CN109535279A - 壳寡糖双胍衍生物及其微波合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开壳寡糖双胍衍生物及其微波合成方法，称取壳寡糖与盐酸于四口瓶，并在微波装置中搅拌反应，之后按照原料配比加入双氰胺水溶液，使用盐酸调节溶液pH，继续在微波装置中搅拌反应。反应结束后，对混合溶液进行醇沉，烘干，研磨，得到固体产物。本发明生产效率高，操作工艺简单，反应过程清洁环保，产品性能好。

Description

壳寡糖双胍衍生物及其微波合成方法

技术领域

本发明属于药学领域,具体涉及一种壳寡糖双胍衍生物的微波合成制备方法及其在改善糖尿病肾病方面的应用。

背景技术

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)又称糖尿病性肾小球硬化症，是一种与糖尿病有关的潜在性疾病。糖尿病肾病的早期病理特征为肾小球变得肥大、细胞外基质容易积聚，也就是基底膜变厚和系膜基质沉积，到了晚期，糖尿病肾病的症状则表现为间质变得纤维化、肾小球变得硬化。糖尿病肾病的发病比较不明显，早期临床症状比较隐匿，起初的变现为微量的蛋白尿，一旦病情继续恶化，进入临床蛋白尿时期，患者肾小球的滤过率将会呈现直线下降，此时对肾脏造成的损害将难以逆转。目前多采取控制血糖、ACEI、钙拮抗剂、噻唑烷二酮类降糖药、降脂药等综合治疗，尚缺乏针对性的疗效满意的药物。因而，针对DN发病机制以及抗DN药物的研究,目前成为国内外医药领域的研究热点。糖尿病肾病的发病机制复杂，蛋白激酶C(PKC)的异常活化为其重要的发病原因之一。糖尿病状态下，糖代谢异常会促进DAG的合成和积累，从而激活DAG-PKC通路，促进蛋白激酶C(PKC)的活化。活化的蛋白激酶C及其促进表达的细胞内转化生长因子(TGF-β)可以增加细胞外基质如纤维连结蛋白(FN)的表达。增加的纤维连接蛋白与肾小球基底膜结合，导致肾小球基底膜增厚和肾小管间质纤维化，促进糖尿病肾病的发展。高血糖的强化治疗可以防止糖尿病肾病，包括微量白蛋白尿的发展，并能延缓DN的发展。细胞外高浓度葡萄糖可以通过增加葡萄糖转运蛋白的表达和转运诱导葡萄糖摄取的增加。其中在肾脏中具有高水平含量的葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)在葡萄糖的摄取方面起到重要作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供壳寡糖双胍衍生物及其微波合成方法，将二甲双胍的结构引入到壳寡糖中，该产物既具有胍基的治疗糖尿病肾病功效，又具有壳寡糖的天然性、安全性和独特的生物活性，且能够缓解双胍药物对胃肠道的刺激作用，该方法生产效率高，操作工艺简单，反应过程清洁环保，产品性能好。

本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：

壳寡糖双胍衍生物，以壳寡糖和双氰胺反应制备，以壳寡糖侧基NH₂和双氰胺在盐酸和微波条件下进行反应并形成与壳寡糖键接的双胍基团，如下化学式所示：

壳寡糖是自然界中唯一带有正电荷的碱性氨基寡糖，它的分子量小，溶解性很好，容易被生物体吸收利用，重均分子量为3000以下，优选1500—3000(KDa)，脱乙酰度在97％以上，优选97—99％。

壳寡糖双胍衍生物中，双胍取代度为40—60％，优选45—55％。

上述化学式中，m和n分别为壳寡糖中乙酰化单元和脱乙酰化单位的聚合度。

壳寡糖双胍衍生物的制备方法，按照下述步骤进行：将壳寡糖分散在盐酸中并在微波160W～560W条件下搅拌，进行第一步微波反应；之后加入双氰胺水溶液并使用盐酸调整反应体系pH值为1—2，继续在微波160W～560W条件下搅拌，进行第二步微波反应，以使壳寡糖和双氰胺反应制备壳寡糖双胍衍生物，具体如下式所示：

