CN109453241A - 一种植物黄酮提取纯化的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于黄酮提取技术领域，尤其是一种植物黄酮提取纯化的方法及应用，所述的植物生物黄酮是通过闪氏提取与微控萃取相结合的方式获得，采用极短的提取时间和充分完全的萃取方式，使得本发明方法兼具快速、高效的特点，生物黄酮的提取率和萃取率高、获得的活性成分含量高，且杂质含量低、操作时间短、溶剂使用量低，为药用、食用植物有效成分的提取纯化提供了便捷高效的获取途径。
Description
技术领域
本发明涉及黄酮提取技术领域，尤其是一种植物黄酮提取纯化的方法及应用。
背景技术
天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，并且由于糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同可以组成各种各样黄酮苷类。组成黄酮苷的糖类包括单糖、双糖、三糖和酰化糖；黄酮苷固体为无定形粉末，其余黄酮类化合物多为结晶性固体；黄酮类化合物不同的颜色为天然色素家族添加了更多色彩；这是由于其母核内形成交叉共轭体系，并通过电子转移、重排，使共轭链延长，因而显现出颜色；黄酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等极性强的溶剂中；但难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中；糖链越长则水溶度越大；黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性；酸性强弱因酚羟基数目、位置而异。
黄酮的功效是多方面的，主要集中在以下几个方面：
(1)它是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，如花青素可以抑制油脂性过氧化物的全阶段溢出，这种阻止氧化的能力是维生素E的十倍以上，这种抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生；
(2)黄酮可以改善血液循环，可以降低胆固醇，向天果中的黄酮还含有一种PAF抗凝因子，这些作用大大降低了心脑血管疾病的发病率，也可改善心脑血管疾病的症状；
(3)被称为花色苷酸的黄酮化合物在动物实验中被证明可以降低26％的血糖和39％的三元脂肪酸丙酯，这种降低血糖的功效是很神奇的，但更重要的是它对稳定胶原质的作用，因此它对糖尿病引起的视网膜病及毛细血管脆化有很好的作用；
(4)黄酮可以抑制炎性生物酶的渗出，可以增进伤口愈合和止痛，栎素由于具有强抗组织胺性，可以用于各类敏感症。
现阶段报道的较为理想的生物黄酮的提取纯化方式中，如专利CN201310676099.2一种从玉米须提取玉米须黄酮的方法及玉米须黄酮的用途，公开利用闪式提取装置和膜分离进行制备，与现有的浸提、大孔树脂层析等方法相比，大大缩短了提取时间，设备操作简单，使用的有机溶剂少，降低了生产成本，但在提取前需要对元材料进行超微粉碎、后续还需进行微滤、超滤、真空冷冻干燥等工序处理，因此其工艺较为复杂，对设备要求高，提取成本较高，提取时间长；再如专利CN201010608369.2一种植物黄酮的提取制备方法，其采用闪式提取、多级闪蒸、打孔树脂纯化结合的方式，实现常温条件下即可提取，具有高效、安全、溶剂用量少的特点，由于其需要多级闪蒸和长时间真空干燥处理，因此，不仅提取纯化周期长，对设备的损耗也较大，不利于工业化生产，提取效果也并不理想。
研究者从事植物有效成分的研究多年，在现有提取、分离技术的基础上，通过对各药用植物有效成分提取纯化的工艺步骤进行不断的改进，意外发现将闪式提取技术与微控萃取技术相结合，并且优化相关工艺条件和参数，能够获得提取时间短、效率高，目标物萃取完全、萃取率高、纯度高，并且毒性物质、杂质等含量低的理想的植物提取分离纯化系统。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种植物黄酮提取纯化的方法，包括以下步骤：
