CN109655507A - 检测心肌肌钙蛋白i的电化学检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物型传感器制造技术领域，具体的说是一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒及其制备方法，其特征在于自下而上依次设有基座、电极层、上盖，其中基座上开设用于安装电极的限位槽，所述限位槽的轮廓为具有一个缺口的圆环形；所述电极层呈一端具有圆形膨大部的长条状，圆形膨大部的外径小于等于基座上限位槽的内径，条形部的宽度小于等于限位槽的缺口宽度，所述电极层设有PET基层，PET基层上设置工作电极、参比电极和对电极，其中工作电极为圆形且位于圆形膨大部的中心，参比电极和对电极为等径的弧形，参比电极和对电极设置在工作电极外侧，工作电极、参比电极、对电极分别经银导线向外输出信号且位于条形部的PET基层上。
Description
技术领域：
本发明涉及生物型传感器制造技术领域，具体的说是一种利用心肌肌钙蛋白I结合相应的抗体，利用层层修饰阻碍电子的传递而产生的电流信号强度的差异，来判断待测样品中心肌肌钙蛋白I的含量，从而实现对其的灵敏检测的检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
心肌肌钙蛋白(cTn)是心肌肌肉收缩的调节蛋白。cTn是由三种不同基因的亚基组成：心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTn I)和肌钙蛋白C(TnC)。目前，用于ACS实验室诊断的是cTnT和cTnI。正常情况下外周血cTnI的水平很低：(0-0.3μg/L)，急性心肌埂塞发作后，由于其分子量小，很快释放人血，浓度迅速升高。
目前已有的蛋白检测方法很多，但是大多数都是需要大型设备和专业的操作人员。电化学技术，因其可以实现在线监测等特点，能够适用于不同环境下的测试。因此，基于电化学生物传感器策略的检测能够达到良好的效果。
免疫传感器是基于分子识别与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过抗体-抗原之间特异性识别而组建，使得它具有高灵敏度、高选择性、分析快速和操作简便等优点。
目前用于检测心肌肌钙蛋白I的含量的免疫传感器存在结构不合理、灵敏度低等问题。
发明内容：
本发明针对现有技术中存在的缺点和不足，提出了一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒及其制备方法。
本发明可以通过以下措施达到：
一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒，其特征在于自下而上依次设有基座、电极层、上盖，其中基座上开设用于安装电极的限位槽，所述限位槽的轮廓为具有一个缺口的圆环形；所述电极层呈一端具有圆形膨大部的长条状，圆形膨大部的外径小于等于基座上限位槽的内径，条形部的宽度小于等于限位槽的缺口宽度，所述电极层设有PET基层，PET基层上设置工作电极、参比电极和对电极，其中工作电极为圆形且位于圆形膨大部的中心，参比电极和对电极为等径的弧形，参比电极和对电极设置在工作电极外侧，工作电极、参比电极、对电极分别经银导线向外输出信号且位于条形部的PET基层上；所述上盖上开设样品加样孔，样品加样孔的下侧沿样品加样孔设置环形凸台，且环形凸台的下端面上开设与限位槽相嵌合的卡槽，上盖的样品加样孔经卡槽与基座上的限位槽嵌合；所述工作电极上修饰心肌肌钙蛋白I抗体。
本发明中基座呈条形，限位槽设置在基座的一端，基座的另一端设置检测插口，电极层的条形部的末端与检测插口相连，上盖也呈条形，基座内壁和上盖内壁可以对应设有相配合的扣槽和卡扣，便于上盖与基座扣合为一体。
本发明中所述电极层的PET基层厚度为0.3mm，工作电极、对电极、参比电极均通过丝网印刷印刷配置，工作电极的直径为3mm，银导线以及对电极、参比电极带宽为1mm。
