CN104357045A

CN104357045A - 具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针的合成方法及其应用

Info

Publication number: CN104357045A
Application number: CN201410637705.4A
Authority: CN
Inventors: 尹梅贞; 万树林; 沈杰; 郑洋
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2014-11-05
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2034-11-05
Also published as: CN104357045B

Abstract

本发明公开了具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针的合成方法及其应用。通过对螺吡喃的3个位点进行修饰，合成出带有2个羧基和一个酚羟基的萘环螺吡喃，具有极酸/极碱pH值可逆开关式响应的特性，其在pH值<1.0呈现红色荧光，pH值1.0-12.0之间没有荧光，pH值>12.0呈现蓝绿色荧光。合成的螺吡喃小分子荧光探针还具有良好的光、热、化学稳定性、结构可设计性、优异的生物相容性、细胞标记性等特性。合成的螺吡喃小分子荧光探针安全低毒，可以顺利地进入细菌内进行生物标记，在生物体内可以实现和溶液中相同的极酸/极碱pH响应，可作为多功能细胞荧光标记染料应用于生物医药领域的科学研究和基因诊断。

Description

具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针的合成方法及其应用

技术领域

本发明属于分子荧光探针技术领域，特别涉及一种具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针的合成方法及其应用。

背景技术

人体由于体液的存在，通常具有一定的酸碱度。人体内的酸碱值在一般情况下处于一个相对较稳定的状态，而当人受到病理之类的影响时体内的pH值会随着产生变化。通过对人体pH值的测定可以非常方便地实时侦探人的健康指数，这也使得pH值测量在生物领域变得至关重要。目前常用的pH值测量方式主要是玻璃电极和荧光探针，而荧光探针以其优于玻璃电极的快响应，安全性和易于体内测量在近些年得到了越来越多的重视。研发具有特定pH值响应的荧光探针，特别是在玻璃电极的瓶颈pH值范围(pH≤5.0和≥9.0)以及极酸/极碱环境中适用的荧光探针成为生物荧光领域的热点研究课题。目前少有关于极端pH值响应的荧光探针的报道，而同时在一个探针上具有两个极端pH值响应的荧光探针则未见报道。

螺吡喃及其衍生物具有出色的环境敏感性，目前报道的有光响应，酸碱响应，离子响应，气体响应以及温度响应。螺吡喃以其快响应，易合成，抗疲劳以及变化现象明显等优越的性能在众多环境敏感性材料中脱颖而出。螺吡喃通过一个SP³杂化的螺碳原子联结的两个芳环相互正交，不产生分子的结构共轭，形成无色闭环体(常用SP表示)，在受到紫外光激发后，分子中的螺氧键发生异裂及电子的组态发生异构化或重排，变为两个环系的共平面式的有色开环体(常用MC表示)，整个分子形成一个大的共轭平面。如果无色闭环体受到酸的刺激则会形成另一个大的共轭平面的质子化有色开环体形式(常用MEH表示)。这两种开环体在可见光照射后又可以回到初始的无色闭环体形式。其开环体形式具有窄的荧光发射峰、能够与细胞背景荧光(395-479nm)分开以及优异的染色性能，已广泛应用于有机光电器件、激光染料以及生物荧光探针领域。

基于其优越的环境敏感性能，人们开始致力于设计一系列酸碱敏感的螺吡喃pH值探针。但由于没有引入合适的取代基团，之前报道的螺吡喃pH值探针往往只能在pH值范围内表现出一个缓慢的渐变响应，没有快速变化的开关式的响应。而在生物pH值检测中，由于生物体内的pH值调控十分精确，能否在特定的pH值具有开关式的响应变化成为了决定一个pH值荧光探针好坏的至关重要的因素。再者，在极酸和极碱的区间这两个的pH值范围响应的荧光探针，由于其在胃病治疗和智能材料方面的广泛需求和此类pH值探针的极少报道和开发而变得十分珍贵。因此，发明一种在特定pH值具有开关式响应的螺吡喃类探针，尤其是极酸/极碱范围的开关响应，对于生物医药领域如细胞标记、药物载体、基因载体等以及智能材料领域具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种化学稳定性好、结构可设计的具有在极酸/极碱环境内开关式响应的螺吡喃类荧光小分子pH探针，并将其应用于极端微生物标记。

本发明所述的具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针的结构式为:

上述具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针在pH值<1.0呈现红色荧光，pH值1.0-12.0之间没有荧光，pH值>12.0呈现蓝绿色荧光。

上述具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针的具体制备步骤为:

