CN109380668A - 一种微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法 - Google Patents

一种微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法，包括：将屠宰后的牛进行三段式预冷，预冷池的温度逐渐降低，预冷的同时用超声波发生器进行三段式超声处理，处理后切片，并将调料与牛肉混合并进行超高压微波处理，然后在牛肉表面涂抹保加利亚乳杆菌菌悬液，然后向牛肉中添加氯化钠、酪朊酸钠和冰水并混合均匀，进行低温真空滚揉处理，真空包装后放入气囊之间，通过对气囊的充气和抽气对牛肉进行拍打、拉伸，将牟氏角毛藻培养液离心后的下层液添加到牛肉中，照射，然后接种成活的嗜热链球菌Streptococcus thermophilus.菌株，加热牛肉后加入质量浓度为硬脂酸钙溶液保持1.5~2h进行凝胶化。

Description

一种微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体地说是一种微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法。
背景技术
肉类菜肴，以畜禽肉为主要原料，或炖煮，或油炸，或烟熏，嫩度高、风味强，色泽诱人，销量逐步提高。肉制品过去主要是少数大企业生产，以满足较少量的市场需求。随着各类冷链的发展，肉制品产量越来越大，不少厂家所占产品比例也在逐步增加，并且成为主要的利润来源。随着原辅料价格的上涨，出品率不高而导致的成本问题，就显得格外突出。
目前的肉制品加工过程中，加热往往是不可缺少的环节，肉纤维蛋白受热会发生变性收缩，跑油失水现象比较严重，而使大量营养流失于汤汁中，最终成品体积明显缩小、组织结构松散韧性不足，口感粗糙。为克服工业化生产肉类菜肴出现的上述现象，肉制品加工企业会利用脂肪来改善肉类品质，一定量脂肪的添加能明显提升肉类的凝胶保水性。近代以来，由于人们追求低脂健康饮食，企业通过添加多种添加物(如磷酸盐和食用胶等)以代替脂肪来达到生产目的。如：专利“一种肉制品乳化剂及其加工方法”（申请号：201410609278.9）中添加复合磷酸盐来提高肉糜的稳定性。以及文献“卡拉胶、黄原胶、海藻酸钠、瓜尔豆胶及转谷氨酰胺酶对牛肉肠出品率和硬度的影响”中添加食用胶类来提高牛肉肠的出品率。但是复合磷酸盐能引起肉制品色泽及风味劣变，以及长期食用影响机体的钙磷平衡。
牛屠宰后必须经过僵直、解僵、成熟过程才能转变为真正的可食用肉，未完全成熟的牛肉肉质粗糙，嫩度和保水性差，滋味和缺乏较淡，牛肉加工企业通常在预冷池完成这一排酸嫩化过程。目前，也有较少企业采用超高压处理或酶处理技术，但超高压加工后的牛肉颜色变浅，无法引起消费者的购买欲望；而如果只是添加酶制剂，作用于牛肉表面，在肌肉组织中难以扩散，对肌原纤维蛋白的分解作用难以充分发挥出来，使得效果不佳、出品率并不高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法，包括如下步骤：
步骤1、将屠宰后的牛置于三段式预冷池中进行预冷，预冷的同时用超声波发生器进行超声处理，超声波发生器频率40Hz、功率3.5千瓦；其中，牛放置于第一个预冷池中时超声波发生器开5~6分钟，停5~6分钟，处理时间为30~40分钟，预冷池温度控制在8~10℃；牛放置于第二个预冷池时，超声波发生器开7~8分钟，停7~8分钟，处理时间为80~100分钟，预冷池温度控制在4~6℃；牛放置于第三个预冷池时，超声波发生器连续开启20~25分钟，预冷池温度控制在0~3℃；经三次预冷、超声处理后把牛取出，切片；
按如下重量份将调料与切片后的牛肉混合：牛肉100份、淀粉2.5~3.0份，食用盐1.5~2.0份，糖3.0~3.5份，味精0.1~0.15份，酱油1.2~1.4份，料酒1.6~1.8份，大米蛋白1.0~2.0份、转谷氨酰胺酶0.3~0.5份，搅拌4~5 min后装入真空聚乙烯袋中，250~300MPa5~6分钟，间隔5~6分钟，循环5~6次；
步骤2、将保加利亚乳杆菌菌悬液以5*107cfu/g的接种量涂抹于步骤1所得牛肉表面，在温度为37~42℃的条件下培养13~15h；
步骤3、向步骤2所得牛肉中添加氯化钠、酪朊酸钠和冰水并混合均匀，然后进行低温真空滚揉处理，滚揉里程为3000~4000m，滚筒温度2~4℃，真空度-0.08~0.15MPa，滚揉转速8r/min，滚揉时间30min；
步骤4、将步骤3所得牛肉真空包装后放入气囊之间，通过对气囊的充气和抽气对牛肉进行拍打、拉伸，其中充气正压为70~80psi，抽气压力为-10~-14psi，抽气和充气的间隔时间为1~2s，气囊充气、抽气的次数均为20~30次；
步骤5、将牟氏角毛藻培养液置于1500rpm下离心10min后弃上清液，加入步骤4所得牛肉中，添加量为每1克步骤4所得牛肉中添加2毫升牟氏角毛藻培养液下层液体，搅拌混匀，随后采用50~60μmol 光子 m-2·s-1卤素灯照射12h，每4h搅拌翻面，温度为26~28℃；
