CN109517056A - 一种茶碱人工抗原的合成方法及其应用 - Google Patents

一种茶碱人工抗原的合成方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种茶碱人工抗原，其特征在于，其结构通式如下：本发明还涉及一种茶碱人工抗原的制备方法和其应用，在茶碱7号位的N上衍生出羟基，用琥珀酸酐衍生出羧基，通过羧基与蛋白质偶联得到茶碱人工抗原。本发明的制备工艺方法简单，过程使用材料和催化剂均为普通产品，反应条件容易实现，反应过程不使用氯仿，适于工业生产。本发明采用的连接臂为链状，保留了茶碱的特征结构，同时尽可能降低免疫动物的免疫系统对连接臂的识别，易于制备特异性抗体，适合于胶体金茶碱检测试纸条的应用。

Description

一种茶碱人工抗原的合成方法及其应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域；具体涉及利用化学合成方法从去甲基茶碱 开始合成茶碱及其衍生物，再与大分子蛋白偶联应用于胶体金检测卡。
背景技术
下面的背景技术用于帮助读者理解本发明，而不能被认为是现有技术。
茶碱(Theophylline)可使平滑肌张力降低，呼吸道扩张；可促进内源性 肾上腺素、去甲肾上腺素的释放，气道平滑肌松弛；抑制钙离子由平滑肌内质 网释放，降低细胞内钙离子浓度而产生呼吸道扩张作用。茶碱对平滑肌的松弛 作用较强，但不及β受体激动剂。
2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初 步整理参考，茶碱在3类致癌物清单中。
作为一些茶碱的衍生物，在部分国家和地区也被列入了管制品目录。
因此进行茶碱检测的相关试剂及其产品的开发就成为需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种茶碱人工半抗原，该茶碱人工半抗原最大程度地 保留了茶碱的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为 抗原决定簇；进一步制备获得的茶碱人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、 特异性强的抗茶碱抗体。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种茶碱人工抗原，其特征在于，其分子结构式如下所示：
本发明提供的茶碱人工半抗原，在茶碱的N位上引入连接臂，在该修饰位点 上引入连接臂能最大程度地保留茶碱的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生 偶联的活性基团，可作为抗原决定簇。
本发明所采用的连接臂为链状，可以尽可能的降低免疫动物是对连接臂识别 度，这样免疫得到的抗体对茶碱的特异性更强。其反应式如下其反应式如下： 反应式一：
反应式二：
本发明选用牛血清蛋白(BSA)作为大分子载体，与牛丙种球蛋白(BGG)相比 具有以下优点：
牛血清蛋白(BSA)能够结合更多的茶碱人工半抗原，免疫原性较好；
从实验看，牛血清蛋白(BSA)与茶碱人工半抗原的结合更稳定，牛丙种球 蛋白(BGG)与茶碱人工半抗原结合后，茶碱人工半抗原容易在后续处理中脱离， 从而使最终的人工抗原在长期保存中容易产生沉淀，稳定性差；
用牛血清蛋白(BSA)与茶碱人工半抗原结合后形成的茶碱人工抗原，经动 物免疫得到的抗茶碱体的特异性更好。
本发明还提供了所述的茶碱人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取一定量的茶碱加入到50ml单口瓶中，并加入36％的甲醛溶液和三乙 胺，室温充分搅拌一个小时，再加入四氢呋喃，室温搅拌5分钟，再静置两天， 有白色固体析出，过滤并干燥得白色固体产物1，其中，茶碱、36％甲醛溶液、 三乙胺和四氢呋喃的摩尔比为1:5.5-6.6:1.02:2.6；
