CN109503393A - 一种高速逆流色谱制备伏马毒素b1标准品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高速逆流色谱制备伏马毒素B1标准品的方法，属于农产品安全检测技术领域；该方法包括样品提取、反相柱层析粗纯化、高速逆流色谱精制；本发明高速逆流色谱制备伏马毒素B1标准品的方法稳定，能够适用于大米、小麦等多种谷物基质中伏马毒素B1的制备，制备量大、回收率高、成本低廉，能单次制备250mg以上纯度大于95%的伏马毒素B1标准品,单次成本仅为500元左右。

Description

一种高速逆流色谱制备伏马毒素B1标准品的方法
技术领域
本发明涉及一种高速逆流色谱制备伏马毒素B1标准品的方法，属于农产品安全检测技术领域。
背景技术
伏马毒素(Fumonisins，FB)是一种镰刀菌毒素，主要由层生镰刀菌(F.proliferatum)和轮枝镰刀菌(F.verticillioides)等产生，它最早是由南非科学家Gelderblom等人于1992年从玉米中分离获得。伏马毒素是一类有不同的多氢醇和丙三羧酸组成的双酯类化合物，有11种不同的种类，但主要以FB1、FB2、FB3三种形式存在，其中FB1危害最大、分布最广。伏马毒素会污染多种粮食作物，在世界各地的谷物及农副产品中广泛存在，尤其是玉米。2007-2010年巴西的100份玉米食品中检测到FB1的浓度为0.126mg/kg～4.348mg/kg，检出率达82％(Food Control,2012,26,614-618)；2010年土耳其抽检的100份玉米样品中，FB1浓度从0.05mg/kg～25.72mg/kg检出率达52％(Food additives&contaminants.Part A,Chemistry,analysis,control,exposure&risk assessment,2012,29,799-808)；李丰华等(Food additives&contaminants.Part B,Surveillance,2015,8,169-174)对2014年山东省522份谷物样品进行检测，发现玉米中FB1检测率为98.1％，平均值为369.2ug/kg。程传民等(饲料博览,2016(3):25-29)2014年对我国19个省615份饲料样品进行了检测，在华南地区的仔猪饲料中FB1污染率高达94.1％，这些调查数据说明我国食品及饲料中FB1污染现状不容乐观。
FB1具有很好的稳定性，食品在储藏、加工、烹调高温条件下都不会发生降解，所以FB1可以通过食物进入体内，危害人和动物的健康。FB1的结构与人或动物的神经鞘氨醇极为相似，通过竞争鞘脂类代谢过程中的关键酶，致使神经鞘脂类生物合成受到抑制。神经鞘脂类代谢的阻断可增强细胞凋亡、影响细胞生长和分化，最终造成细胞的损伤。伏马毒素对很多动物的肝脏和肾脏具有损伤效应，因此具有很大的毒性。FB1会导致马的脑白质软化症(ELEM)，该病对于马属动物有极高的致死率；FB1也会导致猪的肺水肿和胸腔积水，同时会对猪的肝脏和胰脏造成损伤；FB1还与人类食道癌高发率有关，在我国河北和河南部分地区，玉米中伏马毒素污染引发了当地人食管癌高发；山东省某地区原发性肝癌发病率的增加也与FB1污染有关。目前，世界卫生组织国际癌症研究中心通过评估其对人类的危害后，把FB1列为可能致癌物。
鉴于伏马毒素B1污染的普遍性和危害性，它的污染风险评估、毒素研究以及控制研究等受到大家的广泛关注。但是无论是伏马毒素B1的检测、抗体制备、毒理分析还是降解控制研究等，都需要大量的毒素标准品。然而现有的伏马毒素标准品的制备效率不高，技术不强，商品化的伏马毒素标准品主要由国外进口，价格非常昂贵。
