CN109504705B - 一种提高水稻种子胚乳中β-胡萝卜素含量的方法 - Google Patents

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Abstract

一种提高水稻种子胚乳中β‑胡萝卜素含量的方法，将tHMG1、PSY1和CrtI1基因分别与水稻胚乳特异储存蛋白GluB‑1基因启动子和终止子融合，构建基因表达盒，再连接入植物表达载体，获得含tHMG1、PSY1和CrtI1三基因表达盒的植物多基因转化载体，转化至水稻，获得高含量β‑胡萝卜素的转基因水稻，其胚乳中的β‑胡萝卜素含量与转两基因的水稻相比，提高了大约1倍多，既可以直接用于食用，也可以作为生产β‑胡萝卜素的原材料种子，对于新型功能性作物育种具有重要的指导意义和生产应用价值。

Description

一种提高水稻种子胚乳中β-胡萝卜素含量的方法
技术领域
本发明属于农作物基因工程领域，具体涉及一种提高水稻种子胚乳中β-胡萝卜素含量的方法。
背景技术
人体中维生素A的缺乏是世界卫生组织确认的世界四大营养缺乏病之一。缺乏维生素A时，皮肤将变得干涩、粗糙、浑身起小疙瘩，形同鸡皮；头发稀疏、干枯、缺乏光泽、指甲变脆，形状改变；眼睛结膜与角膜 (俗称黑眼仁)亦发生病变，轻者眼干、畏光、夜盲(俗称鸡母眼)，重者黑眼仁混浊、溃疡形成，最后穿孔而失明。
据联合国粮农组织及世界卫生组织(WHO)报告统计，目前全球约有8 亿人因维生素A缺乏症困扰，每年因维生素A缺乏造成100-250万人死亡；每年有1.4-2.5亿学龄前儿童缺乏维生素A，50万学龄前儿童因维生素A 缺乏而失明，因维生素A缺乏导致的干眼病高达1000万人以上。
改善维生素A的摄取，会使死亡率降低23％，使麻疹病死亡率降低 50％，使腹泻死亡率降低33％。早在半个世纪前，人类就已知β-胡萝卜素可在体内水解生成维生素A，进而参与视觉生理代谢，是防止由于维生素 A缺乏而引起夜盲症的重要营养物质。
水稻是重要的粮食作物和模式植物，同时，其种子也是一种优良的生物反应器，稻米的蛋白和活性营养成分主要存在于种皮和胚中，而日常食用的精米则是去掉种皮和胚的胚乳(主要成分是淀粉)，其营养价值大大下降。因此，通过基因工程方法，在胚乳中增加、强化合成特定的营养成分和功能性物质，是功能型水稻育种的主要目标。
由于水稻种子中没有β-胡萝卜素合成途径相关基因，为此Ye等(Science. 2000：287,303-305)成功将来自黄水仙(Narcissus pseudonarcissus)中的八氢番茄红素合成酶基(phytoene synthase，PSY)和欧文氏菌(Erwiniaure dovora) 的胡萝卜素脱氢酶基因(carotene desaturase，CrtI)转入水稻胚乳中，获得了β-胡萝卜素含量达到2μg/g左右的第一代“黄金水稻”。
但是，由于转基因水稻中的β-胡萝卜素含量相对较低，为了提高黄金水稻中的β-胡萝卜素含量，Paine等(Nat.Biotechnol.2005：23,482-487)将来源于玉米(Zea mays)的Psy基因和来自欧文氏菌的CrtI基因共同转化至水稻，培育出了β-胡萝卜素跟第一代黄金水稻相比含量提高约23倍之多的二代“黄金水稻”。
之后相关研究人员希望能够通过基因工程手段进一步提高水稻种子中β- 胡萝卜素含量，但这是一个相对较难攻克的课题研究，主要原因是不能确定在二代“黄金水稻”构建的基础上增加/替换哪些具体的酶可以起到进一步提高β-胡萝卜素含量的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高水稻种子胚乳中β-胡萝卜素含量的方法，利用该方法获得的水稻种子，其胚乳中的β-胡萝卜素含量与现有技术中转PSY1和CrtI两基因的水稻相比，提高了大约1倍多，既可以直接用于食用，也可以作为生产β-胡萝卜素的原材料种子，对于新型功能性作物育种具有重要的指导意义和生产应用价值。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种提高水稻种子胚乳中β-胡萝卜素含量的方法，包括以下步骤：
1)根据水稻的密码子偏好性对酿酒酵母截短的HMG1、玉米的PSY 基因和欧文氏菌的CrtI基因的序列进行优化，获得tHMG1、PSY1和CrtI1 三个基因序列，所述tHMG1基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PSY1基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述CrtI1基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
2)将tHMG1、PSY1和CrtI1三个基因分别与水稻胚乳特异储存蛋白 GluB-1基因启动子和终止子融合，分别构建基因表达盒；
3)将步骤2)获得的3个基因表达盒元件分别连接入植物表达载体，获得含tHMG1、PSY1和CrtI1三基因表达盒的植物多基因转化载体；
4)将步骤3)中获得的植物多基因转化载体转入农杆菌，转化水稻愈伤组织，获得胚乳中β-胡萝卜素含量提高的转基因水稻。
进一步，步骤2)中，所述CrtI1基因还和拟南芥RbcS小亚基基因质体转运肽TP编码序列相连接；所述拟南芥RbcS小亚基基因质体转运肽 TP编码序列如SEQ ID NO.4所示。
又，步骤2)中，所述水稻胚乳特异性储存蛋白GluB-1基因启动子序列如SEQ IDNO.5所示；水稻胚乳特异性储存蛋白GluB-1基因终止子序列如序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，步骤3)中，所述的植物表达载体为pCAMBIA1301。
又，步骤4)中的水稻为水稻中花11。
本发明提供tHMG1、PSY1和CrtI1三基因在水稻转基因育种中的应用，所述tHMG1基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PSY1基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述CrtI1基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明在转两基因水稻构建的基础上，增加了优化后的酿酒酵母截短的3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase的基因(简称tHMG1 基因)，从而提高了水稻种子胚乳中β-胡萝卜素含量。
