CN109651465A - 一种多拉菌素的纯化工艺 - Google Patents

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冯红霞
张葵
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CHONGQING DAXIN PHARMACEUTICAL Co Ltd
Peking University Founder Group Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种多拉菌素的纯化工艺。所述纯化工艺包括：(1)压滤：向多拉菌素发酵液中加入絮凝剂，压滤，得到菌渣；(2)萃取、浓缩：利用有机溶剂对菌渣进行萃取，得到萃取液A；将萃取液A浓缩得到膏状物，将膏状物降温至30℃以下；(3)浸膏萃取：向膏状物中加入有机溶剂，搅拌，得到萃取液B；(4)分层：向萃取液B中加水搅拌，静置，分层，将上层液浓缩，降温抽滤，得到粗品A；(5)重结晶：利用有机溶剂对粗品A进行重结晶，降温，抽滤，得到湿晶体；干燥，得到多拉菌素成品。本发明的优点在于通过各步骤的结合和相互作用，可得到高纯度、高收率的多拉菌素。该工艺简单易行，安全性更高，适用于工业化推广。

Description

一种多拉菌素的纯化工艺
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，具体涉及一种多拉菌素的纯化工艺。
背景技术
多拉菌素为新型、广谱抗寄生虫药，对胃肠道线虫、肺线虫、螨、蜱和伤口蛆等均有高效，用于治疗家畜线虫病和螨病等体外寄生虫病，主要适用于牛和猪。
现有技术公开了多拉菌素的几种纯化方法，如CN104693254A公开了一种多拉菌素的分离方法，其将发酵液经过浸提、浓缩、打浆、结晶等步骤，得到高纯度的多拉菌素。该方法收率较好，步骤简单，但打浆过程中会产生很多母液，此母液杂质甚多，非常难于回收。
CN108976270A公开了一种高纯度多拉菌素的制备方法，该方法将发酵液浸泡、分离，通过超滤膜进行纯化，再通过两次逆流萃取，得到萃取液通过浓缩结晶。该方法使用溶剂均可通过较简单方式回收利用，但存在所使用的甲苯、正庚烷等溶媒危险度高，实际操作不方便，且使用超纳滤膜成本高等缺陷。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供一种新的多拉菌素的纯化工艺，通过压滤、萃取、浓缩、浸膏萃取、结晶等步骤的结合和相互作用，可得到高纯度、高收率的多拉菌素。该工艺简单易行，安全性更高，成本相对低廉，适用于工业化推广。
本发明的技术方案如下：
一种多拉菌素的纯化工艺，包括：
(1)压滤：向多拉菌素发酵液中加入絮凝剂，压滤，得到菌渣；
(2)萃取、浓缩：利用有机溶剂对菌渣进行萃取，得到萃取液A；将萃取液A浓缩得到膏状物，将膏状物降温至30℃以下；
(3)浸膏萃取：向膏状物中加入有机溶剂，搅拌，得到萃取液B；
(4)分层：向萃取液B中加水搅拌，静置，分层，将上层液浓缩，降温抽滤，得到粗品A；
(5)重结晶：利用有机溶剂对粗品A进行重结晶，降温，抽滤，得到湿晶体；干燥，得到多拉菌素成品。
下面对各步骤作进一步说明。
步骤(1)中，所述絮凝剂选自聚合氯化铝、硫酸锌、黄血盐；优选聚合氯化铝；其用量为每升发酵液加入5-10g絮凝剂，优选为每升发酵液加入5-7g絮凝剂；所述压滤选择板框压滤；所得菌渣的水分含量为35-45％，优选38-40％。
步骤(2)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或醋酸丁酯，优选甲醇，其加入量为每千克菌渣使用2-5L有机溶剂，优选3-4L有机溶剂，萃取时间为6-15h，优选8-12h。
步骤(3)中，所述有机溶剂为二氯甲烷、甲醇或乙醇；优选先加入二氯甲烷搅拌，再加入甲醇搅拌，其目的在于将色素杂质以及蛋白质杂质溶解于甲醇中，这样得到的二氯甲烷萃取液纯度更高；所述二氯甲烷的加入量为膏状物重量的4-6倍，优选4-5倍，搅拌30-40min；所述甲醇的加入量为膏状物重量的1-3倍，优选2-3倍，继续30-40min。
