传距离绘制聚类关系图如图3。
结合分析M06和M08引物毛细管电泳结果如图4A-B，可用以鉴定8个常用近交系小鼠品系。并且，利用本发明中所设计的特异性荧光引物，PCR反应后产物经ABI3730测序仪进行毛细管电泳检测，可精确读取产物大小的数据，可避免琼脂糖凝胶电泳图中多出现的影子带现象，结果数据可无干扰地准确判断。
依据多态性结果，荧光引物M06，M08结合使用，可用于本发明中8个近交系小鼠的品系间鉴定，可以将8个品系BALB/c，C57BL/6，CBA，DBA/1，DBA/2，FVB，C3H/He，NOD加以清楚地区分。特别是对于遗传距离非常近的品系也可良好区分：DBA/1与DBA/2两个品系之间遗传距离最近，它们的M06引物扩增产物长度均为290bp，M08位点上的长度则分别为176bp，181bp，结合分析M06和M08引物扩增后的位点片段大小，即可将两品系区分辨别。如表4以及表6所示。
对于NOD和SJL/J两个品系的小鼠，尽管引物M06，M08扩增产物数据相近。则只需增加除M3，M17外的任1组引物进行扩增鉴定，3组扩增产物结合即可实现鉴别。
表6、8个常用近交系小鼠在M6，M8位点上的分型结果(allele：bp)
| 近交系/位点 | M6 | M8 |
| Balb/c | 282 | 185 |
| C57BL/6 | 294 | 185 |
| CBA | 286 | 181 |
| DBA/1 | 290 | 176 |
| DBA/2 | 290 | 181 |
| FVB/NJ | 286 | 185 |
| C3H/He | 282 | 193 |
| NOD | 290 | 185 |
由表6可见，将M06，M08两引物结合使用，可实现8个近交系小鼠品系间的鉴定。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海斯莱克实验动物有限责任公司
<120> 利用微卫星技术对近交系小鼠进行遗传质量监测的方法
<130> 177481
<160> 64
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 1
cttgggcagt gggacagag 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 2
aaccttggtc ggacttgatt tc 22
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 3
gcgagaatgg ctgcttgc 18
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 4
cggcttttgt ctgtctgtct atc 23
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 5
gtttgaagcc agcccagtc 19
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 6
caatctctgt ctctgtgtct ctg 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 7
gccagcccag tcttcatatt g 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 8
gtctctgtgt ctatgtgtct ctg 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 9
gcaaagcagg cacttcatta ac 22
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 10
atattcaaac aagagtcaac agtcag 26
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 11
gcaggcactt cattaactaa gc 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 12
aagagtcaac agtcaggaaa gc 22
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 13
tgtaggcaga ggcaagacg 19
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 14
ataataactg taaggcagcc aaac 24
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 15
tgaggtcagc ctggactata tg 22
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 16
gccaaacaaa agaaactaga caatac 26
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 17
tccatatacc cttgtgataa ctgtag 26
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 18
ctagaaatgg gtccagagtg tatg 24
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 19
ataactgtag agtgtagagc catac 25
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 20
atacaggtgc taaataaatg agagac 26
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 21
gtaggatgtt gagcaataaa ggc 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 22
ccctgttgat ttctcttctt gtc 23
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 23
gctccagaga tgctgatgac 20
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 24
atgctcctcg ctgctgag 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 25
gctggcttgt gtcctgtg 18
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 26
tgctctctga ccacccataa g 21
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 27
atggaacttg aattctctgc attag 25
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 28
ataagtgctg acaggcttga c 21
<210> 29
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 29
aatggtcatt ggaatatagt agatgc 26
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 30
tagatagatg gatggatgat gtatgg 26
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 31
catcctgcca catctatctg tc 22
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 32
gaagggccag cttagtcaag 20
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 33
atgtgagaac agagattcct tttc 24
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 34
cccagacttt tacattttat gacttg 26
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 35
tctgttgttt agacttggtg ataatc 26
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 36
gtcaggataa gcaagttaga atgtg 25
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 37
ccaggtgagc cagggttac 19
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 38
agacatacat gcaggcagaa c 21
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 39
tgagtgttga ggttaatggt gtg 23
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 40
aggtctgtga aaccctgtct c 21
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 41
ccgaagttct tctagttgta atagtc 26
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 42
gcaatacacc ctggaaatga tc 22
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 43
gcactcccct ttaacatctc tc 22
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 44
tgatttctaa ggttgctctc tagg 24
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 45
atttgaagcg acccaggatg 20
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 46
acagagtgag ttccaggaca g 21
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 47
tagagatagc ccaataaaag caattc 26