其中在第一步微波反应中，微波功率为300—400w，反应时间为3—7min，优选5—7min，搅拌速度为每分钟100—200转。

在第二步微波反应中，微波功率为300—400w，反应时间为10—20min，优选15—20min，搅拌速度为每分钟100—200转。

反应结束后，将反应液冷却至室温，对混合溶液进行醇沉，烘干，研磨，得到壳寡糖双胍衍生物粉末。

双氰胺与壳寡糖中氨基的摩尔比为(0.5—3)：1，优选(1—3)：1，更加优选1:1。

盐酸为0.2～0.8mol/L的氯化氢水溶液，使用盐酸调整反应体系pH值为1。

本发明生产效率高，操作工艺简单，反应过程清洁环保，产品性能好。经动物实验证实，本发明中的壳寡糖双胍衍生物可通过调节GLUT2的表达、抑制高糖诱导激活的DAG/PKC通路的活性，改善糖尿病肾病。衍生物55％胍取代度的效果更好，可通过调节GLUT2的表达，稳定血糖水平，抑制DAG/PKC通路的活性，抑制PKC的异常活化，通过调节GLUT2的表达、抑制高糖诱导激活的DAG/PKC通路的活性，改善糖尿病肾病。

附图说明

图1为本发明中壳寡糖(COS)和壳寡糖胍(COSG)的红外光谱图。

图2为本发明中壳寡糖(COS)和壳寡糖胍(COSG)的¹³C图谱。

图3为COSG改善STZ诱导的糖尿病大鼠的(a)体重与(b)血糖的动态变化。数据是均值±标准差，n＝6，^#P<0.05,^##P<0.01,^###P<0.001和空白对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和模型组相比。

图4为COSG改善STZ诱导的糖尿病大鼠的(a)GLUT2的表达(b)GLUT2蛋白印迹法的量化(c)DAG含量。数据是均值±标准差，n＝6，^#P<0.05,^##P<0.01,^###P<0.001和空白对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和模型组相比。

图5为STZ诱导DN大鼠PKC-β和TGF-β蛋白表达的(a)Western blot分析，(b)PKC-β和(c)TGF-β蛋白表达的量化。数据是均值±标准差，n＝6，^#P<0.05,^##P<0.01,^###P<0.001和空白对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和模型组相比。

图6为(A)肾组织病理学HE染色(400X)，(B)纤维连接蛋白免疫组化分析，(C)肾小管萎缩数，(D)纤维连接蛋白免疫组化量化。数据是均值±标准差，n＝6，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001和空白对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和模型组相比。

图7为COSG改善DN大鼠肾功能的生化指标。(a)尿葡萄糖，(b)尿蛋白含量(c)尿NAG活性。数据是均值±标准差，n＝6，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001和空白对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和模型组相比。

具体实施方式

下面是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。选择进行机械搅拌，搅拌速速为每分钟150转。

实施例1壳寡糖双胍衍生物的制备(双胍取代度为55％)

按照原料配比为1：1称取1.44g双氰胺置于锥形瓶中，加入15mL蒸馏水，在50℃恒温震荡培养箱中振荡溶解双氰胺。待壳寡糖(重均分子量3000)和双氰胺均完全溶解后，将双氰胺水溶液倒入盛有壳寡糖盐酸溶液的四口瓶中，使用1mol/L的盐酸调节溶液pH＝1。在微波功率为400W，微波时间为15min条件的下进行反应。反应结束后，对混合溶液醇沉，抽滤，烘干，研磨，得到壳寡糖双胍衍生物粉末COSG。产物经红外光谱、核磁共振谱等鉴定为壳寡糖双胍衍生物，如附图1和2所示。