(2)在干燥的50ml单口瓶中加入0.6g产物1，并加入DCM，再加入三乙胺， DMAP，丁二酸酐，室温反应过夜，反应结束后用1mol/l的盐酸洗两次反应液， 每次5ml，有机相浓缩干，用DCM:MeOH＝100:1淋洗剂过柱得产物2，其中，产 物1、DCM、三乙胺、DMAP和丁二酸酐的摩尔比为1:55:1.2:1.2:1.2；
(3)产物偶联载体蛋白：
(a)取60mg产物2溶于2ml DMF中，配置成浓度为30mg/ml的溶液，配置10mg/ml 的PBS-BSA蛋白；
(b)在2ml×30mg/ml产物2的DMF溶液中加入41mg EDC，25mg NHS,得产物3， 产物2:EDC:NHS＝1:1:1.12，室温搅拌8H；
(c)取(a)步骤中配制的PBS-BSA蛋白溶液27ml，然后滴入产物3；
(d)室温反应12小时得到终产物；
(e)PBS透析3天，得茶碱抗原，测得浓度为5.72mg/ml。
通过茶碱人工半抗原的液相色谱图可以看出经过纯化得到的茶碱人工半抗 原的纯度达到98％以上。
另外，本发明还提供茶碱抗原在制备免疫检测试剂盒中的应用。
另一方面，本发明还提供一种茶碱胶体金检测的方法，包括如下步骤：
S1.用柠檬酸钠还原四氯化金制备直径在20-40nm的胶体金，然后将胶体金标 记到茶碱的抗体上，形成金标抗体，用λmax的吸光值(OD)来表示金标抗体 的浓度；
S2.将金标抗体上样到金标机上，将一定OD值的金标抗体均匀地喷聚酯膜(金 标垫)上，喷好后放入37度烘箱烘8h；切成合适的大小，放入装有干燥机的 铝箔袋内，室温存放备用；
S3.将茶碱抗原稀释到合适浓度，用点膜机点到硝酸纤维素膜上相应检测线位置，37度烘干12h；
S4.玻璃纤维经过缓冲液和表面活性的处理，37度烘干10h备用；
S5.按金标垫、样品垫、硝酸纤维素膜，吸水纸，大卡组装成胶体金检测试纸 卡。
有益效果
本发明具有以下有益效果：
1、本发明的茶碱抗原合成制备工艺中所使用的材料和催化剂均为普通产品，因此更具实用性，适于工业生产并能产生经济价值。
2、本发明没有用到氯仿，毒性较低，更具有安全性。
3、本发明的茶碱抗原应用于试纸条检测，读数准确并且方便快捷。
4、本发明的茶碱抗原效价好，准备度高，灵敏性好，能分辨出结构非常类似的 茶碱与咖啡因。
附图说明
图1为茶碱抗原的结构通式；
图2为半抗原小分子液相图谱；
图3为紫外扫描图；
图4为胶体金检测卡的结构示意图；
图5为色卡示意图；
图6为4-茶碱抗原对于小分子检测结果图；
图7为抗原的加速稳定性结果图。
附图标记：
样品垫201、金标垫202、硝酸纤维素膜203，吸水纸204，大卡205，检测试 纸条200，检测线(T线)206，控制线(C线)207
本发明还做了不同偶联臂以及不同载体蛋白对抗原效价的对比实验，具体 包括以下步骤：
实施例1：
1.称取2克茶碱加入到50毫升单口瓶中，并加入5.56克36％的甲醛溶液和1.14 克三乙胺，室温充分搅拌一个小时，再加入2.3毫升四氢呋喃，室温搅拌五分 钟，再静置两天，有白色固体析出，过滤并干燥得白色固体1.8克产物1：收 率77％；
2.在干燥的100毫升单口瓶中加入1.8克产物1，并加入30毫升DCM，再加入 1.05克三乙胺，1.26克DMAP，1.02克丁二酸酐，室温反应过夜，反应结束后 用1mol/l的盐酸洗两次反应液，每次15毫升，有机相浓缩干，用DCM:MeOH＝100:1 淋洗剂过柱得产物2共2.35克，收率86.5％；
3.产物偶联载体蛋白
(1)取60mg产物2溶于2ml DMF中，配置成浓度为30mg/ml的溶液。另外， 配置10mg/ml的PBS-BSA蛋白；
(2)在2ml×30mg/ml产物2的DMF溶液中加入41mg EDC，25mg NHS,得产物3， 室温搅拌8H；
