CN110386997A - 一种具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物及其制备方法 - Google Patents

一种具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物，所述壳聚糖衍生物具有式(1)所述的结构式：该壳聚糖衍生物既含有正电荷丰富、能够发挥抗菌作用的双胍官能团，又包括水溶性好、生物相容性好的聚乙二醇链段，使得该壳聚糖衍生物同时兼具良好的抗真菌和抗细菌性能和生物相容性。此外，本发明还提供了该壳聚糖衍生物的制备方法，该方法所需设备简单，适合工业化生产。

Description

一种具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物及其制备方法
技术领域
本发明涉及壳聚糖化学改性领域。更具体地，涉及一种具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物及其制备方法。
背景技术
基于生物大分子或天然聚合物的生物医用材料通常具有生物可降解性、固有的生物活性、与细胞配体结合的运输能力、对细胞引起的水解做出响应以及自然重组的能力，是用作生物医用材料的最佳选择。壳聚糖是被研究的最为广泛的天然生物大分子之一，由自然界储量第二丰富的天然聚合物甲壳素经脱乙酰化而来。甲壳素与壳聚糖广泛存在于虾、蟹等海洋动物的外壳，昆虫的甲壳以及真菌(酵母菌、霉菌)的细胞壁中。与甲壳素相比，壳聚糖能够在稀酸溶液中溶解，因此其应用空间相较于甲壳素有较大提升。然而由于壳聚糖仍然具有规整的结晶结构，难溶于水或常见的有机溶剂，从而也极大地限制了其在医药、食品、化工及环保等诸多领域广泛而深入的应用。
聚糖分子结构中包含丰富的氨基和羟基，使其能够通过酰基化、羧基化、醚化、烷基化、酯化、水解等反应[J.Adv.Drug.Deliv.Rev.2001,50,591.]被进一步修饰成为壳聚糖的衍生物，从而增加其他方面的多功能性。羧甲基的引入赋予了壳聚糖良好的水溶性，拓宽了壳聚糖的适用范围。然而，化学结构的改变在一定程度影响了羧甲基壳聚糖的抗菌性能和生物相容性。
因此，需要提供一种可溶于水的、具有良好生物相容性和抗菌性能的壳聚糖衍生物。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物，该壳聚糖衍生物既含有正电荷丰富、能够发挥抗菌作用的双胍官能团，又包括水溶性好、生物友好的聚乙二醇链段，使得该壳聚糖衍生物同时兼具良好的抗菌性能和生物相容性。
本发明的另一个目的在于提供一种具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物的制备方法，该制备方法反应条件相对温和，设备简单，可大规模工业化生产。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物，所述壳聚糖衍生物具有式(1)所述的结构式：
其中，x、y、m、n均为自然数，6<m+n<6000；0.50<m/(m+n)<0.99；0.10<x/(m+n)<0.50；10<y<200。
在式(1)中，m+n与选用的壳聚糖的分子量相关，m与选用的壳聚糖的脱乙酰度相关，x与羧基聚乙二醇单甲醚接枝率相关，而y与选用羰基聚乙二醇单甲醚的分子量相关。
本发明中提供的壳聚糖衍生物上接枝有短链的聚乙二醇，聚合度小于200。聚乙二醇(PEG)是美国食品与药物管理局(FDA)批准可以用于人体的一种常用聚醚类高分子材料。PEG虽然不具有降解性，但水溶性较好，在人体中能够溶于组织液中，且分子量三万以下的PEG能够通过肾脏排出。PEG具有优异的生物相容性，毒副作用小，可供生物医用的PEG分子量范围较宽，从几百到几千不等。将PEG接枝到壳聚糖上，可以破坏壳聚糖结晶结构，不仅提高了壳聚糖的亲水性，且提高了壳聚糖的生物相容性。
在壳聚糖上接枝PEG之后，本发明还在壳聚糖上接枝了双胍基，接枝双胍基后，增加了壳聚糖上的正电荷密度，有利于提高其抗菌性能，有效的调节了因氨基参与PEG接枝而使正电荷密度减少导致的抗菌性能下降。胍基是目前自然界发现的正电性最强的生物活性有机碱，其在生理pH条件下能够质子化，在较宽pH范围内均能形成带正电的基团，与氨基相比有更高的正电荷密度，被广泛用于医药、农业、建筑、服装、化工等领域，因此，本发明中同时接枝有温和PEG和正电性双胍基的壳聚糖衍生物不仅具有良好的水溶性，同时具有优良的抗真菌性和抗细菌性，且细胞毒性低、溶血率低。
为实现本发明的第二个目的，本发明采用了如下技术方案：
