CN108795889A

CN108795889A - 一种反式茴香脑加氧酶的突变体和突变株

Info

Publication number: CN108795889A
Application number: CN201810663221.5A
Authority: CN
Inventors: 王玉琴; 郑璞; 刘思琴; 陈鹏程; 闻鹏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-06-25
Filing date: 2018-06-25
Publication date: 2018-11-13
Anticipated expiration: 2038-06-25
Also published as: CN108795889B

Abstract

本发明公开了一种反式茴香脑加氧酶的突变体和突变株，所述反式茴香脑加氧酶的突变体与野生型反式茴香脑加氧酶氨基酸序列相比，其185位氨基酸Glu变为Asp，所述反式茴香脑加氧酶的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。合成对茴香醛、藜芦醛、洋茉莉醛、香兰素的转化速率分别为原始菌株的1.91、2.08、1.33、1.92倍，5F4在生物法合成芳香醛香料中，展现了良好的应用潜力，同时5F4的催化时pH的适应性更广泛，更适合用工业生产应用，能够降低成本，提高生产效率。

Description

一种反式茴香脑加氧酶的突变体和突变株

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种反式茴香脑加氧酶的突变体和突变株。

背景技术

丙烯基苯型精油单分是通过物理的方法从植物精油中提取的某一种丙烯基苯化合物，这类化合物的共同特征是具有丙烯基侧链，并且在苯环上具有甲氧基取代基团，常被作为合成带有苯环结构的名贵香料和药物的起始物(如香草醛、洋茉莉醛、茴香醛等)。由于化学合成香料在香料生产上存有：香料化合物中残留的化学物质给人体健康带来危害、化学合成会带来环境的污染、化学合成反应立体选择性差而导致产物为外消旋体等的缺陷。目前，生物合成香料化合物的技术越来越受到人们的关注。

反式茴香脑加氧酶(TAO)，由Han等人最先在恶臭假单胞菌Pseudomonas putidaJYR-1中发现，该酶能氧化反式茴香脑合成对茴香醛，同时也能氧化异丁香酚、异黄樟素和对甲氧基异丁香酚，但催化效率不高，E.coli BL21(DE3)(pET-TAO)在含0.5mmol·L^-1的葡萄糖和1mmol·L^-1的不同底物溶液中,反应6h，能分别合成0.63mmol·L^-1对茴香醛和香草醛、0.38mmol·L^-1的洋茉莉醛和藜芦醛。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种式茴香脑加氧酶突变体。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种反式茴香脑加氧酶的突变体，其中：所述反式茴香脑加氧酶的突变体与野生型反式茴香脑加氧酶氨基酸序列相比，其185位氨基酸Glu变为Asp，所述反式茴香脑加氧酶的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。

作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶的突变体的一种优选方案：所述反式茴香脑加氧酶的突变体，其是通过以反式茴香脑加氧酶基因为模板，进行易错PCR，获得反式茴香脑加氧酶的突变体文库，并将所述反式茴香脑加氧酶的反应底物添加入含有反式茴香脑加氧酶的突变体的溶液中进行催化反应，将反应液与2,4-二硝基苯肼进行显色反应，并加入碱溶液及有机溶剂反应，测定吸光度后筛选得到。

作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶的突变体的一种优选方案：所述易错PCR，包括设计易错PCR引物，所述易错PCR引物为：

taoF：TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCGGATCCATGGAGGACATCATGC

taoD：GTCACGATGCGGCCGCTCGAGCTCGAGTCAGTTAGTCCTCAAGTCG。

作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶的突变体的一种优选方案：所述获得反式茴香脑加氧酶的突变体文库，包括以重组质粒PGEX-6P-1-tao为模板，rTaq聚合酶进行易错PCR获得随机突变，PCR体系中添加浓度为7～10mmol·L-¹的Mg2+以及30～250μmol·L-¹的Mn²⁺，PCR产物连接至线性质粒PGEX-6P-1，再将连接产物导入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，获得反式茴香脑加氧酶的突变体文库。

