CN109679648A - 一种基于氮杂环结构的溶酶体靶向型荧光染料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于氮杂环结构的溶酶体靶向型荧光染料及其制备方法和应用,其中基于氮杂环结构的溶酶体靶向型荧光染料是以5‑(二甲氨基)萘‑1‑磺酸或7‑硝基苯并‑2‑氧杂‑1,3‑二唑作为荧光母体,在母体分子结构上引入不同种类的氮杂环取代基,其结构如下所示:其中R选自如下基团中的一种:R1为氢或C1‑5的烷基,R1可以相同或不同。本发明荧光染料采用一步合成法,合成步骤简单、反应条件温和,产品容易提纯。该类荧光染料不仅能特异性靶向多种细胞的溶酶体,而且能够长时间标记细胞的溶酶体。另外,该类荧光染料可用于监测细胞内自噬溶酶体的形成,在生物领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及合成与技术应用领域,具体涉及一种基于氮杂环结构的溶酶体靶向型荧光染 料及其制备方法和应用。
背景技术
溶酶体是细胞内一种重要的细胞器,在细胞的正常生命活动中发挥至关重要的作用:细 胞内大分子的降解和再循环利用、细胞内和细胞外各种材料的降解以及损伤细胞器的再回收 等。溶酶体具有高度动态的特性,他们的形态和空间分布是不断变化的,而其数量和形态的 变化往往能够代表细胞所处的生命活动状态。溶酶体异常通常会引发多种疾病(如痛风、溶 酶体贮积症或矽肺等),并且病变过程中常伴随溶酶体数量、大小、形状、结构等方面的变化。 因此,发展非侵害性、长时程的荧光染料对溶酶体进行特异性成像不仅能够实时监测溶酶体 在细胞生命活动过程中所发生的各种变化,而且对进一步了解溶酶体的生理学和病理学作用 具有重要意义。
荧光染料作为检测标记因其灵敏度高、操作方便等特点而逐渐取代放射性同位素,并广 泛应用于荧光免疫、荧光探针、细胞染色等领域。以荧光染料为核心的荧光显微成像具有高 时空分辨能力,通过染色标记细胞的各类细胞器和生物膜,使细胞内各个细胞器之间的空间 关系一目了然。目前,用于活细胞溶酶体特异性染色的荧光染料已成为荧光显微成像领域的 研究热点之一,相应的染料已经得到了广泛报道。但是,多数用于溶酶体成像的荧光染料仍 存在很大不足,比如斯托克斯位移小、毒性大、孵育时间长等问题。为了能够在复杂生物体 中实现对分子事件高灵敏度、专一性的快速检测以及动态监测,亟需发展大斯托克斯位移、 低细胞毒性和长时程染色的溶酶体定位染料。发展构建性能优越的溶酶体靶向型荧光染料, 将会对探索细胞内溶酶体参与的复杂的生物学过程起极大的推动作用。
发明内容
本发明目的在于解决现有溶酶体染料中存在的技术问题,提供一种基于氮杂环结构的溶 酶体靶向型荧光染料及其制备方法和应用。本发明荧光染料斯托克位移大、荧光背景低、生 物兼容性好,能够专一性累积在细胞的溶酶体内,可实现长时程观察细胞内溶酶体及示踪溶 酶体的自噬过程。该类探针用于细胞染色后,无需清洗,可直接用于激光共聚焦成像。
本发明基于氮杂环结构的溶酶体靶向型荧光染料,是5-(二甲氨基)萘-1-磺酸(DS)或7- 硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)作为荧光母体,在母体分子结构上引入不同种类的氮杂环 取代基,其结构如下所示:
其中R选自如下基团中的一种:
R为1,4,7,10-四氮杂环十二烷、1,4,7-三氮杂环壬烷、哌嗪或吗啉等含不同氮原子或碳原 子的杂环取代基。
R1为氢或C1-5的烷基等,其中R1可以相同也可以不同。
本发明中使用的术语:“烷基”包括直链烷基和支链烷基。