一种如权利要求1所述具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物的制备方法，包括如下步骤：
S1：壳聚糖与羧基聚乙二醇单甲醚反应，得到聚乙二醇修饰的可溶性壳聚糖；
S2：聚乙二醇修饰的可溶性壳聚糖与双氰胺反应，得到具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物。
生成具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物的化学反应流程如下式所示：
其中，x、y、m、n均为自然数，6<m+n<6000；0.50<m/(m+n)<0.99；0.10<x/(m+n)<0.50；10<y<200。
优选地，所述S1和S2中均包括反应结束后对产物进行透析和真空冷冻干燥的步骤；
优选地，所述透析使用的是截留分子量为8000-14000Da的透析袋，透析液为去离子水。本发明中聚乙二醇修饰的壳聚糖是可以溶于水的，采用去离子水透析的方法纯化处理以去除小分子副产物及杂质。
优选地，所述S1中壳聚糖与羧基聚乙二醇单甲醚反应的具体过程为：将羧基聚乙二醇单甲醚、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)加入到2-(N-吗啉代)乙烷磺酸缓冲液(MES)中，在0-35℃下，进行羧基活化反应0.5-3h，得到羧基聚乙二醇单甲醚的羧基活化溶液；然后将羧基活化溶液和壳聚糖的烯酸溶液混合，0-35℃下反应12-72h，加入盐酸羟胺终止反应。
优选地，S1中羧基聚乙二醇单甲醚、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、壳聚糖、盐酸羟胺的物质的量之比为1：(0.5-5)：(0.5-5)：(0.1-10)：1。
优选地，S1中所使用的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸缓冲液(MES)的浓度为10-100mM，pH为4.5-7.5。
优选地，具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物的制备过程中，所使用的壳聚糖的数均分子量为103-106Da，脱乙酰度为50-99％；
优选地，所述羧基聚乙二醇单甲醚的数均分子量为550-8000Da。
优选地，S1中所述壳聚糖的稀酸溶液的溶剂包括稀盐酸溶液或稀醋酸溶液；
优选地，所述壳聚糖的稀酸溶液中壳聚糖的质量浓度为1mg/mL-500mg/mL；优选地，所述壳聚糖的稀酸溶液的pH为3.0-4.0。
优选地，所述S2中聚乙二醇修饰的可溶性壳聚糖与双氰胺反应的具体过程为：将聚乙二醇修饰的可溶性壳聚糖的水溶液加热至60-120℃，然后加入双氰胺，继续反应6-48h。
本发明中具有抗菌作用的可溶性壳聚糖的制备方法，操作简单、条件温和，所用主要原料壳聚糖为自然界中储量第二丰富的天然高分子甲壳素脱乙酰后所得，分步修饰避免了壳聚糖胍基化过程中高温下酸的加入，使壳聚糖衍生物骨架免于过度降解，从而保证了高分子量产物的获得。反应过程中，所需设备简单，适合工业化生产。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物分子中既含有正电荷丰富、能够发挥抗菌作用的双胍官能团，又包含水溶性好、生物相容性优良的聚乙二醇链段，该壳聚糖衍生物同时兼具了良好的抗真菌和细菌性能以及生物相容性。同时由于亲水性聚乙二醇、正电性双胍基侧链的引入，壳聚糖衍生物的使用范围变宽，在酸性条件至弱碱性条件下均可使用。
本发明提供的具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物的制备方法以来源广泛、储量丰富，价格相对较低的壳聚糖为原料，且首先进行了壳聚糖的PEG化既有效改善了天然壳聚糖因高度结晶造成的溶解困难问题，同时也避免了修饰顺序颠倒后副反应繁多且复杂的情况；采用真空冷冻干燥技术可以得到具有三维大孔结构的壳聚糖衍生物，有利于溶解过程中溶剂分子的快速渗入，水溶性提高。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出本发明实施例4中不同浓度的具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物对金黄色葡萄球菌(细菌)和白色念珠菌(真菌)的抑制作用。
图2示出本发明实施例5中不同浓度的具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物对小鼠成纤维细胞L929细胞增殖抑制率结果。
