CN109517849A - 一种利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，包括以下步骤：(1)利用基因工程方法构建含有编码反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列的工程菌株，所述反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列来源于松针炭疽菌，该核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)利用所述工程菌株进行培养，并分离纯化，得到反式茴香脑加氧酶；(3)利用反式茴香脑加氧酶催化反式茴脑的加氧反应，得到茴香醛。本发明采用酶催化反式茴香脑生成茴香醛，反应条件温和，减少反应体系对环境造成的污染，而且得到的产物可归为天然香料。

Description

一种利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法
技术领域
本发明涉及茴香醛的制备方法，具体涉及一种利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法。
背景技术
八角茴香油(star anise oil)又称大茴香油、茴油，是对八角果实或枝叶进行蒸馏而提取出来的芳香精油，其在常温下为无色透明或淡黄色的油状液体，具有八角茴香的特殊香味。八角茴香油含有80-90％的反式茴香脑(trans-anethole)。反式茴脑化学名称为对丙烯基茴香醚，分子式为C10H12O，分子量为148.2。茴香醛(p-anisaldehyde,anisicaldehyde)又称为对甲氧基苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛、对茴香醛、大茴香醛，分子式是C8H8O2，具有持久的山楂香气。在山楂花、葵花、紫丁香香精中作主体香料；在铃兰香精中作香剂；在桂花香精中作修饰剂，也可用于日用香精和食品香精。主要用于配制香草、香辛料、杏、奶油、茴香、焦糖、樱桃、巧克力、胡桃、树莓、草莓、薄荷等型香精，与蜜橘等的精油配合，效果很好。在医药工业中用于制造抗微生物的药物羟氨苄基青霉素等，是抗组织胺药物的中间体。
目前茴香醛的制备方法主要是化学法，第一类是以天然茴香脑为原料，通过氧化反应制得茴香醛；第二类是以石油化工产品为原料，经有机合成制得茴香醛。但化学法存在分离困难、反应条件苛刻、污染严重等问题。根据欧洲和美国的法律规定，“天然”香料只能从天然原料中萃取或酶、微生物工艺来制备，用微生物、酶来合成的茴香醛可归为“天然”产品。天然香料的价格往往要远高于化学香料的价格。
关于生物合成茴香醛的研究，研究人员一般以反式茴香脑为唯一碳源，从土壤中筛选利用反式茴香脑合成茴香醛的微生物。Shimoni等从土壤中分离到一株能以反式茴脑为唯一碳源的菌株Arthrobacter aurescens TA13，除了反式茴香脑，TA13还可以茴香酸、茴香醛、茴香醇用作唯一碳源，将异丁香酚转化为香草醛、香草酸。通过对代谢产物、各种突变株的研究，作者提出其反式茴脑的代谢途径(Shimoni E,Ravid U,Baasov T,et al.Thetrans-anethole degradation pathway in an Arthrobacter sp..J Biol Chem,2002,277:11866-11872；Shimoni E,Baasov T,Ravid U,et al.Biotransformations ofpropenylbenzenes by an Arthrobacter sp.and its t-anethole blocked mutants.JBiotechnol,2003,5:61-70)。广西大学刘雄民研究组从八角树下土壤中分离筛选出菌株Pseudomonas sp.BT-13，能以茴油为碳源合成茴香醛、茴香酸(粟桂娇，刘雄民，朱萍，等.反式茴脑生物降解菌株的筛选及其生物转化.化工进展，2009，28：141-144，172)。BT-13经海藻酸钙固定化处理后，在乙酸-水两相系统中将茴脑转化为茴香醛，摩尔转化率达到12.6％(粟桂娇，刘雄民，李伟光，等.两相系统中生物转化茴脑生成茴香醛.精细化工，2009，26：136-141)。广西民族大学武波研究组也对茴香醛的生物合成进行了研究，他们以反式茴香脑为唯一碳源，通过富集培养和分离纯化，从环境中筛选到320株能以反式茴香脑为唯一碳源的菌株，其中的WGB30和WGP7能产茴香醛，产量最高的为Burkholderia sp.WGB30，培养60小时茴香醛的摩尔转化率达5.08％(梁肖仍，宋张扬，曾华贺，等.一株转化茴脑生成茴香醛的菌株筛选与鉴定.食品与生物技术学报，2011，30：956-961)。