本发明根据水稻的密码子偏好性，优化酿酒酵母截短的HMG1、玉米的PSY基因和欧文氏菌的CrtI基因的序列，优化后的基因称为tHMG1、 PSY1和CrtI1，构建出含tHMG1、PSY1和CrtI1三基因表达盒的植物多基因转化载体，再转入水稻，获得转基因水稻，其种子胚乳中β-胡萝卜素的含量，与转入PSY1和CrtI1两基因的水稻相比，提高了1倍多。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明向水稻中转入了酿酒酵母截短的tHMG1、PSY1基因和CrtI1 三基因，与转入两基因(PSY1和CrtI1)的水稻相比，其种子胚乳中的β- 胡萝卜素含量提高了1倍多，其含有的β-胡萝卜素可达到50μg/g以上。
本发明获得的转基因水稻，既可以直接用于食用，也可以作为生产β- 胡萝卜素的原材料，还可以作为原始材料从而进一步提高水稻种子中虾青素的含量，这对于新型功能性作物育种具有重要的指导意义和生产应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中三基因(tHMG1、PSY1和CrtI1)植物转化载体结构示意图。
图2为本发明对比例中两基因(PSY1和CrtI1)植物转化载体的结构示意图。
图3-5为本发明实施例2中T0代水稻基因组DNA的外源基因的PCR 检测结果，其中，图3为检测PSY1基因的扩增结果，图4为检测CrtI1 基因的扩增结果，图5为检测tHMG1基因的扩增结果；图3-5中，条带1， 2和3为转两基因(PSY1和CrtI1)的水稻；条带4，5和6为转三基因 (tHMG1、PSY1和CrtI1)的水稻；W为野生型水稻，M为Marker。
图6-9为本发明实施例3中采用RT-PCR对T1代水稻授粉后20天发育种子的外源基因的表达检测；其中，图6为对水稻内源actin基因的扩增结果，图7为检测PSY1基因的扩增结果，图8为检测CrtI1基因的扩增结果，图9为检测tHMG1基因的扩增结果；图6-9中，条带1，2和3为转两基因(PSY1和CrtI1)的水稻；条带4，5和6为转三基因(tHMG1、 PSY1和CrtI1)的水稻；W为野生型水稻，M为Marker。
图10为野生型品种中花11种子的外观表型图。
图11为转两基因(PSY1和CrtI1)的水稻种子的外观表型图。
图12为本发明实施例3中转三基因(tHMG1、PSY1和CrtI1)的水稻种子的外观表型图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例中用到的母液及各培养基配方如下：
母液(stock solution)配方：
MSmax母液(stock solution)(10X)：NH4NO3 16.5g、KNO3 19.0g、 MgSO4·7H2O3.7g、CaCl2·2H2O 4.4g，加水定容至1000ml。
MSmin母液(stock solution)(100X)：KI 0.083g、H3BO4 0.62g、 MnSO4·2H2O2.23g、ZnSO4·7H2O 0.86g、Na2MoO4·2H2O 0.025g、 CuSO4·5H2O 0.0025g、CoCl2·2H2O0.0025g，加水定容至1000ml。
N6max母液(stock solution)(10X)：KNO3 28.3g、KH2PO4 4.0g、 (NH4)2·SO44.63g、MgSO4·7H2O 1.85g、CaCl2·2H2O 1.66g，加水定容至 1000ml。
N6min母液(stock solution)(100X)：KI 0.08g、H3BO4 0.16g、 MnSO4·2H2O0.44g、ZnSO4·7H2O 0.15g，加水定容到1000ml
Fe2+-EDTA母液(100X)：FeSO4·7H2O 2.78g、Na2EDTA·2H2O 3.73g，单独溶解，然后混合，加水定容至1000ml。
维生素母液(Vitamin stock solution)(100X)：烟酸(Nicotinic acid) 0.1g、维生素B6(Pyridoxine HCl，VB6)0.1g、维生素B1(Thiaminc HCl， vb1)0.1g、甘氨酸(Glycine)0.2g、肌糖(Inositol)10g，加水定容至 1000ml。
培养基配方：
共培养培养基：N6max母液(N6max stock solution)(10X)12.5ml，N6min母液(N6minstock solution)(100X)1.25ml，Fe2+-EDTA母液(Fe2+-EDTA stock solution)(100X)2.5ml，维生素母液(Vitamin stock solution)(100X) 2.5ml，二氯苯氧乙酸2g/L(2,4-D)0.75ml，酶水解酪素(Casein Enzymatic Hydrolysate)0.2g，蔗糖(Sucrose)5g，琼脂粉(Agarose)1.75g，加水至250ml调pH＝5.6用前微波炉融化加5ml 50％葡萄糖和250μl 20g/L乙酰丁香酮。
选择培养基：N6max母液(N6max stock solution)(10X)25ml，N6min母液(N6min stocksolution)(100X)2.5ml，Fe2+-EDTA母液(Fe2+-EDTA stock solution)(100X)2.5ml，维生素母液(Vitamin stock solution)(100X)2.5ml，二氯苯氧乙酸2g/L(2,4-D)0.625ml，酶水解酪素(Casein Enzymatic Hydrolysate)0.15g，蔗糖(Sucrose)7.5g，琼脂粉(Agarose)1.75g，加水至250ml调pH＝6.0，用前融化加潮霉素和羧苄。
预分化培养基：MSmax母液(MSmax stock solution)(10X)25ml，MSmin母液(MSminstock solution)(100X)2.5ml，Fe2+-EDTA母液(Fe2+-EDTA stock solution)(100X)2.5ml，维生素母液(Vitamin stock solution)(100X) 2.5ml，6-苄胺基嘌呤2g/L(6-BA)0.5ml，激动素2g/L(KT)0.5ml，吲哚乙酸1mg/ml(IAA)50μl，酶水解酪素(Casein EnzymaticHydrolysate) 0.15g，蔗糖(Sucrose)7.5g，琼脂粉(Agarose)1.75g，加水至250m调pH ＝5.9，用前融化加潮霉素和羧苄。