步骤6、将步骤5所得牛肉以2*107cfu/g接种成活的嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus.菌株，并在37℃下温育6h；
步骤7、将步骤6所得牛肉在50℃下加热20~22min后加入质量浓度为0.0002%~0.0003%的硬脂酸钙溶液保持1.5~2h进行凝胶化。
进一步的，还包括步骤8：将步骤7所得牛肉真空包装后速冻，15-20min内牛肉的中心温度达到-15℃以下，送入-18~-22℃的冷库贮藏。
进一步的，所述的步骤3中，氯化钠、酪朊酸钠的添加量为每100克步骤2所得牛肉中添加氯化钠0.5~0.7克、酪朊酸钠0.01~0.015克。
进一步的，所述的步骤5中的牟氏角毛藻培养液的制备方法如下：将牟氏角毛藻接种于经100℃灭菌20 min的培养基中，用CO2鼓泡均质将pH调节至7.3~7.5 ，得培养物；取250mL培养物置于20~22 ℃下以110rpm搅拌14~16h；随后在100~120μmol 光子 m-2·s-1条件下光照处理24~28h，光照处理时培养物搅拌速度为180~200rpm，温度为26~28 ℃，并向培养物中以100mL/min-1连续注入CO2的体积分数为1.5%~2%的无菌空气使培养物pH维持在7.8~8 ，得牟氏角毛藻培养液。
进一步的，所述的培养基的配方是Na2·5H2O 0.4g，NaNO3 3.3g，Fe-EDTA 0.2g，Na2EDTA 0.1g，H3BO3 0.14g，FeCl3·6H2O 0.0004g，MnSO4·7H2O 0.035g，ZnSO4·7H2O0.0025 g，CoSO4·7H2O 0.002g，氰钴胺7.9×10-5g，硫胺 6×10-3g，生物素2×10-4g，溶于1L盐溶液中；
所述的盐溶液由NaCl 20.5g，KCl 0.6g，CaCl2·2H2O 1.2g，MgCl2·6H2O 4.5g，NaHCO30.11g，MgSO4·7H2O 3.50g，溶于1L蒸馏水制成。
进一步的，所述的嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus.菌种的获取方法如下：玻璃棒挤压海带获得海带提取物， 将各海带提取物的1毫升等分试样连续稀释，与15mL甘油天冬酰胺琼脂培养基混合，倒入培养皿中，在26~30 ℃下有氧培养7天后平板划线，挑选菌落生长缓慢、白色、折叠、表面光滑的特征菌株，经分子生物学鉴定后使用。
上述技术方案的关键构思在于：采用三段式预冷（逐渐降低预冷温度）、超声处理，使牛肉结构变松散，牛肉内的蛋白酶充分释放，超高压作用下，利用转谷氨酰胺酶促牛肉蛋白与大米蛋白交联，以改善保水性能，提高出品率；将转谷氨酰胺酶交联蛋白进行真空滚揉促进盐溶蛋白提取，以改善保水性能，提高出品率；由微生物发酵技术改善肉品内外持水性，提高出品率。
上述技术方案的有益效果是：本发明采用屠宰后预冷、超声处理，使得牛肉结构变松散，牛肉内的蛋白酶充分释放，然后进行超高压处理，破坏牛肉蛋白的氢键、二硫键和离子键的结合，使其一级结构遭到破坏，空间结构的改变促使该蛋白成为TGase的催化底物，与酪朊酸钠发生交联，形成新的网络结构，间歇处理使酶催化更彻底，有助于交联反应的有效进行；同时经超声、超高压处理的牛肉，剪切力值下降，提升了肉嫩度，且对色素和风味物质等小分子化合物的共价键无明显影响；赋予牛肉以大米蛋白的优质营养价值及潜在保健功能；采用低温真空滚揉技术，真空条件下牛肉呈现膨胀状态，滚揉作用将已经嫩化的原料肉中的蛋白质与盐水充分接触，有效提高盐溶蛋白的提取速度，加快其向肉块表面移动，利用其热凝胶特点改善产品的保水性，同时交联蛋白的网络结构更紧凑，在真空条件下持水性也得到增强，有效提升了牛肉的出品率。
附图说明
图1所示为实施例1中步骤4的抽气、充气状态示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明如下：
本发明提供的一种微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法，包括如下步骤：
步骤1、将屠宰后的牛置于三段式预冷池中进行预冷，预冷的同时用超声波发生器进行超声处理，超声波发生器频率40Hz、功率3.5千瓦；其中，牛放置于第一个预冷池中时超声波发生器开5~6分钟，停5~6分钟，处理时间为30~40分钟，预冷池温度控制在8~10℃；牛放置于第二个预冷池时，超声波发生器开7~8分钟，停7~8分钟，处理时间为80~100分钟，预冷池温度控制在4~6℃；牛放置于第三个预冷池时，超声波发生器连续开启20~25分钟，预冷池温度控制在0~3℃；经三次预冷、超声处理后把牛取出，切片；
