CN109457019A - Kcnh2基因scd相关snp检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种KCNH2基因SCD相关SNP检测试剂盒及检测方法，是以SEQ ID NO.1～32所示的16对特异性多重PCR引物对，SEQ ID NO.33～82所示的50个SNaPshot单碱基延伸引物，一次性检测KCNH2基因上的50个SCD相关SNP分子标记，筛查与SCD相关的KCNH2基因突变问题。本发明只需进行一次实验即可检测KCNH2基因上50个与SCD相关的SNP，并得到清晰结论，方法简便、快速、准确。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测及其应用领域，特别是涉及一种用于检测KCNH2基因上可致心源性猝死的相关SNP的微测序检测试剂盒。
背景技术
在法医病理学实践中，常遇到一类无明显器质性疾病、不明原因的猝死案例，包括婴幼儿猝死综合征、青壮年猝死综合征、抑制死、云南不明原因死亡等，其在法医学实践中的核心鉴定要点仍为阴性发现和排除性诊断。
心源性猝死(sudden cardiac death，SCD)是由于心脏原因所致的各种突然死亡。已经证明KCNH2是一种SCD相关基因，且国内外对KCNH2基因上多个SNP的突变致病机制均有研究。然而，目前国内尚未有专门的遗传学检测试剂盒针对常见的KCNH2致病或致死突变位点进行筛查。
SNP的检测技术很多，包括基于分子学原理的SNP分型方法，包括等位基因特异性杂交、引物延伸、寡核苷酸链接反应和内切酶酶切技术等。而分型之后的检测方法主要涉及荧光、冷光、质谱等。不同分型方法与检测手段组合可以衍生出各种技术，如DNA荧光测序、Taqman技术、DNA芯片技术、焦磷酸测序技术等。但每种技术都有其一定的优势和局限性。
DNA荧光测序是通过四种不同荧光试剂分别标记四种双脱氧核苷酸进行DNA测序的方法，包括第一代测序(Sanger测序和连锁分析)和新一代测序(NGS)。
到目前为止，Sanger测序仍然是作为基因检测的金标准。但也存在以下问题：1)、Sanger测序的目的是为了寻找与疾病有关的特定基因突变，对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病理筛查是难以完成的；2)、虽然Sanger测序具有较高的分析准确性，但其准确性还取决于测序仪器以及测序条件的设定；3)、Sanger测序不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变类型，因此对于一些与此相关的遗传性疾病，还不能做出基因学诊断；4)、Sanger测序的成本较高，不能满足大部分法医实验室的需求。而采用连锁分析进行基因检测又存在很大的局限性，不但所需遗传样本量较大，一般要求提供3代及以上遗传家系患者血样，而且数据量大，处理复杂，产出速率较慢，定位不够精确，使得研究工作繁重和定位基因的时间周期特别长。
NGS技术主要包括全基因组重测序(WGS)、全外显子组测序(WES)和目标区域测序(TRS)。总体而言，NGS技术具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点。但其也存在技术成本昂贵、操作复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析范围狭窄等不足。
Taqman技术检测灵敏度较高，分型准确，操作便捷，杂交效率高，但只是用于低、中通量的SNP检测。其存在的缺点主要包括淬灭难以彻底，本底较高；定量时易受酶性能和试剂质量影响；检测点突变能力相对不足；价格昂贵；不能读出序列，不太直观。
DNA芯片技术即基因芯片分析，通过激光共聚焦扫描对杂交荧光信号的有无进行检测分析，从而找出突变，是目前国外较为普遍的分析方法。其缺点是技术成本昂贵、操作复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析范围狭窄等。
焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是一种新型的酶联级联测序技术，适于对已知短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与Sanger测序法相媲美，速度却大大提高。存在的主要缺点为：1)、技术原理上讲，对多个单碱基重复序列的准确性比较低；2)、读出的片段较短，且不能提供配对端点测序信息；3)、无克隆反应，导致无法获得材料来覆盖序列缺口，而基因组测序完成过程中的一个重要部分就是补充低丰度区域。
法医学实际检案中，要求检测方法具有高准确性、高灵敏度和高通量，经济而且便于推广。同时，由于SNP遗传标记的多态性不高，较强的复合扩增能力对分型体系的系统效能尤为重要。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一种KCNH2基因SCD相关SNP检测试剂盒。
提供所述KCNH2基因SCD相关SNP的检测方法，是本发明的另一发明目的。
本发明所述的KCNH2基因SCD相关SNP检测试剂盒包括了SEQ ID NO. 1～32所示的16对特异性多重PCR引物对，以及SEQ ID NO. 33～82所示的50个SNaPshot单碱基延伸引物，用于检测以下50个SNP分子标记中的任意两个或两个以上：
rs199472936、rs143167166、rs199473547、rs199473032、rs151031345、rs36210421、rs141117135、rs199473016、rs121912506、rs773724817、rs794728395、rs794728393、rs199472970、rs41307295、rs199473039、rs199472944、rs199473522、rs794728483、rs199472926、rs121912504、rs199472918、rs794728364、rs730880118、rs794728431、rs199472934、rs1016101226、rs199472941、rs199473428、rs12720441、rs199472851、rs189014161、rs199472912、rs199472942、rs794728382、rs199472894、rs1338579153、rs199472842、rs878853771、rs367570298、rs199472899、rs794728434、rs794728366、rs143518632、rs142590566、rs199472947、rs199473416、rs199472838、rs199472952、rs199472835、rs794728475。
其中，所述SEQ ID NO. 1～32所示的16对特异性多重PCR引物对通过扩增能够得到包含不同SNP的靶基因片段，且所述50个SNP分子标记均包含在所述16对特异性多种PCR引物的靶基因片段中，每段靶基因片段中至少含有1个SNP，最多含有7个SNP。