本发明所述电极层的条形部的宽度为7mm，使用时将样品溶液滴入样品加样孔，由于上盖上样品加样孔的下侧沿样品加样孔设置环形凸台，且环形凸台的下端面上开设与限位槽相嵌合的卡槽，上盖与基座能够将样品限制在电极层对应的圆形区域内，目标物抗原与工作电极表面的抗体结合，发生界面反应，进行电化学检测，产生电流信号。
本发明所述基座中限位槽内的圆形区域具有外凸的上表面，用于进一步延展电极层，并起到引导样品溶液均匀分布的作用，使电极层能够与样品充分接触。
本发明还提出了一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：印刷工作电极，印刷烘干之后，分别在超纯水、乙醇、超纯水中，对印刷电极进行超声清洗；氮气吹干，备用；
步骤2：将聚苯胺纳米材料通过恒电流法电沉积到印刷电极中工作电极的介面，聚沉液组成为1.0M HClO 4，0.01-0.8M苯胺和2μg mL-1聚苯乙烯磺酸钠，电沉积步骤具体为：电流密度0.1mA cm-2，沉积时间为0.5-2h，制备的电极被表示为聚苯胺印刷电极；
步骤3：将制备的聚苯胺印刷电极在60μL的PBS混合溶液中室温浸泡0.5-2小时，其中PBS为磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐的浓度为0.2M，缓冲液的PH值为5.4-8.4，PBS混合溶液内含有0.4M EDC,0.1M NHS,和10μg mL-1心肌肌钙蛋白I抗体，从而将心肌肌钙蛋白I抗体成功修饰到聚苯胺纳/印刷电极表面，心肌肌钙蛋白I抗体/聚苯胺修饰电极用PBS缓冲溶液清洗后保存在PBS缓冲溶液中；
步骤4：滴加10-20μL的一系列不同浓度的心肌肌钙蛋白I溶液至心肌肌钙蛋白I抗体/聚苯胺/印刷电极表面，室温孵育5-20分钟，超纯水和PBS冲洗，制得一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学生物传感器。
本发明中印刷电极包括工作电极、参比电极和对电极经过如下步骤实现：
步骤1-1：用二次水将PET基底清洗干净，晾干，100℃烘箱烘干1h；冷却后备用，防止高温变形，使其精密度下降；
步骤1-2：使用601CA-PET-612型银浆进行1号涂层，导线以及参比电极的印刷；
步骤1-3：使用801SS-PET型碳浆进行2号涂层即对电极的印刷，使用新型掺杂碳浆进行3号图层即工作电极的印刷，网版参数为网目250目，膜厚30微米，绷网张力20N，网版与水平工作台距离3mm，印刷时刮刀与水平面成35°角，依此完成碳浆层，银浆层，绝缘层的印刷和套印，其中1号，2号图层固化温度都是50摄氏度，3号图层固化温度为37摄氏度，固化时间分别是1号涂层固化45min，2号涂层固化60min，3号涂层固化120min；
步骤1-4：将印刷完成的PET基底上的每个电极裁成所需形状，与基底层配套安装在圆形槽上。
本发明采用导电聚合物聚苯胺纳米材料为基底材料，利用心肌肌钙蛋白I结合相应的抗体，利用层层修饰阻碍电子的传递而产生的电流信号强度的差异，来判断待测样品中心肌肌钙蛋白I的含量，从而实现对其的灵敏检测。利用聚苯胺自身的氧化还原电信号进行信号输出，增强了传感器的灵敏度，扩宽了线性范围，有效地降低了传感器的检出限，实现了对心肌肌钙蛋白I的灵敏分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，有效克服了目前心肌肌钙蛋白I检测方法的不足。
附图说明：
附图1是本发明的分解结构示意图。
附图2是本发明基座和电极层的结构示意图。
附图3是本发明上盖的仰视图。
附图4是本发明中电极层的结构示意图。
附图5是本发明中电化学沉积导电聚合物聚苯胺的扫描电镜图。
附图6是本发明中电化学沉积导电聚合物聚苯胺的傅里叶红外图。
附图7是本发明中由裸印刷电极-聚苯胺印刷电极-cTnI抗体聚苯胺印刷电极-结合目标物cTnI的电化学信号表征曲线图。