目前，伏马毒素B1制备纯化的方法主要采用固相柱结合制备液相进行分离纯化，在一定程度上降低了实验成本，但制备液相及其分离柱成本较高、制备量小，且分离柱有使用寿命，所以制备成本依然很高。中国专利201510253888.4公开了一种同时制备伏马毒素B1，B2和B3标准品的方法，该方法从玉米、小麦、大米等培养基中提取伏马毒素，该文献首先利用阳离子交换柱净化毒素，然后采用中压制备色谱的方法精制纯化毒素，制纯度高于98％伏马毒素B1、B2、B3各10mg，成本不足2000元。但是该方法制备获得的毒素含量太低，不能满足用于毒素脱毒降解研究、毒理学动物试验等需要大量毒素的要求，尽管该方案单次实验成本较低，但若制备大量毒素标准品，就需要经过多次制备纯化，成本依然较高且耗费大量人力资源。因此需要有一种能够大规模、安全高效、廉价制备纯化伏马毒素的技术。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种高速逆流色谱制备伏马毒素B1标准品的方法，该方法可在提高毒素制备量的同时降低毒素制备的成本。
上述发明的目的是这样实现的：一种高速逆流色谱制备伏马毒素B1标准品的方法，其具体步骤如下：
1、制备伏马毒素培养物：将镰刀菌接种至PDA培养基上25℃活化，待培养皿上长满菌丝后，用孔径6.0mm的灭菌过的牛津杯打孔，按照10个菌碟/瓶的接种量分别接种到装有300g大米培养基的三角瓶中，25℃培养15-40d，即获得大米培养物；将大米培养物置于通风橱中晾干、粉碎至全部颗粒小于1mm，获得伏马毒素培养物，备用；
2、制备含有伏马毒素的大米基质：向步骤1获得的伏马毒素培养物中加入乙酸乙酯，伏马毒素培养物与乙酸乙酯的质量体积比为1：5，(质量体积比单位为g/ml)，震荡萃取3h，分层后，弃上层有机相，将下层的固体物质放通风橱中吹干，即为含有伏马毒素的大米基质；
3、制备第一次提取液：向步骤2获得的含有伏马毒素的大米基质中加入体积分数70％-90％的甲醇-水溶液震荡提取伏马毒素，料液比(即含有伏马毒素的大米基质与甲醇-水溶液质量体积比，g/ml)为1/3-1/6，提取时间1-4h、转速150rpm；然后过滤，过滤后获得滤液和滤饼，备用，滤液即为第一次提取液；
4、制备第二次提取液：取步骤3获得的滤饼加入体积分数70％-90％的甲醇-水溶液重悬，滤饼与甲醇-水溶液的质量体积比(g/ml)为1/3-1/6，提取时间1-4h、转速150rpm，然后过滤，滤液即为第二次提取液；
5、上样：将步骤3和步骤4获得的第一次提取液和第二次提取液合并，减压蒸馏至干，按反相填料质量的0.5-3％上样量加入C18层析柱，用体积分数为30-40％的甲醇-水溶液冲洗杂质，然后用体积分数为50％-60％的甲醇-水溶液洗脱伏马毒素B1，分管收集洗脱液；
6、分离纯化：用TLC法检测步骤5每管洗脱液中伏马毒素的存在情况，展开剂体系为氯仿/甲醇/冰醋酸(氯仿/甲醇/冰醋酸的体积比依次为8:3:1)，将含有伏马毒素B1的洗脱液减压蒸馏至干后，用10mL高速逆流色谱体系的流动相(正庚烷/正丁醇/甲醇/水的体积比依次为2:4:1:4)重溶；再使用高速逆流色谱对伏马毒素B1分离纯化，流动相流速1.5-3mL/min，仪器转速800-1200rpm，运行温度30-45℃，分管收集洗脱液，用TLC方法检测每管洗脱液中伏马毒素B1的存在情况，将含有伏马毒素B1的洗脱液合并后减压蒸馏至干，即获得伏马毒素B1标准品。
大米培养基:将大米和水按照质量体积比10:3(g/mL)混合后，121℃灭菌1h；
PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，余量为蒸馏水，115℃灭菌30min。