1)冰浴下将40-50mmol三氯氧磷缓慢滴加到1-2mL二甲基甲酰胺中，撤去冰浴，在氮气氛围下室温搅拌20-40分钟，然后滴入4-20mL的2,7-二甲氧基萘二氯甲烷溶液，其中2,7-二甲氧基萘为4-15mmol,室温下反应10-24h；反应完成后将反应液滴加入冰水混合液中，水解2-10h后用二氯甲烷萃取，然后蒸干溶剂二氯甲烷，最后用甲醇重结晶得到2,7-二甲氧基-1-醛基萘；

2)将2-7mmol的三溴化硼在0℃下缓慢滴加入5-20mL的2,7-二甲氧基-1-醛基萘的二氯甲烷溶液中，其中2,7-二甲氧基-1-醛基萘为0.2-7mmol,氮气氛围下室温搅拌5-12h；反应结束后，将反应液滴加入水中，用碳酸氢钠调节pH值到5，用氯仿萃取有机相，然后倒入乙醚得到沉淀，过滤除去沉淀，上清液加入正己烷，过滤收集黄色沉淀，即为羟基官能化的中间体；

3)将1-5mmol3-甲基-2-丁酮滴入5-15ml羧基苯肼盐酸盐的乙酸溶液中，其中羧基苯肼盐酸盐为1-5mmol,氮气氛围下回流反应10-24h；反应结束后将反应液加入40-70mL水中，用碳酸氢钠饱和溶液将体系pH值调节到5,用二氯甲烷萃取，有机相除去溶剂二氯甲烷后用丙酮洗涤得到黄色固体，即为羧基官能化的吲哚；

4)将步骤3)得到的羧基官能化的吲哚2-4mmol和4-溴甲基苯甲酸2-4mmol溶解在5-15mL乙腈中，氮气氛围下回流反应10-24h后，向反应液中加入乙醚，过滤得到粉色沉淀，即为季胺化的吲哚盐；

5)将步骤2)得到的羟基官能化的中间体0.5-2.5mmol和步骤4)得到的季胺化的吲哚盐0.5-2.5mmol溶解在5-15mL乙醇中，加入0.5-2mL吡啶催化，氮气氛围下回流反应5-10h后，向反应液加入乙醚，生成的沉淀过滤除去，滤液旋蒸浓缩后加入正己烷，得到粉红色沉淀，即为具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针。

将上述制备的具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针应用于生物标记。

本发明合成的具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针是带有2个羧基和一个酚羟基的萘环螺吡喃，吲哚环六位和季胺化处的苯羧官能团稳定了开环结构，使得具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针的MEH形态只在pH值<1.0触发，其在极酸条件下有个无荧光到红色荧光的转变；2个羧基和一个带酸性的酚羟基改变具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针闭环体的pKa值，实现了其在极碱pH值的开关变化，从无色到蓝绿色荧光的转变。

本发明具有如下有益效果:

1.通过设计新的螺吡喃pH值荧光核分子，通过对螺吡喃的3个位点进行修饰，合成出了具有极酸/极碱pH值可逆式开关式响应的螺吡喃pH值探针，其pH响应具有快，准，可逆等优点。该类大分子还具有良好的光、热、化学稳定性、结构可设计性、优异的生物相容性、细胞标记性等特性，对于螺吡喃类极酸/极碱响应的设计合成还属首次。

2.本发明制备得到的螺吡喃荧光小分子具有很好的生物相容性，且可以顺利地进入细菌内进行生物标记。实验证明，合成的螺吡喃荧光分子在生物体内可以实现和溶液中相同的极酸/极碱响应。标记细菌的同时，在两个极度pH值范围内显示出两种不同荧光的开关式响应。合成的螺吡喃安全低毒、可作为多功能细胞荧光标记染料应用于生物医药领域的科学研究和基因诊断，可以很好地用于研究嗜极生物，具有很好的应用价值。

3.此外，该合成路线简化了以往合成及分离纯化步骤，缩减了合成时间，具有合成简便、效率高、产品纯化简单等优点。

附图说明

图1实施例1中合成具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针C的反应流程图。

图2实施例1中具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针C在pH＝1-6的紫外吸收图。

图3实施例1中具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针C在pH＝7-13的紫外吸收图。

图4实施例1中具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针C在pH＝1-13的荧光发射图。

图5实施例1中具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针C在极酸极碱条件下的响应表观图，其中上图在可见光下，下图在紫外灯下。