本发明基于氮杂环结构的溶酶体靶向型荧光染料的制备方法,包括以下步骤:
将氮杂环类化合物和碱溶于5-100mL有机溶剂中,室温下搅拌反应30-90min,然后将 0.2-20mL溶有化合物DS-Cl或NBD-Cl的溶液缓慢滴加到上述反应液中,并于室温下继续搅 拌反应2-24h;待反应液冷却后抽滤,洗涤,得粗产品,纯化后得到目标产物。
所述化合物DS-Cl、NBD-Cl的结构式如下:
所述氮杂环类化合物的结构如下所示:
其中R1为氢或C1-5的烷基等,R1可以相同也可以不同。
所述碱为碳酸钾、三乙胺或4-N,N-二甲基吡啶等。
所述化合物DS-Cl或NBD-Cl、氮杂环类化合物和碱三者之间的摩尔比为1:1:1-1:4:4。
所述有机溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
所述纯化是采用硅胶柱色谱分离的方法进行纯化,洗脱剂由二氯甲烷和甲醇按体积比 1:1-150:1的比例混合构成。
本发明基于氮杂环结构的溶酶体靶向型荧光染料成功实现对细胞溶酶体的长时程荧光成 像和示踪,能够特异性靶向细胞的溶酶体,并能长时间标记细胞的溶酶体,可用于监测细胞 内溶酶体的自噬过程。
所述细胞包括正常细胞、肿瘤细胞、小鼠巨噬细胞等,具体包括子宫颈癌细胞(HeLa)、 人肾上皮细胞(293T)、人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)、小鼠巨噬细胞(Raw264.7)、人 正常肝细胞(QSG-7701)等。
本发明设计合成了具有荧光背景低、斯托克位移大和膜透性好的溶酶体靶向型荧光染料。 这些荧光染料具有较低的细胞毒性,能够快速跨越多种细胞的细胞膜和溶酶体膜到达溶酶体 内。通过与商业溶酶体染料和溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1-RFP)的共定位实验,证明本发 明中的荧光染料能够专一性累积在溶酶体中。与商业溶酶体染料相比,这些染料的斯托克位 移可达170nm以上,其良好的光稳定性使其适用于长时间观察溶酶体的动态变化过程。另外, 结合绿色融合蛋白(LC3B-GFP),本发明中的荧光染料可以动态观察细胞内溶酶体的自噬过 程。目前,这一类基于氮杂环结构的特异性靶向溶酶体的荧光染料体系的制备方法及其应用 还未见报道。
与现有技术相比,本发明的有益效果体现在:
1、本发明合成的荧光染料是通过取代反应获得的,反应为一步合成法、用料便宜、合成 简单、反应条件温和。
2、本发明合成的荧光染料结构中的氮杂环结构不仅可以提高染料的水溶性,并且能够特 异性靶向细胞的溶酶体。
3、本发明合成的荧光染料耐光性好并能在细胞溶酶体中长时间滞留,为长时间观察溶酶 体的生命活动提供了可行性。
4、本发明合成的荧光染料结合LC3B-GFP融合蛋白能够成功用于示踪细胞中的自噬溶酶 体。
5、本发明中的荧光染料斯托克位移大、耐光性好、细胞毒性小、溶酶体中滞留时间长, 为长时间监测溶酶体的生命活动及示踪自噬溶酶体形成奠定了基础。
附图说明
图1为本发明的荧光染料(DS-C)在10mM PBS(pH=7.4)缓冲溶液下的荧光光谱,激发波长为405nm,发射波长为570nm。插图为染料在365nm紫外灯照射下的荧光照片。
图2为本发明的荧光染料(DS-C)和商业溶酶体染料LysoTracker Deep Red分别在HeLa、293T、MCF-10、RAW 264.7和QSG-7701细胞中的共定位。LysoTracker Deep Red(1μM)加入到细胞中孵育20min后加入DS-C继续培养10min,随后进行共聚焦成像。黄色通道的 荧光来自于染料DS-C,激发波长为405nm,收集的发射峰范围为410-585nm。红色通道的 荧光来自LysoTracker Deep Red,激发波长为633nm,收集的发射峰范围为638-747nm。标 尺为10μm。