按如下重量份将调料与切片后的牛肉混合：牛肉100份、淀粉2.5~3.0份，食用盐1.5~2.0份，糖3.0~3.5份，味精0.1~0.15份，酱油1.2~1.4份，料酒1.6~1.8份，大米蛋白1.0~2.0份、转谷氨酰胺酶0.3~0.5份，搅拌4~5 min后装入真空聚乙烯袋中，250~300MPa5~6分钟，间隔5~6分钟，循环5~6次；
步骤2、将保加利亚乳杆菌菌悬液以5*107cfu/g的接种量涂抹于步骤1所得牛肉表面，在温度为37~42℃的条件下培养13~15h；
步骤3、向步骤2所得牛肉中添加氯化钠、酪朊酸钠和冰水并混合均匀，然后进行低温真空滚揉处理，滚揉里程为3000~4000m，滚筒温度2~4℃，真空度-0.08~0.15MPa，滚揉转速8r/min，滚揉时间30min；
步骤4、将步骤3所得牛肉真空包装后放入气囊之间，通过对气囊的充气和抽气对牛肉进行拍打、拉伸，其中充气正压为70~80psi，抽气压力为-10~-14psi，抽气和充气的间隔时间为1~2s，气囊充气、抽气的次数均为20~30次；
步骤5、将牟氏角毛藻培养液置于1500rpm下离心10min后弃上清液，加入步骤4所得牛肉中，添加量为每1克步骤4所得牛肉中添加2毫升牟氏角毛藻培养液下层液体，搅拌混匀，随后采用50~60μmol 光子 m-2·s-1卤素灯照射12h，每4h搅拌翻面，温度为26~28℃；
步骤6、将步骤5所得牛肉以2*107cfu/g接种成活的嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus.菌株，并在37℃下温育6h；
步骤7、将步骤6所得牛肉在50℃下加热20~22min后加入质量浓度为0.0002%~0.0003%的硬脂酸钙溶液保持1.5~2h进行凝胶化。
进一步的，还包括步骤8：将步骤7所得牛肉真空包装后速冻，15-20min内牛肉的中心温度达到-15℃以下，送入-18~-22℃的冷库贮藏。
进一步的，所述的步骤3中，氯化钠、酪朊酸钠的添加量为每100克步骤2所得牛肉中添加氯化钠0.5~0.7克、酪朊酸钠0.01~0.015克。
进一步的，所述的步骤5中的牟氏角毛藻培养液的制备方法如下：将牟氏角毛藻接种于经100℃灭菌20 min的培养基中，用CO2鼓泡均质将pH调节至7.3~7.5 ，得培养物；取250mL培养物置于20~22 ℃下以110rpm搅拌14~16h；随后在100~120μmol 光子 m-2·s-1条件下光照处理24~28h，光照处理时培养物搅拌速度为180~200rpm，温度为26~28 ℃，并向培养物中以100mL/min-1连续注入CO2的体积分数为1.5%~2%的无菌空气使培养物pH维持在7.8~8 ，得牟氏角毛藻培养液。
进一步的，所述的培养基的配方是Na2·5H2O 0.4g，NaNO3 3.3g，Fe-EDTA 0.2g，Na2EDTA 0.1g，H3BO3 0.14g，FeCl3·6H2O 0.0004g，MnSO4·7H2O 0.035g，ZnSO4·7H2O0.0025 g，CoSO4·7H2O 0.002g，氰钴胺7.9×10-5g，硫胺 6×10-3g，生物素2×10-4g，溶于1L盐溶液中；
所述的盐溶液由NaCl 20.5g，KCl 0.6g，CaCl2·2H2O 1.2g，MgCl2·6H2O 4.5g，NaHCO30.11g，MgSO4·7H2O 3.50g，溶于1L蒸馏水制成。
进一步的，所述的嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus.菌种的获取方法如下：玻璃棒挤压海带获得海带提取物， 将各海带提取物的1毫升等分试样连续稀释，与15mL甘油天冬酰胺琼脂培养基混合，倒入培养皿中，在26~30 ℃下有氧培养7天后平板划线，挑选菌落生长缓慢、白色、折叠、表面光滑的特征菌株，经分子生物学鉴定后使用。
具体的，本发明的工作原理如下：
屠宰后肉牛进入第一个预冷池时处于热鲜状态，温度较高，此时进行8~10℃下、开5~6分钟，停5~6分钟，处理时间为30~40分钟间歇式超声波处理能够更好的破坏肌肉内部结构，释放和激活蛋白酶；肉牛进入第二个预冷池时体温较低进入僵直状态，肌肉收缩，pH下降，蛋白酶活性降低，此时进行4~6℃下，开7~8分钟，停7~8分钟，处理时间为80~100分钟超声波处理，能够使肌肉结构松散，释放较多的蛋白酶；肉牛进入第三个预冷池时，体温更低，经过前两个阶段的超声波处理，处于解僵阶段，此时进行20~25分钟连续的超声处理，加速肉牛的解僵成熟，使得肉质变嫩，同时释放出的蛋白酶与后面涂抹到牛肉表面的转谷氨酰胺酶（TGase）协同，与乳酸菌发酵使得牛肉蛋白与大米蛋白在超高压下有效发生交联。
