CN104418927A

CN104418927A - 一种多拉菌素的分离纯化方法

Info

Publication number: CN104418927A
Application number: CN201310383711.7A
Authority: CN
Inventors: 袁建栋; 刘省伟; 郭明; 唐恒; 杨久林
Original assignee: Borui Bio-Medical Technology (jiangsu) Co Ltd; CHONGQING QIANTAI BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: Borui Bio-Medical Technology (jiangsu) Co Ltd; CHONGQING QIANTAI BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2013-08-29
Filing date: 2013-08-29
Publication date: 2015-03-18
Anticipated expiration: 2033-08-29
Also published as: CN104418927B

Abstract

本发明公开了一种多拉菌素的分离纯化方法。该方法包括通过浸提，将多拉菌素从发酵液中分离，然后通过活性炭脱色处理，结合程序降温结晶法等步骤，得到高纯度的多拉菌素产品。本发明的优点在于采用程序降温结晶法进行分离纯化多拉菌素，收率和纯度高，工艺简单易行，生产成本低，适合工业化生产。

Description

一种多拉菌素的分离纯化方法

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种多拉菌素的分离纯化方法。

背景技术

多拉菌素（Doramectin，DRM）是大环内酯类抗生素阿维菌素的第3代衍生物，由阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）基因工程变异株加入环已烷基羧酸后生物合成获得一种十六元大环内酯类半合成抗生素，与伊维菌素的差别在C₂₅位上具有环已烷基。化学名25-环己烷基-5-O-去甲基-25-去(1-甲基丙基)阿维菌素B1，其化学本质上属于大环内酷类抗生素，分子式为C₅₀H₇₄O₁₄,分子量为899.11，熔点：116℃-119℃，脂溶性高，易溶于有机溶剂，比如甲醇、乙醇、丙酮、1,2-丙二醇、乙酸乙脂、二甲基亚矾、乙酸异丙醋和己烷等，在水中溶解度低(0.0006－0.0009mg/L)；对酸敏感，如用稀酸处理，则可以引起C₁₃位上二糖基断开；对光敏感，用紫外线照射，可导致8，9和10，11之间双键异构化。其结构如下式I所示：

I

商品名为“通灭”（Dectomax®），于1993年于巴西和南非上市， 1997年通过FDA批准在美国上市。对牛、马、猪和骆驼的多种胃肠道线虫、体外节肢动物具有极佳的驱虫效果。与其它市售的伊维菌素类产品比较，其抗寄生虫范围广泛、体内血药浓度高，消除慢（多拉菌素半衰期5.7天，伊维菌素半衰期4.2天），药效维持时间长，无过敏反应等特性，是伊维菌素良好的替代药物。

现有文献主要集中在对多拉菌素生产菌株的改良以及多拉菌素制剂的研究，针对多拉菌素分离纯化的研究较少，文献“发酵液中多拉菌素的提取和萃取条件研究”（天然产物研究与开发，邹泽先等，2012年，110-113）公开了以甲醇为最佳提取试剂，浓缩提取液再经2倍体积乙酸乙酯萃取2次的方法对发酵液中的多拉菌素进行提取和萃取。文献“响应面法优化发酵液中多拉菌素的脱色工艺”（邹泽先等，中国抗生素杂志，2011年，36（12），第912~916页）公开了用甲醇做为提取试剂，采用活性炭进行脱色，活性炭的添加量为1.0%，脱色温度33℃，pH=3的工艺条件对发酵液中多拉菌素进行脱色处理，脱色率达到68.78%。文献“多拉菌素的分离纯化工艺及其微胶囊剂型的初步研究”（邹泽先，武汉工业学院硕士学位论文，2011年，第13-37页）公开了用国产DM11树脂对多拉菌素进行分离纯化，纯度由4%左右增大至约45%，其总回收率在80%左右；再通过进行硅胶柱层析精制，可以使纯度达到约92 %，总回收率约为60 %。

前两篇文献只对产品的提取工艺进行了研究，第三篇文献虽然通过树脂、硅胶层析等步骤对产品进行了纯化，产品纯度较低，仅有92%，不能满足药品的质量要求；同时，由于使用了树脂、硅胶层析，收率也较低，总收率约60%，生产成本较高，不利于工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作方法简单，生产成本低，能够保证产品质量和收率的多拉菌素的分离纯化方法。