(3)取(1)步的PBS-BSA蛋白溶液27ml，然后滴入产物3，室温反应过夜得 到终产物——茶碱抗原A，如图1所示，PBS透析3天，测得浓度为5.72mg/ml。
其中，茶碱人工半抗原的液相色谱图见图2(紫外检测器，波长254nm)，从 图2可以看出经过纯化得到的茶碱人工半抗原的纯度达到98％以上；
图3中，曲线a为茶碱人工半抗原的紫外扫描图，曲线b为茶碱人工抗原的紫 外扫描图，曲线c为牛血清白蛋白的紫外扫描图。茶碱人工半抗原的最大吸收 波长为278nm，茶碱人工抗原的最大吸收波长为254nm，与茶碱半抗原、牛血清 白蛋白相比，茶碱人工抗原的最大吸收波长出现明显变化。
实施例2：
1.称取2克茶碱加入到50毫升单口瓶中，并加入5.56克36％的甲醛溶液和1.14 克三乙胺，室温充分搅拌一个小时，再加入2.3毫升四氢呋喃，室温搅拌五分 钟，再静置两天，有白色固体析出，过滤并干燥得白色固体1.8克产物1：
2.在干燥的50毫升单口瓶中加入1.8克产物1，并加入30毫升DCM，再加入 1.05克三乙胺，1.26克DMAP，1.02克丁二酸酐，室温反应过夜，反应结束后 用1mol/l的盐酸洗两次反应液，每次15毫升，有机相浓缩干，用DCM:MeOH＝100:1 淋洗剂过柱得产物2共2.35克：
3.产物偶联载体蛋白
(1)取60mg产物2溶于2ml DMF中，配置成浓度为30mg/ml的溶液。另外， 配置10mg/ml的PBS-BGG蛋白；
(2)在2ml×30mg/ml产物2的DMF溶液中加入41mg EDC，25mg NHS,得产物3， 室温搅拌8H；
(3)取(1)步的PBS-BGG蛋白溶液27ml，然后滴入产物3，室温反应过夜得 到终产物——茶碱抗原B，PBS透析3天，测得浓度为2.35mg/ml。
实施例3：
1.称取2克茶碱加入到50毫升单口瓶中，并加入5.56克36％的甲醛溶液和1.14 克三乙胺，室温充分搅拌一个小时，再加入2.3毫升四氢呋喃，室温搅拌五分 钟，再静置两天，有白色固体析出，过滤并干燥得白色固体1.8克产物1：
2.在干燥的50毫升单口瓶中加入1.8克产物1，并加入30毫升DCM，再加入 1.05克三乙胺，1.26克DMAP，1.02克戊二酸酐，室温反应过夜，反应结束后 用1mol/l的盐酸洗两次反应液，每次15毫升，有机相浓缩干，用DCM:MeOH＝100:1 淋洗剂过柱得产物2共2.23克：
3.产物偶联载体蛋白
(1)取60mg产物2溶于2ml DMF中，配置成浓度为30mg/ml的溶液。另外， 配置10mg/ml的PBS-BSA蛋白；
(2)在2ml×30mg/ml产物2的DMF溶液中加入41mg EDC，25mg NHS,得产物3， 室温搅拌8H；
(3)取(1)步的PBS-BSA蛋白溶液27ml，然后滴入产物3，室温反应过夜得 到终产物——茶碱抗原C，PBS透析3天，测得浓度为5.14mg/ml。
实施例4：
1.称取2克茶碱加入到50毫升单口瓶中，并加入5.56克36％的甲醛溶液和1.14 克三乙胺，室温充分搅拌一个小时，再加入2.3毫升四氢呋喃，室温搅拌五分 钟，再静置两天，有白色固体析出，过滤并干燥得白色固体1.8克产物1：
2.在干燥的50毫升单口瓶中加入1.8克产物1，并加入30毫升DCM，再加入 1.05克三乙胺，1.26克DMAP，1.02克戊二酸酐，室温反应过夜，反应结束后 用1mol/l的盐酸洗两次反应液，每次15毫升，有机相浓缩干，用DCM:MeOH＝100:1 淋洗剂过柱得产物2共2.23克：
3.产物偶联载体蛋白
(1)取60mg产物2溶于2ml DMF中，配置成浓度为30mg/ml的溶液。另外， 配置10mg/ml的PBS-BGG蛋白；
(2)在2ml×30mg/ml产物2的DMF溶液中加入41mg EDC，25mg NHS,得产物3， 室温搅拌8H；
