CN109401975B - 一种收集陈化烟叶表面微生物的方法 - Google Patents

一种收集陈化烟叶表面微生物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明是一种收集陈化烟叶表面微生物的方法，属于应用微生物学领域。该方法通过加入SDS溶液，然后通过离心、超声振荡、生理盐水重悬菌体等方法收集陈化烟叶表面微生物，结果显示在加入SDS后所收集的细菌总数相比于传统方法显著增加。本发明提取条件简单，工艺简单，成本低，有效提高了陈化烟叶表面微生物的收集效率，对利用陈化烟叶表面微生物开展进一步的研究具有重大的科研价值，是一种简便、稳定、高效的收集陈化烟叶表面微生物的方法。

Description

一种收集陈化烟叶表面微生物的方法
技术领域
本发明涉及一种收集微生物的方法，具体涉及一种收集陈化烟叶表面微生物的方法，属于应用微生物学领域。
背景技术
目前收集陈化烟叶表面微生物的方法主要是利用生理盐水（氯化钠）作为菌体收集液对陈化烟叶进行浸泡，使陈化烟叶表面的微生物脱落在收集液中，再对收集液进行离心、超声振荡等一系列操作从而对陈化烟叶表面微生物进行收集。然而，仅通过生理盐水作为菌体收集液对陈化烟叶表面微生物进行收集效率很低，并且收集的陈化烟叶表面微生物很不完全，这种方法对后续进行陈化烟叶表面的微生物的鉴定与分离都存在很大的缺陷，如不能完整提取到陈化烟叶表面微生物的核酸，不能对陈化烟叶表面微生物进行16sRNA分析，不能对陈化烟叶表面微生物进行系统发育树的构建等。因此，提高陈化烟叶表面微生物的收集效率对陈化烟叶的进一步研究具有重要意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种更加高效实用的收集陈化烟叶表面微生物的方法，本发明的技术方案具体如下：
一种收集陈化烟叶表面微生物的方法，包括以下步骤：
步骤（1）、配备10%的SDS溶液备用；
步骤（2）、提取
将陈化烟叶处理为小于2cm2的碎片，移至一定体积无菌的0.85%氯化钠溶液中，然后加入1-5‰体积的步骤（1）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液，然后在12-16℃，140-160rpm/min下振荡25-35min，过滤去除碎片，滤液离心，弃上清保留沉淀，能使收集液所能收集的陈化烟叶表面细菌总数达到最大量。由于天然陈化烟叶的表面积一般比较大，不能完全被收集液所混匀，因此，应将其剪成面积小于2cm2的碎片，能使其完全浸没在收集液中。
步骤（3）、超声处理
在上述沉淀中加入2-3ml0.85%氯化钠溶液，超声振荡处理15-25min，以使沉淀混匀；
步骤（4）、分离
将超声振荡后的物料离心，使菌体和灰尘分离，得到上清液。
进一步地，步骤（2）中，0.85%氯化钠溶液的体积为100ml；陈化烟叶的质量为8-12g。
进一步地，步骤（2）中，滤液在11000g的条件下离心18-22min。
进一步地，步骤（3）中，超声振荡的条件是：超声频率：40KHz，超声功率：90W。
进一步地，步骤（4）中，在100g的条件下离心4-6min，并重复两次。由于超声振荡后的菌体中含有陈化烟叶表面携带的灰尘，因此需要在100g的条件下离心5min并重复两次，便于使菌体和灰尘分离。
进一步地，该方法还包括步骤（5），取一定量步骤（4）的上清液均匀涂在LB固体培养基上，在37℃培养箱中过夜培养，并观察所收集到细菌形成的菌落总数。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
（1）本发明描述的将陈化烟叶剪成面积为小于2cm2的碎片，相较于传统方法并且能使陈化烟叶更好地浸没在收集液中。
（2）本发明采用的在100mL收集液中加入100-500μL 10%的SDS溶液，陈化烟叶表面微生物的提取效率得到极大提高，能够使收集到的陈化烟叶表面微生物比用传统方法提高将近6倍。SDS属于亲水基表面活性剂，且易溶于生理盐水，在工业上常用作洗涤剂，与阴离子、非离子复配性好，具有良好的乳化、发泡、渗透、去污和分散性能，我们开创性的将其与0.85%氯化钠溶液配合使用，用于收集陈化烟叶表面的微生物，在与陈化烟叶表面微生物结合形成聚合物后悬浮于收集液中，效果是本领域技术人员没有料到的。
