CN109402002B - 一种加氏乳杆菌及其在制备预防早产药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种女性阴道优势菌加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)H87及其在制备预防早产药物中的应用，属于医药微生物技术领域。所述L.gasseri H87是分离自人体的加氏乳杆菌属的新菌属，无排斥效应，具体的所述的L.gasseri H87抗菌肽gassericin，维护阴道菌群的平衡及具有更高的对阴道上皮细胞粘附的能力，减少患者泌尿生殖器区域炎症发生风险，同时减少孕妇孕期并发症的风险,且该菌株可以长期保存利于生产。所述加氏乳杆菌缺乏对妊娠期女性可能产生不良的妊娠结局，如早产，重塑女性阴道微环境，因而本菌株能够较好地满足实际的临床应用需求，为降低早产率提供新的思路。

Description

一种加氏乳杆菌及其在制备预防早产药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种加氏乳杆菌及其在制备预防早产药物中的应用，尤其是一种加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)H87，其在调节阴道微环境、抑制阴道加德纳菌(BV致病菌)的同时，具有明显抑制念珠菌及病原菌的作用，对于临床上的妇科疾病(早产)具有独特治疗优势的潜力，属于医药微生物技术领域。

背景技术

1961年WHO倡议的早产定义为妊娠满28孕周(196d)至37孕周(259d)间分娩，其新生儿为早产。早产包括自发性早产和因母亲或胎儿原因导致的医源性早产(引产或剖宫产约占30％-35％)，其中自发性早产又分为早产临产(约占40％-45％)及早产胎膜早破(PPROM，约占25％-30％)。早产的全球发病率为5％-18％，其中美国为12％-13％，欧洲地区及其他发达国家为5％-9％，我国约为7.1％。早产与感染之间存在极大相关性。研究表明，感染所致的早产约占自发性早产的半数，且一般早于30周。早产孕妇中最常见的是解脲脲原体、人型支原体、阴道加德纳菌、消化链球菌等相对低毒力的阴道微生物；而在胎膜早破的孕妇中偶尔可见大肠埃希菌及B组链球菌；一些细菌在孕前或及早孕周时便已存在但不易被发现。这些微生物通常上升到绒毛蜕膜间隙，甚至能穿过完整的绒毛膜羊膜进入羊水，而感染胎儿。因此，早产与阴道微生物群的关系已成为当今研究热点。

健康育龄女性阴道菌群中，现公认的4种主要乳杆菌菌种为卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和惰性乳杆菌。随着孕周的增加，阴道微生物种类、多样性和丰富度均会降低，主要表现在乳杆菌的增加及厌氧菌的减少。早产与阴道乳杆菌的关系主要分为3种：1.阴道加德纳菌和厌氧菌为主的多种混合菌群取代正常阴道菌群而致细菌性阴道症(bacterial vaginosis,BV)引起的早产；2.正常阴道菌群被大肠埃希菌、GBS、金黄色葡萄球菌等需氧型细菌取代导致需氧菌性阴道炎(aerobic vaginitis,AV)引起的早产；3.正常阴道环境下发生的早产。前两种是阴道乳杆菌缺乏合并阴道菌群紊乱。有研究发现，孕早期孕妇的阴道菌群若由惰性乳杆菌主导，其发生早产的可能性要大于其他阴道乳杆菌，具有产生过氧化氢能力的乳杆菌含量较高，其早产的概率要小。

通过外源菌的介入来恢复阴道乳杆菌的优势，从而达到正常阴道菌群的平衡状态是预防和/或治疗妇科疾病(早产)的一种有效手段。健康妇女阴道内存在多种乳杆菌，具有个体差异，且乳杆菌各株间抗致病菌能力差异明显。选择乳杆菌益生外源菌时，需要综合考虑乳杆菌的种类，其产酸、产过氧化氢，抗菌肽的能力，及与阴道上皮细胞粘附的能力，其中乳杆菌能否在阴道成功定值，是乳杆菌持续作用的基础，也是外源菌发挥疗效的关键因素。

加氏乳杆菌是健康妇女阴道内的优势菌，通过分泌乳酸菌素(gassericin)、乳酸、过氧化氢等物质起到杀灭致病菌的作用。同时，在阴道粘膜上皮细胞的竞争黏附作用起到生物屏障的作用，阻止了致病菌在阴道的繁殖。

甲硝唑主要用于治疗或预防由厌氧菌引起的系统或局部感染，如女性生殖系感染引起的疾病，是最常用的药物。近年来研究表明，阴道给药甲硝唑虽然杀灭了部分细菌性阴道病BV致病相关厌氧菌，但是还残留一些GBS，金黄色葡萄球菌等需氧菌为病原体的相关病菌，从而无法显著降低早产率，急需开发新型药物产品来重塑阴道微环境。Han C,Wu W,FanA,et al.Diagnostic and therapeutic advancements for aerobic vaginitis[J].Archives of Gynecology&Obstetrics,2015,291(2):251-257.