图6实施例1中具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针C进入活细菌后荧光成像图；图A-D是具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针C与活大肠杆菌一起培养12h后的荧光成像图，A-D的培养环境分别是pH＝1.0,3.0,5.0,7.0；E-G是具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针C与活体细胞一起培养12h后的荧光成像图,E-G的培养环境分别是pH＝8.0,11.0,12.0,13.0。

图7：具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针的极酸极碱响应机理图。

具体实施方式

实施例1

1)冰浴下将43.3mmol三氯氧磷缓慢滴加到1.5mL二甲基甲酰胺中，撤去冰浴，在氮气氛围下室温搅拌30分钟，然后滴入10mL的2,7-二甲氧基萘的二氯甲烷溶液，其中2,7-二甲氧基萘为5.3mmol室温下反应10h；反应完成后将反应液滴加入冰水混合液中，水解3h后用二氯甲烷萃取，然后蒸干溶剂二氯甲烷，最后用甲醇重结晶得到白色针状结晶2,7-二甲氧基-1-醛基萘，记为AO，产率78％；

¹H NMR(CDCl₃,400MHz,ppm):δ10.90(s,1H,CHO),8.85(d,1H,ArH),7.98(d,1H,ArH),7.66(d,1H,ArH),7.12(d,1H,ArH),7.07(dd,1H,ArH),4.08(s,3H,OCH₃),3.98(s,3H,OCH₃).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ192.07,164.86,161.52,137.37,133.52,129.74,124.03,117.42,115.70,109.25,103.46,56.42,55.44.

2)将3.69mmol三溴化硼在0℃下缓慢滴加入10mL的2,7-二甲氧基-1-醛基萘的二氯甲烷溶液中，其中2,7-二甲氧基-1-醛基萘为0.46mmol，氮气氛围下室温搅拌10h；反应结束后，将反应液滴加入水中，用碳酸氢钠调节pH值到5，用氯仿萃取有机相，然后倒入乙醚得到沉淀，过滤除去沉淀，上清液加入正己烷，过滤收集黄色沉淀，即为羟基官能化的中间体，记为A1,产率80％；

¹H NMR(CDCl₃,400MHz,ppm):δ13.17(1H,s,-OH),10.67(1H,s,-CHO),7.88(1H,d,-ArH),7.68(2H,d,-ArH),6.98(2H,d,-ArH),5.33(1H,s,-OH).¹³C NMR(101MHz,Acetone):δ194.80,166.25,159.42,140.03,136.21,132.17,123.63,116.79,116.07,111.60,103.19.FAB-MS:m/z calcd for C₁₁H₇O₃,187.0395；found,187.0398(M-H⁺)

3)将1.98mmol的3-甲基-2-丁酮滴入10mL的羧基苯肼盐酸盐乙酸溶液中，其中羧基苯肼盐酸盐为1.32mmol,氮气氛围下回流反应12h；反应结束后将反应液加入50mL水中，用碳酸氢钠饱和溶液将体系pH值调节到5，用二氯甲烷萃取，有机相除去溶剂二氯甲烷后用丙酮洗涤得到黄色固体，即为羧基官能化的吲哚，记为B0，产率70％；

¹H NMR(400MHz,MeOD):δ8.06(dq,J＝3.3,1.5Hz,2H),7.53(d,J＝8.5Hz,1H),4.93(s,3H),1.38(s,6H).¹³C NMR(101MHz,MeOD):δ194.71,169.82,157.77,147.16,131.37,129.33,124.24,120.00,55.23,23.09.FAB-MS:m/z calcd for C₁₂H₁₄NO₂,204.1025；found,204.1035(M+H⁺)。

4)将步骤3)得到的羧基官能化的吲哚2.46mmol和4-溴甲基苯甲酸2.7mmol溶解在10ml乙腈中，氮气氛围下回流反应12h后，向反应液中加入乙醚，过滤得到粉色沉淀，即为季胺化的吲哚盐，记为B1,产率80％；

¹H NMR(400MHz,MeOD):δ1.76(s,6H),6.00(s,2H),7.51(s,2H),7.88(s,1H),8.09(s,2H),8.25(s,1H),8.44(s,1H).¹³C NMR(150MHz,MeOD):δ201.84,167.32,166.48,144.29,142.23,135.98,132.63,131.49,130.74,130.49-130.11(m),127.00,124.49,115.79,55.28,51.11,21.42,16.98.FAB-MS:m/z calcd for[M-2H-Br]-,336.1223；found,336.1219。

