CN109620942B - 人丹在制备预防或治疗亨廷顿舞蹈症药物中的应用 - Google Patents

人丹在制备预防或治疗亨廷顿舞蹈症药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了人丹的新用途，具体公开了人丹在制备预防或治疗亨廷顿舞蹈症中的应用。人丹为治疗中暑头晕的中成药，本发明经过秀丽隐杆线虫实验结果证实，人丹对亨廷顿舞蹈症动物病理模型的荧光聚集表型具有明显的抑制作用，说明人丹有预防或治疗亨廷顿舞蹈症的潜力。本发明公开的人丹治疗亨廷顿舞蹈症的新用途扩大了人丹的适应症，可在制备预防或治疗亨廷顿舞蹈症药物中应用。

Description

人丹在制备预防或治疗亨廷顿舞蹈症药物中的应用
技术领域
本发明属于中药技术领域，涉及人丹的新用途，具体涉及人丹在制备预防或治疗亨廷顿舞蹈症药物中的新用途。
背景技术
亨廷顿舞蹈症(HD)是以进行性发生的异常身体运动(舞蹈症)为主要特征的一种神经退行性疾病，并且伴有认知功能障碍以及个性的改变。HD是一种常染色体显性遗传的神经精神疾病。尽管HD通常会出现舞蹈样及其它异常运动的症状，但进行性的认知障碍和行为异常也会发生，并且对患者的危害相对更大。该疾病的典型症状通常发展非常缓慢，随着年龄的增长而逐渐呈现，往往到中老年才会发病(Gusella,&Macdonald，2000)。
HD是由位于亨廷顿蛋白(htt)N端的polyQ过度延伸而导致的神经退行性疾病，其病变存在明显的polyQ阈值特征，即当polyQ长度在36个谷氨酰胺以下时不会引起疾病，但当PolyQ长度大于或等于36时疾病就会发生，而且越长的重复片段会相对越早地诱发病变(Ross&Poirier，2004)。作为一种常染色体显性遗传疾病，HD具有年龄依赖的外显率，含有40个或更多谷氨酞胺的polyQ重复片段在65岁时几乎达到100％外显率(Langbehn,et al.，2004)。由于至今还没有能够有效治疗HD的药物，因此临床上目前主要是针对HD的表面病症进行药物干预(Bonelli&Hofmann，2007)，作为单基因疾病的亨廷顿疾病，病因相对清楚而且对其进行早期干预相对容易生效，因此，可以通过阻止或延缓polyQ的聚集来阻止发病或延缓发病进程。
转基因秀丽线虫品系AM141基于人源化polyQ神经无损伤的线虫，在该线虫株系中，polyQ同YFP融合表达于肌肉，表现为较强的点状荧光聚集。如果供试药物能够延缓该线虫株系polyQ的聚集，则点状荧光的数量就会减少，我们即能判定该药物具有预防或治疗亨廷顿舞蹈症的功效。因此，本发明将转基因秀丽隐杆线虫株系AM141作为筛选预防或治疗亨廷顿舞蹈症药物的病理模型来评价人丹预防或治疗亨廷顿舞蹈症的作用。
人丹是由薄荷脑、冰片、丁香、砂仁、八角茴香、肉桂、胡椒、木香、干姜、儿茶、甘草等药材组成，该中成药功效为开窍醒神、祛暑化浊。可用于中暑、恶心、腹泻、晕船。本发明通过对人丹的适应症进行筛选，发现了人丹对于亨廷顿舞蹈症具有显著的疗效，即本发明提供了一种人丹的新用途。
参考文献
Bonelli,R.M.,&Hofmann,P.(2007).A systematic review of the treatmentstudies in Huntington’s disease since 1990.Expert opinion on pharmacotherapy,8(2),141-153.
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Langbehn,D.R.,Brinkman,R.R.,Falush,D.,Paulsen,J.S.,&Hayden,M.R.(2004).A new model for prediction of the age of onset and penetrance forhuntington's disease based on cag length.Clinical Genetics,65(4),267–277.
Ross,C.A.,&Poirier,M.A.(2004).Protein aggregation andneurodegenerative disease.Nature Medicine,10(10Suppl),S10.
发明内容
本发明的目的在于提供人丹的一种新用途，具体涉及人丹在制备预防或治疗亨廷顿舞蹈症药物中的应用。
本发明的另一个目的在于提供人丹在制备阻止或延缓polyQ蛋白聚集药物中的应用。
优选地，所述的人丹为人丹醇提物。
所述的人丹由下列原料药组成：薄荷脑40份、冰片30份、丁香25份、砂仁25份、八角茴香15份、肉桂40份、白胡椒15份、木香15份、干姜25份、儿茶200份、甘草364份。
所述的人丹醇提物通过以下方法提取：将人丹成药粉碎，加10倍量75％乙醇，回流提取1小时，得到人丹75％乙醇提物溶液；人丹75％乙醇提物溶液用纱布过滤两次，滤液10000rpm离心10min，取上清液，减压蒸干溶剂，干燥，得到人丹75％醇提物浸膏。