图3示出本发明实施例6中不同浓度的具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物的溶血值(以0.1％Triton X-100的溶血值作为对比)。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物的制备
S1：称取0.16克分子量2×105Da脱乙酰度99％的壳聚糖，溶解在10mL浓度为1％的稀盐酸中，室温下搅拌0.5小时，使壳聚糖完全溶解，得到质量浓度为16mg/mL的均一溶液；随后将在室温下充分活化1小时的羧基聚乙二醇单甲醚、NHS和EDC·HCl的混合溶液(溶剂为25mM的pH＝4.90的MES缓冲溶液)20ml加入壳聚糖稀酸水溶液中，并在室温下持续搅拌反应24小时，其中壳聚糖、羧基聚乙二醇单甲醚、NHS、EDC·HCl的物质的量之比为1:1:2:2；反应结束后加入与羧基聚乙二醇单甲醚等物质的量的盐酸羟胺终止反应，随后将反应液转移至截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，将透析袋两端扎紧置于去离子水中透析处理，每隔6小时换水一次，换水6次后将透析液放入-20℃冷冻过夜后，放入真空冷冻干燥机直至充分干燥至恒重即可得到聚乙二醇单甲醚修饰的可溶性壳聚糖。
S2：称取1.00克步骤S1中所得的可溶性壳聚糖加入到50mL去离子水中，室温下搅拌半小时，以使可溶性壳聚糖完全溶解，从而得到质量百分比为2％的均匀溶液；待温度升高至80℃，向可溶性壳聚糖溶液中加入双氰胺，双氰胺与可溶性壳聚糖的物质的量之比为3:1，80℃下加热搅拌24小时，随后将反应液转移至截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，将透析袋两端扎紧置于去离子水中透析处理，每隔6小时换水一次，换水6次后将透析液放入-20℃冷冻过夜后，放入真空冷冻干燥机中直至充分干燥至恒重即可得抗菌功化可溶性壳聚糖。
实施例2
具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物的制备
S1：称取0.10克分子量106Da脱乙酰度80％的壳聚糖，溶解在100mL浓度为0.4％的稀醋酸中，室温下搅拌0.5小时，使壳聚糖完全溶解，得到质量浓度为1mg/mL的均一溶液；随后将在冰水混合浴下充分活化3小时的羧基聚乙二醇单甲醚、NHS和EDC·HCl的混合溶液(溶剂为10mM pH＝7.50的MES缓冲溶液)20ml加入壳聚糖稀酸水溶液中，并于0℃下持续搅拌反应72小时，其中壳聚糖、羧基聚乙二醇单甲醚、NHS、EDC·HCl的物质的量之比为20:2:1:1；反应结束后加入与羧基聚乙二醇单甲醚等物质的量的盐酸羟胺终止反应，随后将反应液转移至截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，将透析袋两端扎紧置于去离子水中透析处理，每隔5小时换水一次，换水8次后将透析液放入-20℃冷冻过夜后，放入真空冷冻干燥机直至充分干燥至恒重即可得到聚乙二醇单甲醚修饰的可溶性壳聚糖。
S2：称取0.10克S1中所得的可溶性壳聚糖加入到100mL去离子水中，室温下搅拌半小时，以使可溶性壳聚糖完全溶解，从而得到质量百分比为0.1％的均匀溶液；待温度升高至120℃，向可溶性壳聚糖溶液中加入双氰胺，双氰胺与可溶性壳聚糖的物质的量之比为1:10，120℃下加热搅拌6小时，随后将反应液转移至截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，将透析袋两端扎紧置于去离子水中透析处理，每隔10小时换水一次，换水5次后将透析液放入-20℃冷冻过夜后，放入真空冷冻干燥机中直至充分干燥至恒重即可得抗菌功化可溶性壳聚糖。
实施例3
具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物的制备
S1：称取5.00克分子量1000Da脱乙酰度50％的壳聚糖，溶解在10mL100mM pH＝4.50MES缓冲液中，室温下搅拌0.5小时，使壳聚糖完全溶解，得到质量浓度为500mg/mL的均一溶液；随后将在35℃下活化0.5小时的羧基聚乙二醇单甲醚、NHS和EDC·HCl的混合溶液(溶剂为100mM pH＝4.50的MES缓冲溶液)50ml加入上述反应液中，并于35℃下持续搅拌反应12小时，其中壳聚糖、羧基聚乙二醇单甲醚、NHS、EDC·HCl的物质的量之比为1:10:2:2；反应结束后加入与羧基聚乙二醇单甲醚等物质的量的盐酸羟胺终止反应，随后将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，将透析袋两端扎紧置于去离子水中透析处理，每隔10小时换水一次，换水5次后将透析液放入-20℃冷冻过夜后，放入真空冷冻干燥机直至充分干燥至恒重即可得到聚乙二醇单甲醚修饰的可溶性壳聚糖。
