CN109694398A - 一种三七二醇衍生物的制备方法 - Google Patents

一种三七二醇衍生物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种结构式为原三七二醇衍生物20(R)‑25‑羟基‑达玛烷型‑3β，12β，20‑三醇[简称20(R)‑25‑OH‑PPD]的制备方法。三七总皂苷水解的方法获得了如上原三七二醇衍生物，其中三七皂苷水解方法包括碱水解法、酸水解I法和酸水解II法。并经核磁共振光谱确定了其结构。该方法收率高、纯度高，产品质量稳定，可实现工业生产，能满足用于新型抗肿瘤药物的开发需要。

Description

一种三七二醇衍生物的制备方法
技术领域
本发明涉及结构式一种原三七二醇衍生物20(R)-25-羟基-达玛烷型-3β，12β，20-三醇[简称20(R)-25-OH-PPD]的制备方法。其制备方法包括A：硅胶层析法；B：碱水解法，经过酸中和、有机溶剂萃取及硅胶柱层析分离后得到20(R)-25-OH-PPD白色结晶；C、酸水解I法，经过碱中和、有机溶剂萃取及硅胶柱层析分离后得到20(R)-25-OH-PPD；D、酸水解II法，加水沉淀，水洗至中性的沉淀经硅胶柱层析分离后得到20(R)-25-OH-PPD白色结晶。
背景技术
1979年，日本学者Odashima等人发现三七皂苷Rh2在体外能抑制肺癌细胞3LL(小鼠)、莫里斯肝细胞(兔子)、B-16恶性肿瘤(小鼠)和HELA细胞(人)的增殖，并证明三七皂苷能引起癌细胞向正常细胞转化。1991年，日本学者Kikuchi等人报道，给裸鼠口服三七皂苷Rh2可明显抑制人类卵巢癌(HRA)的增生。小鼠的生存率显著上升(对照组124天，治疗组198天)1995-1996年，日本学者Kitagawa等人报道，三七皂苷Rg3可以抑制由bombesin所致大鼠肠癌腹腔内转移的作用。Azuma等报道了20(S)、20(R)三七皂苷Rg3和Rb2在体内体外对B16-BL6肿瘤细胞在肺部的转移有抑制作用。1998年，日本学者Nakata等人报道，口服三七皂苷Rh2(0.4-1.6mg/kg/天)不仅可以抗HRA肿瘤，而且可延长裸鼠生存期(对照组60天，治疗组85天)。天然皂苷肠道菌群代谢转化的研究表明：由于肠道菌群对糖苷键的水解能力极强，大多数天然皂苷入血成分为其次级苷或苷元。多种天然二醇组三七皂苷均报道有抗肿瘤作用，包括：Rg3，Rh2，Rb1等等。这些皂苷最终体内代谢产物均为Compound K(以下简称C-K)或原三七二醇(以下简称PPD)。由此，人们联想：是否C-K或原三七二醇为二醇组三七皂苷抗肿瘤的活性代谢产物。换言之，Rg3，Rh2可能为抗肿瘤天然前体药物。因此，探讨C-K或原三七二醇的抗肿瘤作用有可能会较Rg3或Rh2具有更大的价值。但由于C-K和原三七二醇大量获取的困难，有关这两个化合物的临床前评价尚未见系统报道。2001年11月份，在韩国召开三七皂苷抗肿瘤国际学术研究会，会上，日本著名学者柴田承二作了有关三七皂苷及三萜皂苷抗肿瘤活性的综述报告。二醇组皂苷和原三七二醇衍生物的抗肿瘤的临床价值已引起高度重视。
综上所述，三七皂苷Rg3、Rh2和原三七二醇衍生物，均有作为潜在抗肿瘤药物开发的可能性，但这些皂苷天然含量极低，例如：Rg3在白参中的含量仅为0.0003％，在红参中的含量约为0.03％，而Rh2和20(R)-羟基-3β，12β，20，25-三醇在天然三七中并不存在，仅在红参中含有Rh2约0.001％。而原三七二醇和其衍生物的含量更为稀少。因此，采用化学方法或生物学方法转化上述稀有三七皂苷将具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供20(R)-25-羟基-达玛烷型-3β，12β，20-三醇的制备方法。
本发明的目的是这样实现的：
A、硅胶层析法，用70％乙醇提取、大孔吸附树脂纯化后的三七果总皂苷，经氯仿萃取、硅胶柱层析及反相硅胶柱层析分离后得到20(R)-25-OH-PPD，收率0.1-1.0％。
B、碱水解法，即将三七总皂苷溶解于碱性有机溶剂中进行碱水解，然后经过酸中和、有机溶剂萃取及硅胶柱层析分离后得到20(R)-25-OH-PPD白色针状结晶，收率1-50％。
C、酸水解I法：三七总皂苷溶解于酸性水溶液中进行超声酸水解，然后经过碱中和、有机溶剂萃取及硅胶柱层析分离后得到20(R)-25-OH-PPD白色针状结晶，收率1-50％。
D、酸水解II法：即三七总皂苷溶解于酸性有机溶液中进行超声酸水解，然后加水沉淀，水洗至中性的沉淀经硅胶柱层析分离后得到20(R)-25-OH-PPD，收率1-80％。
E、微生物水解法：利用微生物菌株在水溶液中水解三七总皂苷，反应产物去除微生物后，经大孔吸附树脂柱纯化、硅胶柱层析后得到20(R)-25-OH-PPD，收率1-80％；
F、采用核磁共振光谱法对所得20(R)-25-OH-PPD进行结构鉴定。
上述白色针状晶体，熔点252-254℃(EtOAc)，EI-MS(m/z)：478，分子式为C30H54O4；13C-NMR给出4个羟基碳的化学位移分别为79.5(C-3)，71.9(C-12)，74.7(C-20)，71.5(C-25)。C-17(51.3)，C-21(22.4)，C-22(44.0)化学位移表明化合物1的C-20构型为R。13C-NMR中其它碳的化学位移为：40.3(C-1)，28.0(C-2)，40.0(C-4)，57.3(C-5)，18.9(C-6)，35.9(C-7)，40.9(C-8)，50.9(C-9)，38.2(C-10)，32.0(C-11)，49.5(C-13)，52.6(C-14)，32.0(C-15)，27.1(C-16)，16.3(C-18-CH3)，6.8(C-19-CH3)，19.4(C-23)，45.4(C-24)，29.4(C-26-CH3)，29.1(C-27-CH3)，28.6(C-28-CH3)，16.2(C-29-CH3)，17.4(C-30-CH3)。由此鉴定化合物的结构为20(R)-25-羟基-达玛烷型-3β，12β，20-三醇[20(R)-25-OH-PPD]。