在本发明中：所述的用TLC方法检测每管收集液中伏马毒素的存在情况是指：在定量收集不同的洗脱液后，把每管洗脱液的样品进行旋转浓缩，再用TLC方法检测每管洗脱液中是否含有伏马毒素。
实际制备中，所有的伏马毒素高产毒菌株均可使用本发明方法制备伏马毒素标准品，本申请中，FB1即为伏马毒素B1。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本方法采用二步法纯化伏马毒素，从而减少了多步骤制备纯化造成的毒素损失率；
(2)本方法纯化伏马毒素采用液液分配色谱技术，以有机溶剂作为固定相，极大地降低了毒素制备纯化成本，提高了产品回收率；
(3)本方法一次性能上样高达1g干物质，在确保纯度的前提下，单次制备伏马毒素标准品可高达250mg、纯度大于95％，显著高于现有的其它方法(现有方法一次制备FB1标准品的量在10mg左右)。
附图说明
图1为实施例1获得FB1标准品的高分辨质谱图。
图2为实施例1制备获得FB1标准品的13C-NMR谱图。
图3为实施例1制备获得FB1标准品的1H-NMR谱图。
具体实施方式
以下实施例仅为更详细说明本申请发明方法，并非是对本申请权利要求的限制。
实施例所涉及的培养基：
大米培养基:将大米和水按照质量体积比10:3(g/mL)混合后，放置于三角瓶中，121℃灭菌1h(Journal of Agricultural and Food Chemistry,51(2),521-523)；
PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，余量为蒸馏水，115℃灭菌30min。
实施例中所涉及的菌株：
层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)，购于北纳创联生物技术有限公司，菌株编号：BNCC 195647。
实施例1
制备步骤如下：
1、制备伏马毒素培养物：将层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)195647接种至PDA培养基上25℃活化，待培养皿上长满菌丝后，用孔径6.0mm的灭菌过的牛津杯打孔，按照10个菌碟/瓶的接种量分别接种到装有300g大米培养基的三角瓶中，共3瓶，25℃，培养15d，获得大米培养物；将大米培养物置于通风橱中晾干、粉碎至全部颗粒小于1mm，获得伏马毒素培养物，备用；
伏马毒素B1含量的测定，按照GB5009.240—2016第一法食品中伏马毒素的测定：免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法检测大米培养物中伏马毒素B1的浓度，然后按照公式(大米培养物中FB1重量(mg)＝伏马毒素B1的浓度(mg/kg)×大米培养物的重量(kg))计算出纯化前大米培养物中伏马毒素B1的重量，经过检测计算，本步骤大米培养物中FB1重量＝368.76mg；
2、制备含有伏马毒素的大米基质：向步骤1获得的伏马毒素培养物中加入乙酸乙酯，伏马毒素培养物与乙酸乙酯的质量体积比为1：5，(质量体积比单位为g/ml)震荡萃取3h，分层后，弃上层有机相，将下层的固体物质放通风橱中吹干，即获得含有伏马毒素的大米基质；
3、制备第一次提取液：向步骤2获得的含有伏马毒素的大米基质中加入体积分数70％的甲醇-水溶液震荡提取伏马毒素，料液比(即含有伏马毒素的大米基质与甲醇-水溶液质量体积比，g/ml)为1/3、提取时间1h、转速150rpm；然后用whatmam中速滤纸(型号102，具体实施中也可以使用其他型号的滤纸)过滤，过滤后获得滤液(即第一次提取液)和滤饼，备用；
4、制备第二次提取液：取步骤3获得的滤饼加入体积分数70％的甲醇-水溶液重悬，料液比(滤饼与甲醇-水溶液的质量体积比，g/ml)为1/3，按步骤3所述条件(即提取时间1h、转速150rpm)，然后用whatmam中速滤纸过滤，滤液即为第二次提取液；