分化培养基：MSmax母液(MSmax stock solution)(10X)100ml，MSmin母液(MSminstock solution)(100X)10ml，Fe2+-EDTA母液(Fe2+-EDTA stock solution)(100X)10ml，维生素母液(Vitamin stock solution)(100X)10ml，6-苄胺基嘌呤2g/L(6-BA)2.0ml，激动素2g/L(KT)2.0ml，吲哚乙酸1mg/ml (IAA)0.2ml，萘乙酸1g/L(NAA)0.2ml，酶水解酪素(Casein Enzymatic Hydrolysate)1g，蔗糖(Sucrose)30g，植物凝胶(Phytagel)3g，加水至1000ml调pH＝6.0，分装小瓶。
生根培养基：MSmax母液(MSmax stock solution)(10X)50ml，MSmin母液(MSmin stocksolution)(100X)5ml，Fe2+-EDTA(Fe2+-EDTA stock solution)(100X)10ml，维生素母液(Vitamin stock solution)(100X)10ml，琼脂粉(Sucrose)20g，植物凝胶(Phytagel)3g，加水至1000ml调pH＝ 5.8，分装小瓶。
实施例1本发明的一种提高水稻胚乳中β-胡萝卜素的转基因育种方法，包括以下步骤：
1.三个必需基因(tHMG1、PSY1和CrtI)的优化合成
优化按照以下原则进行：(一)优化基因密码子，按照水稻密码子偏爱，提高基因翻译效率；(二)消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建；(三)消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性；(四)使基因编码蛋白符合 N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；(五)优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。
以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HMG1基因(GenBank No.BD250390.1)为模板，根据水稻密码子偏好性，优化合成获得SEQ ID NO.1所示DNA序列tHMG1，克隆到质粒载体，测序确定其序列；
以玉米(Zea mays)的PSY基因(GenBank No.U32636.1)为模板，根据水稻密码子偏好性，优化合成获得SEQ ID NO.2所示DNA序列PSY1，克隆到质粒载体，测序确定其序列；
以欧文氏菌(Erwiniaure dovora)的CrtI基因(GenBank No.D90087)为模板，根据水稻密码子偏好性，优化合成获得SEQ ID NO.3所示DNA序列CrtI1，克隆到质粒载体，测序确定其序列；
2.构建基因表达盒
参考拟南芥(Arabidopsis thaliana)RbcS小亚基基因(NCBI ReferenceSequence:NM_105379.4)的序列，合成编码质体转运肽TP的序列(SEQ ID NO.4)；
以水稻(Oryza sativa)胚乳特异储存蛋白GluB-1基因(GenBank No. X54314.1)为模板，合成获得SEQ ID NO.5所示DNA序列GluB-1基因启动子，克隆到质粒载体，测序确定其序列；
以水稻(Oryza sativa)胚乳特异储存蛋白GluB-1gene基因(GenBank No.X54314.1)为模板，合成获得SEQ ID NO.6所示DNA序列GluB-1基因终止子，克隆到质粒载体，测序确定其序列。
按照改良的“重叠延伸PCR”技术进行基因表达盒元件的拼接(Appl MicrobiolBiotechnol.2006,73(1):234-40)。
2.1构建tHMG1基因表达盒
根据上述化学合成的GluB-1启动子、tHMG1基因和GluB-1终止子序列设计了三对引物，相邻元件之间的引物存在20bp的重叠区，引物P1上有EcoRI 酶切位点，引物P6上有BamHI酶切位点。
以上述化学合成的GluB-1启动子、tHMG1基因和GluB-1终止子的质粒为模板，分别使用引物对P1和P2、P3和P4、P5和P6进行三个元件(GluB-1 启动子、tHMG1基因和GluB-1终止子)的PCR扩增。
反应体系：1μl质粒，4μl 2.5mmol/L dNTPs，25μl Buffer，KOD Plus(Toyobo 日本)聚合酶1U，1μl P1/P3/P5，1μl P2/P4/P6，加ddH2O至50μl；
反应程序为：94℃30s，54℃30s，72℃90s，共45个循环，72℃再延伸 10min，通过PAGE电泳分离并回收PCR扩增片段。
随后将各个扩增片段等摩尔数混合，以混合片段为模板，利用引物P1和 P6进行PCR扩增，反应体系：1μl质粒，4μl 2.5mmol/L dNTPs，25μl Buffer， KOD Plus(Toyobo日本)聚合酶1U，1μl P1，1μl P6，加ddH2O至50μl；反应程序为：94℃30s，54℃30s，72℃240s，共45个循环，72℃再延伸10min，获得tHMG1基因的表达盒，并对该表达盒进行T-vector克隆和重组质粒的核苷酸全序列测定。
其中，引物对P1和P2、P3和P4、P5和P6的具体序列如下：
P1:GAATTCGATCTCGATTTTTGAGGAATTTTAGAAGTTGAACAGAGTCAATCGAACAGACAG；
P2:AGCTATTTGTACTTGCTTATGGAAACTTAAGCTAATTGATGTGAGTTCAAAGACAGACCA；
P3:ATAAGCAAGTACAAATAGCTATGCTGACCAACAAGACCGTCATCTCTGGTTCCAAGGTCA；
P4:TTAGGATTTGATGCAGGTGACGGAACCATCCTTCAGACGGTTGATGTCAGTGGCATCCAG；
P5:TCACCTGCATCAAATCCTAATGTAATTGAGAACTAGTATCGGCGTAGAGTAAAATAAAAC；
P6:GGATCCGTTCTATTCTTCATTAAGTTAATAAATAATGATATTAGTTCCAAGTTACAAATA。