所述的人丹醇提物可以与任何一种药学上可以接受的辅料混合制成不同剂型，所述的人丹剂型可以为片剂、胶囊剂、口服液或丸剂。剂型的不同不影响人丹在预防或治疗亨廷顿舞蹈症的效果。
优选地，所述的人丹为丸剂。
本发明的有益效果是：而在秀丽隐杆线虫疾病模型中，人丹醇提物特异性减缓了polyQ过度聚集引起的亨廷顿舞蹈症，同时，本发明对人丹的指标性成分进行了测定，发现其指标性成分为儿茶素和表儿茶素，直接将儿茶75％乙醇提取物作用于亨廷顿舞蹈症的线虫，发现儿茶75％乙醇提取物不具有预防或治疗亨廷顿舞蹈症的潜力。即人丹对亨廷顿舞蹈症动物病理模型秀丽隐杆线虫polyQ聚集引起的荧光聚集表型具有明显的专属性抑制作用，该抑制作用是由人丹组合物所作用的，并不是其所含儿茶的作用，说明人丹具有预防或治疗亨廷顿舞蹈症的潜力。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案进行说明，但是本发明的技术方案并不限于以下实施例。
实施例一人丹醇提物的制备
本发明对所述人丹的来源没有特别限定，采用本领域已知的人丹配方和药品标准自行制备而成(如申请号为200910194559.1的专利记载的人丹制备方法)，或从市场购买获得均可。
在本发明的实施例中，所述人丹由上海中华药业有限公司提供，药品基本信息如下：
中文名称：龙虎人丹
【剂型】丸剂(糊丸)
【制法】以上所述药材，取冰片、薄荷脑，加入适量95％乙醇，制成混合液；取儿茶加适量水后加热溶解，滤过得儿茶溶液，加入4.5g苯甲酸钠，180.5g糯米粉，边加热边搅匀，制成儿茶糯米浆。其余丁香等8味粉碎成细粉，混匀，加入混合液中，搅拌混合均匀，制成混合粉，取混合粉与儿茶糯米浆搅匀，机制成丸，干燥，使用红氧化铁和石墨进行包衣。制成1000g，即得。
【标准依据】国家药品标准WS-10157(ZD-0157)-2002-2012Z。产品批号：160507
除上述明确用于指代产品名称外，本发明所述“人丹”特指其中的中药组份。
人丹成药单位处方组成：薄荷脑40份、冰片30份、丁香25份、砂仁25份、八角茴香15份、肉桂40份、白胡椒15份、木香15份、干姜25份、儿茶200份、甘草364.1份。
人丹醇提物：将人丹成药粉碎，加10倍量75％乙醇，回流提取1小时，得到人丹75％乙醇提物溶液；人丹75％乙醇提物溶液用纱布过滤两次，滤液10000rpm离心10min，取上清液，减压蒸干溶剂，干燥，得到人丹75％醇提物浸膏。
实施例二人丹醇提物指标性成分采用HPLC测定
1.样品处理：称取人丹醇提物100mg，加入50％甲醇10ml，称定重量，超声处理10min，室温放置冷却后，再称定重量，用50％甲醇补足损失的重量，滤过，取滤液，即得。
2.标准曲线制作：称取儿茶素以及表儿茶素，配制母液，用50％甲醇溶液逐级稀释并配制标准工作系列溶液，其浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1.0mg/mL，色谱进样10μL，以分别测得的儿茶素、表儿茶素的峰面积对其浓度绘制标准曲线。
3.色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：250mm*4.6mm*5μm，流动相为2％冰醋酸(A)-乙腈(B)进行梯度洗脱。
流动相(A+B)梯度洗脱体系：0-5min：92％A：5-20min：92％A-82％A：20-25min：82％A-50％A：25-26min：50％A-92％A；26-30min：92％A。
流速：1.0ml/min。
柱温：30℃
紫外检测器波长：280n m。
4.样品测定：根据色谱峰保留时间定性，用外标峰面积法进行定量。
采用上述方法，得到儿茶素与表儿茶素峰面积与浓度关系分为为y＝5268.7x+33577，R2＝0.9994；y＝5994.6x-2599.4，R2＝0.9991。计算可得所述每1mg人丹乙醇提取物的标志性化学组分含有儿茶素63.25±2.62μg，含表儿茶素13.54±0.64μg。
实施例三人丹醇提物对亨廷顿舞蹈症的治疗作用
1.生物材料
(1)秀丽隐杆线虫秀丽隐杆线虫AM141购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)；为转基因品系，基于人源化polyQ神经无损伤的线虫，polyQ同YFP融合表达于肌肉，具神经保护作用的受试药物可显著减少polyQ点状荧光，本实施例采用秀丽线虫AM141株系作为筛选抗HD药物的病理模型。
(2)大肠杆菌OP50(尿嘧啶渗漏突变株)购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)，作为秀丽隐杆线虫的食物。
2.试剂
(1)固体NGM(Nematode Growth Medium)培养基成分与制作(以1升为例)：
成分 含量
NaCl 3.00g