为实现上述目的，本发明采用了下述的技术方案：

本发明所述的多拉菌素分离纯化方法包括以下步骤：

1）将发酵培养液加入助滤剂进行过滤，收集菌丝渣；

2）将菌丝渣加入溶剂浸提，过滤，收集得到滤液I；

3）将滤液I浓缩成浸膏；

4）用水溶性溶剂溶解步骤3）中的浸膏，然后加入活性炭，加热搅拌，过滤，收集得到滤液II；

5）将滤液II加水稀释，降温，搅拌，析晶，过滤，收集得到滤饼I；

6）将滤饼I用醇的水溶液溶解，程序降温结晶，过滤，得到多拉菌素产品。

其中，步骤1）所述的助滤剂为硅藻土或珍珠岩，用量为发酵液体积的2~8%（g/ml）。

步骤2）所述的溶剂为90%~100%的甲醇水溶液、90%~100%的乙醇水溶液、90%~100%的丙酮水溶液、乙酸乙酯、醋酸丁酯或异丙醇；所述的将菌丝渣加入溶剂浸提，可以是将步骤1）收集的湿菌丝渣直接加入到溶剂中浸提或者是将菌丝渣烘干至含水量在20%以内后加入到溶剂中浸提，溶剂用量与湿菌丝渣的体积重量比为2~3:1，或与干菌渣体积重量比为3~5:1；浸提温度控制在40~60℃，浸提时间控制在5~15小时。

步骤3）所述的浓缩是在40~60℃温度下进行。

步骤4）所述的水溶性溶剂为甲醇、乙醇或丙酮，优选乙醇；所述溶剂的质量浓度为60%~70%，优选65%，溶剂用量为浸膏重量的20~50倍（V/M）。

步骤5）所述的将滤液II加水稀释，优选将滤液稀释至有机溶剂浓度为30%~35%，稀释速度为每分钟向滤液中加入1%~5%滤液总体积量的纯化水，连续流加，所述的降温搅拌为将滤液温度降至2~15℃，搅拌2~5小时，优选3小时。

步骤6）所述的醇为甲醇、乙醇或异丙醇，优选甲醇；所述的醇的水溶液为醇含量在90%以上（V/V），优选95%以上，用量为滤饼重量的5~10倍（V/W），所述的溶解是在40℃~60℃温度条件下搅拌2~4小时进行；所述的程序降温结晶为控制温度每30分钟降低4℃~8℃，优选每30分钟降低5℃，直至温度降至5~10℃，停止降温，搅拌2~3小时，其中，程序降温结晶可以进行一次，也可以重复结晶多次，直至获得纯度高达98%的产品。

本发明采用活性炭脱色结合程序降温结晶的方法分离纯化多拉菌素，避免了现有技术中树脂和硅胶的使用，由于树脂和硅胶柱层析过程需要用到大量溶剂，同时硅胶通常不可回收重复再利用，因此与现有技术相比，本发明提供的方法不仅降低了生产成本，而且对环境友好。进一步的，本发明使用程序降温结晶方法分离纯化的多拉菌素纯度大大提高，HPLC纯度为98%以上，远远优于现有的产品质量，本发明提供的方法工艺简单，安全，生产成本低，适合于工业化生产。

附图说明

图1是多拉菌素发酵液的HPLC图谱。

图2是分离纯化后多拉菌素的HPLC图谱。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应当理解，这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。下述实施例中，除非另有说明，所述的实验方案具体条件通常按照常规条件或制造厂商建议的条件实施；所述的原料、试剂均通过实收购买获得。

在以下实施例中，多拉菌素的纯度通过HPLC测定，条件如下：

色谱柱：Diamonsil C18柱（4.6mm×150mm，5µm）；流动相：甲醇:乙腈:水=67:15:18(V/V）；检测波长：245nm；流速：1ml/min；进样量：20µl。