2.2构建PSY1基因表达盒：
根据上述化学合成的GluB-1启动子、PSY1基因和GluB-1终止子序列设计了三对引物，相邻元件之间的引物存在20bp的重叠区，引物P7上有BamHI 酶切位点，引物P12上有KpnI酶切位点。以上述化学合成的GluB-1启动子、 PSY1基因和GluB-1终止子的质粒为模板，分别使用引物对P7和P8、P9和 P10、P11和P12进行三个原件(GluB-1启动子、PSY1基因和GluB-1终止子) 的PCR扩增。
反应体系：1μl质粒，4μl 2.5mmol/L dNTPs，25μl Buffer，KOD Plus(Toyobo 日本)聚合酶1U，1μl P7/P9/P11，1μl P8/P10/P12，加ddH2O至50μl；
反应程序为：94℃30s，54℃30s，72℃90s，共45个循环，72℃再延伸 10min，采用PAGE电泳分离并回收PCR扩增片段。
随后将各个扩增片段等摩尔数混合，以混合片段为模板，利用引物P7和 P12进行PCR扩增，反应体系：1μl质粒，4μl 2.5mmol/L dNTPs，25μl Buffer， KOD Plus(Toyobo日本)聚合酶1U，1μl P7，1μl P12，加ddH2O至50μl；反应程序为：94℃30s，54℃30s，72℃180s，共45个循环，72℃再延伸10min，获得PSY1基因的表达盒，并对该表达盒进行T-vector克隆和重组质粒的核苷酸全序列测定。
其中，引物对P7和P8、P9和P10、P11和P12的具体序列如下：
P7:GGATCCGATCTCGATTTTTGAGGAATTTTAGAAGTTGAACAGAGTCAATCGAACAGACAG；
P8:AGCTATTTGTACTTGCTTATGGAAACTTAAGCTAATTGATGTGAGTTCAAAGACAGACCA；
P9:ATAAGCAAGTACAAATAGCTATGGCCATCATACTCGTTAGGGCTGCCTCTCCTGGTCTCT；
P10:GATACTAGTTCTCAATTACATTAGGTCTGGCCATTTCTCAATGAACATGGGAGCAGTAG；
P11:TGTAATTGAGAACTAGTATCGGCGTAGAGTAAAATAAAACACCACAAGTATGACACTTGG；
P12:GGTACCGTTCTATTCTTCATTAAGTTAATAAATAATGATATTAGTTCCAAGTTACAAATA。
2.3构建CrtI1基因表达盒：
根据上述化学合成的GluB-1启动子、CrtI1基因和GluB-1终止子序列设计了三对引物P13和P14、P15和P16、P17和P18，相邻元件之间的引物存在20bp的重叠区，引物P13上有KpnI酶切位点，引物P18上XhoI有酶切位点。
以上述化学合成的GluB-1启动子、CrtI1基因和GluB-1终止子的质粒为模板，分别使用进行三个元件(GluB-1启动子、CrtI1基因和GluB-1终止子) 的PCR扩增。
反应体系：1μl质粒，4μl 2.5mmol/L dNTPs，25μl Buffer，KOD Plus(Toyobo 日本)聚合酶1U，1μl P13/P15/P17，1μl P14/P16/P18，加ddH2O至50μl；
反应程序为：94℃30s，54℃30s，72℃120s，共45个循环，72℃再延伸 10min，通过PAGE电泳分离并回收PCR扩增片段。
随后将各个扩增片段等摩尔数混合，以混合片段为模板，利用引物P13 和P18进行PCR扩增。
反应体系：1μl质粒，4μl 2.5mmol/L dNTPs，25μl Buffer，KOD Plus(Toyobo 日本)聚合酶1U，1μl P13，1μl P18，加ddH2O至50μl；反应程序为：94℃30s， 54℃30s，72℃240s，共45个循环，72℃再延伸10min，获得CrtI1基因的表达盒，并对该表达盒进行T-vector克隆和重组质粒的核苷酸全序列测定。
其中，引物对P13和P14、P15和P16、P17和P18的具体序列如下：
P13:GGTACCGATCTCGATTTTTGAGGAATTTTAGAAGTTGAACAGAGTCAATCGAACAGACA；
P14:GAGAGCATAGAGGAAGCCATAGCTATTTGTACTTGCTTATGGAAACTTAAGCTAATTGAT；
P15:ATGGCTTCCTCTATGCTCTCTTCCGCTACTATGGTTGCCTCTCCAGCTCAAGCCACTATG；
P16:GATACTAGTTCTCAATTACATTAGATCAGGTCCTCCAGCATCAGACCAGCAGTAGCCTTA；P17:TGTAATTGAGAACTAGTATCGGCGTAGAGTAAAATAAAACACCACAAGTATGACACTTGG；
P18:TCTAGAGTTCTATTCTTGATTAAGTTAATAAATAATGATATTAGTTCCAAGTTACAAATA。
3.构建植物表达载体
将上述所获得的tHMG1基因表达盒重组质粒用EcoRI和BamHI酶切并连接到经同样酶切的pCAMBIA1301载体上获得pCAMBIA1301-tHMG1重组质粒；
再将上述所获得的PSY1基因表达盒重组质粒采用BamHI和KpnI酶切并连接到经同样酶切的pCAMBIA1301-tHMG1重组质粒上即获得 pCAMBIA1301-tHMG1-PSY1重组质粒；
最后再将上述所获得的CrtI1基因表达盒重组质粒采用KpnI和XhoI酶切并连接到经同样酶切的pCAMBIA1301-tHMG1-PSY1重组质粒上即获得含有三基因的pCAMBIA1301-tHMG1-PSY1-CrtI1重组植物表达载体(图1)。
采用同样的方法构建了含有两个基因(PSY1和CrtI1)的重组植物表达载体pCAMBIA1301-PSY1-CrtI1(国际上二代“黄金水稻”)，并以此载体转化水稻作为对照，参见图2。
4.转化至水稻
4.1农杆菌的准备
1)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250转/分钟培养20h。
2)取1mL菌液转接入20-30mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250转/分钟培养约12h，测OD600≈1.5。
3)8000转/分钟，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5wt％蔗糖，0.05wt％Silwet L-77)并稀释至OD600≈0.8。