更具体地，本发明所述的16对特异性多重PCR引物对分别用于对应扩增各自所述的SNP分子标记。
rs36210421的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 1所示的上游引物和SEQ ID NO. 2所示的下游引物。
rs142590566的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 3所示的上游引物和SEQ ID NO. 4所示的下游引物。
rs141117135、rs199473016的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 5所示的上游引物和SEQ ID NO. 6所示的下游引物。
rs199472970、rs41307295、rs199473039、rs199472944、rs199473522、rs199472934、rs199472936的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 7所示的上游引物和SEQ IDNO. 8所示的下游引物。
rs1016101226的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物。
rs794728364、rs730880118、rs794728431的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 11所示的上游引物和SEQ ID NO. 12所示的下游引物。
rs773724817、rs794728395、rs121912506、rs794728393的PCR引物对为序列SEQID NO. 13所示的上游引物和SEQ ID NO. 14所示的下游引物。
rs151031345的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物。
rs367570298、rs199472899、rs199472894、rs794728434、rs794728366的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 17所示的上游引物和SEQ ID NO. 18所示的下游引物。
rs794728483、rs199472926、rs121912504、rs199472918的PCR引物对为序列SEQID NO. 19所示的上游引物和SEQ ID NO. 20所示的下游引物。
rs199472912、rs878853771的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 21所示的上游引物和SEQ ID NO. 22所示的下游引物。
rs12720441、rs189014161的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 23所示的上游引物和SEQ ID NO. 24所示的下游引物。
rs199472941、rs199473428、rs199472942、rs143518632、rs199472947、rs199472952的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 25所示的上游引物和SEQ ID NO. 26所示的下游引物。
rs794728382、rs1338579153的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 27所示的上游引物和SEQ ID NO. 28所示的下游引物。
rs143167166、rs199473547、rs199473032的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 29所示的上游引物和SEQ ID NO. 30所示的下游引物。
rs199472851、rs199472842、rs199473416、rs199472838、rs199472835、rs794728475的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 31所示的上游引物和SEQ ID NO. 32所示的下游引物。
进而，本发明所述SEQ ID NO. 33～82所示的SNaPshot单碱基延伸引物是分别针对所述50个SNP分子标记设计的，并具体对应以下各自的SNP分子标记。
rs199472936的延伸引物序列为SEQ ID NO. 33；rs143167166的延伸引物序列为SEQ ID NO. 34；rs199473547的延伸引物序列为SEQ ID NO. 35；rs199473032的延伸引物序列为SEQ ID NO. 36；rs151031345的延伸引物序列为SEQ ID NO. 37；rs36210421的延伸引物序列为SEQ ID NO. 38；rs141117135的延伸引物序列为SEQ ID NO. 39；rs199473016的延伸引物序列为SEQ ID NO. 40；rs121912506的延伸引物序列为SEQ ID NO. 41；rs773724817的延伸引物序列为SEQ ID NO. 42；rs794728395的延伸引物序列为SEQ IDNO. 43；rs794728393的延伸引物序列为SEQ ID NO. 44；rs199472970的延伸引物序列为SEQ ID NO. 45；rs41307295的延伸引物序列为SEQ ID NO. 46；rs199473039的延伸引物序列为SEQ ID NO. 47；rs199472944的延伸引物序列为SEQ ID NO. 48；rs199473522的延伸引物序列为SEQ ID NO. 49；rs794728483的延伸引物序列为SEQ ID NO. 50；rs199472926的延伸引物序列为SEQ ID NO. 51；rs121912504的延伸引物序列为SEQ ID NO. 52；rs199472918的延伸引物序列为SEQ ID NO. 53；rs794728364的延伸引物序列为SEQ IDNO. 54；rs730880118的延伸引物序列为SEQ ID NO. 55；rs794728431的延伸引物序列为SEQ ID NO. 56；rs199472934的延伸引物序列为SEQ ID NO. 57；rs1016101226的延伸引物序列为SEQ ID NO. 58；rs199472941的延伸引物序列为SEQ ID NO. 59；rs199473428的延伸引物序列为SEQ ID NO. 60；rs12720441的延伸引物序列为SEQ ID NO. 61；rs199472851的延伸引物序列为SEQ ID NO. 