附图8是本发明中抗体孵育时间优化曲线图。
附图标记：基座1、电极层2、上盖3、限位槽4、工作电极5、参比电极6、对电极7、银导线8、样品加样孔9、环形凸台10、卡槽11、检测插口12、PET基层13。
具体实施方式：
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
如附图所示，本发明提出了一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒，其特征在于自下而上依次设有基座1、电极层2、上盖3，其中基座1上开设用于安装电极的限位槽4，所述限位槽4的轮廓为具有一个缺口的圆环形；所述电极层2呈一端具有圆形膨大部的长条状，圆形膨大部的外径小于等于基座1上限位槽4的内径，条形部的宽度小于等于限位槽4的缺口宽度，所述电极层2设有PET基层13，PET基层13上设置工作电极5、参比电极6和对电极7，其中工作电极5为圆形且位于圆形膨大部的中心，参比电极6和对电极7为等径的弧形，参比电极6和对电极7设置在工作电极5外侧，工作电极5、参比电极6、对电极7分别经银导线8向外输出信号且位于条形部的PET基层13上；所述上盖3上开设样品加样孔9，样品加样孔9的下侧沿样品加样孔设置环形凸台10，且环形凸台10的下端面上开设与限位槽4相嵌合的卡槽11，上盖3的样品加样孔9经卡槽11与基座1上的限位槽4嵌合；所述工作电极上5修饰心肌肌钙蛋白I抗体。
本发明中基座1呈条形，限位槽4设置在基座的一端，基座1的另一端设置检测插口12，电极层2的条形部的末端与检测插口12相连，上盖3也呈条形，基座1内壁和上盖3内壁可以对应设有相配合的扣槽和卡扣，便于上盖3与基座1扣合为一体。
本发明中所述电极层2的PET基层13厚度为0.3mm，工作电极5、对电极7、参比电极6均通过丝网印刷印刷配置，工作电极5的直径为3mm-5mm，银导线以及对电极、参比电极带宽为0.5-1mm，银导线间距为0.5mm-1mm。
本发明所述电极层的条形部的宽度为7mm，使用时将样品溶液滴入样品加样孔，由于上盖上样品加样孔的下侧沿样品加样孔设置环形凸台，且环形凸台的下端面上开设与限位槽相嵌合的卡槽，上盖与基座能够将样品限制在电极层对应的圆形区域内，目标物抗原与工作电极表面的抗体结合，发生界面反应，进行电化学检测，产生电流信号。
本发明所述基座中限位槽内的圆形区域具有外凸的上表面，用于进一步延展电极层，并起到引导样品溶液均匀分布的作用，使电极层能够与样品充分接触。
实施例1：
本发明还提出了一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：印刷工作电极，分别在超纯水、乙醇、超纯水中，对印刷电极进行超声清洗；氮气吹干，备用；
步骤2：将聚苯胺纳米材料通过恒电流法电沉积到印刷电极中工作电极的介面，聚沉液组成为1.0M HClO 4，0.5M苯胺和2μg mL-1聚苯乙烯磺酸钠，电沉积步骤具体为：电流密度0.1mA cm-2，沉积时间为1小时，制备的电极被表示为聚苯胺/印刷电极；
步骤3：将制备的聚苯胺/印刷电极在60μL PBS(0.2M,pH 7.4)混合溶液(内含有：0.4M EDC,0.1M NHS,和10μg mL-1心肌肌钙蛋白I抗体)中室温浸泡一个小时，从而将心肌肌钙蛋白I抗体成功修饰到聚苯胺纳/印刷电极表面，心肌肌钙蛋白I抗体/聚苯胺修饰电极用PBS(0.2M,pH 7.4)缓冲溶液清洗后保存在PBS(0.2M,pH7.4)缓冲溶液中；
步骤4：滴加10-20μL的一系列不同浓度的心肌肌钙蛋白I溶液至心肌肌钙蛋白I抗体/聚苯胺/印刷电极表面，室温孵育10分钟，超纯水和PBS(0.2M,pH 7.4)冲洗，制得一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学生物传感器。