4.2农杆菌侵染及与水稻愈伤组织的共培养
将预培养4天的成熟胚来源的水稻胚性愈伤组织或培养4-5d的未成熟胚来源的初生愈伤组织立即浸入准备好的农杆菌悬浮液中，侵染30min后，然后将愈伤组织在无菌滤纸上吸除多余的菌液，直接转入共培养培养基于 23℃黑暗条件下培养3-4d。
4.3抗性愈伤组织的筛选
将共培养的愈伤组织转出，无菌水漂洗3-4次，然后用无菌滤纸吸干多余水分，将愈伤组织转入选择培养基上，28℃暗培养，两周继代一次。
4.4植株再生
经2-3代筛选后，选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上进行预分化处理；暗培养5-7天后再将抗性愈伤组织转移到分化培养基 (每天16h光照、8h黑暗、28℃条件下进行分化，再生的小苗剪去原有的根，在生根培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室盆栽，即获得转基因水稻，最初几天保持湿度，后续栽培管理按照常规方法进行。
实施例2转基因水稻的鉴定
1.转化植株基因组DNA PCR检测：
对实施例1中获得的T0代植株叶片，用SDS法抽提基因组DNA作为模版，用PCR扩增方法，分别检测外源基因tHMG1、PSY和CrtI，所用引物的具体序列如下：
PsyZ：ATGGCCATCATACTCGTT；
PsyF：TTATCACTTGGACCATCG；
CrtIZ：ATGGCTTCCTCTATGCTC；
CrtIF：TTAGATCAGGTCCTCTCA；
HMG1Z：ATGGCTTCCTTCTATGCAG；
HMG1F：TGGTCCAAGTGATAAGCT。
所用扩增程序：94℃30s，54℃30s，72℃120s，共45个循环，最后72℃再延伸10min，结果参见图3-5。
由图3-5可知：野生型(WT)对照都不能扩出外源基因，转三基因的三个株系都能扩出上述3个基因，而转两基因的三个株系也都能扩出PSY1和CrtI1 两个基因，表明外源基因均完整整合进了水稻基因组中。
2.转基因植株T1种子的RT-PCR检测：
把实施例1获得的转基因植株的T1代授粉后20天呈现橙红色的发育种子，液氮条件下研磨成粉，再用Trizol方法抽提种子的总RNA，用MMV逆转录试剂盒，oligDT引物反转录为cDNA，用如下引物和扩增条件进行外源tHMG1、PSY和CrtI基因的RT-PCR检测，水稻内源actin基因作为内参，所用引物具体序列如下：
PsyZ1：CTCTGATACCATCTCCGT；
PsyF1：GTTCGTGAGTTGGTTGCA；
CrtIZ1：TCAGGACCTGGGTGGGCT；
CrtIF1：GGTTCAGACCGAAGTGAT；
HMG1Z1：TGAACACTCTGCTGAGCT；
HMG1F1：CATCTCCATACCCAGAAG。
扩增程序：94℃30s，54℃30s，72℃30s，共45个循环，最后72℃再延伸10min，结果参见图6-9。
图6-9结果显示，对照野生型种子不能扩出外源基因，转三基因的三个株系都能扩出上述3个基因，而转两基因的三个株系都能扩出PSY1和CrtI1 两个基因，表明外源基因在转基因种子中均进行了正确的转录表达。
实施例3转基因水稻种子的外观观察和β-胡萝卜素含量检测
1、通过对转基因水稻种子的外观观察，明显可以看出转入3基因的转基因水稻种子比转两基因的水稻种子具有更深的颜色(图10-12)。
表明导入上述3基因的转基因水稻种子中的β-胡萝卜素含量比转两基因的水稻种子高。
2、转基因水稻种子β-胡萝卜素的提取与高效液相色谱(HPLC)鉴定：
取0.1g水稻种子在冰上研磨成粉末，加入2mL甲醇继续均匀研磨 5min；再转入2ml离心管，避光低温振荡(100rpm)提取10min；4℃8000rpm 离心5min收集上清；重复提取沉淀物，直到沉淀呈白色；
将上清在4℃8000rpm离心5min后合并上清，将收集的上清低温避光浓缩干燥；最后将干燥的物质加200μL甲醇用于测定。
将上述待测样品过0.22μm的有机滤膜，再注入到2mL棕色取样瓶，进样量20μL，用C30高效液相色谱柱进行HPLC分析。
流动相为甲醇：水＝95：5；色谱条件为：柱温为室温，流速为1mL/min。测定波长为394nm。β-胡萝卜素HPLC纯标准品购自Sigma。
称取1mgβ-胡萝卜素标样，定溶于10mL甲醇中，再用甲醇分别稀释制成0ppm，5ppm，10ppm的溶液，按上述色谱条件分别取20μL进样，以峰面积为纵坐标，标准品的浓度为横坐标进行线性回归分析。
结果显示，转三基因水稻种子具有与虾青素标样相同的特征峰，且其含有的β-胡萝卜素(50.12μg/g DW)跟转两基因的水稻种子所含有的β-胡萝卜素(24.65μg/g DW)相比，含量提高了1.1倍。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种提高水稻种子胚乳中β-胡萝卜素含量的方法
<130> 1811517
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1506
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 1
atgctgacca acaagaccgt catctctggt tccaaggtca agtccttgtc ctctgcacag 60
tcctcctctt ctggtccatc ctcctcttct gaggaagacg actctcgtga tattgagtcc 120
ttggacaaga agatccgtcc actcgaagaa ctggaagcct tgttgtcctc tggtaacacc 180
aagcaactga agaacaagga ggtcgctgca ttggtcatcc acggtaagtt gccactgtac 240
gcactggaga agaagttggg tgacactact cgtgctgttg ctgtccgtcg taaggcactg 300
tccatcttgg ctgaagcacc tgtcttggca tctgatcgtt tgccatacaa gaactacgac 360
tacgaccgtg tctttggtgc ctgttgtgag aacgtcatcg gttacatgcc actgcctgtt 420