韩国光州科技院的Hor-Gil Hur研究组从土壤中分离到Pseudomonas putidaJYR-1，该菌能以高浓度的反式茴香脑(100mM)为唯一碳源和能源，代谢产物包括茴香脑环氧化合物、茴香酸和对羟基苯甲酸(Ryu J,Seo J,Lee Y,et al.Identification of syn-and anti-anethole-2,3-epoxides in the metabolism of trans-anethole by thenewly isolated bacterium Pseudomonas putida JYR-1.J Agric Food Chem,2005,53:5954-5958)。该研究组通过构建菌株JYR-1的基因组文库、Tn5突变分析，分离出一个长度为1047bp的ORF，该ORF可使大肠杆菌将反式茴香脑转变为茴香醛，证实ORF编码的产物为反式茴香脑加氧酶(TAO,trans-anethole oxygenase)[Han D,Ryu J Y,Kanaly R A,etal.Isolation of a gene responsible for the oxidation of trans-anethole topara-anisaldehyde by Pseudomonas putida JYR-1and its expression inEscherichia coli.Appl Environ Microbiol,2012,78:5238-5246]。该酶催化反式茴脑的加氧反应，不需要类似辅助蛋白的电子传递黄素还原酶，因此属于自给自足类型(self-sufficient)的单组分黄素蛋白单加氧酶。Pseudomonas putida JYR-1的反式茴香脑加氧酶是目前被分离出来的唯一实例，其他能够以反式茴香脑为唯一碳源的菌株均无相关酶的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，该方法通过酶催化反式茴香脑生成茴香醛，反应条件温和，减少反应体系对环境造成的污染，而且得到的产物可归为天然香料。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，包括以下步骤：
(1)利用基因工程方法构建含有编码反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列的工程菌株，所述反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列来源于松针炭疽菌，该核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)利用所述工程菌株进行培养，并分离纯化，得到反式茴香脑加氧酶；
(3)利用反式茴香脑加氧酶催化反式茴脑的加氧反应，得到茴香醛。
本发明根据NCBI中记载的松针炭疽菌(Colletotrichum fioriniae)的一个hypothetical protein CFIO01_02901的氨基酸序列，设计出符合大肠杆菌密码子偏好性的核苷酸序列，得到一个ORF，其起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，长度为993bp。然后，采用基因工程技术将其置于大肠杆菌中表达出重组的反式茴香脑加氧酶，进而将其应用于催化反式茴脑的加氧反应生成茴香醛。
所述步骤(1)中，构建含有编码反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列的工程菌株的方法为：
1)将反式茴香脑加氧酶基因的核苷酸片段插入表达载体pET-41a的Spe I与Xho I位点之间，得到质粒pET41-tao；
2)将得到的pET41-tao转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中培养过夜，得到工程菌E.coli BL21(DE3)/pET41-tao。
所述步骤1)中，为了使基因tao的核苷酸片段置于表达载体pET-41a的SpeI与XhoI之间，在其ORF 5'端前面加上序列TCAACTAGTGGTTCTGGT，在3'端后加上CTCGAGCAC，用SpeI、XhoI切割后插入表达载体pET-41a的SpeI与XhoI之间。
所述步骤2)中通过氯化钙法将质粒pET41-tao转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。
本发明步骤(3)中，所述加氧反应在25～35℃的温度下反应0.5～1小时。
本发明步骤(3)中，所述加氧反应在以下反应液中进行：400nmol/L反式茴香脑加氧酶，10mmol/L NADH，15μmol/L FAD，150mmol/L甲酸钠，0.5U甲酸脱氢酶，20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L反式茴香脑。所述Tris-HCl缓冲液的pH为8.0。
本发明的目的还可通过以下技术方案实现：一种利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，包括以下步骤：
(1)利用基因工程方法构建含有编码反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列的工程菌株，所述反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)利用所述工程菌株进行培养，收集菌体，用基本培养基重悬后加入反式茴香脑，培养，萃取培养液，获得茴香醛。