COS的红外光谱图中，3414cm_-1附近处的强吸收峰为缔合氢键的O－H和N－H伸缩振动吸收峰部分重叠而增宽的多重吸收峰。由于COS分子中存在大量的分子间、分子内氢键，且氢键的长短、强弱也不尽相同，因此其伸缩振动峰出现在较宽的频率范围内。2918cm_-1左右为C－H的伸缩振动吸收峰。1626cm_-1附近处为仲胺的N-H伸缩振动峰。此外，指纹区的1060cm_-1附近处为仲胺的N－H面内弯曲振动吸收峰，因为COS脱乙酰化并不完全，分子中含有少量的－NH－CO－结构，故在该处有吸收峰；602cm_-1附近处对应着N－H的面外摇摆振动吸收带。与COS相比，COSG在1626cm_-1处、1060cm_-1附近处吸收峰明显增强，这两个峰都是仲胺基团的特征峰，说明分子内仲胺类基团增多，表明COS氨基上发生了胍基化反应。此外，3414cm_-1附近处吸收峰为缔合氢键的O－H和N－H伸缩振动吸收峰部分重叠而增宽的多重吸收峰，由于COS分子中存在大量的分子间、分子内氢键，且氢键的长短、强弱也不尽相同，因此其伸缩振动峰出现在较宽的频率范围内，而COSG相对于COS，该峰明显增强，同样说明分子内N－H含量增多，表明了COS氨基上发生了胍基化反应。

壳聚糖环上各个C的化学位移为：C₁：97.03，C₄：76.03，C₅：75.01，C₃：71.49，C₆：60.23，C₂：56.23。壳寡糖是壳聚糖降解后得到的，因此，其糖环上各个C化学环境，化学位移也应与壳聚糖一致。用₁₃C NMR分析技术进一步确定壳寡糖改性后的结构变化，壳寡糖胍盐的化学位移分别为：C₇：165.21，C₈：155.13，C₁：98.91，C₄：78.17，C₅：77.03，C₃：69.13，C₆：60.17，C₂：56.43。其中C₇：165.21和C₈：155.13处新出现的碳的化学位移确定了胍基团的存在。

在确定壳寡糖和双氰胺反应生成胍基团后，本发明使用NaOH标准溶液滴定产物，测得产物的胍取代度DS并以此为判断标准。NaOH和壳寡糖胍中的＝NH₂ ⁺Cl^-反应，滴定等当点时，pH发生突变，NaOH摩尔数等于产物中的＝NH₂ ⁺Cl^-摩尔数。壳寡糖胍的DS可用下列式计算：

式中：

n₁——被胍基取代的结构单元摩尔数；

n₂——未被胍基取代的结构单元摩尔数；

Δv——到达突越点(pH＝9.1)消耗NaOH的体积/ml；

c_NaOH——NaOH标准溶液的浓度/mol·L^-1；

G——产品质量/g；

318——被胍基取代的结构单元的相对摩尔质量/g·mol^-1；

161——未被胍基取代的结构单元的相对摩尔质量/g·mol^-1；

DS——(双)胍取代度/％。

在本发明内容记载的工艺参数基础上进行变更，以实现壳寡糖双胍衍生物的制备并测试其双胍取代度，可达40—60％，其中各个参数的影响如下：微波辐射功率对产率和胍取代度的影响：随着微波辐射功率的增加,取代度逐渐增加,而产率呈现先增加后减小的趋势，原因是过高的微波辐射功率将导致更多的副反应发生。反应时间对产率和胍取代度的影响：随着反应时间的延长,产率和胍取代度提高,达到一定时间后取代度无明显增加。反应物配比对产率和胍取代度的影响：随着壳寡糖结构单元与双氰胺物质量配比增大,胍取代度也逐渐升高,当反应物配比增大到一定值时,产率达到最大值。继续增加反应物配比,由于加入的原料不易溶解,不利于反应的进行,产率有所下降。反应溶剂的选择：反应溶剂对胍取代度的影响较大。选用盐酸作为反应溶剂得到的产率和胍取代度较高，这是由于用盐酸作为极性溶剂,反应在给质子化的液体介质中进行,双氰胺分子中氰基质子化程度较大,反应活性较强。

实施例2选取实施例1中制备的壳寡糖双胍衍生物粉末COSG进行动物药效学实验

通过以下动物实验对本发明应用效果作进一步说明。

1、实验动物及分组

实验动物选用SD成年雄性大鼠30只，每组6只，总共5组，清洁级，体重在500克左右，由天津市动物实验中心提供。动物分笼饲养，动物每笼4～5只。动物饲养实验室符合国标清洁级，空间30m²，室内照明控制在12h/12h光暗周期节律。室内平均气温23℃，相对湿度50％～60％。