(3)取(1)步的PBS-BGG蛋白溶液27ml，然后滴入产物3，室温反应过夜得 到终产物——茶碱抗原D，PBS透析3天，测得浓度为2.41mg/ml。
实施例5：利用不同的原料量和步骤中1中静置时间的不同来制备中间产物— —产物1。
与实施例1相比，通过步骤1中分别通过原材料的使用量不同，以及静置(结晶) 时间的不同来进行茶碱抗原制备中的产物1。
具体的制备得到的产物1的结果如表一：
由表一可知：茶碱与36％甲醛摩尔比在1:5～6之间，制备产物1的得率高；
相对现在常规实验中的8小时静置时间来说，产物1得率不高，本制备方法中 静置两天可以得到较高的产物1得率。
实验例6茶碱人工抗原的性能测定
(1)茶碱人工抗原的鉴定：
摩尔吸收系数ε：用PBS缓冲液配制浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、 20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的茶碱人工半抗原溶液，通过紫外扫描图可知 茶碱半抗原的最大吸收波长为254nm，在254nm处测吸值，每个浓度做平行样。 摩尔吸收系数的计算公式为：ε＝吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度的测定：用PBS缓冲液配制浓度为0μg/ml、10μg/ml、 20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml 的牛血清蛋白溶液各1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴 温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光 值的关系曲线。将人工抗原溶液(用PBS缓冲液配制)按一定比例稀释，在655nm 处测得人工抗原的吸光值，从曲线上读取人工抗原溶液的相应蛋白浓度值。
偶联比测定：配制100μg/ml的牛血清蛋白PBS溶液，将茶碱人工抗原用PBS 稀释到100μg/ml，在254nm处测得吸光值A1，以PBS为空白测得吸光值A2， 则偶联比率γ为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/65000)。
其中ε为摩尔吸收系数(L/mol)，65000为牛血清蛋白的分子量，100×10-3为牛血清蛋白浓度(g/L)。
采用牛丙种球蛋白作载体时，偶联比的计算式为：γ＝[(A1－ A2)/ε]/(100×10-3/150000)；其中，150000为牛丙种球蛋白的分子量。
得到的结果如表二所示。
表二各茶碱人工抗原的偶联比和摩尔吸收系数
编号 人工抗原 偶联比 偶联物蛋白浓度 摩尔吸收系数
实施例1 A 32 5.72mg/ml 5432.26
实施例2 B 11 2.35mg/ml 5314.22
实施例3 C 18 5.14mg/ml 5248.65
实施例4 D 12 2.41mg/ml 5136.54
由表二可见，人工半抗原的结构、载体蛋白的结构对人工半抗原与载体蛋 白交联时的结合比都是有影响的。
(2)动物免疫
将制备的各茶碱人工抗原免疫新西兰白兔，得到的免疫血清经ELISA方法 检测其效价，检测结果见表三。
表三各免疫血清的效价检测结果
编号 人工抗原 免疫血清效价
实施例1 A 1:120000
实施例2 B 1:3300
实施例3 C 1:2500
实施例4 D 1:2600
由表三可见，本发明提供的茶碱人工抗原A进行动物免疫获得的免疫血清， 其效价达1:120000，完全可用于免疫分析中，为茶碱的检测提供更加方便快速 准确的途径。