(1)将待提取植物在40-60℃条件下烘干至恒重，粉碎成粉；
(2)待提物粗粉中加入体积分数为50-90％的提取溶剂，于闪式提取器中提取，得提取液；待提物粗粉与提取溶剂的料液比为1:20-40，提取时间40-120s，提取电压100-200V；
(3)将上述提取液进行过滤，滤液旋转蒸干，然后用步骤(2)所述提取溶剂溶解粗提物，1-5％氢氧化钠溶液调节pH值(7-8.5)，加入有机溶剂，置于微萃取设备中进行微控萃取；
(4)萃取液静置至完全分层后，取有机层旋转蒸干，即得有效成分生物黄酮。
所述步骤(1)中，待提取植物粉碎的粗粉粒度为20-100目。
所述提取溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、乙醚中的一种或一种以上。
所述提取溶剂为体积比乙醇：甲醇＝1：2的混合提取溶剂。
所述步骤(3)提取溶剂与溶解粗提物的质量比为10-15：1
所述有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、乙醚中的一种或一种以上，用量为溶解粗提物质量的1-30倍；
所述有机溶剂为体积比乙酸乙酯：乙醚＝1：1的混合萃取溶剂。
所述步骤(2)中，料液比为1:35，提取时间90s，提取电压140V。
上述的植物黄酮提取纯化的方法，所述步骤(3)中，微萃取设备设置参数如下：
(1)流量设置：上泵5-15ml/min；下泵5-15ml/min；
(2)压力设置：0-5MPa；
(3)环境温度0-40℃，电源电压：AC220V±10％。
上述植物黄酮提取纯化方法在提取车前草、银杏、刺五加、丁香、厚朴植物中生物黄酮的应用。
有益效果
①本发明采用闪式提取技术，在极短的时间内使有效成分扩散到溶剂中，避免了药用植物中活性成分受热或辐射等破坏，是一种高效、安全的提取方式，同时结合微控萃技术，大大的提高了提取纯化的效果。
②通过对黄酮特性的研究，制定出适合于生物碱类成分提取纯化的结合模式，采用特定的复合提取溶剂、提取次数、提取时间，能够获得提取率高、萃取干扰少、大分子物质少且便于后续微控萃取处理的中间产物，大大节约了其他中间处理环节。
③微控萃取是将萃取剂和原料液通入微反应器的反应通道中，进行混合萃取，由于微反应器内部的微结构使得微反应器设备具有极大的比表面积，在平流泵把萃取剂和原料液泵如微反应器后，让溶剂与提取液能够在微反应器内部的管道中得到充分混合，使提取液的有效成分溶于溶剂之中，从而完成混合萃取工作，提高萃取效率。微通道反应器的应用，对于解决安全环保问题和资源消耗严重问题，有重要作用。
④本发明采用特定的微控萃取溶剂、处理设备和流速、压力等参数，粗提物和溶剂混合效果好，传递速率快，操作简便、安全性好，对杂质等分离效果好，单纯微控萃取，效率高于传统萃取2-5个百分点，结合闪式提取，整个提取纯化效率高于其他结合方式2-7个百分点。
⑤本发明的植物黄酮的提取纯化方法，具有高效、环保、安全、可控、无污染的特点，在大健康生物医药领域具有极大的实际应用价值。
为了获得本发明的技术内容，我们进行了一系列的研究，部分提供如下：
一、提取方式的研究
以车前草为原料，选择闪式提取、溶剂热回流提取、超声波提取等三种不同的提取方式，考察其对车前草黄酮提取率的影响，结果如下表1：
表1
以上结果显示：闪式提取技术在提取率上虽然略低于其余两种方法，但是提取时间大大的减少，并且闪式提取是在室温条件下进行，有效的保护热敏物质，不仅节省时间，还节省能源，因此，可选择闪式提取法对车前草、银杏、刺五加、丁香、厚朴进行进一步的扩大研究。
选择车前草、银杏、刺五加、丁香、厚朴共计5种植物，根据以上的提取方式进行比较，结果显示，闪式提取法所得产物含量与传统提取法相比差异不明显，但简单、快速、节约能耗，因此，进一步对提取参数进行考察，以选择最佳的提取参数和流程。