62；rs189014161的延伸引物序列为SEQ ID NO. 63；rs199472912的延伸引物序列为SEQ ID NO. 64；rs199472942的延伸引物序列为SEQ IDNO. 65；rs794728382的延伸引物序列为SEQ ID NO. 66；rs199472894的延伸引物序列为SEQ ID NO. 67；rs1338579153的延伸引物序列为SEQ ID NO. 68；rs199472842的延伸引物序列为SEQ ID NO. 69；rs878853771的延伸引物序列为SEQ ID NO. 70；rs367570298的延伸引物序列为SEQ ID NO. 71；rs199472899的延伸引物序列为SEQ ID NO. 72；rs794728434的延伸引物序列为SEQ ID NO. 73；rs794728366的延伸引物序列为SEQ IDNO. 74；rs143518632的延伸引物序列为SEQ ID NO. 75；rs142590566的延伸引物序列为SEQ ID NO. 76；rs199472947的延伸引物序列为SEQ ID NO. 77；rs199473416的延伸引物序列为SEQ ID NO. 78；rs199472838的延伸引物序列为SEQ ID NO. 79；rs199472952的延伸引物序列为SEQ ID NO. 80；rs199472835的延伸引物序列为SEQ ID NO. 81；rs794728475的延伸引物序列为SEQ ID NO. 82。
本发明所述检测试剂盒中还包括了PCR扩增反应常用的酶和试剂。
进一步地，本发明还提供了一种KCNH2基因SCD相关SNP的检测方法，包括以下步骤。
1、以从待测样本中提取的基因组DNA为模板，通过选自所述SEQ ID NO. 1～32所示16对特异性多重PCR引物对中的引物对，构建多重PCR扩增体系进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化处理。
2、以所述纯化的PCR产物为模版，通过选自所述SEQ ID NO. 33～82所示SNaPshot单碱基延伸引物构建SNaPshot反应体系，进行单碱基延伸(SBE)反应，并对反应制备的单碱基延伸产物进行纯化处理。
3、使用遗传学分析仪检测所述纯化后的单碱基延伸产物，并使用相应基因分析软件GeneMapper对结果进行分析。
更进一步地，所述检测方法还包括对所述检测体系进行灵敏度检测。
本发明检测方法所述的样本包括健康个体构成的正常对照样本、尸检结果为非SCD的甲醛固定人体组织构成的阴性对照样本，以及尸检结果为SCD的甲醛固定人体组织构成的SCD样本。
从所述样本中提取DNA的方法为：分别使用OMEGA E.Z.N.A.TM SE Blood DNA Kit从健康个体的新鲜静脉血中提取基因组DNA，使用OMEGA Mag-Blind® Tissue DNA Kit从甲醛固定人体组织中提取基因组DNA，按照光密度法对提取的基因组DNA进行定量分析，确定基因组DNA的含量和浓度。
本发明提供的检测试剂盒只需要进行一次实验，就可以检测KCNH2离子通道基因上与心源性猝死(SCD)相关的50个SNP，并得到清晰的结论。本发明的检测方法不需要特殊的仪器设备和技术方法，能够简便、快速、准确的筛查多个SNP，其检测通量堪比直接测序，大大节省了人力和物力。
附图说明
图1是KCNH2基因50个正常(未突变)SNP分子标记的分型图。
图2是检测体系的灵敏度检测结果，其中A、B、C、D、E、F分别使用10ng、5ng、2ng、1ng、0.5ng、0.25ng DNA模板。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明技术方案进行进一步的说明。
本实施例采用多重PCR技术结合SNaPshot微测序技术来解决筛查KCNH2基因上与SCD相关的50个SNP的检测问题。
首先，共选择出KCNH2基因上的50个SNP。其中包括22个来自国内外文献中报道的有关KCNH2基因可致SCD的SNP。同时，考虑到框移突变和终止突变对于基因表达的影响比较严重，若发生框移突变或终止突变，可能导致KCNH2基因表达蛋白质紊乱或终止，更容易引起心肌电生理紊乱或猝死。在保证检测准确性的前提下，本实施例从Ensembl数据库中补充了28个KCNH2基因上外显子区的可致病框移突变/终止突变/错义突变。至此，本实施例检测试剂盒中包含了KCNH2基因上的50个与SCD相关的SNP，用以检测KCNH2基因与山西SCD人群的关系。
针对本实施例中的50个SNP，共设计了16对特异性多重PCR引物对，其PCR扩增得到的靶基因片段长度均小于300bp，适合法医学检材，且每个靶基因片段中分别包含有1～7个SNP。
将16对PCR引物分为两个复合扩增体系(后称为体系A和体系B)进行复合扩增，各包含8个引物对，每个复合体系包含25个SNP。其原理是结合了SNaPshot微测序技术和毛细管电泳(CE)技术，以检测SNP的位置和类型，从而确定样本在KCNH2上50个SNP的分型。
本实施例提供了一种KCNH2基因可致SCD的相关SNP微测序检测试剂盒，其中用于检测的相关SNP选自以下表1所示SNP分子标记中一个或一个以上。表1中同时列出了所述SNP分子标记的突变类型。
本实施例的检测试剂盒中包含了针对上述表1所列50个SNP位点的16对特异性多重PCR引物对，该16对多重PCR引物对具体列于表2中。所述50个SNP均包含在这16对引物对的靶基因片段中，每个靶基因片段中至少含有1个SNP，最多含有7个SNP。
进而，在本实施例的检测试剂盒中还包含了表3所述的、针对所述50个SNP分子标记分别设计的50个SNaPshot单碱基延伸引物。
本实施例利用上述检测试剂盒可以检测KCNH2基因上50个可致SCD的相关SNP的变异情况。
1、以样本提取的基因组DNA为模板，通过上述16对特异性多重PCR引物对中的引物对构建多重PCR扩增体系进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化处理。
2、以所述纯化的PCR产物为模版，通过上述SNaPshot单碱基延伸引物构建SNaPshot反应体系进行单碱基延伸(SBE)反应，并对反应制备的单碱基延伸产物进行纯化处理。
3、使用遗传学分析仪检测所述纯化后的单碱基延伸产物，并使用相应的基因分析软件(GeneMapper)对结果进行分析。
同时，还包括对检测体系进行灵敏度检测。
所述样本包括由健康的无关个体构成的正常对照组，司法鉴定中心法医病理学尸检结果为排除SCD的甲醛固定人体组织样本构成的阴性对照组，以及司法鉴定中心法医病理学尸检结果为SCD的甲醛固定人体组织样本构成的SCD组。
本实施例共采集168例样本，分为三组。1)、采用无关个体新鲜静脉血，其中男性和女性各30例，年龄4～52岁，本人及直系亲属均无心脏病史，作为正常对照组；2)、采用71例司法鉴定中心法医病理学尸检结果为SCD的甲醛固定人体组织作为SCD组；3)、采用37例司法鉴定中心法医病理学尸检结果为排除SCD(颅脑损伤、呼吸循环衰竭、溺死、脑死亡、交通事故、中毒等)的甲醛固定人体组织构成的阴性对照组。