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 48
tgtcttctta cttccacatg agag 24
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 49
tgtagcagga gtcatcattc tac 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 50
acacagtaag aaccaaggct atc 23
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 51
ttctccaagc tatgtgtctg atg 23
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 52
tacattcctt cagatagatg gatgg 25
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 53
tgcccaagat cagctttgaa g 21
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 54
caaatatatg agatgggagt ggatag 26
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 55
cacttgagat agtcagctta tatgg 25
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 56
catggactaa agtctctgaa acc 23
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 57
gggaggtgaa ataacaggat gtc 23
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 58
cagccctgaa aatatacaca caag 24
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 59
ttaatggatg gaatcagggc ac 22
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 60
ataagccatc agtaactcca gac 23
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 61
gcatctcatt ggccctagaa tc 22
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 62
ttgatacata agacccacca gttc 24
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 63
tctccagcct cagcatgtat g 21
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 64
tgttggtagg agtctaaact tgtg 24
Claims (10)
1.一种对近交系小鼠的遗传分析的方法，其特征在于，所述方法包括：
以待测样品的DNA为模板，以选自下组的引物对进行PCR扩增：
核苷酸序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的引物；
将获得的扩增产物进行检测，获得遗传分析结果。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的遗传分析结果包括：Nei遗传距离及特性，遗传一致性分析结果，聚类关系。
3.一种特异性鉴定近交系小鼠的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)以待测样品的DNA为模板，以下组的引物对进行PCR扩增：
核苷酸序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物；和
核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物；
(2)获取扩增产物，从而特异性鉴定近交系小鼠。
4.如权利要求1～4所述的方法，其特征在于，所述的近交系小鼠包括：BALB/c小鼠，C57BL/6小鼠，CBA小鼠，DBA/1小鼠，DBA/2小鼠，FVB小鼠，C3H/He小鼠，NOD小鼠。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：
(a)以待测样品的DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物扩增，获得扩增产物1；鉴定扩增产物1的序列长度，若长度为282bp，则鉴定为Balb/c或C3H/He小鼠；若长度为294，则鉴定为C57BL/6小鼠；若长度为286bp，则鉴定为CBA或FVB/NJ小鼠；若长度为290bp，则鉴定为DBA/1、DBA/2或NOD小鼠；
(b)对于(a)中鉴定为Balb/c或C3H/He的小鼠，再以核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQID NO:46的引物，获得扩增产物2；鉴定扩增产物2的序列长度，若长度为185bp，则为Balb/c小鼠；若长度为193bp，则为C3H/He小鼠；或
对于(a)中鉴定为CBA或FVB/NJ的小鼠，再以核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物，获得扩增产物2；鉴定扩增产物2的序列长度，若长度为181bp，则为CBA小鼠；若长度为185bp，则为FVB/NJ小鼠；或
对于(a)中鉴定为DBA/1、DBA/2或NOD的小鼠，再以核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQID NO:46的引物，获得扩增产物2；鉴定扩增产物2的序列长度，若长度为176bp，则为DBA/1小鼠；若长度为181bp，则为DBA/2小鼠；若长度为185bp，则为NOD小鼠。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的近交系小鼠还包括SJL/J小鼠，其以核苷酸序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物扩增，获得扩增产物长度为290，以核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物扩增，获得扩增产物长度为185；当将SJL/J与NOD小鼠进行区分时，所述方法还包括：以待测样品的DNA为模板，以选自下组的引物对之一扩增、获得扩增产物3：
核苷酸序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的引物；或
核苷酸序列如SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的引物；
若以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物扩增，且扩增产物3为248bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为240bp，则为NOD小鼠；
若以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物扩增，且扩增产物3为326bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为290bp，则为NOD小鼠；
若以SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的引物扩增，且扩增产物3为198bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为205bp，则为NOD小鼠；
若以SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的引物扩增，且扩增产物3为165bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为157bp，则为NOD小鼠；
若以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物扩增，且扩增产物3为212bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为187bp，则为NOD小鼠；
若以SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48的引物扩增，且扩增产物3为126bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为134bp，则为NOD小鼠；
若以SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的引物扩增，且扩增产物3为109bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为101bp，则为NOD小鼠；或
若以SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的引物扩增，且扩增产物3为145bp，则为SJL/J小鼠；若扩增产物3为156bp，则为NOD小鼠。
7.一种用于对近交系小鼠进行遗传分析或特异性鉴定近交系小鼠的试剂盒，其特征在于，其中包括引物对，其选自下组：
核苷酸序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的引物；
核苷酸序列如SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的引物。
8.一种特异性鉴定近交系小鼠的试剂盒，其特征在于，其中包括如下引物对：
核苷酸序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物；和
核苷酸序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46的引物。
9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括选自下组的试剂：
探针；
检测标准品；
DNA提取试剂；
Taq酶；
PCR缓冲液；
DNA聚合酶；和/或
说明鉴定方法的使用说明书。
10.权利要求8或9所述的试剂盒的用途，用于对近交系小鼠进行遗传分析或特异性鉴定近交系小鼠。
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