提取溶剂选择：黄酮大都能溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚，常用的提取溶剂可以选择非极性、极性溶剂或混合溶剂；本研究过程中，选择甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等进行比较，结果表明，采用甲醇、乙醇、氯仿、乙醚，用量为原材料的20-40倍，对车前草、银杏、刺五加、丁香、厚朴的提取最为理想，其中优选体积比乙醇：甲醇＝1：2的混合提取溶剂，用量35倍。
提取次数和时间考察：由于闪式提取时间短，效率高，本研究过程选择提取1、2、3次，每次40-120s进行比较；结果表明，闪提1-2次，每次60s-100s，其中优选提取1次、80s。
二、萃取/纯化方法研究
以20g车前草为原料，采用前述闪式提取后，选择微控萃取、传统萃取、大孔树脂纯化三种不同的萃取/纯化方式，考察其对车前草生物黄酮萃取/纯化率的影响，见表2：
表2
| 萃取/纯化方法 | 微控萃取法 | 传统萃取 | 大孔树脂 |
| 溶剂、次数 | 60％乙醇、1次 | 60％乙醇、1次 | 60％乙醇、1次 |
| 溶剂用量 | 1：1 | 2：1 | 2：1 |
| 时间 | 90S | 1h | 1h |
| 温度 | 常温 | 80℃ | 80℃ |
| 芦丁含量(mg/g) | 20.32 | 16.51 | 16.88 |
以上结果显示：微控萃取技术的萃取率明显优于传统萃取/纯化技术，且时间短，溶剂用量比起萃取分离和大孔树脂均大大减少；因此，可选择微控萃取法对车前草、银杏、刺五加、丁香、厚朴等进行进一步的扩大研究。
选择车前草、银杏、刺五加、丁香、厚朴共计5种植物，根据以上的萃取方式进行比较，结果显示，微控萃取法对车前草等5种植物的萃取效果优于传统萃取方式，并且安全无污染、简单、快速、节约能耗；因此，进一步对萃取参数进行考察，以选择最佳的萃取参数和流程。
三、结合研究
以车前草为原料，结合前述研究结果，分别比较A：闪式提取+微控萃取；B：闪式提取+传统萃取；C：溶剂回流提取+微控萃取；D：溶剂回流提取+传统萃取；E:超声辅助提取+微控萃取；F：超声辅助提取+传统萃取，结果如下表3：
表3
具体实施方式
下面结核具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
一种植物黄酮的提取方法，包括以下步骤：
(1)将待提取植物在40℃条件下烘干至恒重，粉碎成粉；
(2)待提物粗粉中加入体积分数为50％的提取溶剂，于闪式提取器中提取，得提取液；待提物粗粉与提取溶剂的料液比为1:20，提取时间40s，提取电压100V；
(3)将上述提取液进行过滤，滤液旋转蒸干，然后用步骤(2)所述提取溶剂溶解粗提物，调节pH值至7.5，加入有机溶剂，置于微萃取设备中进行微控萃取；
(4)萃取液静置至完全分层后，取有机层旋转蒸干，即得有效成分生物黄酮。
所述步骤(1)中，待提取植物粉碎的粗粉粒度为20目。
所述提取溶剂为甲醇；
所述有机溶剂为乙酸乙酯，用量为蒸干后粗提物的1倍。
所述步骤(3)中，微萃取设备设置参数如下：
(1)流量设置：上泵5ml/min；下泵5ml/min；
(2)压力设置：1MPa；
(3)环境温度25℃，电源电压：AC220V±10％。
实施例2
一种植物黄酮的提取方法，包括以下步骤：
(1)将待提取植物在60℃条件下烘干至恒重，粉碎成粉；
(2)待提物粗粉中加入体积分数为80％的提取溶剂，于闪式提取器中提取，得提取液；待提物粗粉与提取溶剂的料液比为1:30，提取时间120s，提取电压200V；
(3)将上述提取液进行过滤，滤液旋转蒸干，然后用步骤(2)所述提取溶剂溶解粗提物，调节pH值为8，加入有机溶剂，置于微萃取设备中进行微控萃取；
(4)萃取液静置至完全分层后，取有机层旋转蒸干，即得有效成分生物黄酮。
所述步骤(1)中，待提取植物粉碎的粗粉粒度为100目。
所述提取溶剂为酸性甲醇；
所述有机溶剂选自氯仿，用量为酸水溶解物质量的30倍；
所述步骤(3)中，用量为蒸干后粗提物的30倍。
所述步骤(3)中，微萃取设备设置参数如下：
(1)流量设置：上泵15ml/min；下泵15ml/min；
(2)压力设置：5MPa；
(3)环境温度35℃，电源电压：AC220V±10％。
实施例3