ggtgtcatcg gtccactggt catcgatggt acttcctacc acatccctat ggccactact 480
gagggttgcc tggtcgcatc tgcaatgcgt ggttgcaagg caatcaacgc tggtggtggt 540
gcaaccactg tcttgaccaa ggatggtatg actcgtggac ctgttgttcg tttcccaacc 600
ctgaaacgtt ctggtgcctg caaaatctgg ctggactccg aagagggtca gaacgccatc 660
aagaaggcat tcaactccac ctctcgtttc gcacgtctgc aacacattca gacctgtctc 720
gctggtgact tgctcttcat gcgttttcgt accactactg gtgatgcaat gggtatgaac 780
atgatctcta agggtgtcga gtactccttg aagcagatgg tcgaagagta tggttgggaa 840
gacatggagg ttgtctccgt ttctggtaac tactgcaccg acaagaagcc tgctgccatc 900
aactggatcg aaggtcgtgg taagtctgtc gtcgctgaag ccaccattcc tggtgatgtt 960
gttcgtaagg tcttgaagtc tgacgtctct gcactggttg aactgaacat tgccaagaac 1020
ctggttggtt ctgcaatggc tggttctgtt ggtggtttca acgcacatgc tgccaacttg 1080
gtcactgctg tcttcttggc actgggtcaa gatcctgcac agaacgtcga gtcttccaac 1140
tgcatcaccc tgatgaagga agttgacggt gacttgcgta tctctgtctc catgccatcc 1200
atcgaagttg gtactattgg tggtggtact gttctggaac cacaaggtgc aatgctggac 1260
ttgttgggtg ttcgtggtcc acatgcaact gctcctggta ctaacgcacg tcaactggca 1320
cgtatcgttg catgtgctgt cctggctggt gagttgtcct tgtgtgctgc actggctgct 1380
ggtcatctgg ttcaatccca catgactcac aatcgtaaac ctgctgaacc aaccaaacct 1440
aacaacctgg atgccactga catcaaccgt ctgaaggatg gttccgtcac ctgcatcaaa 1500
tcctaa 1506
<210> 2
<211> 1233
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 2
atggccatca tactcgttag ggctgcctct cctggtctct ctgctgctga cagcatcagc 60
caccagggga ctctccagtg ctccaccctg ctcaagacga agaggcctgc tgcacgtcgg 120
tggatgcctt gctcgctcct tggtctccac ccgtgggaag ctggtcgtcc ttctcctgcc 180
gtctactcca gcctcgccgt caacccggcg ggagaggccg tcgtctcgtc cgagcagaag 240
gtctacgacg tcgtgctcaa gcaggccgca ttgctcaaac gccagctgcg cacgccggtc 300
ctcgacgcca ggccccagga catggacatg ccacgcaacg ggctcaagga agcctacgac 360
cgctgcggcg agatctgtga ggagtatgcc aagacgtttt acctcggaac tatgttgatg 420
acagaggagc ggcgccgcgc catatgggcc atctatgtgt ggtgtaggag gacagatgag 480
cttgtagatg ggccaaacgc caactacatt acaccaacag ctttggaccg gtgggagaag 540
agacttgagg atctgttcac gggacgtcct tacgacatgc ttgatgccgc tctctctgat 600
accatctcaa ggttccccat agacattcag ccattcaggg acatgattga agggatgagg 660
agtgatctta ggaagacaag gtataacaac ttcgacgaac tctacatgta ctgctactat 720
gttgctggaa ctgtcgggtt aatgagcgta cctgtgatgg gcatcgcaac cgagtctaaa 780
gcaacaactg aaagcgtgta cagtgctgcc ctggctctgg gaattgcgaa ccaactcacg 840
aacatactcc gggatgttgg agaggatgct agaagaggaa ggatatattt accacaagat 900
gagcttgcac aggcagggct ctctgatgag gacatcttca aaggggtcgt cacgaaccgg 960
tggagaaact tcatgaagag gcagatcaag agggccagga tgttttttga ggaggcagag 1020
agaggggtaa ctgaactctc acaggctagc agatggccag tatgggcttc cctgttgttg 1080
tacaggcaga tcctggatga gatcgaagcc aacgactaca acaacttcac gaagagggcg 1140
tatgttggta aagggaagaa gttgctagca cttcctgtgg catatggaaa atcgctactg 1200
ctcccatgtt cattgagaaa tggccagacc taa 1233
<210> 3
<211> 1479
<212> DNA