在使用时，使用电化学工作站进行测试，实验采用印刷电极三电极体系，印刷银导线宽度为1mm，导线间距为1mm，工作电极直径4mm，取75微升样品滴加到试剂盒凹槽，进行10分钟孵化，用移液器移走样品，滴加75微升0.2M、pH 7.4的磷酸缓冲盐(PBS)溶液进行测试；电化学测试方法为差分脉冲伏安法模式，具体测试参数其电压测试范围为-0.4-0.4V，电压增量为4mV，振幅为50mV，脉冲周期为0.5s，测量心肌肌钙蛋白I孵化后的峰电流值，然后记录电流，对照标准曲线获取样品中心肌肌钙蛋白I的浓度。
本发明相对于现有技术，灵敏度高、特异性好、重现性高、稳定好、操作简单、成本低、小型化和快速等特点，能够适用于不同环境下的测试，在急性心肌梗塞(AMI)诊断有重要价值和参考意义，对其检测具有重要的临床意义。
Claims (8)
1.一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒，其特征在于自下而上依次设有基座、电极层、上盖，其中基座上开设用于安装电极的限位槽，所述限位槽的轮廓为具有一个缺口的圆环形；所述电极层呈一端具有圆形膨大部的长条状，圆形膨大部的外径小于等于基座上限位槽的内径，条形部的宽度小于等于限位槽的缺口宽度，所述电极层设有PET基层，PET基层上设置工作电极、参比电极和对电极，其中工作电极为圆形且位于圆形膨大部的中心，参比电极和对电极为等径的弧形，参比电极和对电极设置在工作电极外侧，工作电极、参比电极、对电极分别经银导线向外输出信号且位于条形部的PET基层上；所述上盖上开设样品加样孔，样品加样孔的下侧沿样品加样孔设置环形凸台，且环形凸台的下端面上开设与限位槽相嵌合的卡槽，上盖的样品加样孔经卡槽与基座上的限位槽嵌合；所述工作电极上修饰心肌肌钙蛋白I抗体。
2.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒，其特征在于基座呈条形，限位槽设置在基座的一端，基座的另一端设置检测插口，电极层的条形部的末端与检测插口相连，上盖也呈条形，基座内壁和上盖内壁可以对应设有相配合的扣槽和卡扣，便于上盖与基座扣合为一体。
3.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒，其特征在于所述电极层的PET基层厚度为0.3mm，工作电极、对电极、参比电极均通过丝网印刷印刷配置，工作电极的直径为3mm，银导线以及对电极、参比电极带宽为1mm。
4.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒，其特征在于所述电极层的条形部的宽度为7mm，使用时将样品溶液滴入样品加样孔，由于上盖上样品加样孔的下侧沿样品加样孔设置环形凸台，且环形凸台的下端面上开设与限位槽相嵌合的卡槽，上盖与基座能够将样品限制在电极层对应的圆形区域内，目标物抗原与工作电极表面的抗体结合，发生界面反应，进行电化学检测，产生电流信号。
5.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒，其特征在于所述基座中限位槽内的圆形区域具有外凸的上表面。
6.一种如权利要求1-5中任意一项所述的检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：印刷工作电极，印刷烘干之后，分别在超纯水、乙醇、超纯水中，对印刷电极进行超声清洗；氮气吹干，备用；
步骤2：将聚苯胺纳米材料通过恒电流法电沉积到印刷电极中工作电极的介面，聚沉液组成为 1.0 M HClO 4， 0.01-0.8M苯胺和2 μg mL-1聚苯乙烯磺酸钠，电沉积步骤具体为：电流密度0.1 mA cm -2，沉积时间为0.5-2h，制备的电极被表示为聚苯胺印刷电极；
步骤3：将制备的聚苯胺印刷电极在60 μL的PBS混合溶液中室温浸泡0.5-2小时，其中PBS为磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐的浓度为0.2M，缓冲液的PH值为5.4-8.4，PBS混合溶液内含有0.4 M EDC, 0.1 M NHS,和10 μg mL -1心肌肌钙蛋白I抗体，从而将心肌肌钙蛋白I抗体成功修饰到聚苯胺纳/印刷电极表面，心肌肌钙蛋白I抗体/聚苯胺修饰电极用PBS缓冲溶液清洗后保存在PBS 缓冲溶液中；