大米蛋白是优质的食用蛋白，其氨基酸组成平衡合理，蛋氨酸含量较高，为其他植物蛋白无法比拟。另外，大米蛋白是低抗原性蛋白，不会产生过敏反应。适量大米蛋白的使用足以代替磷酸盐等添加物，不仅可以提升肉制品的保水性、风味和口感，还具有大米蛋白自身营养价值，补充人体所需的各种氨基酸。本发明以牛肉为例，采用超高压协同大米蛋白和微生物发酵技术来提高牛肉制品的出品率。借助于转谷氨酰胺酶（TGase）与乳酸菌发酵使得牛肉蛋白与大米蛋白在超高压下有效发生交联，形成新的网络结构。进一步地，采用真空滚揉来有效提高盐溶蛋白的提取速度，利用微生物发酵技术使凝胶网络在肉块表面形成，进而利用其热凝胶特性来改善产品的保水性和出品率，同时赋予肉类蛋白以大米蛋白的营养价值和保健功能。
从上述描述可知，本发明具有以下有益效果：采用三段式预冷（逐渐降低预冷温度）、超声处理，使牛肉结构变松散，牛肉内的蛋白酶充分释放，大大缩短酶处理时间，并且提高后续交联反应的反应速率；
超高压能破坏牛肉蛋白的氢键、二硫键和离子键的结合，使其一级结构遭到破坏，空间结构的改变使其成为TGase的催化底物，与酪朊酸钠发生交联，形成新的网络结构，同时超高压间歇处理有助于交联反应的有效进行；
TGase的活性中心位于β-折叠区域，此区域的不易压缩，经超高压处理条件的TGase比其他酶类更具有稳定性和活性，使超高压处理与TGase协同加强肉类蛋白内部交联作用；
乳酸菌发酵可降低肉类蛋白质的等电点，并质子化带负电荷的羧酸基团，导致破坏邻近蛋白质上的静电链限制，促进净正电荷的增加使肉纤维蛋白质组之间排斥增加从而为添加水的固定创造了空间；
采用真空滚揉技术，真空条件下牛肉呈现膨胀状态，滚揉作用将已经嫩化的原料肉中的蛋白质与盐水充分接触，有效提高盐溶蛋白的提取速度，加快其向肉块表面移动，利用其热凝胶特点改善产品的保水性，同时交联蛋白的网络结构更紧凑，在真空条件下持水性也得到增强，改善肉块持水能力；
拍打压缩处理避免牛肉过早僵直降低硬度，且增加肌肉间隙，增强持水性，使得牟氏角毛藻培养液可以充分进入肌肉间隙中，反应充分；
涂膜在表面的Chaetoceros muelleri产生的多糖具有良好的持水性，经发酵后进入肉类细胞，嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus.促进Chaetoceros muelleri多糖释放以肉类细胞对汁液的水合能力，采用温热处理使多糖分散体以形成链间螺旋；
Chaetoceros muelleri对肉类也有良好的增色作用，附着力好，避免食品添加剂对人体的不良作用；
加入硬脂酸钙诱导多糖凝胶化使其冷却从而产生稳定的三维网络，使汁液水合能力进一步增强；
本发明避免人体因传统肉类保水剂-磷酸盐食量过多，从而降低钙的吸收，导致钙、磷摄入失衡的问题；
赋予牛肉以大米蛋白的优质营养价值及潜在保健功能。
实施例1
一种微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法，包括如下步骤：
步骤1、将屠宰后的牛置于三段式预冷池中进行预冷，预冷的同时用超声波发生器进行超声处理，超声波发生器频率40Hz、功率3.5千瓦；其中，牛放置于第一个预冷池中时超声波发生器开5分钟，停5分钟，处理时间为30分钟，预冷池温度控制在8℃；牛放置于第二个预冷池时，超声波发生器开7分钟，停7分钟，处理时间为80分钟，预冷池温度控制在4℃；牛放置于第三个预冷池时，超声波发生器连续开启20分钟，预冷池温度控制在0℃；经三次预冷、超声处理后把牛取出，切片；
按如下重量份将调料与切片后的牛肉混合：牛肉100份、淀粉2.5份，食用盐1.5份，糖3.0份，味精0.1份，酱油1.2份，料酒1.6份，大米蛋白1.0份、转谷氨酰胺酶0.3份，搅拌4min后装入真空聚乙烯袋中，250~300MPa超高压处理5分钟，每5分钟为一个间隔，循环5次；
步骤2、将保加利亚乳杆菌菌悬液以5*107cfu/g的接种量涂抹于步骤1所得牛肉表面，在温度为37℃的条件下培养13h；
步骤3、向步骤2所得牛肉中添加氯化钠、酪朊酸钠和冰水并混合均匀，然后进行低温真空滚揉处理，滚揉里程为3000~4000m，滚筒温度2~4℃，真空度-0.08~0.15MPa，滚揉转速8r/min，滚揉时间30min，氯化钠、酪朊酸钠的添加量为每100克步骤2所得牛肉中添加氯化钠0.5克、酪朊酸钠0.01克；
步骤4、将步骤3所得牛肉真空包装后放入气囊之间，通过对气囊的充气和抽气对牛肉进行拍打、拉伸（见图1），其中充气正压为70~80psi，抽气压力为-10~-14psi，抽气和充气的间隔时间为1~2s，气囊充气、抽气的次数均为20次；
步骤5、制备培养基：培养基的配方是Na2·5H2O 0.4g，NaNO3 3.3g，Fe-EDTA 0.2g，Na2EDTA 0.1g，H3BO3 0.14g，FeCl3·6H2O 0.0004g，MnSO4·7H2O 0.035g，ZnSO4·7H2O0.0025 g，CoSO4·7H2O 0.002g，氰钴胺7.9×10-5g，硫胺 6×10-3g，生物素2×10-4g，溶于1L盐溶液中；
所述的盐溶液由NaCl 20.5g，KCl 0.6g，CaCl2·2H2O 1.2g，MgCl2·6H2O 4.5g，NaHCO30.11g，MgSO4·7H2O 3.50g，溶于1L蒸馏水制成；