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 2.34g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 17.23g
蛋白胨 2.50g
琼脂 17.00g
补充H<sub>2</sub>O至 1000mL
固体NGM培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，在无菌操作台下加入5mg/mL胆固醇1mL，1M MgSO4 1mL，1M CaCl2 1mL摇匀，趁热倒入已灭菌的9cm培养板，约20mL/板。静置等待培养基凝固，备用。
(2)M9液配方
成分 含量
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 6.00g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 3.00g
NaCl 5.00g
1M MgSO<sub>4</sub> 1.00mL
补充H<sub>2</sub>O至 1000mL
(3)裂解液的配制：6.4％NaClO溶液和1M NaOH溶液按体积比1:1混合。
(4)表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)：购自成都德思特生物技术有限公司，CAS：989-51-5。文献报道EGCG(200μM)能够显著抑制转基因线虫株系AM141荧光聚集表型，本实施例将其作为阳性药物。
3.配制含有人丹醇提物的NGM平板
药液配制：将实施例一得到的人丹醇提物75％乙醇提取物稀释成下列浓度：
L：0.05mg/mL；M：0.1mg/mL；H：0.25mg/mL；VH：0.5mg/mL
4.实施步骤
(1)线虫的培养：
将线虫接在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上，然后置于20℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。
(2)线虫同步化：
挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出的NGM培养基，用M9液将线虫从培养基上冲下，转移到离心管中，静置使线虫自由沉降至管底，弃上清。视线虫量多少向离心管中加入裂解液，在漩祸搅拌器上振荡5-7分钟待线虫全部断裂时停止涡旋,并分装于1.5mL离心管中，用M9溶液洗线虫卵三次。
(3)人丹醇提物对秀丽隐杆线虫AM141的作用
将同步化后得到的线虫的卵至于离心管中孵化，得L1期的线虫。将L1期线虫接至含药培养基于20℃培养，每24h进行一次荧光聚集度的观察，观察至96h。观察时，用M9缓冲液将线虫洗下来，用叠氮化钠固定线虫于载玻片上，在正置荧光显微镜下观察并拍照。对拍照记录的照片，使用ImageJ软件进行线虫体内荧光聚集度统计，并绘制图表分析，得到不同时期受试线虫体内荧光聚集数量结果见表1。
表1人丹75％乙醇提取物对秀丽隐杆线虫AM141荧光聚集的影响
Figure BDA0001948638350000061
*为与空白组比较P＜0.05
从表1可以看出，人丹75％乙醇提取物在一定时期内使秀丽隐杆线虫AM141的荧光聚集数量显著减少，并呈浓度依赖关系，说明人丹75％乙醇提取物减缓了polyQ的聚集。
实施例四儿茶醇提取物对HD的治疗作用
实验材料：同实施例二。
儿茶素及其衍生物有抑制polyQ聚集的作用，本实施例测定儿茶单味药乙醇提取物与人丹乙醇提取物中儿茶单味药含量保持一致时，儿茶单味药乙醇提取物对HD线虫polyQ聚集的影响。具体实验步骤：同实施例一。
表2儿茶75％乙醇提取物对秀丽隐杆线虫AM141荧光聚集的影响
Figure BDA0001948638350000062
＊为与空白组比较P＜0.05
由表2可以看出，儿茶75％乙醇提取物并不能对秀丽隐杆线虫AM141荧光聚集产生明显的抑制作用，即儿茶75％乙醇提取物不具有预防或治疗亨廷顿舞蹈症的潜力。
综上所述，人丹醇提物显著延缓了HD线虫体内polyQ的聚集进程，而与人丹乙醇提取物保持生药量一致的儿茶提取物则无明显延缓HD线虫体内polyQ的聚集进程的作用，故人丹对亨廷顿舞蹈症动物病理模型秀丽隐杆线虫polyQ聚集引起的荧光聚集表型具有明显的抑制作用，说明人丹具有预防或治疗亨廷顿舞蹈症的潜力。本发明的新用途扩大了人丹的适应症，可在制备预防或治疗亨廷顿舞蹈症药物中应用。

Claims (1)

1.人丹在制备预防或治疗亨廷顿舞蹈症药物中的应用，其特征在于，所述人丹由下述重量份的原料药制成：薄荷脑40份、冰片30份、丁香25份、砂仁25份、八角茴香15份、肉桂40份、白胡椒15份、木香15份、干姜25份、儿茶200份、甘草364.1份。
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