抗生素给药治疗异常菌群也能有效降低一部分早产率，因此临床上更推荐使用抗生素治疗妇孕生殖道感染，但是长期抗生素的使用会产生耐药性，新型抗菌肽类药物成为当前热门研究。Lamont R F.Advances in the Prevention of Infection-RelatedPreterm Birth[J].Frontiers in Immunology,2015,6(21).

早产基妇科疾病的主要表现在乳杆菌的减少及致病菌的增加，保护乳杆菌优势比例可以通过杀菌物质如抗菌肽抑制病原体的生长，gassercin是这种具有革兰氏阴性和阳性活性的抗菌肽的一个实例，从L.gasseri中分离出来，具有较强的抗菌能力。StoyanchevaG,Marzotto M,Dellaglio F,et al.Bacteriocin production and gene sequencinganalysis from vaginal Lactobacillus strains[J].Archives of Microbiology,2014,196(9):645-653.

授权专利(公告号CN 10391130B)提供了加氏乳杆菌再预防/治疗阴道炎，及在计生用品中的用途，还缺乏因为阴道感染引起的早产等妇科生殖性疾病，本发明的加氏乳杆菌Lactobacillus gasseri H87还具有更高的产过氧化氢，乳酸及新型抗菌肽gassericin，可维护阴道菌群的平衡减少患者泌尿生殖器区域炎症发生风险，同时减少孕妇孕期并发症的风险。

发明内容

本发明解决的技术问题是：一种对致病菌拮抗作用较强、抑菌产物多样性高且具有活跃稳定的生物学特性、抑菌能力强的加氏乳杆菌及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：保藏名称：Lactobacillusgasseri H87，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2018年7月13日，该菌株的保藏号为：CCTCC NO：M 2018477。

为了解决上述技术问题，本发明提出的另一技术方案是：所述的加氏乳杆菌87在制备用于预防和/或治疗早产致病菌药品中的应用。

优选的，所述致病菌包括加德纳菌、阿托波氏菌、金黄色葡萄球菌、白色链球菌或大肠埃希菌或淋球菌。

优选的，所述的加氏乳杆菌87在制备用于预防和/或治疗妇科疾病早产药品中的应用。

优选的，所述的疗妇科疾病早产为泌尿生殖器区域炎症或孕妇孕期并发症。

优选的，所述的加氏乳杆菌87在制备调节阴道菌群平衡的药品中的应用。

优选的，所述的加氏乳杆菌87，在制备具有阴道上皮粘附功能的药品中的应用。

有益效果：

本发明的加氏乳杆菌87菌株可以长期保存，并抵抗治疗妇科疾病致病菌。本发明的菌株直接采集于健康人体，具有活跃稳定的生物学特性。本发明能够有效地实现对多种致病菌的拮抗作用。本发明的菌株还具有更高的对阴道上皮细胞的粘附能力以及更高的产酸能力从而降低早产率，重塑阴道微环境，因而本发明的菌株能够较好的满足实际的临床应用需求。

1、本发明的Lactobacillus gasseri H87从人体阴道分泌物中分离得到，无排斥效应,具有活跃稳定的生物学特性，无需驯化和复壮工艺，发酵液冷冻干燥后进行胶囊制剂工艺即可；

2、本发明的Lactobacillus gasseri H87产生的抗菌肽gassercin具有安全长效的杀菌能力，经抑菌圈实验验证抗菌肽含量为25,600AU/mL，较目前最高18,400AU/mL，提高了40％，降低早产风险显著；

3、本发明的Lactobacillus gasseri H87可以长期保藏，优化保藏条件后的复苏存活率可达95％以上，相比于一般80％的存活率，保证活菌数；

4、本发明的Lactobacillus gasseri H87具有抑制加德纳氏菌、抑制白色念珠菌的作用，相比较专利的抑菌效果提高近一倍(专利授权号：CN 1039113009 B)并具有优势的阴道上皮细胞黏附力，在灵长类动物阴道定植的优势能力。

5、本发明的Lactobacillus gasseri H87可产过氧化氢1517.92mmol/10⁷CFU，高于乳酸菌的平均产酸量0.041mmol/10⁷CFU，保证了基本抑菌谱。