我们利用硅胶层析法和三七总皂苷水解的方法获得了一种原三七二醇衍生物，并采用核磁共振光谱法确定它的化学结构为20(R)-25-羟基-达玛烷型-3β，12β，20-三醇[20(R)-25-OH-PPD]。20(R)-25-OH-PPD。经药效学试验体内3种人肿瘤细胞的抗癌试验结构证明20(R)-25-OH-PPD具有较强的抗肿瘤活性。与三七皂苷Rg3对比它们的抑制肿瘤细胞的作用优于三七皂苷-Rg3。该制备20(R)-25-OH-PPD的方法收率、纯度高，产品质量稳定，可实现工业生产，能满足用于新型抗肿瘤药物的开发需要。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：硅胶层析法制备得到20(R)-25-OH-PPD
5kg干燥的五加科三七属植物新鲜三七果用70％乙醇提取后，通过D101大孔吸附树脂柱后(由天津化学有限公司提供)，水洗后用70％乙醇从柱中洗脱将其分离纯化、干燥后获得三七果总皂苷。取三七果总皂苷10g，用氯仿萃取，氯仿萃取物进行硅胶柱层析分离，氯仿∶甲醇(30∶1-5∶1)梯度洗脱得7个流分，流分5经反相硅胶柱层析分离、乙腈∶水(80∶20)洗脱、乙酸乙酯重结晶后得到20(R)-25-OH-PPD，收率0.18％。
实施例2：碱解法制备得到20(R)-25-OH-PPD
称取三七总皂苷10g，溶解于1000ml 95％乙醇溶液中，滤过，除去不溶物，得到滤液。将配制好的0.5％(W/V)氢氧化钠乙醇溶液在搅拌下加入到上述滤液中，静止，滤过，水洗沉淀至中性。干燥后的沉淀经硅胶柱层析分离，石油∶乙酸乙酯(30∶1-1∶1)梯度洗脱得8个流分，流分5经乙酸乙酯重结晶后，得20(R)-25-OH-PPD白色结晶，收率1.2％。
实施例3：氢氧化钠水解法制备20(R)-25-OH-PPD
称取三七果总皂苷10g，溶于1000ml氢氧化钠浓度为2.5mol/L、浓度为80％的甲醇水溶液中水解24h，用2.5mol/L盐酸中和反应液，减压回收甲醇，用氯仿萃取反应液，氯仿相经水洗、无水硫酸钠干燥、蒸干收集残余物，经硅胶柱层析分离、石油∶乙酸乙脂(50∶1-2∶1)梯度洗脱得8个流分，流分5经乙酸乙酯重结晶后，得20(R)-25-OH-PPD白色结晶，收率1.4％。
实施例4：氢氧化钾水解法制备20(R)-25-OH-PPD
称取西洋参果总皂苷10g，溶解于1000ml甲醇溶液中，滤过，除去不溶物，得到滤液。将配制好的0.45％(W/V)氢氧化钾乙醇溶液在搅拌下加入到上述滤液中，静止，滤过，收集沉淀。水洗沉淀至中性。干燥后的沉淀经硅胶柱层析分离、石油∶丙酮(10∶1-1∶1)梯度洗脱得到7个流分，流分4经乙酸乙酯重结晶后，得20(R)-25-OH-PPD白色结晶，收率1.5％。
实施例5：盐酸水解法制备得到20(R)-25-OH-PPD
称取西洋参叶总皂苷10g，溶于1000ml盐酸浓度为2.5mol/L、浓度为80％的乙醇水溶液中超声，超声条件：频率：50kHz；功率：3KW；时间：30分钟；在温度40℃水解12h，用2.5mol/L氢氧化钠中和反应液，减压回收甲醇，用氯仿萃取反应液，氯仿相经水洗、无水硫酸钠干燥、蒸干收集残余物，经硅胶柱层析分离、石油∶丙酮(10∶1-1∶1)梯度洗脱得7个流分，流分4经乙酸乙酯重结晶后，得20(R)-25-OH-PPD白色结晶，收率1.7％。
实施例6：酸解法制备得到20(R)-25-OH-PPD
称取三七叶总皂苷10g，溶于1000ml浓盐酸和1000ml乙醇混合溶液中超声，超声条件：频率：50kHz；功率：3KW；时间：10分钟；在温度40℃水解12h，用5mol/L氢氧化钠中和反应液，减压回收甲醇，用乙醚萃取反应液，萃取液经水洗、无水硫酸钠干燥、蒸干收集残余物，经硅胶柱层析分离，氯仿∶甲醇(30∶1-5∶1)梯度洗脱得7个流分，流分4经乙酸乙酯重结晶后，得20(R)-25-OH-PPD白色结晶，收率1.6％。
实施例7：硫酸水解法制备20(R)-25-OH-PPD
称取三七总皂苷10g，溶于1000ml硫酸浓度为3.0mol/L、浓度为80％的乙醇水溶液中超声，超声条件：频率：50kHz；功率：3KW；时间：60分钟；在温度40℃水解8h，然后加水沉淀，水洗至中性的沉淀经硅胶柱层析分离，氯仿∶甲醇(30∶1-5∶1)梯度洗脱得7个流分，流分4经乙酸乙酯重结晶后，得20(R)-25-OH-PPD白色结晶，收率1.8％。
实施例8：磷酸水解法制备20(R)-25-OH-PPD
称取三七总皂苷10g，溶于1000ml磷酸浓度为8.5mol/L、浓度为80％的甲醇水溶液中超声，超声条件：频率：50kHz；功率：3KW；时间：60分钟；，在温度40℃24h，用2.5mol/L氢氧化钠中和反应液，减压回收甲醇，用氯仿萃取反应液，氯仿相经水洗、无水硫酸钠干燥、蒸干收集残余物，经硅胶柱层析分离、氯仿∶甲醇(30∶1-5∶1)梯度洗脱、乙酸乙酯重结晶后，得20(R)-25-OH-PPD白色结晶，收率1.6％。
实施例9：微生物水解法制备20(R)-25-OH-PPD
将纯化后的微生物菌株头孢霉菌G0405(Cephalosporium sp.)[由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC1703]，接种到含有10g三七总皂苷(含量大于80％)的水溶液中，在温度30℃，摇床转速160r·min-1，自然pH值条件下转化3d。反应产物去除微生物后，经大孔吸附树脂柱纯化、硅胶柱层析分离、氯仿∶甲醇(30∶1-5∶1)梯度洗脱、乙酸乙酯重结晶后，得20(R)-25-OH-PPD白色结晶，收率1.0％。