30只大鼠分为对照组(标记为C，即空白组)，模型组(标记为M，即诱发糖尿病并灌水)，二甲双胍组(标记为Met，即诱发糖尿病并给药甲福明)，壳寡糖组(标记为COS，即诱发糖尿病并给药壳寡糖，重均分子量3000)，壳寡糖胍组(标记为COSG，即诱发糖尿病并给药实施例1中制备的壳寡糖双胍衍生物粉末COSG)5组。对照组喂食正常饮食，其他组饲喂高脂肪和高糖饮食1周，然后禁食12小时，然后以25mg/kg的剂量静脉注射STZ至尾静脉，构建糖尿病肾病大鼠模型(即诱导大鼠产生糖尿病发病)。实验组按照500mg/kg的剂量灌胃给药(溶于蒸馏水，pH值为7)，模型组用相应剂量的蒸馏水进行灌胃。所有大鼠每天一次给予胃洗液，直到实验结束。

2、标本采集

针对动物实验需检测的指标，对实验大鼠血清和组织作如下处理，用于下面各项检测。

(1)血液样品的采集：分别在第二周、第四周和第六周的周二采血，采血前12h内隔夜禁食但不禁水，第二周和第四周采用内眦取血(约2ml)，第六周实施股动脉处放血术，处死大鼠，收集血样。静置血样1h后，对其进行离心处理，转速2500r/min，时间20min，取上清液制备血清。

(2)体重：每周二同一时间测定实验鼠的体重(g)，并作相应纪录。

(3)肾脏标本：实验结束后每组大鼠放血处死，立即取肾脏，称重后取部分肾脏组织以10％甲醛溶液固定，做常规石蜡切块，并进行HE染色，在光镜下观察。

3、研究情况

1)对糖尿病肾病大鼠一般状况的影响：

糖尿病大鼠出现典型的体重下降症状。所有的糖尿病大鼠，包括Met，COS和COSG组，与正常大鼠相比均有明显的体重减轻(P<0.001)。和糖尿病大鼠相比，其他所有组的小鼠的体重在实验过程中逐渐趋于正常(图3a)。

大鼠在6周内出现高血糖症。研究结束时，他们表现出糖耐量降低和空腹血糖显著升高的症状。相对于模型对照组，COSG组中COSG的治疗显著降低了空腹血糖水平(时间为0时)。在葡萄糖耐量试验中，和模型对照组相比，使用COSG治疗的糖尿病大鼠在摄入葡萄糖120分钟后的血糖水平显著降低。然而，用COSG治疗的糖尿病大鼠的血糖水平仍高于空白对照组。模型组的血清葡萄糖比空白对照组的高很多。和模型组相比，用COSG治疗使血清葡萄糖大概降低了31％(图3b)。

2)对糖尿病肾病大鼠肾组织中GLUT2表达与DAG含量的影响：

对肾组织进行蛋白印迹分析，GLUT2的强度用和与之相关的β-肌动蛋白条带对比量化表示(图4a、4b)。与空白对照组相比，模型组的GLUT2表达显著增加(P<0.001)；与模型组相比，Met、COS和COSG组的GLUT2表达明显减少(P<0.05,P<0.01and P<0.01)。

COSG对DAG的作用效果如图4c所示，空白对照组中DAG含量处于自然水平，反之，模型组DAG含量明显增加(P＜0.001)。治疗6周后，与模型组比较，Met,COS和COSG组中DAG水平分别下降了32.4％、34.2％和27.8％，表明COSG疗效优于其他治疗组。

3)对糖尿病大鼠肾病变的影响

蛋白激酶C(PKC)的异常激活是糖尿病肾病的重要原因，检测分析PKC在空白对照组，模型组和治疗组的大鼠中的表达十分重要。可见与空白对照组相比，模型组中PKC的表达量增加到原来的2倍，而和模型组相比，在Met,COS和COSG组中PKC表达量显著减少(图5)。

TGF-β参与肾纤维化、系膜肥大和ECM积聚。在肾组织中，和空白对照组相比，模型组中TGF具有更高的表达量，而在Met,COS和COSG的治疗后，其表达量显著下降。详细地说，COSG组中TGF表达量比Met和COS组中降低更多。