5、上样：将步骤3和步骤4获得的第一次提取液和第二次提取液合并，减压蒸馏至干(转速100转/分钟、温度65℃)，待上样，按反相填料(上海安谱实验科技有限公司，HC-C18，40～63μm)质量的0.5％(w/w)上样量加入C18层析柱，用体积分数为30％的甲醇-水溶液300mL冲洗杂质，然后用体积分数为50％的甲醇-水溶液450mL洗脱伏马毒素B1，分管收集洗脱液；
6、分离纯化：用TLC法(参见文献：Talanta,1999,50(2):381-389.)检测步骤5每管洗脱液中伏马毒素的存在情况，展开剂体系为氯仿/甲醇/冰醋酸(氯仿/甲醇/冰醋酸的体积比依次为8:3:1)，将含有伏马毒素B1的洗脱液减压蒸馏至干后，用10mL高速逆流色谱体系的流动相(正庚烷/正丁醇/甲醇/水的体积比依次为2:4:1:4)重溶；再使用高速逆流色谱(江阴逆流科技有限公司，OptiChromeTM A半制备型高速逆流色谱仪)对伏马毒素B1分离纯化，流动相流速1.5mL/min，仪器转速800rpm，运行温度30℃，分管收集洗脱液，用TLC方法检测每管洗脱液中伏马毒素B1的存在情况，将含有伏马毒素B1的洗脱液合并后减压蒸馏至干，即获得伏马毒素B1标准品。
经过称重后，本实施例获得的伏马毒素B1标准品重量达到229.1mg，和纯化前大米培养基中伏马毒素B1的总量进行比较，按照下面回收率的计算公式，计算出回收率为62.13％(表1)；
表1实施例制备FB1回收率
表2实施例制备FB1纯度的检测结果
然后取其中11.41mg制备的标准品，溶解于1mL体积分数为50％的乙腈-水溶液中，稀释3000倍后用液相色谱检测(Waters e2695高效液相色谱配备Waters 2475荧光检测器，检测方法参照GB5009.240—2016第一法)FB1浓度，然后换算成实际毒素重量(换算公式)，再和称量值进行比较，得到制备获得的FB1的纯度(表2)：
本实验重复三次，计算平均纯度值达到96.86％，把制备获得的FB1标准品进行质谱，核磁共振C谱和H谱检测，结果均表明制备FB1标准品为纯品，详细检测结果见图1-3。
图1是本实施例制备获得FB1标准品的高分辨质谱图，由图中可见样品质谱数据与FB1分子量吻合，同时并无其余杂质信号(其余两个信号为FB1同位素信号)，证明样品即为FB1纯品。
图2是本实施例制备获得FB1标准品的13C-NMR谱图，图中可见FB1所有C原子信号均出现，化学位移符合文献纪录，并且没有明显杂质信号，证明产物即为FB1纯品。
图3是本实施例制备获得FB1标准品的1H-NMR谱图，图中可见FB1所有相关H原子信号均出现，化学位移以及偶合常数均符合文献纪录，并且没有明显杂质信号，证明产物即为FB1纯品。
本实施例中使用的产伏马毒素菌株为层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)195647，在具体实施中，也可以使用其他镰刀菌株或产伏马毒素菌株，同样可实现发明之目的。
实施例2
制备步骤如下：
1、制备伏马毒素培养物：将层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)195647接种至PDA培养基上25℃活化，待培养皿上长满菌丝后，用孔径6.0mm的灭菌牛津杯打孔，按照10个菌碟/瓶的接种量分别接种到装有300g大米培养基的三角瓶中，共3瓶，25℃，培养30d，获得大米培养物；将大米培养物置于通风橱中晾干、粉碎至全部颗粒小于1mm，获得伏马毒素培养物，备用；
