CN109517851B - 一种维生素a醋酸酯的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化合物合成领域，公开了一种维生素A醋酸酯的合成方法，该方法包括将羟基维生素A醋酸酯在有机溶剂中以脱水酶作为催化剂进行脱水反应，使得羟基维生素A醋酸酯脱去一份子水并形成共轭双键。本发明提供的合成方法反应条件温和、能耗低、无副反应、无废水、操作简单、反应收率高，并且产品纯度高、质量好。

Description

一种维生素A醋酸酯的合成方法

技术领域

本发明属于化合物合成领域，具体涉及一种维生素A醋酸酯的合成方法。

背景技术

维生素A及其衍生物是维持人类与动物的生长与生命所不可缺少的物质之一，人体缺乏维生素A，会出现皮肤干燥、脱屑和脱发等症状。最常用的维生素A衍生物是维生素A醋酸酯，其结构式如下：

维生素A醋酸酯用于维生素A缺乏症，该维生素为脂溶性，是调节上皮组织细胞生长与健康的必须因子，使粗糙老化皮肤表面变薄，促进细胞新陈代谢正常化，祛皱效果明显。目前维生素A醋酸酯已被广泛应用于医药、食品添加剂、饲料添加剂及化妆品等行业，其制备合成一直备受关注。传统的Isler合成工艺中，维生素A使用羟基维生素A醋酸酯在有机溶剂中预冷至-55℃～-65℃，用质量浓度≥61％的氢溴酸将其羟基溴代，然后再脱溴形成共轭双键得到维生素A醋酸酯成品，其具体反应过程如下所示：

然而，采用该方法存在以下缺点：

(1)反应路线长，包括上溴、脱溴两步反应，实际工艺化生产还需多次分层萃取，操作步骤繁琐，且会产生大量废水；

(2)需使用其他多种辅料，其中高浓度的氢溴酸具有强腐蚀性，操作危险性大，且设备易被腐蚀；

(3)上溴反应需在超低温条件下反应，能耗高；

(4)整个反应过程对温度及pH值的控制要求极高，易操作失误，从而影响产品质量和外观。

发明内容

本发明针对羟基维生素A醋酸酯脱水生成维生素A醋酸酯合成方法中所存在的以上问题，而提供一种简单高效、产品收率较高、质量较好的维生素A醋酸酯的合成方法。

具体地，本发明提供了一种维生素A醋酸酯的合成方法，其中，该方法包括将羟基维生素A醋酸酯在有机溶剂中以脱水酶作为催化剂进行脱水反应，使得羟基维生素A醋酸酯脱去一份子水并形成共轭双键。

优选地，所述脱水酶产自有机体假单胞菌属、黄杆菌属、乳杆菌属、金黄杆菌属、链球菌属和芽孢杆菌属中的至少一种菌属，更优选产自嗜麦芽寡养单胞菌、嗜冷黄杆菌、植物乳杆菌、脑膜脓毒金黄杆菌、酿脓链球菌和纺锤形赖氨酸芽孢杆菌中的至少一种菌种。

优选地，所述脱水酶按照以下方法获得：通过克隆或化学合成法从所述菌属或菌种中获得酶基因，将该酶基因引入原核表达载体中得到重组载体，之后将所述重组载体转化至大肠杆菌得到重组菌株，所述重组菌株经发酵、分离纯化后得到所述脱水酶；所述酶基因的基因序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。

优选地，所述发酵的方式为将所述重组菌株在含有50～200μg/mL氨苄青霉素的培养基中于25～40℃、100～300rpm条件下震荡培养至OD600值为0.6～0.8，往菌液中加入诱导剂至终浓度为0.8～1.2mM，继续培养20～30h。

优选地，所述分离纯化的方式为将发酵菌液于0～5℃、5000～7000rpm条件下离心分离，弃去上清液，收集菌体，并将收集的菌体重新悬浮于Tris-HCl缓冲液中，超声波破碎后，于0～5℃、5000～7000rpm条件下再次离心分离，收集上层酶液，该酶液即为脱水酶。

优选地，所述脱水酶以固定化酶的形式使用，所述固定化酶包括载体材料以及吸附在所述载体材料上的脱水酶，且所述脱水酶与载体材料的重量比为(1～5)mg:1g。最优选地，所述脱水酶与载体材料的重量比为2mg:1g。

优选地，所述固定化酶采用将脱水酶与载体材料在室温下于摇床中固定化反应5-20小时，之后再洗涤干燥制得。

优选地，所述载体材料选自硅藻土、活性炭、多孔玻璃、硅胶和氧化铝中的至少一种，最优选为硅藻土。

优选地，当所述脱水酶未固定化使用时，则所述羟基维生素A醋酸酯、有机溶剂和酶的用量比为10g︰(50～150)mL:(15～50)mg；当所述脱水酶以固定化酶的形式使用时，则所述羟基维生素A醋酸酯、有机溶剂和固定化酶的用量比为10g︰(50～150)mL:(3～10)g。

优选地，所述脱水反应在减压共沸蒸馏条件下进行。

优选地，所述脱水反应的温度为20～70℃，更优选为30℃～60℃；时间为4h～10h，更优选为5h～8h。

优选地，所述有机溶剂选自C₅～C₈的烷烃、C₅～C₈的环烷烃、C₁～C₈的卤代烃和C₆～C₁₀的芳香烃中的至少一种。

优选地，所述C₅～C₈的烷烃选自正己烷、正庚烷和正戊烷中的至少一种。

优选地，所述C₅～C₈的环烷烃为环己烷。

优选地，所述C₁～C₈的卤代烃为二氯甲烷和/或1-氯己烷。

优选地，所述C₆～C₁₀的芳香烃选自苯、甲苯和二甲苯中的至少一种。

优选地，本发明提供的维生素A醋酸酯的合成方法还包括在所述脱水反应之后，将所得反应液冷却后过滤，所得滤渣作为脱水酶回用，所得滤液经减压蒸发有机溶剂之后得到维生素A醋酸酯。

