CN103214494A - 一种酸敏感双光发射探针、制备方法及其用途 - Google Patents

一种酸敏感双光发射探针、制备方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种酸敏感双光发射探针、制备方法及其用途。具体的酸敏感双光发射探针含有分子内酰胺环的罗丹明6G和丹磺酰氯通过酰胺键连接在二亚乙基三胺两端。制备方法为先由罗丹明6G在二亚乙基三胺经过氨解得到一无色固体；再由丹磺酰氯与所得无色固体反应制备得到Danyl-R6G。酸敏感双光发射探针用于检测细胞内溶酶体pH值的用途。本发明利用含有分子内酰胺环的罗丹明6G衍生物和丹磺酰基团对pH的不同响应性能，实现灵敏的pH比率测定。该探针合成简单，应用探针检测溶酶体pH的方法灵敏，简单，快速。

Description

一种酸敏感双光发射探针、制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及探针领域，特别涉及一种酸敏感双光发射探针、制备方法及其用途。 
背景技术
真核细胞内的pH分布与细胞器特异相关。例如，细胞质是近乎中性的（pH7.2）而溶酶体内则呈酸性（pH 6.0-4.0）。溶酶体内的酸性环境对于真核细胞的内吞、自吞噬、细胞凋亡等过程有重要影响。在诸如细胞成熟、癌细胞扩散等过程中都能观察到溶酶体酸性改变这一现象，因此检测溶酶体pH对于相关科学研究有着重要意义。 
基于单个发光团的单荧光强度法在实际应用中有很多不足，例如样品中探针分布不均匀，样品厚度不均匀等原因导致难以定量测量。与此相比，比率荧光法则由于引入内参而避免了这些问题。含有分子内酰胺环的罗丹明6G衍生物在中性环境下没有荧光，而在酸性环境中由于分子内酰胺开环会生成具有强荧光的罗丹明-酰胺，这说明这类罗丹明衍生物是一种对pH有良好响应的染料。然而，基于这种染料的小分子pH比率荧光探针还没有报道。 
目前，市场上已经有一些通过比率测量溶酶体酸度的探针，如Lysosensor (Invitrogen公司产品)。这类产品为含有单一荧光基团，在酸性溶液中发射两种不同波长的荧光。                                                                                                                                  
发明内容
本发明的目的之一是提供一种具有双荧光发射波长的的溶酶体酸度探针。 
本发明利用含有分子内酰胺环的罗丹明6G衍生物和丹磺酰基团对pH的不同响应性能，实现灵敏的pH比率测定。 
本发明的酸敏感双光发射探针，其特征在于，含有分子内酰胺环的罗丹明6G和丹磺酰氯通过酰胺键连接在二亚乙基三胺两端。具有如下结构： 
Figure 247523DEST_PATH_IMAGE001
本发明还保护酸敏感双光发射探针的制备方法，步骤为，先由罗丹明6G在二亚乙基三胺经过氨解得到一无色固体；再由丹磺酰氯与所得无色固体反应制备得到Danyl-R6G。
所述的无色固体经过硅胶柱分离纯化步骤得到。 
所述的Danyl-R6G经过过硅胶柱分离纯化步骤得到。 
制备方法具体为10 g罗丹明6G加入到100 ml 二亚乙基三胺，60摄氏度搅拌反应，直至罗丹明6G的颜色消失；向反应液中加入500 ml水，混合液用二氯甲烷萃取；保留有机相。将加热有机相，除去溶剂所得固体用过硅胶柱分离纯化，得到一无色固体；将该无色固体加入100 ml二氯甲烷,然后加入3 g丹磺酰氯与10 ml三乙胺；室温搅拌反应2小时；加热有机相，除去溶剂，所得固体用过硅胶柱分离纯化，得到Danyl-R6G。 
本发明还保护酸敏感双光发射探针用于检测细胞内溶酶体pH值的用途。 
本发明提供一种具有通过能够在细胞溶酶体内聚集的、通过含有胺基的连接臂将丹磺酰氯与含有分子内酰胺环的罗丹明6G连接在一起的探针。利用探针内罗丹明6G-内酰胺环和丹磺酰基团对pH的不同响应特性，利用含有胺基连接臂能够富集在细胞溶酶体的特性，实现该探针在溶酶体内的富集以及溶酶体pH的比率测定。 
本发明探针的制备方法为：先由罗丹明6G在二亚乙基三胺经过氨解得到一无色固体；再由丹磺酰氯与所得无色固体反应生成丹磺酰胺-二亚乙基三胺-罗丹明6-内酰胺（简称Danyl-R6G） (见图1的Dansyl-R6G的合成路线图)。 
所述探针检测溶酶体pH值的应用(图2为Dansyl-R6G的pH检测原理)：在磷酸缓冲液环境中通过荧光放射光谱的方法检测Danyl-R6G对pH的响应，另外对含有分子内酰胺环的罗丹明6G衍生物（简称为R6G-内酰胺）和丹磺酰基团(dansyl)分别在532 nm和300 nm两个波长下进行激发检测二者对pH的响应（图3）。可以看到，当缓冲液pH在5.5至3.5区间变化时，波长在552 nm时激发出最优荧光强度（图3），表明制备的Danyl-R6G通过酸性介导的内酰胺开环而使之产生强烈的荧光。其中，pH4.0时发出的荧光强度比pH 6.5强200倍。相反地，随着缓冲液的pH从7.0降低到3.5,Danyl基团的荧光发射强度有所减弱（激发波长为300 nm)。 
通过双波长光激发pH滴定检测R6G-内酰胺和Danyl基团的荧光强度比率（I552 nm/I485 nm）。滴定曲线表明，在pH 6.0-3.5区间，Danyl-R6G对pH的比率响应高度敏感（图3）。Danyl-R6G的pH最佳比率测定区间（pH 6.5-3.5）与溶酶体的pH区间（pH 6.0-4.0）重合，说明Danyl-R6G适用于监测活细胞溶酶体的酸性环境。 
Danyl-R6G非常容易地进入到细胞中，通过含有氨基连接臂的质子化作用导致探针聚集细胞溶酶体内。为了检测Danyl-R6G在细胞中的位置，L929细胞与Danyl-R6G和Lyso Tracker Green DND 26（Invitrogen公司出产的一种溶酶体染料）共染。R6G信号可以清晰地被检测到与Danyl染色部分相似，这表明溶酶体pH调节了探针的R6G基团的开环。共聚焦显微镜显示DND-22着色的图像与R6G信号相同(图4)。这证明了Danyl-R6G专一聚集在溶酶体中。 