将牟氏角毛藻接种于经100℃灭菌20 min的培养基中，用CO2鼓泡均质将pH调节至7.3~7.5 ，得培养物；取250mL培养物置于20~22 ℃下以110rpm搅拌14~16h；随后在100~120μmol光子 m-2·s-1条件下光照处理24~28h，光照处理时培养物搅拌速度为180~200rpm，温度为26~28 ℃，并向培养物中以100mL/min-1连续注入CO2的体积分数为1.5%~2%的无菌空气使培养物pH维持在7.8~8 ，得牟氏角毛藻培养液；
将牟氏角毛藻培养液置于1500rpm下离心10min后弃上清液，加入步骤4所得牛肉中，添加量为每1克步骤4所得牛肉中添加2毫升牟氏角毛藻培养液下层液体，搅拌混匀，随后采用50~60μmol 光子 m-2·s-1卤素灯照射12h，每4h搅拌翻面，温度为26℃；
步骤6、获取嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus.菌种：用玻璃棒挤压海带获得海带提取物， 将各海带提取物的1毫升等分试样连续稀释，与 15mL甘油天冬酰胺琼脂培养基混合，倒入培养皿中，在26~30 ℃下有氧培养7天后平板划线，挑选菌落生长缓慢、白色、折叠、表面光滑的特征菌株，经分子生物学鉴定后使用；
将步骤5所得牛肉以2*107cfu/g接种成活的嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus.菌株，并在37℃下温育6h；
步骤7、将步骤6所得牛肉在50℃下加热20min后加入质量浓度为0.0002%~0.0003%的硬脂酸钙溶液保持1.5~2h进行凝胶化。
步骤8、将步骤7所得牛肉真空包装后速冻，15min内牛肉的中心温度达到-15℃以下，送入-18~-22℃的冷库贮藏。
实施例2
一种微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法，包括如下步骤：
步骤1、将屠宰后的牛置于三段式预冷池中进行预冷，预冷的同时用超声波发生器进行超声处理，超声波发生器频率40Hz、功率3.5千瓦；其中，牛放置于第一个预冷池中时超声波发生器开5.5分钟，停5.5分钟，处理时间为35分钟，预冷池温度控制在9℃；牛放置于第二个预冷池时，超声波发生器开7.5分钟，停7.5分钟，处理时间为90分钟，预冷池温度控制在5℃；牛放置于第三个预冷池时，超声波发生器连续开启23分钟，预冷池温度控制在2℃；经三次预冷、超声处理后把牛取出，切片；
按如下重量份将调料与切片后的牛肉混合：牛肉100份、淀粉2.75份，食用盐1.75份，糖3.25份，味精0.13份，酱油1.3份，料酒1.7份，大米蛋白1.5份、转谷氨酰胺酶0.4份，搅拌4.5min后装入真空聚乙烯袋中，250~300MPa超高压处理5.5分钟，间隔5.5分钟，循环5次；
步骤2、将保加利亚乳杆菌菌悬液以5*107cfu/g的接种量涂抹于步骤1所得牛肉表面，在温度为40℃的条件下培养14h；
步骤3、向步骤2所得牛肉中添加氯化钠、酪朊酸钠和冰水并混合均匀，然后进行低温真空滚揉处理，滚揉里程为3000~4000m，滚筒温度3℃，真空度-0.08~0.15MPa，滚揉转速8r/min，滚揉时间30min，氯化钠、酪朊酸钠的添加量为每100克步骤2所得牛肉中添加氯化钠0.6克、酪朊酸钠0.013克；
步骤4、将步骤3所得牛肉真空包装后放入气囊之间，通过对气囊的充气和抽气对牛肉进行拍打、拉伸，其中充气正压为70~80psi，抽气压力为-10~-14psi，抽气和充气的间隔时间为1~2s，气囊充气、抽气的次数均为25次；
步骤5、制备培养基：培养基的配方是Na2·5H2O 0.4g，NaNO3 3.3g，Fe-EDTA 0.2g，Na2EDTA 0.1g，H3BO3 0.14g，FeCl3·6H2O 0.0004g，MnSO4·7H2O 0.035g，ZnSO4·7H2O0.0025 g，CoSO4·7H2O 0.002g，氰钴胺7.9×10-5g，硫胺 6×10-3g，生物素2×10-4g，溶于1L盐溶液中；
所述的盐溶液由NaCl 20.5g，KCl 0.6g，CaCl2·2H2O 1.2g，MgCl2·6H2O 4.5g，NaHCO30.11g，MgSO4·7H2O 3.50g，溶于1L蒸馏水制成；
将牟氏角毛藻接种于经100℃灭菌20 min的培养基中，用CO2鼓泡均质将pH调节至7.3~7.5 ，得培养物；取250mL培养物置于20~22 ℃下以110rpm搅拌14~16h；随后在100~120μmol光子 m-2·s-1条件下光照处理26h，光照处理时培养物搅拌速度为180~200rpm，温度为27℃，并向培养物中以100mL/min-1连续注入CO2的体积分数为1.5%~2%的无菌空气使培养物pH维持在7.9 ，得牟氏角毛藻培养液；