综上可知，本发明提供的茶碱人工半抗原，最大程度地保留了茶碱的特征 结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一 步制备获得的茶碱人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗茶 碱抗体。
实施例7：抗原在胶体金检测试纸条的应用
1.用柠檬酸钠还原四氯化金制备直径在20-40nm的胶体金，然后将胶体金标记 到抗茶碱的抗体到上，用λmax的吸光值(OD)来表示金标抗体的浓度；
2.将金标抗体上样到金标机上，将一定OD值的金标抗体均匀地喷聚酯膜(金 标垫203)上，喷好后放入37度烘箱烘8h；切成合适的大小，放入装有干燥机 的铝箔袋内，室温存放备用；
将茶碱抗原稀释到合适浓度，用点膜机点到硝酸纤维素膜203上相应T线206 位置，同样在硝酸纤维素膜203上相应C线207位置加上相应的鼠抗原(用于 检测该检测卡是否有效)，37度烘干12h；
样品垫201---玻璃纤维经过缓冲液和表面活性的处理，37度烘干10h备用；
按金标垫202、样品垫201、硝酸纤维素膜203，吸水纸204，大卡205组装成 胶体金检测试纸卡200，见图4；
配制相应浓度的小分子溶液，加入到样品垫201上，5分钟后读取结果；
产品对茶碱的Cutoff值的要求是100000ng/ml。
备注1：所有待测小分子均溶于阴性尿液中；
备注2：标准色卡:标准色卡的比色范围在0-10之间，即G1-G10，颜色从无 到有，颜色深度依次递增，见图5所示。
备注3：QC标准：
将检测试纸条的检测T线206与标准色卡进行对比：
线条深度大于G8时表示阴性；
-50％cutoff情况下，线条深度﹥G4为合格；
+50％cutoff情况下线条深度﹤G3.5为合格
表四：三种抗原对茶碱小分子的检测灵敏度结果(见图6)
表五:抗原的加速稳定性(将组装好的检测卡55℃烘72小时)结果(见图7)
由表四、表五可知：产物符合QC标准，且热稳定性好，检测抗原合格。

Claims (4)

1.一种茶碱人工抗原，其特征在于，其结构通式如下：
2.一种制备如权利要求1所述的茶碱人工抗原的方法，其特征在于,通过甲醛在茶碱7号位的N上衍生出羟基，用琥珀酸酐衍生出羧基，通过羧基与蛋白质偶联得到茶碱及其衍生物检测抗原，其反应式如下：
反应式一：
反应式二：
3.一种制备如权利要求1所述的茶碱及其衍生物检测抗原的方法，其特征在于，具体制备步骤如下：
(1)称取一定量的茶碱加入到50ml单口瓶中，并加入36％的甲醛溶液和三乙胺，室温充分搅拌一个小时，再加入四氢呋喃，室温搅拌5分钟，再静置两天，有白色固体析出，过滤并干燥得白色固体产物1，其中，茶碱、36％甲醛溶液、三乙胺和四氢呋喃的摩尔比为1:5.5-6.6:1.02:2.6；
(2)在干燥的50ml单口瓶中加入0.6g产物1，并加入DCM，再加入三乙胺，DMAP，丁二酸酐，室温反应过夜，反应结束后用1mol/l的盐酸洗两次反应液，每次5ml，有机相浓缩干，用DCM:MeOH＝100:1淋洗剂过柱得产物2，其中，产物1、DCM、三乙胺、DMAP和丁二酸酐的摩尔比为1:55:1.2:1.2:1.2；
(3)产物偶联载体蛋白：
(a)取60mg产物2溶于2ml DMF中，配置成浓度为30mg/ml的溶液；再配置10mg/ml的PBS-BSA蛋白溶液；
(b)在2ml×30mg/ml产物2的DMF溶液中加入41mg EDC，25mg NHS,得产物3，其中，产物2:EDC:NHS的摩尔比为1:1:1.12，室温搅拌8H；
(c)取(a)步骤中配制的PBS-BSA蛋白溶液27ml，然后滴入产物3；
(d)室温反应12小时得到终产物；
(e)PBS透析3天，得茶碱抗原，测得浓度为5.72mg/ml。
4.如权利要求1-3之一所述的茶碱抗原在制备免疫检测试剂盒中的应用。
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