上述技术方案中，在工程菌株培养过程中，利用合成的反式茴香脑加氧酶催化反式茴香脑生成茴香醛。无需进行工程菌株裂解、分离、纯化的步骤，从而简化了茴香醛合成的工序。
本发明步骤(2)中，所述基本培养基配方为：1.2g(NH4)2SO4,0.1g CaCl2·H2O,0.1gMgSO4·7H2O,0.01g FeSO4·7H2O,0.2g K2HPO4,0.1g KH2PO4,1200mL蒸馏水；所述基本培养基重悬菌体后，加入葡萄糖使培养液的OD600＝2.0，然后加入反式茴香脑在25℃、250r/min反应24小时。
所述步骤(1)中，构建含有编码反式茴香脑加氧酶基因(tao)的核苷酸序列的工程菌株的方法为：
1)将反式茴香脑加氧酶基因的核苷酸片段插入表达载体pET-41a的Spe I与Xho I位点之间，得到质粒pET41-tao；
2)将得到的pET41-tao转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中培养过夜，得到工程菌E.coli BL21(DE3)/pET41-tao。
所述步骤1)中，为了使反式茴香脑加氧酶基因的核苷酸片段置于表达载体pET-41a的SpeI与XhoI之间，在其ORF 5'端前面加上序列TCAACTAGTGGTTCTGGT，在3'端后加上CTCGAGCAC，用SpeI、XhoI切割后插入表达载体pET-41a的SpeI与XhoI之间。
所述步骤2)中，通过氯化钙法将质粒pET41-tao转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)与常规化学提取法相比，本发明以松针炭疽菌(Colletotrichum fioriniae)基因的开放阅读区序列表达出反式茴香脑加氧酶，应用该酶催化茴香脑生成茴香醛，反应条件温和，减少反应体系对环境造成的污染，而且得到的产物可归为天然香料。
(2)本发明验证松针炭疽菌(Colletotrichum fioriniae)基因的开放阅读区序列编码的产物为反式茴香脑加氧酶(TAO,trans-anethole oxygenase)，拓宽酶来源范围，为酶催化生产茴香醛提供更多的选择。
附图说明
下面结合附图中的具体实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
图1为含有反式茴香脑加氧酶基因基因的表达载体图谱。
图2为融合蛋白-反式茴香脑加氧酶的SDS-PAGE结果。
图3为茴香醛标准曲线。
具体实施方式
实施例1
(1)根据植物病原菌松针炭疽菌(Colletotrichum fioriniae)全基因组序列信息中的一个CFIO01_02901的氨基酸序列，设计出符合大肠杆菌密码子偏好性的核苷酸序列，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，该ORF长度为993bp，命名为tao基因。对tao基因进行全序列合成(委托生工生物工程上海(股份)有限公司合成)。Colletotrichum fioriniae反式茴香脑加氧酶与Pseudomonas putida JYR-1的反式茴香脑加氧酶氨基酸序列有33％的一致性。
(2)为了使该ORF置于pET-41a的SpeI与XhoI之间，在ORF 5'端前面加上一小段序列TCAACTAGTGGTTCTGGT，在3'端后加上CTCGAGCAC，委托上海生工合成1020bp的片段(993+18+9＝1020bp)，用SpeI、XhoI切割后插入pET-41a(+)(购自Novagen公司)SpeI与XhoI之间，得到的质粒命名为pET41-tao。
(3)将pET41-tao用氯化钙法转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自全式金生物技术公司)，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。
(4)挑取单菌落至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜。次日，按1％接种量转接于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养至OD600 0.4～0.6，加入IPTG(诱导剂，异丙基硫代半乳糖苷)至浓度为0.1mmol/L，20℃诱导表达过夜。将菌液于8000r/min、4℃的条件下离心10min，收集菌体，用1×PBS缓冲液重悬。