一种植物黄酮的提取方法，包括以下步骤：
(1)将待提取植物在50℃条件下烘干至恒重，粉碎成粉；
(2)待提物粗粉中加入体积分数为60％的提取溶剂，于闪式提取器中提取，得提取液；待提物粗粉与提取溶剂的料液比为1:30，提取时间90s，提取电压100V；
(3)将上述提取液进行过滤，滤液旋转蒸干，然后用步骤(2)所述提取溶剂溶解粗提物，调节pH为7.5，加入有机溶剂，置于微萃取设备中进行微控萃取；
(4)萃取液静置至完全分层后，取有机层旋转蒸干，即得有效成分生物黄酮。
所述步骤(1)中，待提取植物粉碎的粗粉粒度为60目。
所述提取溶剂为体积比为乙醇：酸性甲醇＝1：2的混合提取溶剂；
所述有机溶剂选择体积比为乙酸乙酯：乙醚＝1：1的混合萃取溶剂，用量为酸水溶解物质量的20倍；
所述步骤(3)中，用量为蒸干后粗提物的20倍。
所述步骤(3)中，微萃取设备设置参数如下：
(1)流量设置：上泵10ml/min；下泵10ml/min；
(2)压力设置：3.5MPa(k按压力稳定情况调)；
(3)环境温度22℃，电源电压：AC220V±10％。
试验例
采用实施例3的提取方法分别对车前草、银杏、刺五加、丁香、厚朴共5种植物黄酮提取，结果如下表：
一、车前草黄酮提取研究：
(1)取45-60℃已烘干粉碎至40目的车前草粗粉12.5g，加入体积分数为60％的乙醇250ml溶液浸泡1h后，使用闪式提取器在电压为100V下进行提取，得到提取液，过滤后得滤液，以芦丁为标准品，用紫外分光光度法测其含量；
(2)将所得滤液旋转蒸干，得总提取物，称取1g用150ml60％乙醇溶解，过滤，滤液用4％NaOH调节其pH值为7～8，加入有机溶剂乙酸乙酯150ml,置于微萃取设备中进行微控萃取；
(3)萃取液静置至完全分层后，取有机层，旋转蒸干及得有效成分黄酮，以芦丁为标准品，用紫外分光光度法检测其含量，结果如表4、表5；
表4
表5
二、银杏黄酮提取研究：
(1)取45-60℃已烘干粉碎至40目的银杏粗粉12.5g，加入体积分数为70％的乙醇250ml溶液浸泡1h后，使用闪式提取器在电压为100V下进行提取，得到提取液，过滤后得滤液，以芦丁为标准品，用紫外分光光度法测其含量；
(2)将所得滤液旋转蒸干，得总提取物，称取1g用150ml70％乙醇溶解，过滤，滤液用4％NaOH调节其pH值为7-8，加入有机溶剂乙酸乙酯150ml,置于微萃取设备中进行微控萃取；
(3)萃取液静置至完全分层后，取有机层，旋转蒸干及得有效成分黄酮，以芦丁为标准品，用紫外分光光度法检测其含量，结果如表6、表7；
表6
表7
三、刺五加黄酮提取研究：
(1)取45-60℃已烘干粉碎至40目的刺五加粗粉12.5g，加入体积分数为70％的乙醇250ml溶液浸泡1h后，使用闪式提取器在电压为100V下进行提取，得到提取液，过滤后得滤液，以芦丁为标准品，用紫外分光光度法测其含量；
(2)将所得滤液旋转蒸干，得总提取物，称取1g用150ml70％乙醇溶解，过滤，滤液用4％NaOH调节其pH值为7～8，加入有机溶剂乙酸乙酯150ml,置于微萃取设备中进行微控萃取；
(3)萃取液静置至完全分层后，取有机层，旋转蒸干及得有效成分黄酮，以芦丁为标准品，用紫外分光光度法检测其含量，结果如表8、表9；
表8
表9
四、丁香黄酮提取研究：
(1)取45-60℃已烘干粉碎至40目的丁香粗粉12.5g，加入体积分数为60％的乙醇250ml溶液浸泡1h后，使用闪式提取器在电压为100V下进行提取，得到提取液，过滤后得滤液，以芦丁为标准品，用紫外分光光度法测其含量；
(2)将所得滤液旋转蒸干，得总提取物，称取1g用150ml60％乙醇溶解，过滤，滤液用4％NaOH调节其pH值为7～8，加入有机溶剂乙酸乙酯150ml,置于微萃取设备中进行微控萃取；
(3)萃取液静置至完全分层后，取有机层，旋转蒸干及得有效成分黄酮，以芦丁为标准品，用紫外分光光度法检测其含量，结果如表10、表11；
表10
表11
四、厚朴黄酮提取研究：
(1)取45-60℃已烘干粉碎至40目的厚朴粗粉10g，加入体积分数为70％的乙醇350ml溶液浸泡1h后，使用闪式提取器在电压为100V下进行提取，得到提取液，过滤后得滤液，以芦丁为标准品，用紫外分光光度法测其含量；