本发明的检测探针含有两种不同的荧光基团，其中丹磺酰作为内参荧光染，罗丹明-内酰胺作为pH报告基团，通过比率法测定溶酶体酸度。 
本发明利用含有丹磺酰基团和酸敏感的罗丹明-内酰胺分子的探针，通过比率法实现溶酶体pH的检测。相比于现有技术中的溶酶体pH探针，该探针的化学结构与发光原理是不同的（图2）。可以利用荧光共聚焦显微镜来测定溶酶体pH。 
本发明提供的是一种含有双荧光基团的比率探针用于探测溶酶体的酸度。该探针合成简单，为通过利用得到广泛应用的2种荧光基团的组合，得到具有新型用途的探针。应用探针检测溶酶体pH的方法灵敏，简单，快速。 
附图说明
图1为Dansyl-R6G的合成路线图； 
图2为Dansyl-R6G的pH检测原理图；
图3为Dansyl-R6G在不同pH缓冲溶液中的荧光发射光谱图；
图4为Dansyl-R6G 在双波长激发下的荧光发射强度比率的酸度滴定曲线图；
图5A、B、C、D为Dansyl-R6G积聚在L929细胞的溶酶体的荧光图；
图6为利用Dansyl-R6G 对L929细胞溶酶体的酸度定位图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。 
 实施例1：Danyl-R6G的合成 
在一个带盖的管或瓶中将罗丹明6G（10 g）加入到100 ml 二亚乙基三胺，60摄氏度搅拌反应，直至罗丹明6G的颜色消失。向反应液中加入500 ml水，混合液用二氯甲烷萃取。加热有机相，除去溶剂，所得固体用过硅胶柱分离纯化，得到一无色固体（9 g）。将该固体加入100 ml二氯甲烷,然后加入3 g丹磺酰氯与10 ml三乙胺。室温搅拌反应2小时。加热有机相，除去溶剂，所得固体用过硅胶柱分离纯化，得到Danyl-R6G（5 g）。合成路线见图1。
 实施例2：双波长光激发下的Danyl-R6G的比率法pH滴定 
用不同梯度pH的磷酸钠缓冲液将Danyl-R6G配置成终浓度为1微克/毫升的溶液，分别测定不同pH对应的300 nm激发的荧光素激发光谱和532 nm激发的罗丹明6G内酰胺激发光谱。结果见图3和图4；
图3为Dansyl-R6G在pH 8.0, 7.5, 7.0, 6.5, 6.0, 5.5, 5.0, 4.5, 4.0, and 3.5 缓冲溶液中的荧光发射光谱（Dansyl-基团的激发波长为300 nm, R6G-内酰胺基团的激发波长为532 nm）。横坐标为荧光发射波长，纵坐标为荧光发射强度；从图中可以看出，当缓冲液pH在5.5至3.5区间变化时，Danyl基团在485 nm处发出最优荧光强度，而R6G在552 nm处出最优荧光强度，表明制备的Danyl-R6G通过酸性介导的内酰胺开环而使之产生强烈的荧光。其中，pH4.0时发出的荧光强度比pH 6.5强200倍。相反地，随着缓冲液的pH从7.0降低到3.5,Danyl基团的荧光发射强度有所减弱（激发波长为300 nm）；
图4为 Dansyl-R6G 在双波长激发下的荧光发射强度比率的酸度滴定曲线（Dansyl基团的激发波长为300 nm, R6G-内酰胺基团的激发波长为532 nm），横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度比率的lg转换数值（Lg555nm/485nm）。可以看出，通过双波长光激发pH滴定检测R6G-内酰胺和Danyl基团的荧光强度比率（I552 nm/I485 nm）。滴定曲线表明，在pH 6.0-3.5区间，Danyl-R6G对pH的比率响应高度敏感。Danyl-R6G的pH最佳比率测定区间（pH 6.0-3.5）与溶酶体的pH区间（pH 6.0-4.0）重合，说明Danyl-R6G适用于监测活细胞溶酶体的酸性环境。
 实施例3：L929细胞中Danyl-R6G的定位 
L929细胞（来自American Type Culture Collection）在含有0.1 mg/ml Danyl-R6G与 Lyso Tracker green DND 26的培养基中培养2个小时，去除培养液后洗两次，更换新培养基继续培养半个小时。接着进行荧光共聚焦仪器（Zeisis 780）分析，结果见图5A、5B、5C、5D，其中图5A 为LysoTracker Blue DND 26的荧光，图5C为R6G-内酰胺基团的荧光，图5B为Dansyl基团的荧光。图5D的叠加图片显示三者在细胞内的分布位置相同。标尺长度为10 μm。可以看出，R6G信号（图5C）可以清晰地被检测到与Danyl染色部分（图5B）相似，这表明溶酶体pH调节了探针的R6G基团的开环。共聚焦显微镜显示DND-22着色的图像（图5A）与R6G信号相同(图5C)。这证明了Danyl-R6G专一聚集在溶酶体中。
 实施例4：比率法测定L929细胞中溶酶体的酸性 
L929细胞在含有0.1 mg/ml Danyl-R6G的培养基中培养2个小时，去除培养液后洗两次，更换新培养基继续培养半个小时。接着进行荧光共聚焦仪器（Zeisis 780）分析溶酶体的酸度。结果见图6。图中的点状结构的不同颜色为通过Dansyl基团的蓝色荧光与R6G-酰胺的红色荧光叠加得到。由于不同溶酶体的酸度不同，导致了溶酶体内Dansyl基团荧光发射强度与R6G-酰胺的荧光发射强度的比率不同，从而导致了所叠加区域不同溶酶体颜色的区别。通过荧光共聚焦显微镜测量不同溶酶体的Dansyl基团的蓝色荧光强度与R6G-酰胺的红色荧光的强度，由此得到其荧光发射比率，在pH-荧光发射比率的校正曲线的基础上，可以确定单个溶酶体的酸度。图6中的数值为所选定溶酶体酸性的pH值:7.28,6.15,2.51。
 以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内 