S2：称取5.00克S1中所得的可溶性壳聚糖加入到10mL去离子水中，室温下搅拌半小时，以使可溶性壳聚糖完全溶解，从而得到质量百分比为50％的均匀溶液；待温度升高至60℃，向可溶性壳聚糖溶液中加入双氰胺，双氰胺与可溶性壳聚糖的物质的量之比为10:1，20℃下加热搅拌48小时，随后将反应液转移至截留分子量为1000Da的透析袋中，将透析袋两端扎紧置于去离子水中透析处理，每隔5小时换水一次，换水8次后将透析液放入-20℃冷冻过夜后，放入真空冷冻干燥机中直至充分干燥至恒重即可得抗菌功化可溶性壳聚糖。
实施例4
对金黄色葡萄球菌(细菌)的抑制
用灭菌水溶解实施例1中所得的具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物，得到浓度分别为0.10、0.50、1.00mg/mL的水溶液，各取5mL待用；金黄色葡萄球菌经胰蛋白胨大豆肉汤培养至对数期并稀释至浓度为105CFU/mL；取0.1mL上述菌液与具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物水溶液混合，静置10分钟后，取充分作用后的样品-菌液混合液0.1mL均匀涂布于直径90mm的MH琼脂平板上并倒置于37℃培养箱中过夜。经5mL 1×PBS(0.01M,pH＝7.2-7.4)处理过的等量菌液涂布的MH琼脂平板作为对照。对琼脂平板上生长的菌落进行计数，并通过式(2)计算具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物对金黄色葡萄球菌的抑菌率。所得结果如附图1所示，结果表明按照实施例1步骤制备的具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物水溶液能够在较宽浓度范围内对细菌有较强(>95％)的抑制作用。
对白色念珠菌(真菌)的抑制
用灭菌水溶解实施例1中所得的具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物，得到浓度分别为0.10、0.50、1.00mg/mL的水溶液，各取5mL待用；白色念珠菌经沙氏液体培养基培养至对数期并稀释至浓度为105CFU/mL；取0.1mL上述菌液与具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物水溶液混合，静置10分钟后，取充分作用后的样品-菌液混合液0.1mL均匀涂布于直径90mm的沙氏琼脂平板上并倒置于28℃培养箱中过夜。经5mL 1×PBS(0.01M,pH＝7.2-7.4)处理过的等量菌液涂布的沙氏琼脂平板作为对照。对琼脂平板上生长的菌落进行计数，并通过式3计算具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物对白色念珠菌的抑菌率。所得结果如附图1所示，结果表明按照实施例1步骤制备的具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物水溶液能够在较宽浓度范围内对真菌有较强(>95％)的抑制作用。
实施例5
生物细胞增殖抑制率
用不含胎牛血清的DMEM细胞培养基溶解实施例1中所得的具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物，得到浓度分别为5、10、20、40mg/mL的样品溶液；小鼠成纤维细胞L929经DMEM(含10％胎牛血清、1％青霉素、链霉素)细胞培养基培养至对数期，并取0.05mL细胞悬液加入96孔聚苯乙烯培养板中，使每孔含5000-8000个细胞；取等体积样品溶液加入细胞悬液中，使具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物的终浓度分别为2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL。0.05mL 1×PBS(0.01M,pH＝7.2-7.4)作用的细胞悬液作为对照组。将培养板置于5％CO2、37℃的培养箱中继续培养24小时后，吸去各孔中培养基并添加等量的新鲜培养基，同时向每孔加入CCK-8溶液0.01mL，培养2-4小时后通过多模式微孔板检测仪测定450nm处各孔的吸光值，并通过式4计算细胞存活率。所得结果如说明书附图2所示，结果表明经具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物处理的L929细胞存活率较高，通过本发明实施例1制备的具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物具有较低的细胞毒性。