作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶的突变体的一种优选方案：所述进行显色反应，包括，将导入感受态细胞的反式茴香脑加氧酶的突变体文库涂布平板，挑取单菌落接种于含有100mg·L-¹的氨苄青霉素的LB培养基中，诱导培养，离心获得菌体，加入100～200μL的缓冲液混匀菌体，添加终浓度为0.1～1.0g·L-1的反式茴香脑加氧酶反应底物，28～37℃催化反应20～120min，取反应上清液与2,4-二硝基苯肼显色剂于10～40℃反应5～40min，再加入0.5～3mol·L-¹的NaOH以及0～80％的乙醇溶液，10～40℃溶解沉淀，用酶标仪测定吸光度OD470。

作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶的突变体的一种优选方案：所述反式茴香脑加氧酶的反应底物，包括4-丙烯基-2-甲氧基苯酚、反式-1-甲氧基-4-丙烯基苯、1,2-二甲氧基-4-丙烯基苯。

作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶的突变体的一种优选方案：所述重组质粒PGEX-6P-1-tao，是将来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida JYR-1的反式茴香脑加氧酶基因连接到质粒PGEX-6P-1。

作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶的突变体的一种优选方案：所述反式茴香脑加氧酶的突变体，其适合催化的pH范围为7～9。

作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种式茴香脑加氧酶突变株。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种式茴香脑加氧酶突变株，其中，所述反式茴香脑加氧酶突变菌株包含权利要求1～8任一所述的反式茴香脑加氧酶的突变体。

本发明的有益效果：本发明通过随机突变反式茴香脑加氧酶，导入到E.Coli BL21(DE3)中，并通过改进显色方法，经过筛选后获得突变重组菌5F4，其合成对茴香醛、藜芦醛、洋茉莉醛、香兰素的转化速率分别为原始菌株的1.91、2.08、1.33、1.92倍，5F4在生物法合成芳香醛香料中，展现了良好的应用潜力，同时5F4的催化时pH的适应性更广泛，更适合用工业生产应用，能够降低成本，提高生产效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为5F4全细胞催化丙烯基苯型精油单分合成芳香醛产物HPLC测定图。

图2为5F4全细胞催化合成藜芦醛、香兰素的GC-MS图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1：

高通量筛选方法的建立：

(1)不同碱溶液对显色的影响

分别测定1mol·L^-1的NaOH-50％乙醇溶液以及KOH-50％乙醇溶对显色的影响，记录OD₄₇₀以及稳定性(1h内OD₄₇₀的最大差值的绝对值与当前使用值得比值)，如表1所示。

表1不同碱溶液对显色的影响

碱液	NaOH	KOH
			OD₄₇₀	2.86	1.814
稳定性	0.016	0.055

结果表明采用NaOH-50％乙醇溶液的OD₄₇₀响应较高、稳定性较好。

(2)不同碱浓度对显色的影响

分别测定0.5～3.0mol·L^-1的NaOH对显色的影响，记录OD₄₇₀以及稳定性，如表2所示。

表2不同碱浓度对显色的影响

结果表明NaOH浓度在1.5-2.0mol·L^-1时，OD₄₇₀稳定。

(3)不同有机溶剂对显色的影响

分别测定乙醇以及甲醇作为有机溶剂对显色的影响，记录OD₄₇₀以及稳定性，如表3所示。

表3不同有机溶剂对显色的影响

有机溶剂	乙醇	甲醇
			OD₄₇₀	2.463	0.33
稳定性	0.013	0.048

结果表明选择乙醇，OD₄₇₀响应较高、稳定性较好。

(4)不同浓度的乙醇对显色的影响

分别测定浓度为0％～80％的乙醇溶解NaOH后对现场的影响，记录OD₄₇₀以及稳定性，如表4所示。

表4不同浓度的乙醇对显色的影响

结果表明乙醇浓度大于50％时，OD₄₇₀响应值和稳定性较好。

本发明反应完成后利用酶标仪，在范围为300～700nm(增量为10nm)的波长下进行扫描，得出反应液最大吸收波长为470nm。该方式能够作为高通量筛选方式使用。

实施例2：

以合成产物洋茉莉醛为例，取50μL洋茉莉醛标准液(浓度为0～1000mg·L^-1)，加入50～300μL的2,4-二硝基苯肼显色剂，10～40℃反应5～40min，加入0.5～3mol·L^-1的NaOH-(0～80％)乙醇溶液，10～40℃反应5～60min，将其取出，利用酶标仪测定其吸光值OD₄₇₀，以洋茉莉醛浓度为横坐标，OD470值为纵坐标，绘制标准曲线，获得计算公式为y＝0.00496x+0.09445，R²为0.9995，洋茉莉醛检测浓度范围为0～700mg·L^-1。该方式能够作为高通量筛选方式使用。