优选地，所述冷却之后反应液的温度降至20℃以下。

优选地，所述减压蒸发的条件包括温度为50℃～60℃，压力为-0.060～-0.099MPa。

本发明提供的合成方法反应条件温和、能耗低、无副反应、无废水、操作简单、反应收率高，并且产品纯度高、质量好，避免了前述维生素A醋酸酯合成方法存在的缺陷。

采用本发明提供的方法合成的维生素A醋酸酯，外观为黄色油状物。采用《饲料中维生素A的测定高效液相色谱法(GB/T 17817-2010)》的检测方法分析，效价＞250万IU/g，折纯收率可达92％以上，可广泛用作药物、饲料添加剂、食品添加剂等。

具体实施方式

下面将对本发明进行更详细地描述。

本发明以羟基维生素A醋酸酯作为原料，将其溶解在有机溶剂中，使用脱水酶催化脱去一份子水并形成共轭双键得到维生素A醋酸酯，其反应式如下：

所述脱水酶可以为现有的各种能够使得羟基维生素A醋酸酯脱去一份子水并形成共轭双键的酶，例如可产自有机体假单胞菌属、黄杆菌属、乳杆菌属、金黄杆菌属、链球菌属和芽孢杆菌属中的至少一种菌属，具体可产自嗜麦芽寡养单胞菌、嗜冷黄杆菌、植物乳杆菌、脑膜脓毒金黄杆菌、酿脓链球菌、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌等中的至少一种菌种。

根据本发明的一种优选实施方式，所述脱水酶按照以下方法获得：通过克隆或化学合成法从所述菌属或菌种中获得酶基因，将该酶基因引入原核表达载体中得到重组载体，之后将所述重组载体转化至大肠杆菌得到重组菌株，所述重组菌株经发酵、分离纯化后得到所述脱水酶；所述酶基因的基因序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。其中，通过克隆或化学合成法获得酶基因、将酶基因引入原核表达载体中得到重组载体、将重组载体转化至大肠杆菌得到重组菌株的方式均为本领域技术人员公知，在此不作赘述。所述原核表达载体例如可以为PET系列的表达载体(如PET-14、PET-21、PET-22、PET-25、PET-28)、PGEX系列的表达载体(如PGEX-4T-2、PGEX-6T-1)等。所述大肠杆菌例如可以为大肠杆菌BL21(DE3)。

SEQ ID NO:1：

SEQ ID NO:2：

SEQ ID NO:3：

SEQ ID NO:4：

SEQ ID NO:5：

SEQ ID NO:6：

所述发酵的温度可以为25～40℃。此外，所述发酵所采用的培养基可以为现有的各种适合大肠杆菌生长、繁殖的培养基，例如，可以选自LB培养基、SOB培养基、SOC培养基、TB培养基、SB培养基等中的至少一种。所述培养基中还可以含有50～200μg/mL抗生素(如氨苄青霉素)。根据本发明的一种具体实施方式，所述发酵的方式为将所述重组菌株在含有50～200μg/mL氨苄青霉素的培养基中于25～40℃、100～300rpm条件下震荡培养至OD600值为0.6～0.8，往菌液中加入诱导剂至终浓度为0.8～1.2mM，继续培养20～30h。其中，所述诱导剂例如可以为诱导剂IPTG。

所述分离纯化的方式可以为将发酵菌液于0～5℃、5000～7000rpm条件下离心分离，弃去上清液，收集菌体，并将收集的菌体重新悬浮于Tris-HCl缓冲液中，超声波破碎后，于0～5℃、5000～7000rpm条件下再次离心分离，收集上层酶液，该酶液即为脱水酶。

所述脱水酶可以直接使用，也可以经酶固定化之后以固定化酶的形式使用。所述酶固定化处理是指将酶吸附于具有大比表面积和活泼表面的载体材料上，即，所述固定化酶包括载体材料以及吸附在所述载体材料上的脱水酶。具体地，所述固定化酶采用将脱水酶与载体材料在室温下于摇床中固定化反应5-20小时，之后再洗涤干燥制得。所述脱水酶与载体材料的重量比优选为(1～5)mg:1g，最优选为2mg:1g。所述载体材料的具体实例包括但不限于：硅藻土、活性炭、多孔玻璃、硅胶和氧化铝中的至少一种，优选为硅藻土。所述固定化酶不仅可以改善稳定性及重复使用性，而且极易与反应体系分离，因此，优选地，所述脱水酶以固定化酶的形式使用。

一方面，所述有机溶剂用于分散反应物和酶，用量不宜过多，否则会稀释反应物及催化剂的浓度，不仅不利于反应的顺利进行，而且还会降低设备的利用率；另一方面，脱水酶的增加可促进反应的进行，但过多不利于分散且会增加成本。基于以上两个因素综合考虑，当所述脱水酶未固定化使用时，则所述羟基维生素A醋酸酯、有机溶剂和酶的用量比优选为10g︰(50～150)mL:(15～50)mg；当所述脱水酶以固定化酶的形式使用时，则所述羟基维生素A醋酸酯、有机溶剂和固定化酶的用量比优选为10g︰(50～150)mL:(3～10)g。

所述脱水反应在减压共沸蒸馏条件下进行。为了有效地保持脱水酶的活性、提高产品品质并增加产物收率，所述脱水反应的温度优选为20～70℃，更优选为30℃～60℃；时间优选为4h～10h，更优选为5h～8h。