(5)纯化重组蛋白：在8000r/min、4℃的条件下离心10min，弃上清，按照一站式GST标记蛋白质微量纯化套装(购自北京天恩泽基因科技有限公司)纯化重组蛋白。即用5mL冰浴的新鲜配制的细胞裂解液和125μL 10mg/mL的的PMSF溶液(蛋白酶抑制剂)以及5μLBenzonase(核酸酶)，重悬细菌沉淀，冰上放置30分钟。将细胞裂解物在12000r/min、4℃的条件下离心30分钟，去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱。取上清液，用0.45μm滤膜过滤。将谷胱甘肽-Agarose介质充分混匀后，取200μL加入到预放了一片筛板的层析柱中。用5mL预冷的1×PBS缓冲液洗柱。将过滤后的裂解液(含可溶性GST标记蛋白)上柱，将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在4℃过夜，以使它们充分结合，让重力使上柱液自然流出。用2mL 1×PBS缓冲液洗柱。用1mL GST洗脱液洗柱，收集并保存穿透液(含GST标记蛋白)，获得融合蛋白。该融合蛋白为tao基因编码的蛋白质，即反式茴香脑加氧酶(TAO)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，命名为TAO蛋白，功能为反式茴香脑加氧酶，tao基因与表达载体携带的GST标签肽融合表达，含有tao基因的表达载体的谱图如图1所示，可知tao基因与表达载体携带的GST标签肽编码序列形成的ORF为1674bp。
(6)融合蛋白的鉴定：采用5％浓缩胶、12％分离胶对获得的TAO蛋白进行SDS-PAGE电泳测试，用考马斯亮蓝R-250染色，分析融合蛋白。酶液蛋白质含量采用Super-Bradford蛋白定量试剂盒(购自康为世纪生物科技有限公司)测定，以BSA为标准蛋白。融合蛋白的SDS-PAGE结果如图2所示，蛋白分子量为64.4kDa，符合预期大小。
(7)融合蛋白反式茴香脑加氧酶的功能验证和酶活力测试在1mL反应体系中加入400nmol/L融合蛋白、10mmol/L NADH、15μmol/L FAD、150mmol/L甲酸钠、0.5U甲酸脱氢酶、20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH为8.0)和1mmol/L反式茴香脑，在30℃的条件下反应1小时，生成茴香醛。
吸取8.00mL茴香醛于250mL容量瓶中，加入100mL乙醇，摇匀，用蒸馏水定容，得到0.25mol/L茴香醛溶液。使用时用水逐级稀释至0.0002～0.001mol/L。吸取1mL 0.0002～0.001mol/L茴香醛溶液于10mL具塞比色管，加入6mol/L盐酸3.0mL，然后加入0.04mol/L硫代巴比妥酸溶液2.0mL，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。放置10min后，用1cm比色皿，以试剂空白作对照，用紫外可见分光光度计于415nm处测定吸光度，测得茴香醛标准曲线，如图3所示。标准曲线的回归方程为：y＝7095x+0.0171，相关系数R2＝0.9987。
取1mL反应产物样品于10mL具塞比色管，按前述步骤处理后，测出在415nm下的吸光值代入标准曲线方程，求出茴香醛的摩尔浓度。1个活力单位定义为1小时催化产生1μmol茴香醛的酶量。
测得纯化的重组蛋白以反式茴香脑为底物的酶活力为26.3U/mg。
实施例2加氧酶基因tao的重组载体pET41-tao的功能验证
实施例1步骤(3)中诱导表达后，将菌液在10000r/min、4℃的条件下离心10min，收集菌体，用基本培养基重悬，洗涤，离心。基本培养基配方为：1.2g(NH4)2SO4、0.1g CaCl2·H2O、0.1g MgSO4·7H2O、0.01g FeSO4·7H2O、0.2g K2HPO4、0.1g KH2PO4和1200mL蒸馏水。再用基本培养基洗涤一次。加入适量的基本培养基和0.5mmol/L葡萄糖，使OD600＝2.0，然后加入1mmol/L反式茴香脑，在25℃、250r/min搅拌速度的条件下反应24小时，生成茴香醛。用等体积乙酸乙酯萃取30min以上，收集有机相，用于测定茴香醛，结果表明产生了0.7mmol/L茴香醛。证明携带pET41-tao的重组大肠杆菌BL21(DE3)可直接用于转化反式茴香脑生成茴香醛。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于步骤(7)的反应条件为：25℃的条件下反应1小时。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于步骤(7)的反应条件为：35℃的条件下反应0.5小时。
以上实施例为本发明的部分实施方式，并不限制于本发明。对本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下做出的若干改进和变型，也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 玉林师范学院
<120> 一种利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 993
<212> DNA
<213> 松针炭疽菌(Colletotrichum fioriniae)
<400> 1
atgaacccga gcaacagcca gattagccaa gacagctacc actggattag caaagcgatc 60