Claims (7)

1.一种酸敏感双光发射探针，其特征在于，含有分子内酰胺环的罗丹明6G和丹磺酰氯通过酰胺键连接在二亚乙基三胺两端。
2.权利要求1的酸敏感双光发射探针，其特征在于，具有如下结构：
Figure 254537DEST_PATH_IMAGE001
。
3.权利要求1的酸敏感双光发射探针的制备方法，其特征在于，先由罗丹明6G在二亚乙基三胺经过氨解得到一无色固体；再由丹磺酰氯与所得无色固体反应制备得到Danyl-R6G。
4.权利要求3的酸敏感双光发射探针的制备方法，其特征在于，所述的无色固体经过硅胶柱分离纯化步骤得到。
5.权利要求3的酸敏感双光发射探针的制备方法，其特征在于，所述的Danyl-R6G经过过硅胶柱分离纯化步骤得到。
6.权利要求3的酸敏感双光发射探针的制备方法，其特征在于，10 g罗丹明6G加入到100 ml 二亚乙基三胺，60摄氏度搅拌反应，直至罗丹明6G的颜色消失；向反应液中加入500 ml水，混合液用二氯甲烷萃取；保留有机相，将加热有机相，除去溶剂，所得固体用过硅胶柱分离纯化，得到一无色固体；将该无色固体加入100 ml二氯甲烷,然后加入3 g丹磺酰氯与10 ml三乙胺；室温搅拌反应2小时；加热有机相，除去溶剂，所得固体用过硅胶柱分离纯化，得到Danyl-R6G。
7.权利要求1的酸敏感双光发射探针用于检测细胞内溶酶体pH值的用途。
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