图3为本发明的荧光染料(DS-C)与溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1-RFP)在HeLa细胞中的共定位。其中图片中黄色和红色通道中的荧光分别来自于染料DS-C和LAMP-1-RFP, 其激发波长分别为405和543nm及通道收集的发射峰的波长范围分别为410-585和578-696nm。标尺为5μm。
图4为本发明的荧光染料(DS-C)与LC3B-GFP融合蛋白示踪细胞自噬溶酶体。首先,用氯喹处理转染了LC3B-GFP融合蛋白的HeLa细胞,然后向细胞中加入DS-C培养10min 后进行共聚焦成像。其中,黄色和绿色通道中的荧光分别来自于DS-C和LC3B-GFP,其激发 波长分别为405和488nm及通道收集的发射峰的波长范围分别为410-585和493-598nm。标 尺为10μm。
图5为本发明中的荧光染料(DS-C)与LysoTracker Deep Red的荧光在细胞中随时间的 变化趋势。向不同组HeLa细胞中同时加入DS-C和LysoTracker Deep Red,然后分别拍摄培 养不同时间段(0、2、6、18、24和72h)后细胞的荧光照片。取荧光照片中至少30个细胞的荧光强度,然后计算这些细胞荧光强度的平均值,并画出对应时间段的荧光曲线。
图6为本发明中的荧光染料(DS-P和DS-T)与LysoTracker Red DND-99在HeLa细胞中的共定位。首先,将染料Red DND-99加入到HeLa细胞中孵育30min,然后将探针DS-P 和DS-T分别加入到不同组细胞中,继续培养10min后进行共聚焦成像。荧光照片中的黄色 通道来自染料DS-P和DS-T,红色通道来自LysoTracker Deep Red。黄色通道激发波长为405nm,收集的发射波长范围为410-585nm;红色通道激发波长为543nm,收集的发射波长范 围为578-696nm。标尺为20μm。
具体实施方式
实施例1:染料丹磺酰-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DS-C)的合成
将638.7mg 1,4,7,10-四氮杂环十二烷(3.71mmol)和512.3mg无水碳酸钾(0.371mmol) 溶于20mL无水乙腈中,于室温下搅拌30min;溶有250mg丹磺酰氯(0.927mmol)的10mL 无水乙腈溶液逐滴加入到上述反应体系中,于室温下继续搅拌反应3h。待反应完成后,抽滤 除去碳酸钾粉末,并用真空旋转蒸发仪除去乙腈。得到的绿色粘状残渣用柱层析纯化得目的 产物DS-C,洗脱剂为CH2Cl2/CH3OH(V/V=10:1)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.56(d,1H), 8.38(d,1H),7.98(d,1H),7.52(m,2H),7.19(d,1H),3.62(t,4H),3.20(t,4H),3.04(t,4H), 2.88-2.91(m,10H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ151.9,133.1,130.8,130.4,130.2,128.6,123.2, 119.1,115.9,115.6,49.4,49.3,48.7,45.8,45.4.