2、伏马毒素B1含量的测定，按照GB5009.240—2016第一法食品中伏马毒素的测定：免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法检测大米培养物中伏马毒素B1的浓度，然后按照公式(大米培养物中FB1重量(mg)＝伏马毒素B1的浓度(mg/kg)×大米培养物的重量(kg))计算出纯化前大米培养物中伏马毒素B1的重量，经过检测计算，本实施例步骤1中大米培养物中FB1重量＝315.34mg；
3、大米培养物中杂质的去除：向步骤1获得的伏马毒素培养物中加入乙酸乙酯，伏马毒素培养物与乙酸乙酯的质量体积比为1：5，(质量体积比单位为g/ml)，震荡萃取3h，分层后，弃上层有机相，将下层的固体物质放通风橱中吹干，即获得含有伏马毒素的大米基质；
4、第一次提取液：向步骤3获得的含有伏马毒素的大米基质中加入体积分数为80％的甲醇-水溶液震荡提取伏马毒素，料液比(即含有伏马毒素的大米基质与甲醇-水溶液质量体积比，g/ml)为1/4，提取时间3h，转速150rpm；然后用whatmam中速滤纸(型号102，具体实施中也可以使用其他型号的滤纸)过滤，过滤后获得滤液(即第一次提取液)和滤饼，备用；
在具体实施中，震荡提取步骤中，料液比(g/ml)在1：3-6范围范围内，提取1-4h均可实现本步骤萃取之目的。
5、第二次提取液：取步骤4获得的滤饼加入体积分数80％的甲醇-水溶液重悬，料液比为1/4(g/ml)，按步骤4所述条件(即提取时间3h、转速150rpm)，然后用whatmam中速滤纸过滤，滤液即为第二次提取液；
在具体实施中，震荡提取步骤中，料液比(g/ml)在1：3-6范围范围内，提取1-4h均可实现本步骤萃取之目的。
6、上样：将步骤4和步骤5获得的第一次提取液和第二次提取液合并，减压蒸馏至干(转速100转/分钟、温度65℃)，待上样，按反相填料(上海安谱实验科技有限公司，HC-C18，40～63μm)质量的2％(w/w)上样量加入C18层析柱，用体积分数为35％的甲醇-水溶液300mL冲洗杂质，然后用体积分数为55％的甲醇-水溶液450mL洗脱伏马毒素B1，分管收集洗脱液；
7、分离纯化：用TLC法检测步骤6每管洗脱液中伏马毒素的存在情况，展开剂体系为氯仿/甲醇/冰醋酸(三者的体积比为8:3:1)，将含有伏马毒素B1的洗脱液减压蒸馏至干后，用10mL高速逆流色谱体系的流动相(正庚烷/正丁醇/甲醇/水的体积比依次为2:4:1:4)重溶；再使用高速逆流色谱(江阴逆流科技有限公司，OptiChromeTM A半制备型高速逆流色谱仪)对伏马毒素B1分离纯化，流动相流速2.2mL/min，仪器转速1050rpm，运行温度35℃，分管收集洗脱液，用TLC方法检测每管洗脱液中含有伏马毒素B1的存在情况，将含有伏马毒素B1的洗脱液合并后减压蒸馏至干，即获得伏马毒素B1标准品。
经过称重后，本实施例获得的伏马毒素B1标准品重量达到233.63mg，和纯化前大米培养基中伏马毒素B1的总量进行比较，按照下面回收率的计算公式，计算出回收率为74.09％(表1)；
然后取本实施例制备的13.05mg标准品，溶解于1mL体积比为50％的乙腈-水溶液中，稀释3000倍后用液相色谱检测(Waters e2695高效液相色谱配备Waters 2475荧光检测器，检测方法参照GB5009.240—2016第一法)FB1浓度，然后换算成实际毒素重量(换算公式)，再和称量值进行比较，得到制备获得的FB1的纯度(表2)：
本实验重复三次，计算平均纯度值达到95.58％，把制备获得的FB1标准品进行质谱，核磁共振C谱和H谱检测，结果均表明制备FB1标准品为纯品。
实施例3
制备步骤如下：