(2)将所得滤液旋转蒸干，得总提取物，称取1g用150ml70％乙醇溶解，过滤，滤液用4％NaOH调节其pH值为7～8，加入有机溶剂乙酸乙酯150ml,置于微萃取设备中进行微控萃取；
(3)萃取液静置至完全分层后，取有机层，旋转蒸干及得有效成分黄酮，以芦丁为标准品，用紫外分光光度法检测其含量，结果如表12、表13；
表12
| 提取方法 | 闪式提取法 | 溶剂回流 | 超声波提取法 |
| 提取溶剂、次数 | 70％乙醇溶液、1次 | 70％乙醇溶液、1次 | 70％乙醇溶液、1次 |
| 提取时间 | 90s | 1h | 1h |
| 提取温度 | 常温 | 80℃ | 80℃ |
| 浸膏重量(g) | 1.76 | 1.95 | 1.89 |
| 芦丁含量(mg/g) | 17.90 | 18.69 | 18.13 |
表13
综上可知，闪式提取法+微控萃取技术两者相结合有效的提高了有效成分的含量，缩短提取纯化时间，提高提取效率，降低溶剂用量，节约成本。
在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。
Claims (10)
1.一种植物黄酮提取纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待提取植物在40-60℃条件下烘干至恒重，粉碎成粉；
(2)待提物粗粉中加入体积分数为50-90％的提取溶剂，于闪式提取器中提取，得提取液；待提物粗粉与提取溶剂的料液比为1:20-40，提取时间40-120s，提取电压100-200V；
(3)将上述提取液进行过滤，滤液旋转蒸干，然后用步骤(2)所述提取溶剂溶解粗提物，1-5％氢氧化钠溶液调节pH值，加入有机溶剂，置于微萃取设备中进行微控萃取；
(4)萃取液静置至完全分层后，取有机层旋转蒸干，即得有效成分生物黄酮。
2.如权利要求1所述的植物黄酮的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中，待提取植物粉碎的粗粉粒度为20-100目。
3.如权利要求1所述的植物黄酮的提取方法，其特征在于：所述提取溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、乙醚中的一种或一种以上。
4.如权利要求3所述的植物黄酮提取纯化的方法，其特征在于：所述提取溶剂为体积比乙醇：甲醇＝1：2的混合提取溶剂。
5.如权利要求1所述的植物黄酮提取纯化的方法，其特征在于：所述步骤(3)提取溶剂与溶解粗提物的质量比为10-15：1。
6.如权利要求1所述的植物黄酮提取纯化的方法，其特征在于：所述有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、乙醚中的一种或一种以上，用量为溶解粗提物质量的1-30倍。
7.如权利要求6所述的植物黄酮的提取方法，其特征在于：所述有机溶剂为体积比乙酸乙酯：乙醚＝1：1的混合萃取溶剂。
8.根据权利要求1所述的植物黄酮提取纯化的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，料液比为1:35，提取时间90s，提取电压140V。
9.根据权利要求1所述的植物黄酮提取纯化的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，微萃取设备设置参数如下：
(1)流量设置：上泵5-15ml/min；下泵5-15ml/min；
(2)压力设置：0-5MPa；
(3)环境温度0-40℃，电源电压：AC220V±10％。
10.权利要求1-9任一项所述的方法在提取车前草、银杏、刺五加、丁香、厚朴植物中生物黄酮的应用。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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