将牟氏角毛藻培养液置于1500rpm下离心10min后弃上清液，加入步骤4所得牛肉中，添加量为每1克步骤4所得牛肉中添加2毫升牟氏角毛藻培养液下层液体，搅拌混匀，随后采用50~60μmol 光子 m-2·s-1卤素灯照射12h，每4h搅拌翻面，温度为27℃；
步骤6、获取嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus.菌种：用玻璃棒挤压海带获得海带提取物， 将各海带提取物的1毫升等分试样连续稀释，与 15mL甘油天冬酰胺琼脂培养基混合，倒入培养皿中，在26~30 ℃下有氧培养7天后平板划线，挑选菌落生长缓慢、白色、折叠、表面光滑的特征菌株，经分子生物学鉴定后使用；
将步骤5所得牛肉以2*107cfu/g接种成活的嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus.菌株，并在37℃下温育6h；
步骤7、将步骤6所得牛肉在50℃下加热21min后加入质量浓度为0.0002%~0.0003%的硬脂酸钙溶液保持1.5~2h进行凝胶化。
步骤8、将步骤7所得牛肉真空包装后速冻，18min内牛肉的中心温度达到-15℃以下，送入-20℃的冷库贮藏。
实施例3
一种微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法，包括如下步骤：
步骤1、将屠宰后的牛置于三段式预冷池中进行预冷，预冷的同时用超声波发生器进行超声处理，超声波发生器频率40Hz、功率3.5千瓦；其中，牛放置于第一个预冷池中时超声波发生器开6分钟，停6分钟，处理时间为30~40分钟，预冷池温度控制在10℃；牛放置于第二个预冷池时，超声波发生器开8分钟，停8分钟，处理时间为100分钟，预冷池温度控制在6℃；牛放置于第三个预冷池时，超声波发生器连续开启25分钟，预冷池温度控制在0~3℃；经三次预冷、超声处理后把牛取出，切片；
按如下重量份将调料与切片后的牛肉混合：牛肉100份、淀粉3.0份，食用盐2.0份，糖3.5份，味精0.15份，酱油1.4份，料酒1.8份，大米蛋白2.0份、转谷氨酰胺酶0.5份，搅拌5min后装入真空聚乙烯袋中，250~300MPa超高压处理6分钟，每6分钟为一个间隔，，循环6次；
步骤2、将保加利亚乳杆菌菌悬液以5*107cfu/g的接种量涂抹于步骤1所得牛肉表面，在温度为42℃的条件下培养15h；
步骤3、向步骤2所得牛肉中添加氯化钠、酪朊酸钠和冰水并混合均匀，然后进行低温真空滚揉处理，滚揉里程为3000~4000m，滚筒温度4℃，真空度-0.08~0.15MPa，滚揉转速8r/min，滚揉时间30min，氯化钠、酪朊酸钠的添加量为每100克步骤2所得牛肉中添加氯化钠0.7克、酪朊酸钠0.015克；
步骤4、将步骤3所得牛肉真空包装后放入气囊之间，通过对气囊的充气和抽气对牛肉进行拍打、拉伸，其中充气正压为70~80psi，抽气压力为-10~-14psi，抽气和充气的间隔时间为1~2s，气囊充气、抽气的次数均为30次；
步骤5、制备培养基：培养基的配方是Na2·5H2O 0.4g，NaNO3 3.3g，Fe-EDTA 0.2g，Na2EDTA 0.1g，H3BO3 0.14g，FeCl3·6H2O 0.0004g，MnSO4·7H2O 0.035g，ZnSO4·7H2O0.0025 g，CoSO4·7H2O 0.002g，氰钴胺7.9×10-5g，硫胺 6×10-3g，生物素2×10-4g，溶于1L盐溶液中；
所述的盐溶液由NaCl 20.5g，KCl 0.6g，CaCl2·2H2O 1.2g，MgCl2·6H2O 4.5g，NaHCO30.11g，MgSO4·7H2O 3.50g，溶于1L蒸馏水制成；
将牟氏角毛藻接种于经100℃灭菌20 min的培养基中，用CO2鼓泡均质将pH调节至7.3~7.5 ，得培养物；取250mL培养物置于20~22 ℃下以110rpm搅拌14~16h；随后在100~120μmol光子 m-2·s-1条件下光照处理28h，光照处理时培养物搅拌速度为180~200rpm，温度为28℃，并向培养物中以100mL/min-1连续注入CO2的体积分数为1.5%~2%的无菌空气使培养物pH维持在8 ，得牟氏角毛藻培养液；
将牟氏角毛藻培养液置于1500rpm下离心10min后弃上清液，加入步骤4所得牛肉中，添加量为每1克步骤4所得牛肉中添加2毫升牟氏角毛藻培养液下层液体，搅拌混匀，随后采用50~60μmol 光子 m-2·s-1卤素灯照射12h，每4h搅拌翻面，温度为28℃；
步骤6、获取嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus.菌种：用玻璃棒挤压海带获得海带提取物， 将各海带提取物的1毫升等分试样连续稀释，与 15mL甘油天冬酰胺琼脂培养基混合，倒入培养皿中，在26~30 ℃下有氧培养7天后平板划线，挑选菌落生长缓慢、白色、折叠、表面光滑的特征菌株，经分子生物学鉴定后使用；