所述有机溶剂可以为现有的各种能够作为反应介质的、不溶或微溶于水的惰性液态物质，优选选自C₅～C₈的烷烃、C₅～C₈的环烷烃、C₁～C₈的卤代烃和C₆～C₁₀的芳香烃中的至少一种，当采用这些优选的有机溶剂时，在减压共沸蒸馏脱水时能较好地将反应副产物水带出，加速反应向正方向进行，提高产物收率。其中，所述C₅～C₈的烷烃优选选自正己烷、正庚烷和正戊烷中的至少一种。所述C₅～C₈的环烷烃特别优选为环己烷。所述C₁～C₈的卤代烃优选为二氯甲烷和/或1-氯己烷。所述C₆～C₁₀的芳香烃优选选自苯、甲苯和二甲苯中的至少一种。

本发明提供的维生素A醋酸酯的合成方法优选还包括在所述脱水反应之后，将所得反应液冷却后过滤，所得滤渣作为脱水酶回用，所得滤液经减压蒸发有机溶剂之后得到维生素A醋酸酯。其中，鉴于反应液温度过高将导致过滤过程中有机溶剂挥发，增大溶剂损耗，优选地，所述冷却之后反应液的温度降至20℃以下。此外，所述减压蒸发的条件优选包括温度为50℃～60℃，压力为-0.060～-0.099MPa，减压蒸发温度过高会破坏产物，降低品质。在本发明中，所述压力均指表压。

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，使用的物料均为市售产品，产品等级均为食品级或医药级。采用《饲料中维生素A的测定高效液相色谱法(GB/T 17817-2010)》的检测方法对产物进行检测分析。

对比例

将羟基维生素A醋酸酯(20g，纯度93.73％)加入到正己烷(100ml)中，搅拌30分钟，充分溶解后，降温至-50℃，加入10ml浓度为61wt％的HBr，反应13min，加入30ml浓度为10wt％的NaOH水溶液淬灭，反应3h后，加入60ml浓度为10wt％的Na₂CO₃水溶液，反应3h后，分层萃取，油层加入80ml蒸馏水洗涤，分层萃取。油层干燥后，在-0.060～-0.099MPa、50℃条件下减压蒸发回收正己烷，得到黄色油状物18.87g。将所得黄色油状物按照《饲料中维生素A的测定高效液相色谱法(GB/T 17817-2010)》的方法进行分析。结果表明，维生素A醋酸酯效价为245.8万IU/g，相当于含量84.55wt％，纯收率为89.69％。该方法操作步骤多，共产生废水160ml，产品纯度较低、质量较差，收率较低。

制备例1

该制备例用于说明本发明提供的脱水酶的合成。

(1)酶合成：将脑膜脓毒金黄杆菌的酶基因(由生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成获得，所述酶基因的基因序列为SEQ ID NO:4)克隆到pET25载体内，然后将所得重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌株，将该重组菌株在含有100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基中于30℃、180rpm条件下振荡培养至OD600值为0.6-0.8，之后往菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，继续培养24h。将菌液于4℃、6000rpm离心15min，弃去上清液，收集菌体。将收集的菌体重新悬浮于Tris-HCl缓冲液(20mM Tris-HCl、300mM NaCl、pH值8.0)中，超声波破碎后，于4℃、6000rpm离心15min，收集上层酶液(5mg/ml)，保存在4℃下。

(2)酶固定化：取2mL上述酶液(5mg/ml)与5g硅藻土(使用前活化处理，即于300℃～450℃烘干2～4h，下同)混匀后置于摇床中，室温下振荡吸附12h，吸去酶液，用20mM的Tris-HCl缓冲液(pH值8.0)洗涤3次，于50℃真空干燥24h，即得到固定化酶。用HPLC法检测得到该固定化酶的活性为12000IU/g。

制备例2

该制备例用于说明本发明提供的脱水酶的合成。

(1)酶合成：将嗜麦芽寡养单胞菌的酶基因(由生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成获得，所述酶基因的基因序列为SEQ ID NO:1)克隆到pET25载体内，然后将所得重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌株，将该重组菌株在含有50μg/mL氨苄青霉素的TB培养基中于25℃、100rpm条件下振荡培养至OD600值为0.6-0.8，之后往菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度为1.2mM，继续培养30h。将菌液于4℃、7000rpm离心15min，弃去上清液，收集菌体。将收集的菌体重新悬浮于Tris-HCl缓冲液(20mM Tris-HCl、300mM NaCl、pH值8.0)中，超声波破碎后，于4℃、7000rpm离心15min，收集上层酶液(5mg/ml)，保存在4℃下。

(2)酶固定化：取1mL上述酶液(5mg/ml)与5g硅藻土混匀后置于摇床中，室温下振荡吸附20h，吸去酶液，用20mM的Tris-HCl缓冲液(pH值8.0)洗涤3次，于50℃真空干燥24h，即得到固定化酶。用HPLC法检测得到该固定化酶的活性为10800IU/g。

制备例3

该制备例用于说明本发明提供的脱水酶的合成。

(1)酶合成：将嗜冷黄杆菌的酶基因(由生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成获得，所述酶基因的基因序列为SEQ ID NO:2)克隆到pET25载体内，然后将所得重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌株，将该重组菌株在含有200μg/mL氨苄青霉素的TB培养基中于40℃、300rpm条件下振荡培养至OD600值为0.6-0.8，之后往菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度为0.8mM，继续培养20h。将菌液于4℃、5000rpm离心15min，弃去上清液，收集菌体。将收集的菌体重新悬浮于Tris-HCl缓冲液(20mM Tris-HCl、300mM NaCl、pH值8.0)中，超声波破碎后，于4℃、5000rpm离心15min，收集上层酶液(5mg/ml)，保存在4℃下。

(2)酶固定化：取5mL上述酶液(5mg/ml)与5g硅藻土混匀后置于摇床中，室温下振荡吸附5h，吸去酶液，用20mM的Tris-HCl缓冲液(pH值8.0)洗涤3次，于50℃真空干燥24h，即得到固定化酶。用HPLC法检测得到该固定化酶的活性为10500IU/g。