步骤(4)中，所述水的加入量为甲醇用量的10％-20％。为了获得更好的效果，所述下层液建议重复分层1-2次。所述浓缩可使用旋转蒸发器，浓缩温度为45℃-65℃。
步骤(5)中，所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙醇、丙酮，优选乙酸乙酯，用量为3-5ml/g，优选为3ml/g。具体重结晶的条件为：在55℃-60℃下溶解搅拌1-2h，然后自然降温结晶，降温至5-10℃，降温时间为6-12h。所述干燥为真空干燥，干燥温度为40℃-50℃，干燥时间为6-12h。抽滤，重复1-2次。
本申请所述方案与现有技术相比，优势在于采用溶媒萃取替代打浆，可以除掉大部分的蛋白杂质以及色素杂质，产生的母液量更少；而且，本发明重结晶采用的溶媒均是相对更安全的单一溶媒，生产更易控制且安全性更高。本发明所述的纯化工艺收率可达65％，比现有工艺提高了5％，且产品含量可达到95％以上，在工业化生产中已属于显著的技术提升。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供一种多拉菌素的纯化工艺，包括：
(1)向多拉菌素发酵液30L(发酵单位1115ug/ml)(33.5g)中加入210g聚合氯化铝，搅拌30分钟后，通过板框压滤，得到菌渣4.3kg；
(2)用12.9L醋酸丁酯萃取菌渣，搅拌10h，抽滤，得到12.8L萃取液(单位为2221ug/ml)(28.5g)；
(3)将萃取液在60℃下浓缩，得到膏状物；将膏状物降温至30℃以下，加入膏状物重量的4倍的二氯甲烷，搅拌半小时；
搅拌后加入膏状物重量的2倍的甲醇，继续搅拌半小时，然后加入甲醇用量的15％水搅拌；静置，分层，将上层液收集，下层液继续重复1次上述步骤(加二氯甲烷和甲醇)，将收集的两次或多次上层液合并，在50℃下浓缩，浓缩液降温抽滤，得到粗品A 41.9g，含量为64.5％(27.0g)。
(4)向粗品A中加入126ml乙酸乙酯，在55℃-60℃下溶解搅拌至粗品溶解完，趁热过滤出去少量不溶物，然后自然降温结晶，然后放置冰箱内降温至5-10℃，降温时间为6-12h。抽滤，得到湿晶体。
将湿晶体在真空度-0.9MPa、45℃下，干燥12h，得到成品含量22.4g，95.4％(21.5g)，总收率64.2％。
实施例2
本实施例提供一种多拉菌素的纯化工艺，包括：
(1)向多拉菌素发酵液28L(发酵单位1200ug/ml)(33.6g)中加入196g聚合氯化铝，搅拌30分钟后，通过板框压滤得到菌渣4.2kg；
(2)用12.6L乙醇萃取菌渣，搅拌10h，抽滤，得到12.5L萃取液(单位为2264ug/ml)(28.3g)；
(3)将萃取液在50℃下浓缩，得到膏状物，将膏状物降温至30℃以下，加入膏状物重量的4倍的二氯甲烷，搅拌半小时；搅拌后加入膏状物重量的2倍的甲醇，继续搅拌半小时，然后加入甲醇用量的15％水搅拌，静置，分层，将上层液收集，下层液继续重复1次以上步骤，将收集的上层液在50℃下浓缩，浓缩液降温抽滤得到粗品A 42.1g，含量为63.2％(26.6g)。
(4)向粗品A中加入126ml乙酸乙酯，在55℃下溶解搅拌至粗品溶解完，趁热过滤出去少量不溶物，然后自然降温结晶，然后放置冰箱内降温至5-10℃，降温时间为6-12h。抽滤，得到湿晶体。
将湿晶体在真空度-0.9MPa、45℃下，干燥12h，得到成品含量22.8g，96.0％(21.9g)，总收率65.2％。
实施例3
本实施例提供一种多拉菌素的纯化工艺，包括：
(1)向多拉菌素发酵液31L(发酵单位1180ug/ml)(36.6g)中加入155g聚合氯化铝,搅拌30分钟后，通过板框压滤，得到菌渣4.6kg；
(2)用13.8L甲醇萃取菌渣，搅拌12h，抽滤得到13L萃取液(单位为2362ug/ml)(30.7g)；
(3)将萃取液在50℃下浓缩得到膏状物，将膏状物降温至30℃以下，加入膏状物重量的4倍的二氯甲烷，搅拌半小时；搅拌后加入膏状物重量的2倍的甲醇，继续搅拌半小时，然后加入甲醇用量的15％水搅拌，静置，分层，将上层液收集，下层液继续重复1次以上步骤，将收集的上层液在50℃下浓缩，浓缩液降温，抽滤，得到粗品A41.9g,含量为68.3％(28.9g)；