<213> Erwiniaure dovora
<400> 3
atgaagccaa ctactgtcat cggtgctggt ttcggtggtc tggctctggc tatccgtctg 60
caagctgctg gtatcccagt cctgctgctg gaacaacgtg acaagccagg tggtcgtgct 120
tacgtctacg aggaccaggg tttcactttc gacgctggtc caactgtcat cactgaccca 180
tccgctatcg aggagctgtt cgctctggct ggtaagcagc tgaaggagta cgtcgagctg 240
ctgccagtca ctccattcta ccgtctgtgc tgggaatctg gtaaggtctt caactacgac 300
aacgaccaga ctcgtctgga agctcagatc cagcagttca acccacgtga cgtcgaaggt 360
tatcgtcagt tcctggacta ctcccgtgct gtcttcaagg aaggttatct gaagctcggt 420
actgtcccat tcctgtcctt ccgtgacatg ctgcgtgctg ctccacagct ggctaagctc 480
caggcttggc gttctgtcta ctccaaggtc gcttcctaca tcgaagacga acacctgcgt 540
caggctttct ccttccactc cctgctggtc ggtggtaatc cattcgctac ttcctccatc 600
tacactctga tccacgctct ggaacgtgaa tggggtgtct ggttcccacg tggtggtact 660
ggtgctctgg tccagggtat gatcaagctg tttcaggacc tgggtggtga agtcgtcctg 720
aacgctcgtg tctcccacat ggaaactact ggtaacaaga tcgaggctgt ccacctggag 780
gacggtcgtc gtttcctgac tcaggctgtc gcttccaacg ctgacgtcgt tcacacttac 840
cgtgatctgc tgtctcagca tccagctgct gtcaagcagt ccaacaagct gcaaactaag 900
cgtatgtcca actctctgtt cgtcctgtac ttcggtctga accaccatca cgaccagctg 960
gctcaccaca ctgtctgctt cggtccacgt taccgtgagc tgatcgacga aatcttcaac 1020
cacgacggtc tggctgagga cttctctctg tacctgcacg ctccatgcgt cactgactcc 1080
tctctggctc cagaaggttg tggttcctac tacgttctgg ctccagtccc acacctgggt 1140
actgctaacc tggactggac tgtcgaaggt ccaaagctgc gtgaccgtat cttcgcttac 1200
ctggaacagc actacatgcc aggtctgcgt tctcagctgg tcactcaccg tatgttcact 1260
ccattcgact tccgtgatca gctgaacgct taccacggtt ccgctttctc cgtcgaacca 1320
gtcctgactc agtctgcttg gttccgtcca cacaaccgtg acaagactat cactaacctg 1380
tacctggtcg gtgctggtac tcatccaggt gctggtatcc caggtgtcat cggttccgct 1440
aaggctactg ctggtctgat gctggaggac ctgatctaa 1479
<210> 4
<211> 255
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 4
atggcttcct ctatgctctc ttccgctact atggttgcct ctccagctca agccactatg 60
gttgccccat tcaacggcct caaatcctcc gctgctttcc cagccaccag aaaggctaac 120
aacgacatca cttccatcac ttccaacggc ggaagagtca actgtatgca ggtgtggcct 180
ccaatcggca agaagaagtt cgagactctc tcttaccttc ctgaccttac cgactccggt 240
ggcagagtca actgt 255
<210> 5
<211> 1351
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 5
gatctcgatt tttgaggaat tttagaagtt gaacagagtc aatcgaacag acagttgaag 60
agatatggat tttctaagat taattgattc tctgtctaaa gaaaaaaagt attattgaat 120
taaatggaaa aagaaaaagg aaaaagggga tggcttctgc tttttgggct gaaggcggcg 180
tgtggccagc gtgctgcgtg cggacagcga gcgaacacac gacggagcag ctacgacgaa 240
cgggggaccg agtggaccgg acgaggatgt ggcctaggac gagtgcacaa ggctagtgga 300
ctcggtcccc gcgcggtatc ccgagtggtc cactgtctgc aaacacgatt cacatagagc 360
gggcagacgc gggagccgtc ctaggtgcac cggaagcaaa tccgtcgcct gggtggattt 420
gagtgacacg gcccacgtgt agcctcacag ctctccgtgg tcagatgtgt aaaattatca 480
taatatgtgt ttttcaaata gttaaataat atatataggc aagttatatg ggtcaataag 540