实施例3：

tao突变库的建立：

(1)易错PCR建立tao突变库

根据Pseudomonas putida JYR-1中反式茴香脑加氧酶基因合成tao，并连接至PGEX-6P-1上，获得重组质粒PGEX-6P-1-tao，并以此为模板，设计易错PCR引物taoF、taoD，设定Mg²⁺浓度、Mn²⁺浓度分别为7～10mmol·L^-1以及30～250μmol·L^-1，利用普通rTaq聚合酶进行易错PCR。引物如下：

taoF：ttccaggggcccctgggatccGGATCCATGGAGGACATCATGC

taoD：gtcacgatgcggccgctcgagCTCGAGTCAGTTAGTCCTCAAGTCG

PCR程序设置如下：

用核酸凝胶电泳检测PCR产物，纯化回收PCR产物后，再采用一步克隆试剂盒连接至线性载体PGEX-6P-1上，并转化至E.coli BL21(DE3)超级感受态中，涂布培养，挑取单菌落进行菌落PCR验证，测序得出该突变库中平均氨基酸突变量1～6个。

实施例4：

突变库的筛选：

(1)突变库的初筛

将获得的单菌落划线于48小格平板，将其至于37℃恒温培养箱过夜培养，4℃保藏。

采用牙签挑取保存的菌体分别接种于100～1000μL的96深孔板中，37℃过夜培养后，以1～10％的接种量将其转接至含100～1000μL的LB的96深孔板培中，37℃，110rpm培养2～5h，添加终浓度为0.05～1.0mmol·L^-1的IPTG诱导剂，20～25℃，诱导6～12h。培养结束后利用孔板离心机离心收集菌体。在菌体中加入100～200μL的缓冲液(pH 7～8.5)，利用振荡器重悬混匀菌体，添加终浓度为0.1～1.0g·L^-1的4-烯丙基-1,2-亚甲二氧基苯，总反应体系为300μL，28～37℃催化反应10～120min，结束反应后离心，取反应上清液50μL，按照实施例1中方法测定显色后的OD₄₇₀，即，将50μL上清液与50～300μL的2,4-二硝基苯肼显色剂10～40℃反应5～40min，加入800μL的0.5～3mol·L^-1的NaOH-(0～80％)乙醇溶液，10～40℃反应5～60min，酶标仪测定OD₄₇₀，与对照组比较，选取其中吸光值高的菌株进行复筛。

2,4-二硝基苯肼显色剂的配置方法为：将0.5g的2,4-二硝基苯肼粉末完全溶解于0.03L浓硫酸中，向其中缓缓加入0.3L的95％乙醇溶液，混合后利用容量瓶定容至1.0L，储存于棕色试剂瓶中密封，置于阴凉处保存。

(2)突变库的复筛

将复筛菌株利用30mL/250mL的LB培养基，添加终浓度为0.4mmol·L-¹的IPTG于20℃诱导6h，收集菌体。在PBS缓冲液中添加浓度为0.1～3g·L-¹的4-烯丙基-1,2-亚甲二氧基苯的底物，湿重为1％～3％的湿菌体，于28～37℃催化反应10～120min，利用两倍体积的甲醇终止反应，处理反应液后，利用高效液相色谱测定洋茉莉醛的浓度，计算转化速率，获得突变菌株E.ColiBL21(DE3)-5F4，其突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，其与野生型反式茴香脑加氧酶氨基酸序列相比，有一个氨基酸发生变化，为185Glu变为Asp(记为E185D)。

实施例5：

5F4全细胞催化最适反应pH：

按照实施例4中菌体培养的方式，收集菌体后，分别用pH为4、5、6的柠檬酸钠缓冲液，pH为6、7、8的磷酸二氢钠缓冲液，pH为8、9的Tris-HCL缓冲液，pH为9、10、11的甘氨酸-NaOH缓冲液重悬菌体，并按照实施例4中的催化过程反应，测定转化速率，结果如下表：