gacaccctgg acccggagac cgactacgaa accatctggc gtctgaccag cagctatcag 120
ctgagcgatt tcgcgaacaa cctgatttat accctgacct tcccgaactt tgtgatcccg 180
ctgcacggtg cggaagtggt ttggcgtagc gacggtggca aggtggttca caaagcggtg 240
gaccgtgttg ataagaccga gcactacaac atggcgtggt ggtactatgg cccgagcgac 300
caacgttgcc gtgatgcggc ggaacgtatt aaccagctgc atgcgggtct ggcgcgtcaa 360
tatccgggcc gtttcagcca caacgaggat tacgtgtata ccctgacctt tagcgcggtt 420
ctgatgcacc gtctgcgtat tcgtctgggt ctgagcggct tcaccgagaa acagcaaatc 480
gcggcgcacc acttctggcg tgacatgggt ccgctgttta aggtggaggg taaaggcacc 540
gttaaggatt acccggcgga cttcgatggc tgcatcgcgt tttgcgaggc gtatgaaaac 600
accccgcgtg agtacaacga aaaggcgcgt tatattggtc tgagcatctt caacctgttt 660
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gaggaaaccc gtgcgctgga taaaagctac gagcagttca tcatgagcca actgagcggt 960
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<210> 2
<211> 330
<212> PRT
<213> 松针炭疽菌(Colletotrichum fioriniae)
<400> 2
Met Ala Pro Ser Ala Ser Gly Ile Ser Gly Ala Ser Thr His Thr Ile
1 5 10 15
Ser Leu Ala Ile Ala Thr Leu Ala Pro Gly Thr Ala Thr Gly Thr Ile
20 25 30
Thr Ala Leu Thr Ser Ser Thr Gly Leu Ser Ala Pro Ala Ala Ala Leu
35 40 45
Ile Thr Thr Leu Thr Pro Pro Ala Pro Val Ile Pro Leu His Gly Ala
50 55 60
Gly Val Val Thr Ala Ser Ala Gly Gly Leu Val Val His Leu Ala Val
65 70 75 80
Ala Ala Val Ala Leu Thr Gly His Thr Ala Met Ala Thr Thr Thr Thr
85 90 95
Gly Pro Ser Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ile Ala Gly
100 105 110
Leu His Ala Gly Leu Ala Ala Gly Thr Pro Gly Ala Pro Ser His Ala
115 120 125
Gly Ala Thr Val Thr Thr Leu Thr Pro Ser Ala Val Leu Met His Ala
130 135 140
Leu Ala Ile Ala Leu Gly Leu Ser Gly Pro Thr Gly Leu Gly Gly Ile
145 150 155 160
Ala Ala His His Pro Thr Ala Ala Met Gly Pro Leu Pro Leu Val Gly
165 170 175
Gly Leu Gly Thr Val Leu Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Gly Cys Ile
180 185 190
Ala Pro Cys Gly Ala Thr Gly Ala Thr Pro Ala Gly Thr Ala Gly Leu
195 200 205
Ala Ala Thr Ile Gly Leu Ser Ile Pro Ala Leu Pro Ala Thr Ala Thr
210 215 220
Pro Pro Pro Gly Leu Ala Thr Pro Gly Met Ala Pro Pro Ala Thr Leu
225 230 235 240
Ser Leu Pro Thr Thr Leu Ser Ala Pro Ala Ile Gly Pro Ala Ala Pro
245 250 255
Leu Leu Ala Ala Ile Ile Ile Pro Ile Val Ala Ala Leu Pro Leu Val