cagtaaaaag gcttatgaca tggtaaaatt acttacacca atatgcctta ctgtctgata 600
tattttacat gacaacaaag ttacaagtac atcatttaaa aatacaagtt acttatcaat 660
tgtagtgtat caagtaaatg acaacaaacc tacaaatttg ctattttgaa ggaacactta 720
aaaaaatcaa taggcaagtt atatagtcaa taaactgcaa gaaggcttat gacatggaaa 780
aattacatac accaatatgc tttattgtcc ggtatatttt acaagacaac aaagttataa 840
gtatgtcatt taaaaataca agttacttat caattgtcaa gtaaatgaaa acaaacctac 900
aaatttgtta ttttgaagga acacctaaat tatcaaatat agcttgctac gcaaaatgac 960
aacatgctta caagttatta tcatcttaaa gttagactca tcttctcaag cataagagct 1020
ttatggtgca aaaacaaata taatgacaag gcaaagatac atacatatta agagtatgga 1080
cagacatttc tttaacaaac tccatttgta ttactccaaa agcaccagaa gtttgtcatg 1140
gctgagtcat gaaatgtata gttcaatctt gcaaagttgc ctttcctttt gtactgtgtt 1200
ttaacactac aagccatata ttgtctgtac gtgcaacaaa ctatatcacc atgtatccca 1260
agatgctttt ttattgctat ataaactagc ttggtctgtc tttgaactca catcaattag 1320
cttaagtttc cataagcaag tacaaatagc t 1351
<210> 6
<211> 398
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 6
tgtaattgag aactagtatc ggcgtagagt aaaataaaac accacaagta tgacacttgg 60
tggtgattct gttcgatatc agtactaaat aaaggttaca aacttcttaa ttttcctact 120
tcatgccatg gatattccat tatggactat agtggacagg gccggtccta tgattttgag 180
ggccctaggc gaactcatcg cgatgggccc tccaagctat atataaaatt tattgatata 240
tatagacgct aattttactt gcaaaacgaa aacaaataca tctatatatt aaatttaaca 300
ttcctggtaa ttatcaagaa ataaaatcga ccaaaataac aatatatttg taacttggaa 360
ctaatatcat tatttattaa cttaatgaag aatagaac 398

Claims (5)

1.一种提高水稻种子胚乳中β-胡萝卜素含量的方法，包括以下步骤：
1)将根据水稻的密码子偏好性对酿酒酵母截短的HMG1、玉米的PSY基因和欧文氏菌的CrtI基因的序列进行优化，获得tHMG1、PSY1和CrtI1三个基因序列，所述tHMG1基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PSY1基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述CrtI1基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
2)将tHMG1、PSY1和CrtI1三个基因分别与水稻胚乳特异储存蛋白GluB-1基因启动子和终止子融合，分别构建基因表达盒；
3)将步骤2)获得的3个基因表达盒元件分别连接入植物表达载体，获得含tHMG1、PSY1和CrtI1三基因表达盒的植物多基因转化载体；
4)将步骤3)中获得的植物多基因转化载体转入农杆菌，转化至水稻愈伤组织，获得胚乳中β-胡萝卜素含量提高的转基因水稻。
2.根据权利要求1所述提高水稻种子胚乳中β-胡萝卜素含量的方法，其特征在于，步骤2)中，所述水稻胚乳特异性储存蛋白GluB-1基因启动子序列如SEQ ID NO.5所示；水稻胚乳特异性储存蛋白GluB-1基因终止子序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1所述提高水稻种子胚乳中β-胡萝卜素含量的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的植物表达载体为pCAMBIA1301。
4.根据权利要求1所述提高水稻种子胚乳中β-胡萝卜素含量的方法，其特征在于，步骤4)中的水稻愈伤组织为水稻中花11的愈伤组织。
5.tHMG1基因、PSY1基因和CrtI1基因在水稻转基因育种中的应用，其特征在于，所述tHMG1基因、PSY1基因和CrtI1基因分别是根据水稻的密码子偏好性对酿酒酵母截短的HMG1、玉米的PSY基因和欧文氏菌的CrtI基因的序列进行优化后获得，所述tHMG1基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PSY1基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述CrtI1基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述应用指将所述tHMG1基因、PSY1基因和CrtI1基因分别与水稻胚乳特异储存蛋白GluB-1基因启动子和终止子融合，构建基因表达盒，获得转化载体，转化至水稻中，获得胚乳中β-胡萝卜素含量提高的转基因水稻。
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