1、制备伏马毒素培养物：将层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)195647接种至PDA培养基上25℃活化，待培养皿上长满菌丝后，用孔径6.0mm的灭菌过的牛津杯打孔，按照10个菌碟/瓶的接种量分别接种到装有300g大米培养基的三角瓶中，共3瓶，25℃，培养40d，获得大米培养物；将大米培养物置于通风橱中晾干、粉碎至全部颗粒小于1mm，获得伏马毒素培养物；
2、伏马毒素B1含量的测定，按照GB5009.240—2016第一法食品中伏马毒素的测定：免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法检测大米培养物中伏马毒素B1的浓度，然后按照公式(大米培养物中FB1重量(mg)＝伏马毒素B1的浓度(mg/kg)×大米培养物的重量(kg))计算出纯化前大米培养物中伏马毒素B1的重量，经过检测计算，本实施例步骤1中大米培养物中FB1重量＝327.93mg；
3、大米培养物中杂质的去除：向步骤1获得的伏马毒素培养物中加入乙酸乙酯，伏马毒素培养物与乙酸乙酯的质量体积比为1：5，(质量体积比单位为g/ml)，震荡萃取3h，分层后，弃上层有机相，将下层的固体物质放通风橱中吹干，即获得含有伏马毒素的大米基质；
4、第一次提取液：向步骤3获得的含有伏马毒素的大米基质中加入体积分数为90％的甲醇-水溶液震荡提取伏马毒素，料液比(即含有伏马毒素的大米基质与甲醇-水溶液质量体积比，g/ml)为1/6、提取时间4h、转速150rpm；然后用whatmam中速滤纸(型号102，具体实施中也可以使用其他型号的滤纸)过滤，过滤后获得滤液(即第一次提取液)和滤饼，备用；
5、第二次提取液：取步骤4获得的滤饼加入体积比90％的甲醇-水溶液重悬，料液比为1/6(g/ml)，按步骤4所述条件(即提取时间4h、转速150rpm)，然后用whatmam中速滤纸过滤，滤液即为第二次提取液；
6、上样：将步骤4和步骤5获得的第一次提取液和第二次提取液合并，减压蒸馏至干(转速100转/分钟、温度65℃)，待上样，按反相填料(上海安谱实验科技有限公司，HC-C18，40～63μm)质量的3％(w/w)上样量加入C18层析柱，用体积比为40％的甲醇-水溶液300mL冲洗杂质，然后用体积比为60％的甲醇-水溶液500mL洗脱伏马毒素B1，分管收集洗脱液；
7、分离纯化：用TLC法检测步骤6每管洗脱液中伏马毒素的存在情况，展开剂体系为氯仿/甲醇/冰醋酸(三者的体积比依次为8:3:1)，将含有伏马毒素B1的洗脱液减压蒸馏至干后，用10mL高速逆流色谱体系的流动相(正庚烷/正丁醇/甲醇/水的体积比依次为2:4:1:4)重溶；再使用高速逆流色谱(江阴逆流科技有限公司，OptiChromeTM A半制备型高速逆流色谱仪)对伏马毒素B1分离纯化，流动相流速3.0mL/min，仪器转速1200rpm，运行温度45℃，分管收集洗脱液，用TLC方法检测每管洗脱液中含有伏马毒素B1的存在情况，将含有伏马毒素B1的洗脱液合并后减压蒸馏至干，即获得伏马毒素B1标准品。
经过称重后，本实施例获得的伏马毒素B1标准品重量达到253.91mg，和纯化前大米培养基中伏马毒素B1的总量进行比较，按照下面回收率的计算公式，计算出回收率为77.43％(表1)；
然后取其中11.43mg制备的标准品，溶解于1mL体积比为50％的乙腈-水溶液中，稀释3000倍后用液相色谱检测(Waters e2695高效液相色谱配备Waters 2475荧光检测器，检测方法参照GB5009.240—2016第一法)FB1浓度，然后换算成实际毒素重量(换算公式)，再和称量值进行比较，得到制备获得的FB1的纯度(表2)：
本实验重复三次，计算平均纯度值达到95.47％，把制备获得的FB1标准品进行质谱，核磁共振C谱和H谱检测，结果均表明制备FB1标准品为纯品。