制备例4

该制备例用于说明本发明提供的脱水酶的合成。

按照制备例1的方法合成和固定化脱水酶，不同的是，脱水酶产自植物乳杆菌(酶基因由生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成获得，所述酶基因的基因序列为SEQ IDNO:3)，酶合成以及酶固定化的方式和条件均与实施例1相同，得到固定化酶。用HPLC法检测得到该固定化酶的活性为12080IU/g。

制备例5

该制备例用于说明本发明提供的脱水酶的合成。

按照制备例1的方法合成和固定化脱水酶，不同的是，脱水酶产自酿脓链球菌(酶基因由生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成获得，所述酶基因的基因序列为SEQ IDNO:5)，酶合成以及酶固定化的方式和条件均与实施例1相同，得到固定化酶。用HPLC法检测得到该固定化酶的活性为11960IU/g。

制备例6

该制备例用于说明本发明提供的脱水酶的合成。

按照制备例1的方法合成和固定化脱水酶，不同的是，脱水酶产自纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(酶基因由生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成获得，所述酶基因的基因序列为SEQ ID NO:6)，酶合成以及酶固定化的方式和条件均与实施例1相同，得到固定化酶。用HPLC法检测得到该固定化酶的活性为11910IU/g。

实施例1

将羟基维生素A醋酸酯(20g，纯度93.57％)加入到正己烷(100ml)中，搅拌30分钟，充分溶解后，加入由制备例1制得的固定化酶(6g)，对搅拌釜进行抽真空，通过调节真空控制反应温度为20℃，反应10h后，将反应液冷却至20℃以下，过滤得到酶，可直接套用到下一次反应。将滤液在-0.060～-0.099MPa、50℃条件下减压蒸发回收正己烷，得到黄色油状物19.00g。将所得黄色油状物按照《饲料中维生素A的测定高效液相色谱法(GB/T 17817-2010)》的方法进行分析。结果表明，维生素A醋酸酯效价为253.22万IU/g，相当于含量87.11wt％，纯收率为93.20％。

实施例2

将羟基维生素A醋酸酯(20g，纯度94.02％)加入到环己烷(200ml)中，搅拌30分钟，充分溶解后，加入由制备例4制得的固定化酶(10g)，对搅拌釜进行抽真空，通过调节真空控制反应温度为30℃，反应8h后，将反应液冷却至20℃以下，过滤得到酶，可直接套用到下一次反应。将滤液在-0.065～-0.099MPa、55℃条件下减压蒸发回收环己烷，得到黄色油状物18.93g。将所得黄色油状物按照《饲料中维生素A的测定高效液相色谱法(GB/T 17817-2010)》的方法进行分析。结果表明，维生素A醋酸酯效价为254.06万IU/g，相当于含量87.40wt％，纯收率为92.71％。

实施例3

将羟基维生素A醋酸酯(20g，纯度93.87％)加入到正庚烷(250ml)中，搅拌30分钟，充分溶解后，加入由制备例5制得的固定化酶(16g)，对搅拌釜进行抽真空，通过调节真空控制反应温度为60℃，反应6h后，将反应液冷却至20℃以下，过滤得到酶，可直接套用到下一次反应。将滤液在-0.080～-0.099MPa、60℃条件下减压蒸发回收正庚烷，得到黄色油状物18.98g。将所得黄色油状物按照《饲料中维生素A的测定高效液相色谱法(GB/T 17817-2010)》的方法进行分析。结果表明，维生素A醋酸酯效价为253.73万IU/g，相当于含量87.28wt％，纯收率为92.94％。

实施例4

将羟基维生素A醋酸酯(20g，纯度93.69％)加入到二氯甲烷(300ml)中，搅拌30分钟，充分溶解后，加入由制备例6制得的固定化酶(20g)，对搅拌釜进行抽真空，通过调节真空控制反应温度为70℃，反应4h后，将反应液冷却至20℃以下，过滤得到酶，可直接套用到下一次反应。将滤液在-0.090～-0.099MPa、60℃条件下减压蒸发回收二氯甲烷，得到黄色油状物18.99g。将所得黄色油状物按照《饲料中维生素A的测定高效液相色谱法(GB/T17817-2010)》的方法进行分析。结果表明，维生素A醋酸酯效价为252.95万IU/g，相当于含量87.01wt％，纯收率为92.93％。

实施例5

按照实施例1的方法合成维生素A醋酸酯，不同的是，将由制备例1制得的固定化酶采用相同重量份的由制备例2制得的固定化酶替代。结果表明，维生素A醋酸酯效价为252.34万IU/g，相当于含量86.80wt％，纯收率为92.57％。

实施例6

按照实施例1的方法合成维生素A醋酸酯，不同的是，将由制备例1制得的固定化酶采用相同重量份的由制备例3制得的固定化酶替代。结果表明，维生素A醋酸酯效价为252.51万IU/g，相当于含量86.86wt％，纯收率为92.36％。

实施例7

按照实施例1的方法合成维生素A醋酸酯，不同的是，将由制备例1制得的固定化酶(6g)采用由制备例1所得未固定化的酶液(8ml)替代，具体过程如下：

将羟基维生素A醋酸酯(20g，纯度93.57％)加入到正己烷(100ml)中，搅拌30分钟，充分溶解后，加入由制备例1所得未固定化的酶液(8ml)，对搅拌釜进行抽真空，通过调节真空控制反应温度为20℃，反应10h后，将反应液静置分层，将油层在-0.060～-0.099MPa、50℃条件下减压蒸发回收正己烷，得到黄色油状物。将所得黄色油状物按照《饲料中维生素A的测定高效液相色谱法(GB/T 17817-2010)》的方法进行分析。结果表明，维生素A醋酸酯效价为251.88万IU/g，相当于含量86.65wt％，纯收率为92.36％。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门金达威集团股份有限公司