6、本发明的Lactobacillus gasseri H87可产乳酸20.96g，高于同种属加氏乳杆菌中产乳酸量，增加抑菌能力。

附图说明

图1是使用Lactobacillus gasseri前后金黄葡萄糖球菌和大肠埃希菌致病菌的活菌数

本发明提供的加氏乳杆菌Lactobacillus gasseri H87已经于2018年7月13日提交中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏号为：CCTCC NO：M 2018477

具体实施方式

本文所用的术语“预防”是指通过施用根据本发明所述的药物组合来抑制早产或延迟其发作的所有行为。

本发明提供一株加氏乳杆菌，保藏名称：Lactobacillus gasseri H87，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2018年7月13日，该菌株的保藏号为：CCTCC NO：M 2018477；。

该菌株在MRS固体培养基上的菌落形态为圆形菌落，直径0.5-0.75mm，表面粗糙，在显微镜下呈革兰氏染色阳性短杆菌。

该菌株的培养条件可以采用已知的加氏乳杆菌的培养方法，例如，该菌株可以在MRS液体培养基和MRS固体培养基上正常生长。其中，该菌株的生长温度可以为常规的温度，例如，生长温度可以为36-38℃。

MRS液体培养基是指由10g的蛋白胨、5g的酵母膏、10g的牛肉膏、20g的葡萄糖、5g乙酸钠、2g的柠檬酸铵、1ml的吐温80/0.58g的MgSO4·7H2O、0.25g的MnSO4·77H2O、2g的K2HPO4和1000ml的蒸馏水混合，调节pH值为6.2-6.4并且经121℃高压蒸汽灭菌后得到的培养基。

MRS固体培养基是指由10g的蛋白胨、5g的酵母膏、10g的牛肉膏、20g的葡萄糖、5g乙酸钠、2g的柠檬酸铵、1ml的吐温80/0.58g的MgSO4·7H2O、0.25g的MnSO4·77H2O、2g的K2HPO4、20g的琼脂粉和1000ml的蒸馏水混合，调节pH值为6.2-6.4并且经121℃高压蒸汽灭菌后得到的培养基。

另一方面，本发明还提供了了上述菌株在制备用于预防或治疗妇科疾病(早产)药物中的用途。

上述菌株可以通过如下方式发挥治疗妇科疾病(早产)的作用：(1)在MRS液体培养基中接种上述菌株，并且培养为菌体浓度为10⁷个菌体/mL，既得到上述菌株的培养液，经冷冻干燥后以胶囊的形式用于治疗；(2)16SRNA基因序列鉴定，以细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，并进行PCR扩增，取PCR产物进行凝胶电泳，确定16SRNA基因片段；(3)以甘油及PEG-6000作为冷冻保护剂，于-80℃条件下冷冻呈固态，抽真空制成冻干粉。

最后，本发明还提供了一种诊断早产的方法。

(1)从分离自孕妇阴道分泌物样品中的提取16srDNA；

(2)对16sDNA使用引物对进行聚合酶链式反应(PCR)；

(3)通过对所述PCR的产物进行测序确定相比于正常孕妇，在病例中来源属于惰性乳杆菌的细菌的分布高出至少两倍，则该病例具有高的早产风险。

所述加氏乳杆菌可以预防孕妇早产，可用于预防或治疗相关妇科阴道炎症疾病，并可以通过测量来源于孕妇阴道分泌物中惰性乳杆菌含量来诊断早产的风险。

在本发明的实施方式中，进行研究旨在考查加氏乳杆菌在先前具有早产史的妇女中对早产分娩和早产的影响。该研究的参与者包括300名可评价的孕妇，其中150名被选择进入治疗组，150名被选择进入安慰剂组。该研究是在处于高的自发早产风险下的妊娠受试者中进行的预期的、随记的、安慰剂对照的、双盲的试验。研究参与者从16 0/7和22 6/7妊娠周被筛选出。将受试者从180/7到22 6/7妊娠周被随机化分组给予药物或安慰剂。

参加研究之前，非怀孕妇女和孕妇签署了同意书，熟练的研究人员收集了参与者的流行病学和临床资料。在18 0/7到22 6/7妊娠周之间满足研究标准的受试者由调查员进行登记并以1:1比率接受同样包装、按序标号的加氏乳杆菌阴道药物。当随机化分组后，受试者开始使用被分派的加氏乳杆菌药物进行处理并每天给药直到37周孕龄、发生胎膜早破或分娩为止。每名患者以2周为间隔进行评价。在妊娠28周时，所有受试者经历另一次经阴道超声以确定子宫长度。