以上详细说明了本发明的实施方式，但这只是为了便于理解而举的实例，不应被视为是对本发明范围的限制。同样，任何所属技术领域的技术人员均可根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，做出各种可能的等同改变或替换，但所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种高速逆流色谱制备伏马毒素B1标准品的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）制备伏马毒素培养物：将镰刀菌接种至大米培养基中，25℃培养15d-40 d，即获得大米培养物，将大米培养物晾干、粉碎，获得伏马毒素培养物，备用；
大米培养基: 将大米和水按照质量体积比10:3混合后，质量体积比单位为g/mL ，121℃灭菌1h；
2）制备含有伏马毒素的大米基质：向步骤1）获得的伏马毒素培养物中加入乙酸乙酯，震荡萃取后，分层，弃上层有机相，将下层的固体物质吹干，即为含有伏马毒素的大米基质；
3）制备第一次提取液：向步骤2）获得的含有伏马毒素的大米基质中加入甲醇-水溶液震荡提取伏马毒素，震荡萃取后过滤，过滤后获得滤液和滤饼，备用，滤液即为第一次提取液；
4）制备第二次提取液：取步骤3）获得的滤饼加入甲醇-水溶液重悬，震荡萃取后过滤，滤液即为第二次提取液；
5）上样：将步骤3）和步骤4）获得的第一次提取液和第二次提取液合并，减压蒸馏至干，加入C18层析柱，用甲醇-水溶液冲洗杂质，然后用甲醇-水溶液洗脱伏马毒素B1，分管收集洗脱液；
6）分离纯化：用TLC法检测步骤5）每管洗脱液中是否含有伏马毒素，展开剂体系为氯仿、甲醇、冰醋酸按体积比依次为8:3:1混合后获得；将含有伏马毒素B1的洗脱液减压蒸馏至干后，用高速逆流色谱体系的流动相重溶；再使用高速逆流色谱对伏马毒素B1分离纯化，分管收集洗脱液，用TLC方法检测每管洗脱液中是否含有伏马毒素B1，将含有伏马毒素B1的洗脱液合并后减压蒸馏至干，即获得伏马毒素B1标准品。
2.根据权利要求1所述高速逆流色谱制备伏马毒素B1标准品的方法，其特征在于，步骤1）所述粉碎是指将大米培养物粉碎至粒径小于1mm。
3.根据权利要求1所述高速逆流色谱制备伏马毒素B1标准品的方法，其特征在于，步骤2）所述伏马毒素培养物与乙酸乙酯的质量体积比为1：5，质量体积比单位为g/ml。
4.根据权利要求1所述高速逆流色谱制备伏马毒素B1标准品的方法，其特征在于，步骤3）中含有伏马毒素的大米基质与甲醇-水溶液的质量体积比为1/3-1/6，质量体积比单位为g/ml；步骤5）所述滤饼与甲醇-水溶液的质量体积比为1/3-1/6，质量体积比单位为g/ml。
5.根据权利要求1所述高速逆流色谱制备伏马毒素B1标准品的方法，其特征在于，步骤6）所述流动相为正庚烷、正丁醇、甲醇、水按体积比2:4:1:4混合后获得。
6.根据权利要求1所述高速逆流色谱制备伏马毒素B1标准品的方法，其特征在于，步骤3）和步骤4）所述甲醇-水溶液中，甲醇的体积分数为70%-90%。
7.根据权利要求1所述高速逆流色谱制备伏马毒素B1标准品的方法，其特征在于，步骤5）所述用甲醇-水溶液冲洗杂质，然后用甲醇-水溶液洗脱伏马毒素B1是指，用体积分数为30-40%的甲醇-水溶液冲洗杂质，然后用体积分数50%-60%的甲醇-水溶液洗脱伏马毒素B1。
8.根据权利要求1-7任一所述高速逆流色谱制备伏马毒素B1标准品的方法，其特征在于，步骤1）所述将镰刀菌接种至大米培养基中，是指：将镰刀菌接种至PDA培养基上，25℃待培养皿上长满菌丝后，打孔获得孔径为6.0mm的菌碟，每10个菌碟接种至300g大米培养基中。
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