Claims (3)

1.20(R)-25-羟基-达玛烷型-3β，12β，20-三醇的制备方法，其特征在于：采用酸水解法：其制备过程如下：
三七总皂苷溶解于酸性有机溶液中进行超声酸解，然后经过碱中和，有机溶剂萃取及硅胶柱层析分离后得到20(R)-25-OH-PPD白色针状结晶，收率1-80％；
或三七总皂苷溶解于酸性有机溶液中进行超声酸水解，然后加水沉淀，水洗至中性的沉淀经硅胶柱层析分离后得到20(R)-25-OH-PPD，收率1-80％。
2.根据权利要求1所述的20(R)-25-羟基-达玛烷型-3β，12β，20-三醇的制备方法，其特征在于：三七总皂苷是指来自五加科三七属具有达玛烷四环三萜结构骨架的所有植物的根、茎、叶、花、花蕾、果实、果实浆、种子中含有的皂苷类化合物。
3.根据权利要求1所述的20(R)-25-羟基-达玛烷型-3β，12β，20-三醇的制备方法，其特征在于：20(R)-25-OH-PPD的制备是将三七总皂苷溶解于低级醇中在超声条件下进行酸水解，然后经过碱金属氢氧化物中和，有机溶剂萃取及硅胶柱层析分离得到20(R)-25-OH-PPD白色结晶，收率1-80％。
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