从所述样本中提取基因组DNA的方法为：1)、健康个体新鲜静脉血：使用OMEGAE.Z.N.A.TM SE Blood DNA Kit提取基因组DNA。2)、甲醛固定人体组织：使用洗涤缓冲液(PBS)将甲醛固定人体组织洗涤两次后，使用OMEGA Mag-Blind® Tissue DNA Kit提取基因组DNA。按照光密度法对提取的基因组DNA进行定量分析，确定基因组DNA的含量和浓度。
以样本中提取的基因组DNA为模板(10ng)，进行如下反应。
1、多重PCR及其产物的纯化处理。
1)、使用复合扩增体系分别对体系A和体系B进行复合扩增。体系A及体系B除所加引物对不相同，其余反应体系的成分及反应条件均形同。
PCR反应为10μl体系，包括：5μl 2×Multiplex PCR Mix (DNA polymerase 1U、dNTP 0.3mM、Trics-HCI(pH 8.7) 20mM、KCl 100Mm、MgCl2 2.5mM、GC Enhancer)，1μl PCR引物混合物(引物终浓度为0.2～1μM不等)，10ng DNA模板。
PCR反应条件为：95℃ 10min；95℃ 25s，59℃ 30s，72℃ 45s，30个循环；72℃5min。
2)、使用rSAP(虾碱性磷酸酶)和ExoⅠ(核酸外切酶Ⅰ)分别对体系A和体系B的PCR产物进行纯化，去除PCR产物中多余的核酸片段和未反应的dNTP。
纯化反应为5μl体系：PCR产物3.3μl，rSAP 0.5μl，10×rSAP buffer 0.5μl，Exo I0.2μl，10×Exo I buffer 0.5μl。
纯化条件为：37℃ 1h，95℃ 15min。
2、PCR纯化产物的单碱基延伸(SBE)反应及对其产物进行纯化处理。
1)、使用SNaPshot试剂盒将PCR纯化产物进行单碱基延伸反应。体系A及体系B除所加单碱基延伸引物不相同，其余反应体系的成分及反应条件均形同。
延伸反应为5μl体系：PCR纯化产物2μl，2×SNaPshot Reaction Mix 2.5μl，单碱基延伸引物复合物0.5μl(引物终浓度为0.02～0.8μM不等)。
延伸反应条件为：96℃ 5s，50℃ 10s，60℃ 15s，35个循环。
2)、使用rSAP对延伸产物进行纯化，去除延伸产物中未反应的ddNTP。
纯化体系为5μl体系：4μl单碱基延伸反应产物，0.5μl rSAP，0.5μl 10×rSAPbuffer。
纯化条件为：37℃ 1h，95℃ 15min。
3、单碱基延伸反应纯化产物的毛细管电泳及其结果分析。
1)、使用毛细管电泳仪检测SNP。
毛细管电泳预变性处理的组成体系和条件如下：预变性体系为：10μl甲酰胺(Hi-Di formamide)，1.5μl纯化产物，0.1μl内标(GeneScan-LIZ 120)。
预变性条件为：95℃ 5min后迅速冰浴3min。通过ABI® 3130遗传学检测仪完成对SNaPshot延伸反应产物的检测。
2)使用Gene Mapper软件分析SNP的分型结果。根据不同颜色的荧光信号对SNP进行分析与分型。
KCNH2上SCD相关的50个SNP的分型结果如图1所示。其中不同颜色的荧光信号表示不同碱基，腺嘌呤(A)显示绿色、鸟嘌呤(G)显示蓝色、胞嘧啶(C)显示黑色、胸腺嘧啶(T)显示红色的荧光峰。
4、灵敏度检测。
本实验灵敏度检测采用多重PCR方法，将基因组DNA模板按照下列浓度：10ng，5ng，2ng，1ng，0.5ng，0.25ng，0ng分成各组。多重PCR和单碱基延伸反应的反应体系和反应条件如前述，每次实验均重复3次，检测结果见图2。
经检测后发现，上述复合体系的检测灵敏度均在0.5ng以上，当基因组DNA模板量为0.25ng时会丢失SNP位点，即DNA含量大于0.5ng时本方法才有效。低于 0.5ng的DNA不建议采用本方法。
本实验共考察3组样本，在正常山西人群及非SCD人群中均未发现KCNH2基因上这50个SNP的突变，而在SCD人群中也未见明确的基因突变。
对以上结果可以考虑：1)、由于地域、种族、国情、医疗条件和生活方式等不同，虽然在美国人中发现了R1047L、P967L、R1005W、Q1680R、P1157L的突变；日本人中发现了F640L、N629K、A614V、A561V、G584S的突变；中国部分地区人中发现了F627L、G604S、Y597C、G601S、R863*、S600R的突变；高加索人中发现了R356H的突变；土耳其人中发现了R835Q的突变；芬兰人中发现了L552S的突变；亚洲人中发现了T618I、R1135H的突变；意大利人中发现了A1116V的突变。但由于不同人群和家系的关系，这些位点均未在山西和重庆的SCD人群中发现。故而推测KCNH2基因的这50个SNP在山西和重庆SCD人群中的突变频率很低。2)、由于并不容易收集到大量SCD样本，本实施例只收集到2015年至2018年的33例山西SCD样本和38例重庆SCD样本。或许由于可以支持本实验进行的样本不够而暂未在山西SCD人群或重庆SCD人群中筛查出突变基因。
虽然在现有样本中暂未发现KCNH2基因上的这50个SNP的突变，但这并不代表以后不会筛查出其他人的SNP突变，本实施例检测试剂盒的意义在于实现对KCNH2基因突变引起的SCD进行法医辅助鉴定和遗传学诊断SCD，以及对基因治疗提供一定依据。
通过上述实施例可以看出本发明具有以下优点。
1)、分型准确。目标SNP的检测相对于全基因组测序较为精准，降低了错配率。由于SNaPshot微测序技术是以纯化后的多重PCR产物为模板，使用酶、四种荧光标记的ddNTP和5'端紧靠SNP位点的单碱基延伸引物为体系进行延伸反应，单碱基延伸引物延伸一个碱基即终止，经毛细管电泳仪检测后，根据荧光峰位置确定延伸产物对应的SNP位点，荧光峰的颜色可得知SNP的碱基种类，从而确定该样本的SNP分型。
2)、与传统SNP检测技术相比，多位点SNP复合分型和SNaPshot微测序相结合的检测技术更具有优越性。虽然一个SNaPshot反应体系的分型能力有限，但是建立多个延伸体系即可弥补这一缺点。
3)、与一代测序、二代测序相比，本方法不受实验室设备条件的限制。本方法所使用的仪器设备为大多数法医DNA实验室常用设备，容易普及。
4)、本方法可以一次性检测到50个SNP的多态性，其检测通量堪比直接测序。而且该方法不止局限于错义突变或插入/缺失，任何一种突变都可以不受SNP位点多态性的限制。
5)、可能用于系统性分析KCNH2相关的遗传性心肌离子通道疾病和心房纤维颤动的构成，对于KCNH2离子通道基因突变导致的恶性心律失常和SCD的早期诊断和预防及基于基因型的特异性治疗都有重要的意义。