将步骤5所得牛肉以2*107cfu/g接种成活的嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus.菌株，并在37℃下温育6h；
步骤7、将步骤6所得牛肉在50℃下加热20~22min后加入质量浓度为0.0002%~0.0003%的硬脂酸钙溶液保持1.5~2h进行凝胶化。
步骤8、将步骤7所得牛肉真空包装后速冻， 20min内牛肉的中心温度达到-15℃以下，送入-22℃的冷库贮藏。
对比例1
屠宰后牛肉灭菌后直接进行速冻。
对比例2
无预冷、超声处理，其他步骤与实施例2相同。
对比例3
无牟氏角毛藻和乳酸菌处理，其他步骤与实施例2相同。
对比例4
无硬脂酸钙处理，其他步骤与实施例2相同。
对比例5
无气囊方式拍打、拉伸处理，其他步骤与实施例2相同。
持水率检测结果
取处理完的牛肉样品，使用频率为18.2MHz的PQ001 Niumag脉冲NMR分析仪分析超声波处理后的牛肉的水分分配。将约1.5g处理过的样品置于15mm玻璃管中并插入NMR探针中。分析仪的温度保持在32 ℃，共振频率为22.6MHz 。测量自旋-自旋弛豫时间（T2），脉冲参数如下：TR = 4500 ms，SW = 100 kHz，D3 = us，τ = 200 μs，NS= 8，NECH=4000。记录两个弛豫时间（T2b和T21）。
表1 各处理对牛肉水分迁移的影响
处理时间 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5
T<sub>2b</sub>(ms)处理前 1.64 1.64 1.65 1.66 1.68 1.69 1.61 1.65
T<sub>2b</sub>(ms)处理后 1.65 1.63 1.67 1.65 1.69 1.70 1.63 1.68
T<sub>21</sub>(ms)处理前 48.44 48.95 48.33 48.52 48.67 48.30 48.97 48.44
T<sub>21</sub>(ms)处理后 63.20 65.87 62.13 52.61 57.04 54.88 55.57 56.76
T2b为与蛋白质侧链和肉的大分子成分紧密结合的水，处理前后并无发现各处理会影响牛肉中结合水的流动性。T21为蛋白质结构中的肌原纤维水，其与肌原纤维肿胀有关，表1表明，牛肉中毛细水的流动性受到专利工艺的显著影响，表明肌原纤维内蛋白质基质中的水含量随着不同工艺的处理而增加，促进了牛肉WHC的提高。
出品率计算
将以上实施例、对比例加工得到的牛肉放入真空袋80℃保持30min，并冷却至室温，用纸巾将肉表面可见的汁液轻控吸干后称取质量。
出品率/%=熟肉饼净质量/生品质量*100%
表2 各处理方式对牛肉出品率的影响
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5
出品率 103.24 109.87 104.93 75.31 92.39 95.78 97.70 96.43
表1数据表明，按本发明实施例1、实施例2、实施例3处理后牛肉盐溶蛋白结合能力极大增强，促进蛋白质分子间交联，将蛋白质分子粘合起来形成新的共价键，极大地提高牛肉的持水性和蒸煮出品率。
本发明采用三段式预冷（逐渐降低预冷温度）、超声处理，使牛肉结构变松散，牛肉内的蛋白酶充分释放，大大缩短酶处理时间，并且提高后续交联反应的反应速率；超高压能破坏牛肉蛋白的氢键、二硫键和离子键的结合，使其一级结构遭到破坏，空间结构的改变使其成为TGase的催化底物，与酪朊酸钠发生交联，形成新的网络结构。同时超高压间歇处理有助于交联反应的有效进行；同时经超声、超高压处理的牛肉，剪切力值下降，提升了肉嫩度，且对色素和风味物质等小分子化合物的共价键无明显影响；赋予牛肉以大米蛋白的优质营养价值及潜在保健功能；采用低温真空滚揉技术，真空条件下牛肉呈现膨胀状态，滚揉作用将已经嫩化的原料肉中的蛋白质与盐水充分接触，有效提高盐溶蛋白的提取速度，加快其向肉块表面移动，利用其热凝胶特点改善产品的保水性，同时交联蛋白的网络结构更紧凑，在真空条件下持水性也得到增强，有效提升了牛肉的出品率。
本发明已由上述相关实施例和附图加以描述，然而上述实施例仅为实施本发明的范例。必须指出的是，已揭露的实施例并未限制本发明的范围。相反地，包括于权利要求的精神及范围的修改及均等设置均包括于本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将屠宰后的牛置于三段式预冷池中进行预冷，预冷的同时用超声波发生器进行超声处理，超声波发生器频率40Hz、功率3.5千瓦；其中，牛放置于第一个预冷池中时超声波发生器开5~6分钟，停5~6分钟，处理时间为30~40分钟，预冷池温度控制在8~10℃；牛放置于第二个预冷池时，超声波发生器开7~8分钟，停7~8分钟，处理时间为80~100分钟，预冷池温度控制在4~6℃；牛放置于第三个预冷池时，超声波发生器连续开启20~25分钟，预冷池温度控制在0~3℃；经三次预冷、超声处理后把牛取出，切片；