260 265 270
Thr Gly Val Leu Leu Pro Ala Pro Leu Val Pro Pro Pro Gly Ala Leu
275 280 285
Gly Thr Leu Pro Gly Val Gly Thr Ala Leu Ala Leu Gly Gly Thr Ala
290 295 300
Ala Leu Ala Leu Ser Thr Gly Gly Pro Ile Met Ser Gly Leu Ser Gly
305 310 315 320
Pro Gly Cys Pro Pro Ser Ala Leu Val Gly
325 330

Claims (10)

1.一种利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用基因工程方法构建含有编码反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列的工程菌株，所述反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列来源于松针炭疽菌，该核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)利用所述工程菌株进行培养，并分离纯化，得到反式茴香脑加氧酶；
(3)利用反式茴香脑加氧酶催化反式茴脑的加氧反应，得到茴香醛。
2.一种利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用基因工程方法构建含有编码反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列的工程菌株，所述反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)利用所述工程菌株进行培养，收集菌体，用基本培养基重悬后加入反式茴香脑，培养，萃取培养液，获得茴香醛。
3.根据权利要求2所述的利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述基本培养基配方为：1.2g(NH4)2SO4，0.1g CaCl2·H2O，0.1g MgSO4·7H2O，0.01gFeSO4·7H2O，0.2g K2HPO4，0.1g KH2PO4，1200mL蒸馏水；所述基本培养基重悬菌体后，加入葡萄糖使混合溶液的OD600＝2.0，然后加入反式茴香脑在25℃、250r/min反应24小时。
4.根据权利要求1或2或3所述的利用反式茴香脑加氧酶基因合成茴香醛的方法，其特征在于，所述工程菌株为大肠杆菌菌株。
5.根据权利要求4所述的利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，构建含有编码反式茴香脑加氧酶的核苷酸序列的工程菌株的方法为：
1)将反式茴香脑加氧酶基因的核苷酸片段插入表达载体pET-41a的SpeI与XhoI位点之间，得到质粒pET41-tao；
2)将得到的pET41-tao转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中培养过夜，得到工程菌E.coli BL21(DE3)/pET41-tao。
6.根据权利要求5所述的利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，所述步骤1)中，为了使基因tao的核苷酸片段置于表达载体pET-41a的SpeI与XhoI之间，在其ORF5'端前面加上序列TCAACTAGTGGTTCTGGT，在3'端后加上CTCGAGCAC，用SpeI、XhoI切割后插入表达载体pET-41a的SpeI与XhoI之间。
7.根据权利要求5所述的利用反式茴香脑加氧酶基因合成茴香醛的方法，其特征在于，所述步骤2)中通过氯化钙法将质粒pET41-tao转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。
8.根据权利要求1所述利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述加氧反应在25～35℃的温度下反应0.5～1小时。
9.根据权利要求8所述利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，步骤(3)中，加氧反应在以下反应液中进行：400nmol/L反式茴香脑加氧酶，10mmol/L NADH，15μmol/L FAD，150mmol/L甲酸钠，0.5U甲酸脱氢酶，20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L反式茴香脑。
10.根据权利要求9所述利用反式茴香脑加氧酶合成茴香醛的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液的pH为8.0。
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