（3）本发明所需的提取条件简单，工艺简单，成本低，有效提高了陈化烟叶表面微生物的收集效率，对利用陈化烟叶表面微生物开展进一步的研究具有重大的科研价值。
附图说明
图1为实施例1-5的从陈化烟叶表面提取微生物的结果；
图2为实施例1与对比例1的从陈化烟叶表面提取微生物的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例的收集陈化烟叶表面微生物的方法，包括如下步骤：
步骤（1）、配备10%的SDS溶液备用
称取10g SDS固体溶解于100mL的蒸馏水中，配置成10%的SDS溶液，灭菌后在室温放置。
步骤（2）、提取
称取10g陈化烟叶，剪成面积为1cm2的碎片，移至装有100mL无菌的0.85%氯化钠溶液的锥形瓶中，加入1‰体积（即100μL）的10%的SDS溶液，放置于15℃，150rpm/min的摇床中振荡30min，再用纱布过滤以除去陈化烟叶等碎片，随后在11000g的条件下离心20min，弃上清保留沉淀。
步骤（3）、超声处理
在上述沉淀中加入2.5ml0.85%氯化钠溶液，超声振荡处理20min，以使沉淀混匀；超声振荡的条件是：超声频率：40KHz，超声功率：90W。
步骤（4）、分离
将超声振荡后的物料在100g的条件下离心5min,并且重复该步骤2次，以使菌体和灰尘分离，收集离心后的上清液并吹打混匀。
步骤（5）、取100μL步骤（4）的上清液均匀涂在现有的LB固体培养基上，在37℃培养箱中过夜培养，并观察所收集到细菌形成的菌落总数，结果如图1所示。
实施例2
本实施例的收集陈化烟叶表面微生物的方法，包括如下步骤：
步骤（1）、配备10%的SDS溶液备用
称取10g SDS固体溶解于100mL的蒸馏水中，配置成10%的SDS溶液，灭菌后在室温放置。
步骤（2）、提取
称取10g陈化烟叶，剪成面积为1cm2的碎片，移至装有100mL无菌的0.85%氯化钠溶液的锥形瓶中，加入2‰体积（即200μL）的10%的SDS溶液，放置于16℃，160rpm/min的摇床中振荡25min，再用纱布过滤以除去陈化烟叶等碎片，随后在11000g的条件下离心18min，弃上清保留沉淀。
步骤（3）、超声处理
在上述沉淀中加入3ml0.85%氯化钠溶液，超声振荡处理25min，以使沉淀混匀；超声振荡的条件是：超声频率：40KHz，超声功率：90W。
步骤（4）、分离
将超声振荡后的物料在100g的条件下离心6min，并且重复该步骤2次，以使菌体和灰尘分离，收集离心后的上清液并吹打混匀。
步骤（5）、取100μL步骤（4）的上清液均匀涂在现有的LB固体培养基上，在37℃培养箱中过夜培养，并观察所收集到细菌形成的菌落总数，结果如图1所示。
实施例3
本实施例的收集陈化烟叶表面微生物的方法，包括如下步骤：
步骤（1）、配备10%的SDS溶液备用
称取10g SDS固体溶解于100mL的蒸馏水中，配置成10%的SDS溶液，灭菌后在室温放置。
步骤（2）、提取
称取10g陈化烟叶，剪成面积为1cm2的碎片，移至装有100mL无菌的0.85%氯化钠溶液的锥形瓶中，加入3‰体积（即300μL）的10%的SDS溶液，放置于16℃，160rpm/min的摇床中振荡35min，再用纱布过滤以除去陈化烟叶等碎片，随后在11000g的条件下离心22min，弃上清保留沉淀。
步骤（3）、超声处理
在上述沉淀中加入2ml0.85%氯化钠溶液，超声振荡处理18min，以使沉淀混匀；超声振荡的条件是：超声频率：40KHz，超声功率：90W。
步骤（4）、分离
将超声振荡后的物料在100g的条件下离心6min，并且重复该步骤2次，以使菌体和灰尘分离，收集离心后的上清液并吹打混匀。
步骤（5）、取100μL步骤（4）的上清液均匀涂在现有的LB固体培养基上，在37℃培养箱中过夜培养，并观察所收集到细菌形成的菌落总数，结果如图1所示。
实施例4
本实施例的收集陈化烟叶表面微生物的方法，包括如下步骤：
步骤（1）、配备10%的SDS溶液备用
称取10gSDS固体溶解于100mL的蒸馏水中，配置成10%的SDS溶液，灭菌后在室温放置。
步骤（2）、提取
称取10g左右陈化烟叶，剪成面积为1cm2的碎片，移至装有100mL无菌的0.85%氯化钠溶液的锥形瓶中，加入4‰体积（即400μL）的10%的SDS溶液，放置于16℃，160rpm/min的摇床中振荡35min，再用纱布过滤以除去陈化烟叶等碎片，随后在11000g的条件下离心18min，弃上清保留沉淀。