5)将步骤2)得到的羟基官能化的中间体0.69mmol和步骤4)得到的季胺化的吲哚盐0.69mmol溶解在10mL乙醇中，加入1mL吡啶催化，氮气氛围下回流反应10h后，向反应液加入乙醚，生成的沉淀过滤除去，滤液旋蒸浓缩后加入正己烷，得到粉红色沉淀，即为具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针，记为C，产率60％，结构式为：

¹H NMR(400MHz,MeOD):δ7.96(d,J＝8.1Hz,2H),7.81(d,J＝11.8Hz,2H),7.62(d,J＝8.8Hz,1H),7.58(d,J＝4.0Hz,1H),7.55(s,1H),7.41(d,J＝8.1Hz,2H),7.32(s,1H),6.94(d,J＝8.8Hz,1H),6.74(d,J＝8.8Hz,1H),6.34(d,J＝8.2Hz,1H),5.91(d,J＝10.4Hz,1H),4.68(d,J＝17.1Hz,1H),4.38(d,J＝17.0Hz,1H),2.03(s,1H),1.39(d,J＝22.8Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,MeOD):δ170.46,169.69,157.88,153.71,152.67,145.59,138.21,132.97,132.25,131.50,131.32,131.10,130.72,127.91,127.14,125.35,124.53,122.56,117.07,116.72,114.82,110.45,107.54,105.95,104.04,52.53,32.75,26.47,23.71,20.50,14.45.FAB-MS:m/z calcd for C₃₁H₂₄NO₆,506.1604；found,506.1622(M-H⁺)。

活体细菌摄取实验：

将合成的螺吡喃小分子C用5％二甲基亚砜(DMSO)水溶液溶解后，再分别用pH＝1.0,3.0,5.0,7.0,9.0,11.0,12.0,13.0的缓冲溶液稀释20倍制备成标记溶液。选择特定pH值范围内的标记溶液分别对活体大肠杆菌(pH＝1.0-7.0)和活体枯草芽孢杆菌(pH＝9.0-13.0)进行培养，发现螺吡喃小分子C不仅能进入活体细菌，而且表现出良好的生物相容性，并且能够在活体内显示出良好的pH值响应，不同pH值表现出不同的荧光颜色(pH值＝1.0红色荧光，pH＝12.0和13.0蓝绿色荧光，其他pH值无色荧光)。

细菌摄取实验表明，螺吡喃小分子C能够很快的穿透细胞膜及具有很好的标记的能力，并且可以得到和在溶液体系里相同的极酸碱pH的双色荧光响应。

Claims

1.一种具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针，其特征在于，其结构式为:

2.根据权利要求1所述的具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针，其特征在于，其在pH值<1.0呈现红色荧光，pH值1.0-12.0之间没有荧光，pH值>12.0呈现蓝绿色荧光。

3.根据权利要求1所述的具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，其具体制备步骤为:

1)冰浴下将40-50mmol氯氧磷缓慢滴加到1-2mL二甲基甲酰胺中，撤去冰浴，在氮气氛围下室温搅拌20-40分钟，然后滴入4-20mL的2,7-二甲氧基萘的二氯甲烷溶液，其中2,7-二甲氧基萘为4-15mmol，室温下反应10-24h；反应完成后将反应液滴加入冰水混合液中，水解2-10h后用二氯甲烷萃取，然后蒸干溶剂二氯甲烷，最后用甲醇重结晶得到2,7-二甲氧基-1-醛基萘；

2)将2-7mmol三溴化硼在0℃下缓慢滴加入5-20mL的2,7-二甲氧基-1-醛基萘的二氯甲烷溶液中，其中2,7-二甲氧基-1-醛基萘为0.2-7mmol，氮气氛围下室温搅拌5-12h；反应结束后，将反应液滴加入水中，用碳酸氢钠调节pH值到5，用氯仿萃取有机相，然后倒入乙醚得到沉淀，过滤除去沉淀，上清液加入正己烷，过滤收集黄色沉淀，即为羟基官能化的中间体；

3)将1-5mmol 3-甲基-2-丁酮滴入5-15ml羧基苯肼盐酸盐的乙酸溶液中，其中羧基苯肼盐酸盐为1-5mmol，氮气氛围下回流反应10-24h；反应结束后将反应液加入40-70mL水中，用碳酸氢钠饱和溶液将体系pH值调节到5，用二氯甲烷萃取，有机相除去溶剂二氯甲烷后用丙酮洗涤得到黄色固体，即为羧基官能化的吲哚；

4.根据权利要求3所述的方法制备得到的具有极酸/极碱开关响应的螺吡喃小分子荧光探针在生物标记中的应用。