尽管上述实施例已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域技术人员来说，对上述实施例做出修改或者采用等同替代方案，对本领域技术人员而言是显而易见的，在不偏离本发明精神的基础上，所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山西医科大学
<120> KCNH2基因SCD相关SNP检测试剂盒及检测方法
<160> 82
<170> SIPO Sequence Listing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 1
CTCCCTCTAC CAGACAACAC 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 2
GGGCGACGTG GAGAGCA 17
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 3
CCTGCCCTAA AGCAAGTACA C 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 4
GGGGCTGTCA TCATGTTCAT C 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 5
GACAGGGGGT TGCAAGTGTC 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 6
TGAGAGCAGT GAGGATGAG 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 7
CTGGGCACAC TCACAGCCAA 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 8
AAACCCTACA ACAGCAGCG 19
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 9
ATCCAGCCTG CTCTCCAC 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 10
TCACCCAGCT CTGCTCTCT 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 11
CCAAGCTCCT CCAAGGTGA 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 12
ACCGCACCAT TAGCAAGATT 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 13
TCAGGGCAGC CAACTCACA 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 14
ACATCTTTGG GGAGCCTCTG 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 15
ACCTGAGAAA GCGAGTCCAA G 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 16
TCCCCACTTC TCTGAGCATC 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 17
ATGAGGTCCA CCACAGCCA 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 18
GACGTGCTGC CTGAGTACAA 20
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 19
GTTGTGCAGC CAGCCGA 17
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 20
CTTGCCCCAT CAACGGAATG 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 21
TTTTCTCTGT CCTCCTCGCC 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 22
ATCAACTTCC GCACCACCTA 20
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 23
GCATTTCCAG TCCAGTGCC 19
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 24
CTGACATCTG CCTGCACCTG A 21
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 25
CTGGGCACAC TCACAGCCAA 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 26
CACTGGCTAG CCTGCATCTG 20
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 27
TTGCTGTGCC AAGAGGTTC 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 28
CCAGCCCTCA TGTATGCTA 19
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 29
GGAGCTGTGC TTTCGAGTTC 20
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 30
GTATTGCAGG TTTCCCAGTT C 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 31
AGAAGGCGAT TTCCACTTTG C 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 32
GGAGAATGTG GGGAAGGGCT 20
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 33
TGGAGGGGCC GCCCAGGC 18
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 34
GGCAGCCCCA CTAACTGCCC 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 35
GCTGGCCCGG TAGGGAGAGG 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 36