多拉菌素的发酵液由重庆乾泰生物医药有限公司通过发酵培养获得。发酵液图谱见附图1。

实施例 1

取20L多拉菌素发酵液（发酵单位1.1 g/L，HPLC图谱如图1所示），加入800g硅藻土，搅拌均匀，使用板框压滤机进行过滤，获得滤渣6.3kg。加入18.9L 95%甲醇，保持温度50℃，搅拌8小时，抽滤，并用4L 95%乙醇洗涤滤饼，收集滤液约22L。控制温度50℃，将滤液浓缩至膏状，浸膏重量约为58g，用65%乙醇2.3L溶解浸膏，然后加入活性炭46g，控制温度50℃，搅拌2小时，抽滤，并用200mL 65%乙醇洗涤滤饼，收集滤液2.5L，以每分钟75ml的速度向滤液中连续加入纯化水进行稀释，边稀释边搅拌，稀释至溶液中乙醇浓度达到33%，然后边搅拌边降温，直至温度降至10℃，继续搅拌3小时，抽滤，得到28g滤饼，取140ml 95%的甲醇溶液加入到滤饼中，并加热到50℃，搅拌至滤饼全部溶解后，维持温度3h，然后以每30分钟降低5℃的方式程序降温，温度降至10℃时，停止降温，搅拌3小时，抽滤，得潮晶24.8g，50℃真空干燥得成品16.4g，收率74.54%，纯度达98.9%（图谱如附图2所示）。

实施例 2

取20L多拉菌素发酵液（发酵单位1.1g/L），加入400g珍珠岩，搅拌均匀，使用板框压滤机进行过滤，获得滤渣6.1kg。加入12.6L 90%乙醇，保持温度40℃，搅拌5小时，抽滤，将滤饼用4L90%乙醇洗涤，收集滤液约16L。控制温度40℃将滤液减压浓缩至膏状，浸膏重量约为46g，用浓度60%的甲醇920ml溶解浸膏，然后加入活性炭69g，控制温度50℃，搅拌2小时，抽滤。滤饼用100mL 60%的甲醇洗涤，收集滤液，以每分钟10ml的速度向滤液中连续加入纯化水，边稀释边搅拌，直至溶液甲醇浓度达到30%，然后边搅拌边降温，直至温度降至2℃，连续搅拌2小时，抽滤，得到滤饼约25g，取125ml 95%的甲醇加热到40℃至全部溶解，维持2h，然后以每30分钟降低4℃的方式程序降温，温度降至5℃时，停止降温，搅拌2小时，抽滤，得潮晶21.4g，50℃真空干燥得成品14.5g，纯度达98.8%，收率65.9%。

实施例 3

取20L多拉菌素发酵液（发酵单位1.1 g/L），加入1600g硅藻土，搅拌均匀，使用板框压滤机进行过滤，获得滤渣6.7kg，50℃加热烘干，得干菌渣约2.72 kg，加入13.6L醋酸丁酯，保持温度60℃，搅拌15小时，抽滤，将滤饼用4L醋酸丁酯洗涤，收集滤液约17.5L。控制温度60℃将滤液减压浓缩至膏状，浸膏重量约为42g，用浓度2.1L 70%的丙酮溶解浸膏，然后加入活性炭25g，控制温度50℃，搅拌2小时，抽滤，滤饼用100mL 70%的丙酮洗涤，收集滤液2.2L，以每分钟110ml的速度向滤液中连续加入纯化水，边稀释边搅拌，直至溶液丙酮浓度达到35%，然后边搅拌边降温，直至温度降至15℃，连续搅拌5小时，抽滤，得到滤饼约31g，向滤饼中加入95%的甲醇水溶液310ml加热到60℃至全部溶解，维持4h，然后以每30分钟降低8℃的方式程序降温，温度降至10℃时，停止降温，搅拌3小时，抽滤，得潮晶24.4g，50℃真空干燥得成品16.1g，纯度达99.1%，收率73.2%。

实施例 4

取20L多拉菌素发酵液（发酵单位1.1 g/L），加入1000g硅藻土，搅拌均匀，使用板框压滤机进行过滤，获得滤渣6.3kg，50℃加热烘干，得干菌渣约2.64 kg，加入7.92L 丙酮，保持温度50℃，搅拌8小时，抽滤，将滤饼用2L丙酮洗涤，收集滤液约9.3L。控制温度60℃将滤液减压浓缩至膏状，浸膏重量约为38g，用浓度65%的乙醇720ml溶解浸膏，然后加入活性炭14g，控制温度50℃，搅拌2小时，抽滤。滤饼用100mL 65%的乙醇洗涤，收集滤液，以每分钟8ml的速度向滤液中连续加入纯化水进行稀释，边稀释边搅拌，直至溶液乙醇浓度达到30%，然后边搅拌边降温，直至温度降至5℃，连续搅拌3小时，抽滤。滤饼约26g，用95%的甲醇130ml加热到60℃至全部溶解，维持3h，然后以每30分钟降低5℃的方式程序降温，温度降至5℃时，停止降温，搅拌3小时，抽滤，得潮晶22.6g， 50℃真空干燥得成品15.4g，纯度达99.1%，收率70%。