表5：5F4全细胞催化最适反应pH

从上表可知，5F4全细胞催化的最适反应pH范围(7、8、9)相较于出发菌株反应pH范围(7、8)有所扩大。

实施例6：

突变株5F4全细胞催化合成芳香醛的方法：

将5F4利用LB培养基于37℃过夜培养后，转接至新鲜的LB培养基中培养，之后利用终浓度为0.05～1.0mmol·L^-1的IPTG，20～25℃诱导8～12h，离心收集菌体。在PBS缓冲液中添加浓度为1～15mmol·L^-1的反式-1-甲氧基-4-丙烯基苯、1,2-二甲氧基-4-丙烯基苯、4-烯丙基-1,2-亚甲二氧基苯、4-丙烯基-2-甲氧基苯酚的底物，添加湿重为1％～3％的湿菌体，于28～37℃催化反应15min，利用两倍体积的甲醇终止反应，处理反应液后，利用高效液相色谱测定对茴香醛、藜芦醛、洋茉莉醛以及香草醛的浓度，计算转化速率，结果如下表：

表6突变株5F4与E.coli BL21(DE3)(pET-TAO)催化结果比较

图1为5F4全细胞催化丙烯基苯型精油单分合成芳香醛产物HPLC测定图，

图2为5F4全细胞催化合成藜芦醛、香兰素的GC-MS图。

本发明通过随机突变反式茴香脑加氧酶，导入到E.Coli BL21(DE3)中，并通过改进显色方法，经过筛选后获得突变重组菌5F4，其与反式茴香脑加氧酶氨基酸序列相比，有一个氨基酸发生变化，为185Glu变为Asp，其合成对茴香醛、藜芦醛、洋茉莉醛、香兰素的转化速率分别为原始菌株的1.91、2.08、1.33、1.92倍，5F4在生物法合成芳香醛香料中，展现了良好的应用潜力，同时5F4的催化时pH的适应性更广泛，更适合用工业生产应用，能够降低成本，提高生产效率。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种反式茴香脑加氧酶的突变体和突变株

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 348

<212> PRT

<213> 反式茴香脑加氧酶的突变体(Pseudomonas putida)