CCGGGGGCAG CTCCTCACAC 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 37
GGACCAGCGT CATCTGCCTC 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 38
TCCCTCACCT GTTGAGCTGG 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 39
AGCCCCTGAT GGAGGACTGC 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 40
CCCCAGGCCC CCCGGAGAGC 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 41
CTGGCAAGTC GAACGGGGAT 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 42
TGGAGATCAC CTTCAACCTG 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 43
GCACCTCCAG CAGGTCGTCC 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 44
TCACCTACTG TGACCTACAC 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 45
CTGAGCATGA CGCAGATGGA 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 46
GAGTTGGTGT TGGGAGAGAC 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 47
AGCCTCACCA GTGTGGGCTT 20
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 48
CTGAAGGTGA AGTAGAGC 18
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 49
TGTCCTTGAT GGAGGGGC 18
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 50
AGCAGCCACA CATGGACT 18
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 51
CATGTTGCCG ATGGCGTA 18
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 52
AGATGCAGGC TAGCCAGTGC 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 53
GCGCAAAGGT GCACATGAGC 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 54
CTCAGTGACA TTGTGGGTTC 20
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 55
CTTAGGTGCT ATGATCTCA 19
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 56
CCCTTGAGGT CCACAAAGTT 20
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 57
CCCAGGCCGC TGCTGTTG 18
<210> 58
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 58
TGGTACTGGC GGCCCC 16
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 59
TGGGCGGCCC CTCCATCAAG 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 60
GCCCAGGTTG TGCAGCCAGC 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 61
CAGGATCTCG ATGGAGCCCC 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 62
TGCGCTCCTC GGCGCCCAGC 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 63
GCAGCCCTTG GTGGCCCCTC 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 64
GGGGATGGCG GCCACCATGT 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 65
GAAGTAGAGC GCCGTCACAT 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 66
GGTGTAGGAC CAGGCGTGCT 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 67
GTAGGGTGTG AAGACAGCCG 20
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 68
GGTGGAAGCG GATGAACT 18
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 69
CACCTCGGCC CGCGAGTAGC 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 70
ATGAGGAACC AGCCCTTGAA 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 71
CCTGCTACCG AGTGTGGCTA 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 72
CCTTCAGCAG GAAGGCAGCC 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 73
GGCCTTGAAG GGGCTGTAAT 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 74