按如下重量份将调料与切片后的牛肉混合：牛肉100份、淀粉2.5~3.0份，食用盐1.5~2.0份，糖3.0~3.5份，味精0.1~0.15份，酱油1.2~1.4份，料酒1.6~1.8份，大米蛋白1.0~2.0份、转谷氨酰胺酶0.3~0.5份，搅拌4~5 min后装入真空聚乙烯袋中，250~300MPa超高压处理5~6分钟，间隔5~6分钟，循环5~6次；
步骤2、将保加利亚乳杆菌菌悬液以5*107cfu/g的接种量涂抹于步骤1所得牛肉表面，在温度为37~42℃的条件下培养13~15h；
步骤3、向步骤2所得牛肉中添加氯化钠、酪朊酸钠和冰水并混合均匀，然后进行低温真空滚揉处理，滚揉里程为3000~4000m，滚筒温度2~4℃，真空度-0.08~0.15MPa，滚揉转速8r/min，滚揉时间30min；
步骤4、将步骤3所得牛肉真空包装后放入气囊之间，通过对气囊的充气和抽气对牛肉进行拍打、拉伸，其中充气正压为70~80psi，抽气压力为-10~-14psi，抽气和充气的间隔时间为1~2s，气囊充气、抽气的次数均为20~30次；
步骤5、将牟氏角毛藻培养液置于1500rpm下离心10min后弃上清液，加入步骤4所得牛肉中，添加量为每1克步骤4所得牛肉中添加2毫升牟氏角毛藻培养液下层液体，搅拌混匀，随后采用50~60μmol 光子 m-2·s-1卤素灯照射12h，每4h搅拌翻面，温度为26~28℃；
步骤6、将步骤5所得牛肉以2*107cfu/g接种成活的嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus.菌株，并在37℃下温育6h；
步骤7、将步骤6所得牛肉在50℃下加热20~22min后加入质量浓度为0.0002%~0.0003%的硬脂酸钙溶液保持1.5~2h进行凝胶化。
2.根据权利要求1所述的微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法，其特征在于，还包括步骤8：将步骤7所得牛肉真空包装后速冻，15-20min内牛肉的中心温度达到-15℃以下，送入-18~-22℃的冷库贮藏。
3.根据权利要求1所述的微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法，其特征在于，所述的步骤3中，氯化钠、酪朊酸钠的添加量为每100克步骤2所得牛肉中添加氯化钠0.5~0.7克、酪朊酸钠0.01~0.015克。
4.根据权利要求1所述的微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法，其特征在于，所述的步骤5中的牟氏角毛藻培养液的制备方法如下：将牟氏角毛藻接种于经100℃灭菌20 min的培养基中，用CO2鼓泡均质将pH调节至7.3~7.5 ，得培养物；取250mL培养物置于20~22 ℃下以110rpm搅拌14~16h；随后在100~120μmol 光子 m-2·s-1条件下光照处理24~28h，光照处理时培养物搅拌速度为180~200rpm，温度为26~28℃，并向培养物中以100mL/min-1连续注入CO2的体积分数为1.5%~2%的无菌空气使培养物pH维持在7.8~8 ，得牟氏角毛藻培养液。
5.根据权利要求4所述的微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法，其特征在于，所述的培养基的配方是Na2·5H2O 0.4g，NaNO3 3.3g，Fe-EDTA 0.2g，Na2EDTA0.1g，H3BO3 0.14g，FeCl3·6H2O 0.0004g，MnSO4·7H2O 0.035g，ZnSO4·7H2O 0.0025 g，CoSO4·7H2O 0.002g，氰钴胺7.9×10-5g，硫胺 6×10-3g，生物素2×10-4g，溶于1L盐溶液中；
所述的盐溶液由NaCl 20.5g，KCl 0.6g，CaCl2·2H2O 1.2g，MgCl2·6H2O 4.5g，NaHCO30.11g，MgSO4·7H2O 3.50g，溶于1L蒸馏水制成。
6.根据权利要求1所述的微生物发酵多级处理提高牛肉类冷冻菜肴持水性方法，其特征在于，所述的嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus.菌株的获取方法如下：玻璃棒挤压海带获得海带提取物， 将各海带提取物的1毫升等分试样连续稀释，与 15mL甘油天冬酰胺琼脂培养基混合，倒入培养皿中，在26~30 ℃下有氧培养7天后平板划线，挑选菌落生长缓慢、白色、折叠、表面光滑的特征菌株，经分子生物学鉴定后使用。
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