步骤4：滴加10-20 μL的一系列不同浓度的心肌肌钙蛋白I溶液至心肌肌钙蛋白I抗体/聚苯胺/印刷电极表面，室温孵育5-20分钟，超纯水和PBS冲洗，制得一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学生物传感器。
7.根据权利要求6所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒的制备方法，其特征在于印刷电极包括工作电极、参比电极和对电极经过如下步骤实现：
步骤1-1：用二次水将PET基底清洗干净，晾干，100℃烘箱烘干1h；冷却后备用，防止高温变形，使其精密度下降；
步骤1-2：使用601CA-PET-612型银浆进行1号涂层，导线以及参比电极的印刷；
步骤1-3：使用801SS-PET型碳浆进行2号涂层即对电极的印刷，
使用新型掺杂碳浆进行3号图层即工作电极的印刷，网版参数为网目250目，膜厚30微米，绷网张力20N，网版与水平工作台距离3mm，印刷时刮刀与水平面成35°角，依此完成碳浆层，银浆层，绝缘层的印刷和套印，其中1号，2号图层固化温度都是50摄氏度，3号图层固化温度为37摄氏度，固化时间分别是1号涂层固化45min，2号涂层固化60min，3号涂层固化120min；
步骤1-4：将印刷完成的PET基底上的每个电极裁成所需形状，与基底层配套安装在圆形槽上。
8.根据权利要求6所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学检测试剂盒的制备方法，其特征在于工作电极由如下步骤制成：
步骤1：印刷工作电极，分别在超纯水、乙醇、超纯水中，对印刷电极进行超声清洗；氮气吹干，备用；
步骤2：将聚苯胺纳米材料通过恒电流法电沉积到印刷电极中工作电极的介面，聚沉液组成为 1.0 M HClO 4，0.5 M苯胺和2 μg mL-1聚苯乙烯磺酸钠，电沉积步骤具体为：电流密度0.1 mA cm -2，沉积时间为1小时，制备的电极被表示为聚苯胺/印刷电极；
步骤3：将制备的聚苯胺/印刷电极在60 μL PBS混合溶液中室温浸泡一个小时，从而将心肌肌钙蛋白I抗体成功修饰到聚苯胺纳/印刷电极表面，心肌肌钙蛋白I抗体/聚苯胺修饰电极用PBS 缓冲溶液清洗后保存在PBS缓冲溶液中，其中PBS混合溶液内含有：0.4 M EDC,0.1 M NHS, 和10 μg mL -1心肌肌钙蛋白I抗体，PBS为0.2 M, pH 7.4；
步骤4：滴加10-20 μL的一系列不同浓度的心肌肌钙蛋白I溶液至心肌肌钙蛋白I抗体/聚苯胺/印刷电极表面，室温孵育10分钟，超纯水和PBS冲洗，制得一种检测心肌肌钙蛋白I的电化学生物传感器。
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Denomination of invention: Electrochemical detection kit for detecting myocardial Troponin I and its preparation method Effective date of registration: 20230628 Granted publication date: 20201124 Pledgee: Weihai Branch of Bank of Communications Co.,Ltd. Pledgor: WEIHAI NEOPROBIO. CO.,LTD. Registration number: Y2023980046073 |
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