(4)向粗品A中加入126ml乙酸乙酯，在55℃下溶解搅拌至粗品溶解完，趁热过滤出去少量不溶物，然后自然降温结晶，然后放置冰箱内降温至5-10℃，降温时间为6-12h。抽滤，得到湿晶体。
将湿晶体在真空度-0.9MPa、45℃下，干燥12h，得到成品含量25.3g，95.8％(24.2g)，总收率66.0％。
实施例4
本实施例提供一种多拉菌素的纯化工艺，包括：
(1)多拉菌素发酵液28L(发酵单位1020ug/ml)(28.6g)，按照实施例1得到粗品A36.1g，含量为63.2％(22.8g)；
(2)向粗品A中加入180ml乙醇，在55℃下溶解，搅拌，至粗品溶解完，趁热过滤出去少量不溶物，然后自然降温结晶，然后放置冰箱内降温至5-10℃，降温时间为6-12h。抽滤，得到湿晶体。
将湿晶体在真空度-0.9MPa、45℃下，干燥12h，得到成品含量19.6g，95.6％(18.7g)，总收率65.3％。
实施例5
本实施例提供一种多拉菌素的纯化工艺，包括：
(1)多拉菌素发酵液33L(发酵单位986ug/ml)(32.5g)。按照实施例1得到粗品A44.4g，含量为60.1％(26.7g)。
(2)向粗品A中加入230ml丙酮，在55℃下溶解搅拌至粗品溶解完，趁热过滤出去少量不溶物，然后自然降温结晶，然后放置冰箱内降温至5-10℃，降温时间为6-12h。抽滤，得到湿晶体。
将湿晶体在真空度-0.90MPa、45℃下，干燥12h，得到成品含量22.2g，94.9％(21.1g)，总收率64.9％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种多拉菌素的纯化工艺，其特征在于，包括：
(1)压滤：向多拉菌素发酵液中加入絮凝剂，压滤，得到菌渣；
(2)萃取、浓缩：利用有机溶剂对菌渣进行萃取，得到萃取液A；将萃取液A浓缩得到膏状物，将膏状物降温至30℃以下；
(3)浸膏萃取：向膏状物中加入有机溶剂，搅拌，得到萃取液B；
(4)分层：向萃取液B中加水搅拌，静置，分层，将上层液浓缩，降温抽滤，得到粗品A；
(5)重结晶：利用有机溶剂对粗品A进行重结晶，降温，抽滤，得到湿晶体；干燥，得到多拉菌素成品。
2.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，步骤(1)中，所述絮凝剂选自聚合氯化铝、硫酸锌、黄血盐；优选聚合氯化铝。
3.根据权利要求1或2所述的纯化工艺，其特征在于，步骤(1)中，所述絮凝剂的用量为每升发酵液加入5-10g絮凝剂，优选为每升发酵液加入5-7g絮凝剂。
4.根据权利要求1-3任一述的纯化工艺，其特征在于，步骤(2)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或醋酸丁酯，优选甲醇。
5.根据权利要求1-4任一述的纯化工艺，其特征在于，步骤(2)中，所述有机溶剂的加入量为每千克菌渣使用2-5L有机溶剂，优选3-4L有机溶剂。
6.根据权利要求1-5任一所述的纯化工艺，其特征在于，步骤(3)中，所述有机溶剂为二氯甲烷、甲醇或乙醇，优选先加入二氯甲烷搅拌，再加入甲醇搅拌。
7.根据权利要求1-6任一所述的纯化工艺，其特征在于，步骤(3)中，所述二氯甲烷的加入量为膏状物重量的4-6倍；
和/或，所述甲醇的加入量为膏状物重量的1-3倍。
8.根据权利要求1-7任一所述的纯化工艺，其特征在于，步骤(4)中，所述水的加入量为甲醇用量的10％-20％；
和/或，所述下层液重复分层1-2次；
和/或，所述浓缩温度为45℃-65℃。
9.根据权利要求1-8任一所述的纯化工艺，其特征在于，步骤(5)中，所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙醇、丙酮，优选乙酸乙酯；
和/或，所述有机溶剂的用量为3-5ml/g，优选为3ml/g。
10.根据权利要求1-9任一所述的纯化工艺，其特征在于，步骤(5)中，所述重结晶的条件为：在55℃-60℃下溶解搅拌，然后自然降温结晶，降温至5-10℃；
和/或，所述干燥温度为40℃-50℃。
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