<120> 一种维生素A醋酸酯的合成方法

<130> JDWJ-18004-CNI

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1770

<212> DNA

<213> 嗜麦芽寡养单胞菌

<400> 1

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tgtccagtgg atgcgcgtgg cctgcttgcg gcccggctgc agatcaaagt cgacatcggt 1020

cacttcggtg ccgtactgga acaccacgcc atggtcctgc agccacttca ccagtggcag 1080

caccagcgac tcgtactggt tgtagcgggt gaacttcagc gccgagaagt ccggcagccc 1140

accgatgtgg tggatgaaac ggtgcaggta cagcttcatc tccagcgccg agtgccattc 1200

ctcgaacgcg aacatcgtgc gccagtacag ccagaagttg ctgtccagga aatcacggcc 1260

cagcacctcg tcgatgcgct tgttctccat ctcctgccgg gtggccagga acagcgcgat 1320

gatgtccttc tgcgcctgtt cgctcagggt aaagaggcca tcggtgtgcg catcctcgcc 1380

gcgattgatc gtggcgcgct gcaaggaata gttcgggtcg tccttgttca accagtagaa 1440

ctcgtccagc acgctggcgt cggcgatctc cagtgacggg atcgagcgga acagatccca 1500

caggcactcg aagtggtcct ccatctcgcg gcccccgcgg attacaaagc ccttctccgg 1560

caccttcagg ccatccagcg cgccgccagg aatctgctgc tgctcaagaa tggtgatgcg 1620

ctttccggcc atgcgcccgt cacgtatcag gaacgcggcg ccggccagcg aggccaggcc 1680

cgaaccgacg aaccatgcgc gcttgtcatc gacaccggcg ggcttgcgcg gacgcgcgaa 1740

ggcttcgtag ttgccactgc tgtaatacat 1770

<210> 2

<211> 1935

<212> DNA

<213> 嗜冷黄杆菌

<400> 2

ttaaagactt tttgcccatt cttgaagttt tccaaattgc tcactaataa atgattcgtg 60

gtgttcttcg gtctgatcat tgttaggtaa aatatgttcg aagtaggtgt tcttcaatac 120

ctttcttaaa atactttcac caggaaaagg catgttgtca tttaatgctt ttgtagcttt 180

taataactgg cgaatatcgt attgtgttcc tgcaatatct ggtacttgtt tattagagtt 240

taataattta taaacggctg ttctagcagt tcttaccgat gattctacgg taaatacaac 300

atcatttttt gtctctacaa actgccccac aagtcctaaa tttttacatc cttctggtac 360

tatttctggt ctatcgccgg tggctctagg caaaaacata gatgtaatat atggcataaa 420

agcagtacga acaatggtat tttctattac gttttctaat tgattttcca aatcaaggtg 480

ataacataat tctgataaaa tttcgttacc agtacattga gtcattgttt tttgcacata 540

atttcctggt ttgtctatgt ataaggcata aacccaaact actaaaatat catctggttg 600

cgtaggataa tgtggctgac ggttgatggt aaaactcatt aaccaatttg aatcggtaat 660

ggttacaata ccgcctgttg cagtttttcc tgaataagga tcatttacac aatactcttt 720

aaatttctct gttaaatctg aggggcgaca ggttaaagtt gcagattgcc aagccgattt 780

ttctatcgaa ctgcaaaatt tttcaggtct tccaaagaca gacgacttag cggctaaatt 840

tttccataat tcccagcccg cactttctcc gctttcatta ttatcgagtc ctgcaatggc 900

tggttttgta ttggttccat acgaagtatc ttcggtcata gaacctgtgg ttactattac 960

ataatcattt tttgtaacag gaattactac ttctttattg ttttgtttgg taattatacc 1020

ttttacaatt tttccttcag aattaatttg aatgtctaaa tctttaacca gtgtgtcaaa 1080

ctgaattttt acgcctttag attttagatg ctccgttaat ggttttacaa atgtatcata 1140

ctgattgtat tttgggaaaa ttaagcaaga taaatctttc atcccatcga tggtgtgcaa 1200

aaaacggtgc atgtataatt tgcactctag taaactatgc cagttctcga aagcaaacat 1260

agtacgccat aaaaaccaaa aattactttg taaaaaggat ttactaaaat aatcttcaat 1320

ggttaaatca tctaaatctt ctttcttttt taataaaagt tttacaatgg ctaattgatc 1380

ttttttctct aaaccaaatt tactaaaatc tttaacaaca cctttattgt gaattaatcg 1440

agctttggag taattaggat cgttatcatt tagcaaacga tattcatcta aaacgctata 1500

gggagcaggt agctctaagg caggaatatc ctgaaaaata tcccaaagat tctcataagt 1560

catctccatt tctctaccac ctctaataat ataaccatca ttggcatttc cagctccatc 1620

aagcgaacca cctgctaccg aaagtttatc taaaaaaata atatttttgc ctaaaaaatg 1680

accatctcta ataaaataat atgctgccga taaacctgct attccgctac ctacaatata 1740

aactttacta tctttaaatg attttgaagg aatgccttta ttgcgctgat aatttcctgt 1800

taaatctgca aagggcattg aaatatcttt tgaattgcga accacatctt tacttgcatc 1860

aggtgtgtga tttacgttgc ctaaaaaagg agaaacgttt aatactttgt caaattttga 1920

ggtttcttta ttcat 1935

<210> 3

<211> 1695

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌

<400> 3

atgatcaagc ataaggcgat catgatcggt gcagggctgg ccaatatggc tgcagctgtt 60

tatctcattc aggaagctca ttggcaaggt gatcaaatca ccttctattc actggatgat 120

catggttcaa atgatggtgc cccaacagtc gatactgtgg atgaatattg gaacaaaaat 180

catcccatgg aaaacacgaa gggctatgtt gctcggggcg gtcggatgtt gaattaccgg 240

acgtatgtcg atttgatgga tttgcttagt cggattccat cggcaacgga accgggactc 300

acagctgaag aagacacgcg ccaattcgat gcccaacatc ggacgtttga taaagctcgg 360

ttgatggaag gcggtattgg catcatccaa gcaggacact tgggcctgaa taacacggat 420

cgccttttgc tgacgaagtt aatcatgatg cctgattccg aagaagaaaa gctcgacaat 480

gttagcatcg ccgactactt caaggatgat ccgcacatgt tccaaaccaa tttctggtat 540

atgtgggaaa ccacctttgc cttccgcaca caaagttctg cgcaggaatt gcggcggtac 600

atgcacatga tgatttatga atttactcaa attgagcatt tagtcggggt taaccggacc 660

cgctataatc aatttgaaag cattatgctg ccactgatta attacctgaa ggagcaaggc 720

tgcaagatca ttttgaaccg gcgtgtcaca gcgtttgaat ttaaagacac ggccatgacc 780

gatgaaatta cagttacggg tctcaccatt ctgaacacag agactgatga cgaagaacat 840

attaccgttg atgatgagac cgccgttttc ttcacaaatg gatcgatcac cgactccgca 900

actcaaggtg actttgatca tgcagcagtc gaaaacatgg actacggtgc tgccgcgagt 960

ctgtggaaac aagcgactgg gcatttttat aaccttggta atcctgataa gttctttgcg 1020

gatcggtcat ccagcgagtg ggtcagcttc accttgacga ccaaagacca tttgttgctt 1080

aacgaaatcg aacgtattac aacgcaagtt cctggtaaag ccctgaattc gttcatgtca 1140

acccaaccaa tcacggcact tgggcaaaaa gatgttatga tgtcaatcgt ggtacatcat 1200

cagccgcact ttaccaccca gaaaccaaac gagaccgtct tgtggggcta cttcctttat 1260

ccacggcgct acggtgaatt tgtcaacaag ccgtatatcg aaatgacggg taaagagatg 1320

gcccttgaat tgattggtca gcttgctaaa gttgatcccg gtcctagtaa tattcgtgat 1380

catcaagatg agattatggc aagcatcatc aacaacatcc ctgtttatat gccatatgct 1440

tcggcactct tcaacaatcg cgccaaggtt gatcggccag acgtgattcc agcacattca 1500

acaaaccttg cctttaccgg tgaattcgct gaacaaccat tccaaatggt cttcactgag 1560

caaagtgctg ttcgttcagg tgagattgcc gcttatcatt tcaccggcat tccaatgagt 1620

catttagtta aaacaccgcg gtatgataaa gacatcaaga cattgatgcg tgccacgaaa 1680

aaaatgtttg aataa 1695

<210> 4

<211> 1941

<212> DNA

<213> 脑膜脓毒金黄杆菌

<400> 4

atgaacccaa taacttcaaa atttgacaaa gtacttaatg cttcttccga atacggacat 60

gtaaaccatg aaccggattc cagtaaagaa cagcaacgaa acaccccgca aaaatcaatg 120

cccttttctg atcagattgg aaattatcag agaaacaaag ggattcctgt acaatcatat 180

gacaatagta agatttacat tataggcagt ggaatcgcag gtatgtcggc agcttattat 240

tttatacgcg atgggcatgt tcctgcaaaa aacatcacct tcttggaaca attgcatatc 300

gatggcggtt cattagatgg tgccggaaat ccgacagacg gctatattat ccgtggcggt 360

cgtgaaatgg acatgacgta cgaaaatctt tgggatatgt ttcaggatat acctgcctta 420

gaaatgcctg ctccttacag tgtactggac gaatacagat taattaatga taacgactcc 480

aattattcta aagcccggtt aatcaacaat aaaggtgaga taaaagactt tagcaagttc 540

ggcctaaata aaatggacca gttagctatt atcagattac ttctgaaaaa taaagaagaa 600

ctggacgatt taaccattga ggattacttc agcgaatcct tcctgaaaag taatttctgg 660

actttttgga gaacgatgtt tgcctttgaa aactggcata gcttattgga actgaaactt 720

tacatgcacc gtttccttca cgccatagac ggactgaacg atctgtcttc actggtattc 780

cctaaataca accaatacga caccttcgta actcctctgc gcaaattcct tcaggaaaaa 840

ggtgttaata tccacctgaa cactctggta aaagatctgg atatccacat caataccgaa 900

ggaaaagttg tagaaggaat tatcaccgaa caggatggta aggaagtaaa aatccctgtt 960

ggtaaaaatg actatgtcat tgtaactaca ggttccatga cggaagatac cttctacgga 1020

aataataaaa ctgctcctat tattggcata gacaacagca caagcggaca aagtgccgga 1080

tggaagttgt ggaaaaatct ggctgcaaaa tcagaaattt ttgggaaacc agagaaattc 1140

tgcagcaata tcgagaaatc tgcatgggaa tctgcaacgc taacctgtaa accttcagcc 1200

cttatcgaca agctgaaaga atactctgtt aacgatccat attccggaaa aactgttacc 1260