步骤（3）、超声处理
在上述沉淀中加入2ml0.85%氯化钠溶液，超声振荡处理18min，以使沉淀混匀；超声振荡的条件是：超声频率：40KHz，超声功率：90W。
步骤（4）、分离
将超声振荡后的物料在100g的条件下离心4min，并且重复该步骤2次，以使菌体和灰尘分离，收集离心后的上清液并吹打混匀。
步骤（5）、取100μL步骤（4）的上清液均匀涂在现有的LB固体培养基上，在37℃培养箱中过夜培养，并观察所收集到细菌形成的菌落总数，结果如图1所示。
实施例5
本实施例的收集陈化烟叶表面微生物的方法，包括如下步骤：
步骤（1）、配备10%的SDS溶液备用
称取10gSDS固体溶解于100mL的蒸馏水中，配置成10%的SDS溶液，灭菌后在室温放置。
步骤（2）、提取
称取10g左右陈化烟叶，剪成面积为1cm2的碎片，移至装有100mL无菌的0.85%氯化钠溶液的锥形瓶中，加入5‰体积（即500μL）的10%的SDS溶液，放置于14℃，160rpm/min的摇床中振荡35min，再用纱布过滤以除去陈化烟叶等碎片，随后在11000g的条件下离心18min，弃上清保留沉淀。
步骤（3）、超声处理
在上述沉淀中加入2ml0.85%氯化钠溶液，超声振荡处理18min，以使沉淀混匀；超声振荡的条件是：超声频率：40KHz，超声功率：90W。
步骤（4）、分离
将超声振荡后的物料在100g的条件下离心4min，并且重复该步骤2次，以使菌体和灰尘分离，收集离心后的上清液并吹打混匀。
步骤（5）、取100μL步骤（4）的上清液均匀涂在现有的LB固体培养基上，在37℃培养箱中过夜培养，并观察所收集到细菌形成的菌落总数，结果如图1所示。
作为对照，步骤（2）中不加入SDS溶液，其余步骤与实施例1相同，结果如图1所示。
从图1可以看出，加入SDS溶液后，实施例1-5的菌落数明显多于对照例，尤其是在体积比为1‰的情况下，菌落数将近是对照例的菌落数的6倍，可见，SDS溶液的加入效果显著，并非显而易见。
为了进一步验证结果，实施例1中，取步骤（4）的上清液100μL，稀释10倍均匀涂布于LB固体培养基，将LB固体培养基放置于37℃培养箱过夜，观察所收集到细菌形成的菌落总数，结果如图2所示。
作为对照，步骤（2）中不加入SDS溶液，其余步骤与实施例1相同，取步骤（4）的上清液100μL，稀释10倍均匀涂布于LB固体培养基，将LB固体培养基放置于37℃培养箱过夜，观察所收集到细菌形成的菌落总数，结果如图2所示。
从图2可以看出，实施例1的菌落数将近是对照例的菌落数的6倍，结果相同。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种收集陈化烟叶表面微生物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤（1）、配备10%的SDS溶液备用；
步骤（2）、提取
将陈化烟叶处理为小于2cm2的碎片，移至100ml无菌的0.85%氯化钠溶液中，然后加入1-5‰体积的步骤（1）的SDS溶液，然后在12-16℃，140-160rpm下振荡25-35min，过滤去除碎片，滤液离心，弃上清保留沉淀；
步骤（3）、超声处理
在上述沉淀中加入2-3ml0.85%氯化钠溶液，超声振荡处理15-25min，以使沉淀混匀；超声振荡的条件是：超声频率：40KHz，超声功率：90W；
步骤（4）、分离
将超声振荡后的物料离心，使菌体和灰尘分离，得到上清液。
2.根据权利要求1所述的收集陈化烟叶表面微生物的方法，其特征在于：步骤（2）中，陈化烟叶的质量为8-12g。
3.根据权利要求1所述的收集陈化烟叶表面微生物的方法，其特征在于：步骤（2）中，滤液在11000g的条件下离心18-22min。
4.根据权利要求1所述的收集陈化烟叶表面微生物的方法，其特征在于：步骤（4）中，在100g的条件下离心4-6min，并重复两次。
5.根据权利要求1所述的收集陈化烟叶表面微生物的方法，其特征在于：该方法还包括步骤（5），取一定量步骤（4）的上清液均匀涂在LB固体培养基上，在37℃培养箱中过夜培养，并观察所收集到细菌形成的菌落总数。
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