4)对肾脏病理学改变的影响

治疗六周后，肾组织病理学显示五组差异性显著。与空白对照组中正常肾结构相比，HE染色(图6A)DN大鼠肾组织中表现出严重的病理改变，如肾小球系膜扩张，肾小球肥大的迹象，肾小管间质的炎性细胞浸润，肾小球官腔硬化，此外，在模型组中还观察到管状扩张。相比之下，在COSG治疗下的DN大鼠肾小球结构基本正常，除了细微的空泡化，肾小管上皮细胞和偶尔出现的蛋白管型(图6B)。

在DN早期，ECM蛋白如FN的产生是导致肾小球硬化的主要致病因素。TGF-β被认为是肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质过多的主要介质之一。与对照组相比，糖尿病大鼠肾小球中FN阳性表达增加。然而，在COSG治疗的糖尿病小鼠肾小球中FN染色显示其阳性表达明显减少(图6C、图6D)。

5)对糖尿病肾病大鼠肾功能的影响

糖尿病后期并发的肾病对机体损害更为严重。肾脏病变,会引发一系列的变化。肾小球滤过率下降,重吸收能力下降,尿中的蛋白会显著增加,并引发血中尿素氮等明显增加。模型组大鼠的尿葡萄糖水平显著高于对照组(图7a)。同样，尿蛋白和尿NAG活性在糖尿病肾病大鼠中不同程度升高(图7b、图7c)。然而，和模型组相比，在经过Met,COS和COSG的治疗后，尿糖，尿蛋白和尿NAG活性都有所下降。而且COSG组中的治疗效果比Met和COS效果要好。

通过上述实验和分析可知，本专利发明的壳寡糖双胍衍生物能抑制体重降低与血糖升高，能够抑制肾小球系膜细胞中GLUT2表达，维持了肾小球细胞中葡萄糖浓度并降低DAG含量，下调糖尿病大鼠PKC-α和TGF-β的表达，改善糖尿病肾病肾组织病理学改变和DN大鼠肾功能，即本发明壳寡糖双胍衍生物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (8)

1.壳寡糖双胍衍生物，其特征在于，以壳寡糖和双氰胺反应制备，以壳寡糖侧基NH₂和双氰胺在盐酸和微波条件下进行反应并形成与壳寡糖键接的双胍基团，如下化学式所示：

2.根据权利要求1所述的壳寡糖双胍衍生物，其特征在于，壳寡糖重均分子量为3000以下，优选1500—3000(KDa)，脱乙酰度在97％以上，优选97—99％。

3.根据权利要求1所述的壳寡糖双胍衍生物，其特征在于，双胍取代度为40—60％，优选45—55％。

4.壳寡糖双胍衍生物的微波合成方法，其特征在于，按照下述步骤进行：将壳寡糖分散在盐酸中并在微波160W～560W条件下搅拌，进行第一步微波反应；之后加入双氰胺水溶液并使用盐酸调整反应体系pH值为1—2，继续在微波160W～560W条件下搅拌，进行第二步微波反应，以使壳寡糖和双氰胺反应制备壳寡糖双胍衍生物；双氰胺与壳寡糖中氨基的摩尔比为(0.5—3)：1，盐酸为0.2～0.8mol/L的氯化氢水溶液。

5.根据权利要求4所述的壳寡糖双胍衍生物的微波合成方法，其特征在于，在第一步微波反应中，微波功率为300—400w，反应时间为3—7min，优选5—7min，搅拌速度为每分钟100—200转。

6.根据权利要求4所述的壳寡糖双胍衍生物的微波合成方法，其特征在于，在第二步微波反应中，微波功率为300—400w，反应时间为10—20min，优选15—20min，搅拌速度为每分钟100—200转。

7.根据权利要求4所述的壳寡糖双胍衍生物的微波合成方法，其特征在于，双氰胺与壳寡糖中氨基的摩尔比为(1—3)：1，优选1:1。

8.根据权利要求4所述的壳寡糖双胍衍生物的微波合成方法，其特征在于，使用盐酸调整反应体系pH值为1。