GGCACCGCGC ATCCACCGCT 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 75
GGCAAACCCT ACAACAGCAG 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 76
CATGTCCTTC TCCATCACCA 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 77
CACTGGTGAG GCTGCTGAAG 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 78
CGGCCCGTGC AGGAAGTCGC 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 79
AGCTCGCAGA AGCCGTCGTT 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 80
TGGGAGAGAC GTTGCCGAAG 20
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 81
CGGGTGGAGA ACTGCGCC 18
<210> 82
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 82
GTTGGCGATG ATGAACTT 18
Claims (7)
1.一种KCNH2基因SCD相关SNP的检测试剂盒，包括SEQ ID NO. 1～32所示的16对特异性多重PCR引物对，以及SEQ ID NO. 33～82所示的50个SNaPshot单碱基延伸引物，用于检测以下50个SNP分子标记中的任意两个或两个以上：
rs199472936、rs143167166、rs199473547、rs199473032、rs151031345、rs36210421、rs141117135、rs199473016、rs121912506、rs773724817、rs794728395、rs794728393、rs199472970、rs41307295、rs199473039、rs199472944、rs199473522、rs794728483、rs199472926、rs121912504、rs199472918、rs794728364、rs730880118、rs794728431、rs199472934、rs1016101226、rs199472941、rs199473428、rs12720441、rs199472851、rs189014161、rs199472912、rs199472942、rs794728382、rs199472894、rs1338579153、rs199472842、rs878853771、rs367570298、rs199472899、rs794728434、rs794728366、rs143518632、rs142590566、rs199472947、rs199473416、rs199472838、rs199472952、rs199472835、rs794728475。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征是所述SEQ ID NO. 1～32所示的16对特异性多重PCR引物对通过扩增同时得到包含有不同SNP的扩增子，每段扩增子至少含有1个SNP，最多含有7个SNP。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征是所述16对特异性多重PCR引物对分别用于对应扩增以下所述的SNP分子标记：
rs36210421的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 1所示的上游引物和SEQ ID NO. 2所示的下游引物；
rs142590566的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 3所示的上游引物和SEQ ID NO. 4所示的下游引物；
rs141117135、rs199473016的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 5所示的上游引物和SEQID NO. 6所示的下游引物；
rs199472970、rs41307295、rs199473039、rs199472944、rs199473522、rs199472934、rs199472936的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 7所示的上游引物和SEQ ID NO. 8所示的下游引物；
rs1016101226的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 9所示的上游引物和SEQ ID NO. 10所示的下游引物；
rs794728364、rs730880118、rs794728431的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 11所示的上游引物和SEQ ID NO. 12所示的下游引物；
rs773724817、rs794728395、rs121912506、rs794728393的PCR引物对为序列SEQ IDNO. 13所示的上游引物和SEQ ID NO. 14所示的下游引物；
rs151031345的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 15所示的上游引物和SEQ ID NO. 16所示的下游引物；
rs367570298、rs199472899、rs199472894、rs794728434、rs794728366的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 17所示的上游引物和SEQ ID NO. 18所示的下游引物；
rs794728483、rs199472926、rs121912504、rs199472918的PCR引物对为序列SEQ IDNO. 19所示的上游引物和SEQ ID NO. 20所示的下游引物；
rs199472912、rs878853771的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 21所示的上游引物和SEQID NO. 22所示的下游引物；
rs12720441、rs189014161的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 23所示的上游引物和SEQID NO. 24所示的下游引物；