给予加氏乳杆菌时的≤32周的早产率显著低于给予安慰剂时的≤32周的早产率。阴道给药加氏乳杆菌药物在具有中期三个月子宫颈变短的孕妇中降低提前早产率并改善新生儿预后。

基于这些结果，使用加氏乳杆菌药物进行的预防性治疗在根据自发早产被选择的高风险孕妇中可以有效地降低反复早产的频率。

实施例1

本实施用于说明本发明的菌株对阴道加德纳菌的拮抗作用。本实施例中所用的阴道加德纳菌为购自ATCC的商品号为10231的菌株。

将Lactobacillus gasseri H87用MRS液体培养基培养为菌体浓度1×10⁷CFU/mL的培养液，命名为培养液A。

将阴道加德纳菌用MRS液体培养基培养为菌体浓度1×10⁷CFU/mL的培养液，命名为培养液B。

将上述培养液A和上述培养液B等体积混合作为实验组，将单独的上述培养液B作为对照组。

分别将1mL的实验组和对照组培养液，接种到150mL的MRS液体培养基中，37℃下培养24小时，得到共培养的培养液。

分别取实验组和对照组的共培养培养液100uL，接种到15mL的阴道加德纳菌选择性培养基平板中——沙氏葡萄糖琼脂培养基，37℃下选择培养24小时，然后对阴道加德纳菌进行计数。

计数结果显示，实验组的阴道加德纳菌菌体浓度仅为6.81×10⁵CFU/mL，而对照组的阴道加德纳菌菌体浓度高达5.68×10⁶CFU/mL。

对比例1

按照实施例1的方法进行测试，不同的是，将实施例1中的Lactobacillus gasseriH87替换为购自ATCC的商品号为9857的加氏乳杆菌。

计数结果显示，对于购自ATCC的商品号为9857的加氏乳杆菌，实验组的阴道加德纳菌菌体浓度也达到了3.23×10⁶CFU/mL，而对照组的阴道加德纳菌菌体浓度仍为5.68×10⁶CFU/mL。

实施例2

本实施例用于说明本发明的菌株对大肠埃希菌的拮抗作用。本实施例中所用的大肠埃希菌为购自ATCC的商品号为35218的菌株。

将Lactobacillus gasseri H87用MRS液体培养基培养为浓度1×10⁷CFU/mL的培养液，命名为培养液A。

将大肠埃希菌用MRS液体培养基培养为浓度1×10⁷CFU/mL的培养液，命名为培养液B。

将上述培养液A和上述培养液B等体积混合作为实验组，将单独的上述培养液B作为对照组。

分别将1mL的实验组和对照组培养液，接种到150mL的MRS液体培养基中，37℃下培养24小时，得到共培养的培养液。

分别取实验组和对照组的共培养培养液100uL，接种到15mL的大肠埃希菌选择性培养基平板中——曙红亚甲基蓝琼脂培养基，37℃下选择培养24小时，然后对大肠埃希菌进行计数。

计数结果显示，实验组的大肠埃希菌菌体浓度仅为6.18×10⁷CFU/mL，而对照组的大肠埃希菌菌体浓度高达4.86×10⁸CFU/mL。

对比例2

按照实施例2的方法进行测试，不同的是，将实施例1中的Lactobacillus gasseriH87替换为购自ATCC的商品号为9857的加氏乳杆菌。

计数结果显示，对于购自ATCC的商品号为9857的加氏乳杆菌，实验组的大肠埃希菌菌体浓度也达到了2.32×10⁸CFU/mL，而对照组的大肠埃希菌体浓度仍为4.86×10⁸CFU/mL。

实施例3

本实施例用于说明本发明的菌株对金黄色葡萄球菌的拮抗作用。本实施例中所用的金黄色葡萄球菌为购自ATCC的商品号为35218的菌株。

将Lactobacillus gasseri H87用MRS液体培养基培养为浓度1×10⁷CFU/mL的培养液，命名为培养液A。

将金黄色葡萄球菌用MRS液体培养基培养为浓度1×10⁷CFU/mL的培养液，命名为培养液B。

将上述培养液A和上述培养液B等体积混合作为实验组，将单独的上述培养液B作为对照组。

分别将1mL的实验组和对照组培养液，接种到150mL的MRS液体培养基中，37℃下培养24小时，得到共培养的培养液。

分别取实验组和对照组的共培养培养液100uL，接种到15mL的金黄色葡萄球菌选择性培养基平板中——甘露醇氯化钠琼脂培养基，37℃下选择培养24小时，然后对金黄色葡萄球菌进行计数。