实施例 5

取20L多拉菌素发酵液（发酵单位1.1 g/L），加入800g硅藻土，搅拌均匀，使用板框压滤机进行过滤，获得滤渣6.3kg。加入18.9L 95%甲醇，保持温度50℃，搅拌8小时，抽滤，并用4L 95%乙醇洗涤滤饼，收集滤液约22L。控制温度50℃，将滤液浓缩至膏状，浸膏重量约为58g，用65%乙醇2.3L溶解浸膏，然后加入活性炭46g，控制温度50℃，搅拌2小时，抽滤，并用200mL 65%乙醇洗涤滤饼，收集滤液2.5L，以每分钟75ml的速度向滤液中连续加入纯化水进行稀释，边稀释边搅拌，稀释至溶液中乙醇浓度达到33%，然后边搅拌边降温，直至温度降至10℃，继续搅拌3小时，抽滤，得到约28g滤饼，取140ml 90%的乙醇溶液加入到滤饼中，并加热到50℃，搅拌至滤饼全部溶解后，维持温度3h，然后以每30分钟降低5℃的方式程序降温，温度降至10℃时，停止降温，搅拌3小时，抽滤，得潮晶22.6g，50℃真空干燥得成品15.1g，纯度达98.2%，收率68.6%。

实施例 6

取20L多拉菌素发酵液（发酵单位1.1 g/L），加入800g硅藻土，搅拌均匀，使用板框压滤机进行过滤，获得滤渣6.3kg。加入18.9L 95%甲醇，保持温度50℃，搅拌8小时，抽滤，并用4L 95%乙醇洗涤滤饼，收集滤液约22L。控制温度50℃，将滤液浓缩至膏状，浸膏重量约为58g，用65%乙醇2.3L溶解浸膏，然后加入活性炭46g，控制温度50℃，搅拌2小时，抽滤，并用200mL 65%乙醇洗涤滤饼，收集滤液2.5L，以每分钟75ml的速度向滤液中连续加入纯化水进行稀释，边稀释边搅拌，稀释至溶液中乙醇浓度达到33%，然后边搅拌边降温，直至温度降至10℃，继续搅拌3小时，抽滤，得到约28g滤饼，取140ml异丙醇加入到滤饼中，并加热到50℃，搅拌至滤饼全部溶解后，维持温度3h，然后以每30分钟降低5℃的方式程序降温，温度降至10℃时，停止降温，搅拌3小时，抽滤，得潮晶22.6g，50℃真空干燥得成品14.8g，纯度达98.4%，收率67.3%。

Claims

1.一种多拉菌素的分离纯化方法，所述方法包括以下步骤：

1）将发酵培养液加入助滤剂进行过滤，收集菌丝渣；

2）将菌丝渣加入溶剂浸提，过滤，收集得到滤液I；

3）将滤液I浓缩成浸膏；

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1）所述的助滤剂为硅藻土或珍珠岩，用量为发酵液体积的2~8%（g/ml）。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2）所述的溶剂为90%~100%的甲醇水溶液、90%~100%的乙醇水溶液、90%~100%的丙酮水溶液、乙酸乙酯、醋酸丁酯或异丙醇；所述的将菌丝渣加入溶剂浸提，是将步骤1）收集得到的湿菌丝渣直接加入到溶剂中浸提或者是将湿菌丝渣烘干至水分含量在20%以内后加入到溶剂中浸提，溶剂用量与湿菌丝渣的体积重量比为2~3:1，或与干菌丝渣体积重量比为3~5:1；浸提温度控制在40~60℃，浸提时间控制在5~15小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3）所述的浓缩是在40~60℃温度下进行。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤4）所述的水溶性溶剂为甲醇、乙醇或丙酮；所述溶剂的质量浓度为60%~70%，用量为浸膏重量的20~50倍。

6. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤5）所述的降温是将温度降至2~15℃，搅拌时间为2~5小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤6）所述的醇为甲醇、乙醇或异丙醇，所述的醇的水溶液为醇含量在90%以上（V/V），用量为滤饼重量的5~10倍（V/W），溶解过程是在40℃~60℃温度下搅拌2~4h进行。

8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤6）所述程序降温结晶为控制温度每30分钟降低4℃~8℃，直至温度降至5~10℃，停止降温，搅拌2~3小时；所得到的多拉菌素产品为一次程序降温结晶获得或者是重复多次结晶获得。