rs199472941、rs199473428、rs199472942、rs143518632、rs199472947、rs199472952的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 25所示的上游引物和SEQ ID NO. 26所示的下游引物；
rs794728382、rs1338579153的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 27所示的上游引物和SEQID NO. 28所示的下游引物；
rs143167166、rs199473547、rs199473032的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 29所示的上游引物和SEQ ID NO. 30所示的下游引物；
rs199472851、rs199472842、rs199473416、rs199472838、rs199472835、rs794728475的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 31所示的上游引物和SEQ ID NO. 32所示的下游引物。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征是所述SEQ ID NO. 33～82所示的SNaPshot单碱基延伸引物分别对应以下各自的SNP分子标记：
rs199472936的延伸引物序列为SEQ ID NO. 33；rs143167166的延伸引物序列为SEQID NO. 34；rs199473547的延伸引物序列为SEQ ID NO. 35；rs199473032的延伸引物序列为SEQ ID NO. 36；rs151031345的延伸引物序列为SEQ ID NO. 37；rs36210421的延伸引物序列为SEQ ID NO. 38；rs141117135的延伸引物序列为SEQ ID NO. 39；rs199473016的延伸引物序列为SEQ ID NO. 40；rs121912506的延伸引物序列为SEQ ID NO. 41；rs773724817的延伸引物序列为SEQ ID NO. 42；rs794728395的延伸引物序列为SEQ IDNO. 43；rs794728393的延伸引物序列为SEQ ID NO. 44；rs199472970的延伸引物序列为SEQ ID NO. 45；rs41307295的延伸引物序列为SEQ ID NO. 46；rs199473039的延伸引物序列为SEQ ID NO. 47；rs199472944的延伸引物序列为SEQ ID NO. 48；rs199473522的延伸引物序列为SEQ ID NO. 49；rs794728483的延伸引物序列为SEQ ID NO. 50；rs199472926的延伸引物序列为SEQ ID NO. 51；rs121912504的延伸引物序列为SEQ ID NO. 52；rs199472918的延伸引物序列为SEQ ID NO. 53；rs794728364的延伸引物序列为SEQ IDNO. 54；rs730880118的延伸引物序列为SEQ ID NO. 55；rs794728431的延伸引物序列为SEQ ID NO. 56；rs199472934的延伸引物序列为SEQ ID NO. 57；rs1016101226的延伸引物序列为SEQ ID NO. 58；rs199472941的延伸引物序列为SEQ ID NO. 59；rs199473428的延伸引物序列为SEQ ID NO. 60；rs12720441的延伸引物序列为SEQ ID NO. 61；rs199472851的延伸引物序列为SEQ ID NO. 62；rs189014161的延伸引物序列为SEQ ID NO. 63；rs199472912的延伸引物序列为SEQ ID NO. 64；rs199472942的延伸引物序列为SEQ IDNO. 65；rs794728382的延伸引物序列为SEQ ID NO. 66；rs199472894的延伸引物序列为SEQ ID NO. 67；rs1338579153的延伸引物序列为SEQ ID NO. 68；rs199472842的延伸引物序列为SEQ ID NO. 69；rs878853771的延伸引物序列为SEQ ID NO. 70；rs367570298的延伸引物序列为SEQ ID NO. 71；rs199472899的延伸引物序列为SEQ ID NO. 72；rs794728434的延伸引物序列为SEQ ID NO. 73；rs794728366的延伸引物序列为SEQ IDNO. 74；rs143518632的延伸引物序列为SEQ ID NO. 75；rs142590566的延伸引物序列为SEQ ID NO. 76；rs199472947的延伸引物序列为SEQ ID NO. 77；rs199473416的延伸引物序列为SEQ ID NO. 78；rs199472838的延伸引物序列为SEQ ID NO. 79；rs199472952的延伸引物序列为SEQ ID NO. 80；rs199472835的延伸引物序列为SEQ ID NO. 81；rs794728475的延伸引物序列为SEQ ID NO. 82。
5.一种使用权利要求1所述检测试剂盒检测KCNH2基因SCD相关SNP的方法，包括以下步骤：
1)、以从待测样本中提取的基因组DNA为模板，通过选自所述SEQ ID NO. 1～32所示16对特异性多重PCR引物对中的引物对构建多重PCR扩增体系进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化处理；
2)、以所述纯化的PCR产物为模版，通过选自所述SEQ ID NO. 33～82所示SNaPshot单碱基延伸引物构建SNaPshot反应体系进行单碱基延伸反应，并对反应制备的单碱基延伸产物进行纯化处理；
3)、使用遗传学分析仪检测所述纯化后的单碱基延伸产物，并使用基因分析软件对结果进行分析。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是所述的样本包括健康个体构成的正常对照样本、尸检结果为非SCD的甲醛固定人体组织构成的阴性对照样本，以及尸检结果为SCD的甲醛固定人体组织构成的SCD样本。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征是分别使用OMEGA E.Z.N.A.TM SE BloodDNA Kit从健康个体的新鲜静脉血中提取基因组DNA，使用OMEGA Mag-Blind® Tissue DNAKit从甲醛固定人体组织中提取基因组DNA，按照光密度法对提取的基因组DNA进行定量分析，确定基因组DNA的含量和浓度。
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