ggcggtatta ttaccattac agattccaac tggctgatga gtttcacctg caacagacag 1320

ccacacttcc cggaacagcc ggatgatgta ctggtacttt gggtatatgc cttattcatg 1380

gacaaagagg gaaactatat caaaaaaaca atgctggaat gtacaggaga tgaaattctt 1440

gcagaattat gctaccattt aggtattgaa gatcagctgg aaaatgtaca gaaaaataca 1500

attgtaagaa ctgcattcat gccctatata acttctatgt ttatgccaag agctaaaggc 1560

gatcgcccta gagtagtgcc tgaaggctgt aaaaatctgg gactggtagg tcagtttgta 1620

gaaaccaata atgatgtggt atttacaatg gaaagctctg taagaacagc gagaattgct 1680

gtctacaaat tactaaacct caacaaacag gttcctgata tcaatccttt acagtatgat 1740

atccgacatc tgctaaaagc agcaaaaaca ctgaatgatg acaaaccatt tgtaggtgaa 1800

ggcttgttga gaaaagtcct taaaggaact tactttgaac atgtgttacc tgccggtgca 1860

gcagaggaag aagaacatga atcctttatc gctgaacatg taaataagtt cagagaatgg 1920

gtaaaaggaa taagaggata a 1941

<210> 5

<211> 1773

<212> DNA

<213> 酿脓链球菌

<400> 5

atgtattata ctagtggtaa ttacgaagct tttgcaacac ctcgaaaacc tgaaggggta 60

gatcagaaat cagcttatat tgttggcact ggtttagctg gtttagcagc agctgttttc 120

cttattcgcg atgggcatat ggctggggaa cgcattcatc tgtttgagga attgccttta 180

gcaggtggtt ctttagatgg tattgaaaag cctcatcttg gttttgtgac ccgtggtggt 240

cgtgagatgg aaaatcattt tgagtgtatg tgggacatgt atcgctctat tccctcactg 300

gaaattcccg gtgcgtctta tttagatgaa ttttattggt tggataagga tgatcctaac 360

tcatccaact gtcgtttgat tcacaagaga ggaaatcgtg tggatgatga cggccagtat 420

acgctcggta aacagtcaaa agaattaatc catttaatca tgaagacaga agaatctcta 480

ggagaccaaa ccattgaaga gttcttctca gaagatttct ttaagagtaa tttttgggtg 540

tattgggcaa ccatgtttgc ttttgaaaaa tggcactctg ctgtagaaat gcggcgctat 600

gcgatgaggt ttatccacca tattgatggt ttgccagatt ttacctccct caagttcaac 660

aaatataacc aatatgactc tatggtcaaa ccgattattg cttacctaga atcacacgac 720

gttgacatcc aatttgacac aaaagtcact gatattcagg tggaacaaac agctggtaaa 780

aaggtagcaa aaaccatcca tatgacggtg tctggggagg ctaaggcgat tgagctaaca 840

cctgatgatt tggtttttgt gaccaatggt tctattactg aaagcagcac atacggtagt 900

catcacgaag tggctaagcc aaccaaagcg ttaggtggtt cttggaattt atgggaaaat 960

ctagctgctc aatcagatga ttttggtcat cctaaagtgt tttaccagga cttgcctgct 1020

gaaagctggt ttgtgtctgc cacagcaacc ataaaacacc cagctatcga gccttatatt 1080

gaacgtttga cccaccgtga cttgcacgat ggcaaagtga acactggcgg catcatcact 1140

attacagatt ctaactggat gatgagcttt gccattcacc gtcaacctca ttttaaagaa 1200

caaaaagaaa atgagaccac tgtctggatt tacggtcttt attccaatag taagggcaat 1260

tacgtccaca agaaaattga ggagtgtaca ggtcaagaaa tcacagaaga atggttgtac 1320

caccttgggg tacctgttga taaaatcaag gacttagcga gtcaggacta tatcaataca 1380

gttcctgttt acatgcctta tattacgagt tactttatgc cacgcgtcaa aggagaccgt 1440

ccgaaagtta tcccagatgg ttcagtcaac ttggccttta ttggtaactt tgcggaatct 1500

ccatctcgag atacggtctt tacgactgag tattctattc gtactgccat ggaagcagtg 1560

tatagcttct tgaatgtgga acgaggcatc ccagaagtct ttaattcagc ctatgatatt 1620

cgtgaattgc tcaaagcctt ttattacctt aatgataaaa aggcaatcaa ggatatggat 1680

ttgccaattc ctgcactgat tgagaaaatc ggacataaaa aaatcaagga tacctttatc 1740

gaagaattgc tcaaagatgc taatcttatt taa 1773

<210> 6

<211> 1773

<212> DNA

<213> 纺锤形赖氨酸芽孢杆菌

<400> 6

ttatatcaat ttactttctt ttagtaaatc ataaatgatt gtatcctttg ttttatgaat 60

acctaattta ccgatttgtt ttaagataaa tggcgcatct atatctgtca attttttacc 120

atctagtaag cgagccgttg acgctaataa cgtacgaata tcaaaggcag aagcaaatac 180

ttcaggaacc cctcggtcaa ttgctaataa ttgataaacc gcctccattg ctgttcttac 240

tgaatattct gttgtgaata cggtatctct ttcagtttca ctaaaattcc ctataaaggc 300

taggtttaca gatccttttg ggacaactaa cggacgatcg cctattgctc tcggcataaa 360

gtaagatgtg atatatggca tatagcatgg gattgtctga caagaatttt gcgctaaatc 420