<400> 1

Met Gly Ala Ile Met Gly Gly Thr Ala Ala Ala Val Ser Ala Ala Ala

1 5 10 15

Gly Thr Leu Thr Ile Ala Ala Gly Ile Gly Ala Leu Ala Pro Gly Leu

20 25 30

Ala Pro Ala Gly Ile Thr Ala Leu Ser Thr Thr Thr Thr Val Ala Ala

35 40 45

Pro Val Met Ala Leu Val Thr Thr Leu Gly Ile Pro Ala Pro Thr Gly

50 55 60

Pro Pro Ala Gly Ser Val Val Met Gly Val Thr Thr Gly Leu Ala Ile

65 70 75 80

Leu Leu Pro Gly Leu Ala Thr Ala Ala Thr Leu Gly His Pro Thr Thr

85 90 95

Thr Pro Gly Thr Gly Pro Ala Ala Pro Ala Met Gly Ala Ser Leu Ala

100 105 110

His Val Ala Ala Gly His Ala Ala Leu Ala Leu Ala Ser Pro Gly Thr

115 120 125

Pro Pro Ala Ala Ala Val Ile Thr Thr Thr Ala Thr Ile Gly Ala Ala

130 135 140

Leu His Ala Leu Ala Leu Ser Val Gly Leu Pro Gly Pro Thr Leu Ala

145 150 155 160

Gly Gly Ile Ala Ser Gly Ala Thr Thr Ala Ala Ile Cys Ala Gly Pro

165 170 175

Thr Ser Gly Ala Gly Leu Val Thr Ala Thr Pro Gly Ser Pro Gly Ala

180 185 190

Met Leu Gly Thr Ile Gly Ala Thr Gly Ala Gly Pro Thr Gly Gly Val

195 200 205

Gly Ser Gly Ala Val Leu Thr Gly Ala Ile Ile Leu Gly Pro Val Ala

210 215 220

Ala Thr Pro Pro Gly Pro Leu Gly Thr Ile Gly Ala Gly Leu Thr Leu

225 230 235 240

Ser Pro Gly Leu Pro Thr Ile Ala Gly Leu Met Gly Ser Gly Leu Pro

245 250 255

Ala Pro Ile Met Leu Thr Val Met Ala Leu Gly Leu Thr Pro Gly Leu

260 265 270

Thr Leu Gly Gly Ala Val Pro Pro Ala Pro Leu Leu Ser Thr Pro Gly

275 280 285

Leu Ala Ala Ala Leu Pro Val Ala Pro Gly Gly His Ile Ala Pro Pro

290 295 300

Thr Ala Gly Val Leu Cys Pro Pro Pro Gly Ala Thr Ser Gly Pro Ser

305 310 315 320

Ile Pro Ser Ala Ala Ser Ser Gly Cys Pro Pro His Ala Gly Leu Ala

325 330 335

Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ser Ala Leu Ala Thr Ala

340 345

Claims

1.一种反式茴香脑加氧酶的突变体，其特征在于：所述反式茴香脑加氧酶的突变体与野生型反式茴香脑加氧酶氨基酸序列相比，其185位氨基酸Glu变为Asp，所述反式茴香脑加氧酶的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。

2.如权利要求1所述的反式茴香脑加氧酶的突变体，其特征在于：所述反式茴香脑加氧酶的突变体，其是通过以反式茴香脑加氧酶基因为模板，进行易错PCR，获得反式茴香脑加氧酶的突变体文库，并将所述反式茴香脑加氧酶的反应底物添加入含有反式茴香脑加氧酶的突变体的溶液中进行催化反应，将反应液与2,4-二硝基苯肼进行显色反应，并加入碱溶液及有机溶剂反应，测定吸光度后筛选得到。

3.如权利要求2所述的反式茴香脑加氧酶的突变体，其特征在于：所述易错PCR，包括设计易错PCR引物，所述易错PCR引物为：

taoF：TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCGGATCCATGGAGGACATCATGC

taoD：GTCACGATGCGGCCGCTCGAGCTCGAGTCAGTTAGTCCTCAAGTCG。

4.如权利要求2或3所述的反式茴香脑加氧酶的突变体，其特征在于：所述获得反式茴香脑加氧酶的突变体文库，包括以重组质粒PGEX-6P-1-tao为模板，rTaq聚合酶进行易错PCR获得随机突变，PCR体系中添加浓度为7～10mmol·L^-1的Mg²⁺以及30～250μmol·L^-1的Mn²⁺，PCR产物连接至线性质粒PGEX-6P-1，再将连接产物导入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，获得反式茴香脑加氧酶的突变体文库。

5.如权利要求2或3所述的反式茴香脑加氧酶的突变体，其特征在于：所述进行显色反应，包括，将导入感受态细胞的反式茴香脑加氧酶的突变体文库涂布平板，挑取单菌落接种于含有100mg·L^-1的氨苄青霉素的LB培养基中，诱导培养，离心获得菌体，加入100～200μL的缓冲液混匀菌体，添加终浓度为0.1～1.0g·L^-1的反式茴香脑加氧酶反应底物，28～37℃催化反应20～120min，取反应上清液与2,4-二硝基苯肼显色剂于10～40℃反应5～40min，再加入0.5～3mol·L^-1的NaOH以及0～80％的乙醇溶液，10～40℃溶解沉淀，用酶标仪测定吸光度OD₄₇₀。

6.如如权利要求2或3所述的反式茴香脑加氧酶的突变体，其特征在于：所述反式茴香脑加氧酶的反应底物，包括4-丙烯基-2-甲氧基苯酚、反式-1-甲氧基-4-丙烯基苯、1,2-二甲氧基-4-丙烯基苯。

7.如权利要求4所述的反式茴香脑加氧酶的突变体，其特征在于：所述重组质粒PGEX-6P-1-tao，是将来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida JYR-1的反式茴香脑加氧酶基因连接到质粒PGEX-6P-1。

8.如权利要求1～3或7任一所述的反式茴香脑加氧酶的突变体，其特征在于：所述反式茴香脑加氧酶的突变体，其适合催化的pH范围为7～9。

9.一种反式茴香脑加氧酶突变菌株，其特征在于：其特征在于：所述反式茴香脑加氧酶突变菌株包含权利要求1～8任一所述的反式茴香脑加氧酶的突变体。