计数结果显示，实验组的金黄色葡萄球菌菌体浓度仅为2.13×10⁷CFU/mL，而对照组的金黄色葡萄球菌菌体浓度高达8.68×10⁷CFU/mL。

对比例3

按照实施例2的方法进行测试，不同的是，将实施例1中的Lactobacillus gasseriH87替换为购自ATCC的商品号为9857的加氏乳杆菌。

计数结果显示，对于购自ATCC的商品号为9857的加氏乳杆菌，实验组的金黄色葡萄球菌菌体浓度也达到了4.12×10⁷CFU/mL，而对照组的金黄色葡萄球菌浓度仍为8.68×10⁷CFU/mL。

根据实施例1-3和对比例1-3的结果可以看出，本发明的Lactobacillus gasseriH87对阴道加德纳菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌具有优异的拮抗作用。

实施例4

本实施例按照文献的方法测定本发明中的Lactobacillus gasseri H87对阴道上皮细胞的粘附能力。

经测定，本发明中的Lactobacillus gasseri H87对阴道上皮细胞的粘附指数为15.46±2.92。

对比例4

按照实施例4的方法测定测定购自ATCC的商品号为9857的加氏乳杆菌。

经测定，购自ATCC的商品号为9857的加氏乳杆菌对阴道上皮细胞的粘附指数为11.32±1.74。

根据实施例4和对比例4的结果可以看出，本发明分Lactobacillus gasseri H87具有更高的对阴道上皮细胞的粘附能力。

实施例5

本实施例按照文献的方法测定本发明中的Lactobacillus gasseri H87的乳酸含量。

结果本发明的Lactobacillus gasseri H87的乳酸含量为20.96g/L。

对比例5

按照实施例5的方法测定测定购自ATCC的商品号为9857的加氏乳杆菌。

经测定，购自ATCC的商品号为9857的加氏乳杆菌的乳酸含量为6.67g/L。

根据实施例5和对比例5的结果可以看出，本发明分Lactobacillus gasseri H87具有更高的产乳酸能力。

实施例6

本实施例按照文献的方法测定本发明中的Lactobacillus gasseri H87的过氧化氢含量。

结果本发明的Lactobacillus gasseri H87的过氧化氢量为60mg/L。

对比例6

按照实施例6的方法测定测定购自ATCC的商品号为9857的加氏乳杆菌。

经测定，购自ATCC的商品号为9857的加氏乳杆菌的过氧化氢含量为35mg/L。

根据实施例5和对比例5的结果可以看出，本发明分Lactobacillus gasseri H87具有更高的产过氧化氢能力。

实施例7

本实施用于说明本发明的菌株产抗菌肽gassercin的作用。本实施例中所用的大肠杆菌为本实验室保存的Ecoli.Dh5a；

将Lactobacillus gasseri H87用MRS液体培养基培养为菌体浓度5×10⁷CFU/mL的培养液，命名为培养液A。

将大肠杆菌用LB液体培养基培养为菌体浓度4.2×10⁸CFU/mL的培养液，命名为培养液B。

取250μL培养液B菌液于平板中间，涂布器涂布，用打孔器在培养基表面打孔，将孔内琼脂挑出，注入200Μl培养液B，将平板用封口膜封住，放在37℃摇床上培养24小时后观察。

结果显示，本实验的Lactobacillus gasseri H87出现明显抑菌圈，直径为1.7cm。

对比例7

按照实施例1的方法进行测试，不同的是，将实施例1中的Lactobacillus gasseriH87替换为购自ATCC的商品号为9857的加氏乳杆菌。

结果显示，Lactobacillus gasseri 9857同样出现抑菌圈，直径为0.5cm。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变形，这些简单变形均属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri ）H87，其特征在于，保藏名称： Lactobacillus gasseri H87，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2018年7月13日，该菌株的保藏号为：CCTCC NO：M 2018477。

2.权利要求1所述的加氏乳杆菌在制备用于预防和/或治疗早产致病菌药品中的应用。

3.根据权利要求2所述的加氏乳杆菌在制备用于预防和/或治疗早产致病菌药品中的应用，其特征在于：所述致病菌包括阴道加德纳菌、金黄色葡萄球菌或大肠埃希菌。

4.权利要求1所述的加氏乳杆菌在制备用于预防和/或治疗妇科疾病早产药品中的应用。

5.根据权利要求4所述的加氏乳杆菌在制备用于预防和/或治疗妇科疾病早产药品中的应用，其特征在于：所述的疗妇科疾病早产为泌尿生殖器区域炎症。

6.权利要求1所述的加氏乳杆菌在制备调节阴道菌群平衡的药品中的应用。

7.权利要求1所述的加氏乳杆菌在制备具有阴道上皮粘附功能的药品中的应用。

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