实施例2:染料DS-C在PBS缓冲溶液中的荧光光谱
将DS-C溶于乙醇中,配置成浓度为10mmol/L的储备液。从储备液中取出2μL DS-C加入到2mL的PBS的缓冲溶液中(pH=7.4,10mM),使探针的最终浓度为10μM,测定 激发波长为405nm下染料DS-C的荧光发射。并在365nm紫外灯照射下,用数码相机拍下 染料的荧光照片。染料的荧光光谱及荧光照片如图1所示。
实施例3:染料DS-C与商业溶酶体染料LysoTracker Deep Red在不同细胞中的共定位
将溶酶体染料Deep Red分别加入到不同种类的细胞中,于37℃,5%CO2条件下培养30 min后,用培养基或(PBS)洗涤一次除去残余的Deep Red。随后将实施例1制备的荧光染 料DS-C,加入到上述细胞中使其最终浓度5μM,培养10min后,进行激光共聚焦成像,成像结果见图2。由图可以看出,染料DS-C与Deep Red能够完美地重叠,说明染料具有特异 靶向溶酶体的能力,并且具有普适性。染料能够特异性靶向溶酶体可能是因为氮杂环取代基具有弱碱性,细胞溶酶体内环境则是弱酸性,染料有向溶酶体累积的趋动力。
实施例4:染料DS-C和溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1-RFP)在HeLa细胞中的共定位
将HeLa细胞种在激光共聚焦专用玻璃皿中,培养24h后进行转染。每皿加入2μL脂质 体Lipo 2000和2μg红色荧光蛋白标记的溶酶体膜相关蛋白质粒(LAMP-1-RFP),转染4-6h 后更换培养基,继续培养18h。将染料DS-C加到细胞中,培养10min后,于激光共聚焦上进行成像。如图3所示,细胞表达的溶酶体相关膜蛋白LAMP-1-RFP在共聚焦上能够清晰地看出,形成的红色荧光空心圈即为溶酶体。源于染料DS-C的黄色荧光则能够很好地嵌入到溶酶体内,该实验进一步证明了染料DS-C能够特异性靶向细胞的溶酶体。
实施例5:染料DS-C与Deep Red的荧光强度随孵育时间的变化
将染料DS-C与Deep Red同时加入到不同组HeLa细胞中,于37℃,5%CO2条件下培养 不同时间(0、2、6、18、24和72h)后进行激光共聚焦成像,成像结果见图4。由图4可以 看出,染料Deep Red的红色荧光随细胞孵育时间的延长发生明显的猝灭,当细胞孵育时间达24h后,其荧光猝灭80%左右(图4中红色曲线所示),细胞孵育时间达72h后,细胞中基 本观察不到Deep Red的荧光。然而染料DS-C在细胞中培育72h后,仍能在细胞中观察到明 亮的黄色荧光,其荧光强度仅猝灭50%(图4中黄色曲线)。上述结果表明,染料DS-C是一 种耐光性染料,能够长时间染色溶酶体,这为长时程观察细胞溶酶体的生命活动提供了可能 性。
实施例6:染料DS-C对自噬溶酶体的示踪
将HeLa细胞种在激光共聚焦专用玻璃皿中,待培养24h后,进行转染。每皿加入2μL脂 质体Lipo 2000和2μg绿色荧光蛋白标记的自噬相关蛋白质粒(LC3B-GFP),转染4-6h后更 换培养基,继续培养18h。然后向细胞中加入氯喹培养2h后,洗掉溶液中残余的氯喹,加入染料DS-C继续培养10min,最后激光共聚焦成像,成像结果见图5。由图所示,细胞表达 的LC3B-GFP蛋白形成的自噬体(绿色荧光)与溶酶体(黄色荧光)融合后能够形成自噬溶 酶体。通过观察黄色、绿色和二者叠加色的荧光,可以区分细胞的自噬体、溶酶体和自噬溶 酶体,故染料DS-C能够示踪自噬溶酶体的形成。
实施例7:其他染料(DS-T和DS-P)的合成步骤
a.染料丹磺酰-1,4,7-三氮杂环壬烷的合成(DS-T)
将81.7mg 1,4,7-三氮杂环壬烷(0.927mmol)和384.3mg无水碳酸钾(2.781mmol)溶 于10mL无水乙腈中,并于室温下搅拌30min;将溶有250mg丹磺酰氯(0.927mmol)的 10mL无水乙腈溶液逐滴加入到上述反应体系中,并于室温下继续搅拌反应3h。待反应完成 后,抽滤除去碳酸钾粉末,并用真空旋转蒸发仪除去乙腈。得到的浅绿色固体用柱层析纯化 得目的产物DS-T,洗脱剂为CH2Cl2/CH3OH(V/V=10:1)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.51 (q,1H),8.44(q,1H),7.97(m,1H),7.51(m,2H),7.17(t,1H),3.39(q,4H),3.09(q,4H),2.90(d,4H),2.86(d,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ151.7,134.6,130.4,130.3,130.1,128.2,128.1, 115.2,123.1,119.7,115.3,53.7,49.3,49.2,45.4.