实施例6
血液相容性评价
用生理盐水溶解实施例1中所得的具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物，得到浓度分别为5、10、20、40mg/mL的样品溶液；取体积浓度为5％，分散在生理盐水中的家兔红细胞悬液0.5mL；向其中加入等体积样品溶液，等体积生理盐水做阴性对照，等体积0.1％Triton X-100(生理盐水配制)做阳性对照，100rpm摇床中37℃恒温孵育至分层，1000×g离心10分钟，取上清液转移至96孔板中，通过多模式微孔板检测仪测定540nm处各孔的吸光值并通过式5计算样品值从而表征不同浓度样品血液相容性。所得结果如说明书附图3所示，结果表明具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物溶血值较低，通过本发明实施例1制备的具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物具有良好的血液相容性。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物，其特征在于，所述壳聚糖衍生物具有式(1)所述的结构式：
其中，x、y、m、n均为自然数，6<m+n<6000；0.50<m/(m+n)<0.99；0.10<x/(m+n)<0.50；10<y<200。
2.一种如权利要求1所述具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：壳聚糖与羧基聚乙二醇单甲醚反应，得到聚乙二醇修饰的可溶性壳聚糖；
S2：聚乙二醇修饰的可溶性壳聚糖与双氰胺反应，得到具有抗菌功能的生物相容性壳聚糖衍生物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S1和S2中均包括反应结束后对产物进行透析和真空冷冻干燥的步骤；优选地，所述透析使用的是截留分子量为8000-14000Da的透析袋，透析液为去离子水。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S1中壳聚糖与羧基聚乙二醇单甲醚反应的具体过程为：将羧基聚乙二醇单甲醚、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到2-(N-吗啉代)乙烷磺酸缓冲液，进行羧基活化反应，得到羧基聚乙二醇单甲醚的羧基活化溶液；然后将羧基活化溶液和壳聚糖的稀酸溶液混合，0-35℃下反应12-72h，加入盐酸羟胺终止反应。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，壳聚糖的数均分子量为103-106Da，脱乙酰度为50-99％；优选地，所述羧基聚乙二醇单甲醚的数均分子量为550-8000Da。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述S1中加入的羧基聚乙二醇单甲醚、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、壳聚糖、盐酸羟胺的物质的量之比为1：(0.5-5)：(0.5-5)：(0.1-10)：1。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述S1中羧基活化反应是在0-35℃下反应0.5-3h。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S1中所述壳聚糖的稀酸溶液的溶剂包括稀盐酸溶液或稀醋酸溶液；优选地，所述壳聚糖的质量浓度为1mg/mL-500mg/mL；优选地，所述壳聚糖的稀酸溶液的pH为3.0-5.0。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S2中聚乙二醇修饰的可溶性壳聚糖与双氰胺反应的具体过程为：将聚乙二醇修饰的可溶性壳聚糖的水溶液加热至60-120℃，然后加入双氰胺，继续反应6-48h。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇修饰的可溶性壳聚糖与双氰胺的物质的量之比为1：(0.1-10)。
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