tggaatatcc tcaacaggta cacccatatg gtacaaccac tcttgtgcta tctcactgcc 480

actacattcc gtaatacttt ttttaataaa atcccctggc ttattagata gtaaaccata 540

aatccaaaca actaattgat cttttggttg atttttaaaa tgaggttgtc gattcaatgt 600

atagcttagc atccaattcg aatcttttgc tgttacaata ccacccgtaa cgaccttccc 660

cgcatatgga tctcttttac taatcttttc aatataaggt gctactcgat catctaatgt 720

agtgagtgtt gctgaaacaa accaactttc tttcggcaaa ttatcacaga atttttctgg 780

tcttccaaac gcagcatctt gggcagcgat gtttttccaa agagaccagc ttcctcctaa 840

gtcagttgtt tcaggggctg gtgtgttatt gtctccatac gttgtacttt ccgtaatact 900

accatttgtc acaaaaacca attcattttc ggttagctct atattttttt tctcaccatt 960

ttgctttaac actaatgtat gagctacctt tttatctcca acattgtcaa ttagaacatt 1020

ttcgacaacc gtattatatt ggaaatcaac attatgtttt tctaaatagt tgatcatcgg 1080

aagtactagg gattcatact ggttatactt tgtaaatttc agtgcagata aatctggtaa 1140

tccaccaata tgatggataa agcgcataat gtaacgacgc atttccatag cagaatgcca 1200

tttttcaaag gcaaacatcg tggaccaata cagccaaaaa ttcgattcaa aaaattcatc 1260

agagaaaaca tctgtaattt ttttatcctc tagcttctct tcaggcgtaa agaataattt 1320

aatcatttct tcagacgatt gatcggataa tgtgaacttt ccgtcatcct ctaatctttg 1380

tcctcgattc tccattaatc tacattttga ataattagga tcttctttat ttaaccaata 1440

aaattcatct aaaaccgaag cattttctat ttctaatgat ggaatggaac ggaataaatc 1500

ccataagcat tcaaagtgat cttccatttc tcgaccacca cgaataataa accctcttgt 1560

cggatttaaa attccgtcaa gactaccgcc tgaaatatct aactcttcaa gaatatgaat 1620

attctcacct ttcatttggc catcacgaat taaaaaacat gcggctgaaa gtgaggcaag 1680

ccccgaacca atcagatagg ctgatttttc atcgacaccc tcgggttttt tcggacgtgc 1740

gaaagcttca taattaccat tactgtaata cat 1773

Claims (19)

1.一种维生素A醋酸酯的合成方法，其特征在于，该方法包括将羟基维生素A醋酸酯在有机溶剂中以脱水酶作为催化剂进行脱水反应，使得羟基维生素A醋酸酯脱去一份子水并形成共轭双键；所述脱水酶产自有机体假单胞菌属、黄杆菌属、乳杆菌属、链球菌属和芽孢杆菌属中的至少一种菌属；所述脱水酶按照以下方法获得：通过克隆或化学合成法从所述菌属中获得酶基因，将该酶基因引入原核表达载体中得到重组载体，之后将所述重组载体转化至大肠杆菌得到重组菌株，所述重组菌株经发酵、分离纯化后得到所述脱水酶；所述酶基因的基因序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6。

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述脱水酶产自嗜麦芽寡养单胞菌、嗜冷黄杆菌、植物乳杆菌、酿脓链球菌和纺锤形赖氨酸芽孢杆菌中的至少一种菌种。

3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述发酵的方式为将所述重组菌株在含有50～200μg/mL氨苄青霉素的培养基中于25～40℃、100～300rpm条件下震荡培养至OD600值为0.6～0.8，往菌液中加入诱导剂至终浓度为0.8～1.2mM，继续培养20～30h。

4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述分离纯化的方式为将发酵菌液于0～5℃、5000～7000rpm条件下离心分离，弃去上清液，收集菌体，并将收集的菌体重新悬浮于Tris-HCl缓冲液中，超声波破碎后，于0～5℃、5000～7000rpm条件下再次离心分离，收集上层酶液，该酶液即为脱水酶。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的合成方法，其特征在于，所述脱水酶以固定化酶的形式使用，所述固定化酶包括载体材料以及吸附在所述载体材料上的脱水酶，且所述脱水酶与载体材料的重量比为(1～5)mg:1g。

6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述脱水酶与载体材料的重量比为2mg:1g。

7.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述固定化酶采用将脱水酶与载体材料在室温下于摇床中固定化反应5～20小时，之后再洗涤干燥制得。

8.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述载体材料选自硅藻土、活性炭、多孔玻璃、硅胶和氧化铝中的至少一种。

9.根据权利要求1-4中任意一项所述的合成方法，其特征在于，当所述脱水酶未固定化使用时，则所述羟基维生素A醋酸酯、有机溶剂和酶的用量比为10g︰(50～150)mL:(15～50)mg；当所述脱水酶以固定化酶的形式使用时，则所述羟基维生素A醋酸酯、有机溶剂和固定化酶的用量比为10g︰(50～150)mL:(3～10)g。

10.根据权利要求1-4中任意一项所述的合成方法，其特征在于，所述脱水反应在减压共沸蒸馏条件下进行；所述脱水反应的温度为20～70℃，时间为4h～10h。

11.根据权利要求10所述的合成方法，其特征在于，所述脱水反应的温度为30℃～60℃，时间为5h～8h。

12.根据权利要求1-4中任意一项所述的合成方法，其特征在于，所述有机溶剂选自C₅～C₈的烷烃、C₅～C₈的环烷烃、C₁～C₈的卤代烃和C₆～C₁₀的芳香烃中的至少一种。

13.根据权利要求12所述的合成方法，其特征在于，所述C₅～C₈的烷烃选自正己烷、正庚烷和正戊烷中的至少一种。

14.根据权利要求12所述的合成方法，其特征在于，所述C₅～C₈的环烷烃为环己烷。

15.根据权利要求12所述的合成方法，其特征在于，所述C₁～C₈的卤代烃为二氯甲烷和/或1-氯己烷。

16.根据权利要求12所述的合成方法，其特征在于，所述C₆～C₁₀的芳香烃选自苯、甲苯和二甲苯中的至少一种。

17.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，该方法还包括在所述脱水反应之后，将所得反应液冷却后过滤，所得滤渣作为脱水酶回用，所得滤液经减压蒸发有机溶剂之后得到维生素A醋酸酯。

18.根据权利要求17所述的合成方法，其特征在于，所述冷却之后反应液的温度降至20℃以下。

19.根据权利要求17所述的合成方法，其特征在于，所述减压蒸发的条件包括温度为50℃～60℃，压力为-0.060～-0.099MPa。