b.染料丹磺酰-哌嗪(DS-P)的合成
将160mg哌嗪(1.854mmol)和256.2mg无水碳酸钾(1.854mmol)溶于10mL无水 乙腈中,并于室温下搅拌30min。将溶有250mg丹磺酰氯(0.927mmol)的10mL无水乙腈 溶液逐滴加入到上述反应体系中,于室温下继续搅拌反应3h;待反应完成后,抽滤除去碳酸 钾粉末,用真空旋转蒸发仪除去乙腈。得到的黄绿色固体用柱层析纯化得目的产物DS-P,洗 脱剂为CH2Cl2/CH3OH(V/V=20:1)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.56(d,1H),8.43(d,1H), 8.20(dd,1H),7.53(m,2H),7.18(d,1H),3.15(t,4H),2.85-2.88(m,10H).13C NMR(100MHz, CDCl3):δ151.7,132.7,130.6,130.5,130.1,127.9,119.9,115.2,115.1,46.5,45.5,45.4.
实施例8:染料DS-T、DS-P分别与商业溶酶体染料Red DND-99的共定位
将商业溶酶体染料Red DND-99分别加入到不同组HeLa细胞中,于37℃,5%CO2条件 下培养30min后,然后向上述细胞中分别加入染料DS-T和DS-P,继续培养10min后,进 行激光共聚焦成像。如图6所示,染料DS-T和DS-P与商染Red DND-99都能很好的重叠, 表明染料DS-T和DS-P也是溶酶体靶向型荧光染料。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述,但并非是对发明保护范围的限 制。对本发明所属技术领域的技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,所作出的若干 简单的推演和替换,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于氮杂环结构的溶酶体靶向型荧光染料,其特征在于:
所述溶酶体靶向型荧光染料是以5-(二甲氨基)萘-1-磺酸或7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑作为荧光母体,在母体分子结构上引入不同种类的氮杂环取代基。
2.根据权利要求1所述的基于氮杂环结构的溶酶体靶向型荧光染料,其特征在于其结构如下所示:
其中R选自如下基团中的一种:
R1为氢或C1-5的烷基,R1可以相同或不同。
3.一种权利要求1或2所述的基于氮杂环结构的溶酶体靶向型荧光染料的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
将氮杂环类化合物和碱溶于有机溶剂中,室温下搅拌反应30-90min,然后将溶有化合物DS-Cl或NBD-Cl的溶液缓慢滴加到反应体系中,并于室温下继续搅拌反应2-24h;待反应液冷却后抽滤,洗涤,得粗产品,纯化后得到目标产物;
所述化合物DS-Cl、NBD-Cl的结构式如下:
所述氮杂环类化合物为如下结构化合物中的一种:
其中R1为氢或C1-5的烷基等,R1可以相同或不同。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:
所述碱为碳酸钾、三乙胺或4-N,N-二甲基吡啶。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法,其特征在于:
所述化合物DS-Cl或NBD-Cl、氮杂环类化合物和碱三者之间的摩尔比为1:1:1-1:4:4。
6.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:
所述有机溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
7.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:
所述纯化是采用硅胶柱色谱分离的方法进行纯化,洗脱剂由二氯甲烷和甲醇按体积比1:1-150:1的比例混合构成。
8.一种权利要求1或2所述的基于氮杂环结构的溶酶体靶向型荧光染料的应用,其特征在于:所述溶酶体靶向型荧光染料能够特异性靶向细胞的溶酶体,并能长时间标记细胞的溶酶体,可用于监测细胞内溶酶体的自噬过程。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于:
所述细胞包括正常细胞、肿瘤细胞或小鼠巨噬细胞等。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:
所述细胞包括子宫颈癌细胞HeLa、人肾上皮细胞293T、人正常乳腺上皮细胞MCF-10A、小鼠巨噬细胞Raw264.7、人正常肝细胞QSG-7701等。
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