CN109369765B - 一种鼠胆酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物合成技术领域，尤其是涉及一种鼠胆酸的制备方法。所述鼠胆酸的制备方法，以3α，6α‑二羟基‑5β‑胆烷酸为原料经烷基酯化，6位、3位选择性氧化，溴化反应，取代反应，6位还原，水解得到鼠胆酸。本发明通过上述合成路线制备得到鼠胆酸，即3α，6β，7β‑三羟基‑5α‑胆烷酸，原料来源广泛，供应充足；并且，经过上述步骤得到的鼠胆酸的产率高，可达24.5％，适合大量制备，可为后续的相关研究提供数据支持及参考。
Description
技术领域
本发明涉及药物合成技术领域，尤其是涉及一种鼠胆酸的制备方法。
背景技术
胆汁酸是与无数生物学功能相关的重要内源性分子，包括胆固醇的吸收和排泄，在脂肪代谢中起到重要作用。疏水性胆汁酸的肝内积聚诱导细胞损伤,并且可导致各种疾病，例如肝炎和黄疸。通过细胞色素P450(CYP)酶对疏水性胆汁酸的羟基化被认为是防止胆汁酸毒性的防御机制。
鼠胆酸(Muricholic acid，MCA)是重要的胆汁酸，主要存在三种不同的构型分别为α-鼠胆酸(α-Muricholic acid)、β-鼠胆酸(β-Muricholic acid)、ω-鼠胆酸(ω-Muricholic acid)，其结构如图1所示。鼠胆酸是这种解毒机制中潜在的一种代谢物，并且经过不断研究发现鼠胆酸在研究大鼠胆汁的代谢及肝移植术中有着广泛的应用，并且鼠胆酸的钠盐是肝脏释放的胆汁酸盐，通常多用于胆石病的研究。Michael B.Francis发现鼠胆酸抑制艰难梭菌孢子的萌发和生长，可能对艰难梭菌感染的小鼠模型中的艰难梭菌毒力具有影响，可以为由艰难梭菌引起的感染类疾病的动物模型建立提供了参考和依据，进一步来解决由艰难梭菌引起的感染类疾病问题。
鼠胆酸还是一种保肝剂，对慢性胆汁淤积性肝病有益，同时尿液中的牛磺酸-β-鼠胆酸被鉴定为有希望的生物标志物，以促进中药何首乌(PMR)诱导的肝毒性的临床监测，并且可以作为潜在的治疗靶标。然而，由于大多数CYP产生多种羟基化产物，因此在不知道它们的化学成分和组成的情况下，难以表征这些代谢物，因此，需要合成这些胆汁酸来进一步了解胆汁酸的生物动力学，并且对这种转化的了解可以促进胆汁淤积药物的开发，进一步调节胆汁酸积累。另外为后续的其他研究提供标样。
目前，鼠胆酸的制备主要通过从动物胆汁提取和人工合成两种方法获得。以动物胆汁为来源，多从鼠胆汁中来提取，但鼠胆来源有限，提取麻烦，所以来源受限。人工合成主要通过鹅去氧胆酸经过一系列的转化得到的。20世纪90年代左右，鼠胆酸的合成主要通过鹅去氧胆酸甲酯，经氧化，亲电取代，还原，水解一系列转化得到的。但鹅去氧胆酸原料的来源较困难，工艺难度高，不适合大量生产，因此导致了鼠胆酸的工艺成本升高，价格昂贵。因此发现一种新途径，新方法来合成鼠胆酸解决其来源问题是迫切需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鼠胆酸的制备方法，以猪去氧胆酸(3α，6α-二羟基-5β-胆烷酸)作为原料，来源广泛，价格低廉，并且合成路线各步骤条件温和，收率高，适合大量制备，解决了现有技术中存在的鼠胆酸合成工艺复杂、成本高的技术问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种鼠胆酸的制备方法，包括如下步骤：以3α，6α-二羟基-5β-胆烷酸为原料经如下反应制备得到鼠胆酸；
，其中R为烷基。
优选的，R包括甲基、乙基、异丙基等低脂肪链中的任一种，优选为甲基。
以3α，6α-二羟基-5β-胆烷酸(A)为原料经烷基酯化得到3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸烷基酯(B)，3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸烷基酯(B)6位选择性氧化得到3α-羟基-6-酮-5β-胆烷酸烷基酯(C)，3α-羟基-6-酮-5β-胆烷酸烷基酯(C)的3位选择性氧化得到3α-乙酰基-6-酮-5β-胆烷酸烷基酯(D)，3α-乙酰基-6-酮-5β-胆烷酸烷基酯(D)进行溴化反应得到3α-乙酰基-7α-溴-6-酮-5α-胆烷酸烷基酯(E)，3α-乙酰基-7α-溴-6-酮-5α-胆烷酸烷基酯(E)的7位进行取代反应得到3α-乙酰基-7β-羟基-6-酮-5α-胆烷酸烷基酯(F)，3α-乙酰基-7β-羟基-6-酮-5α-胆烷酸烷基酯(F)的6位还原得到6β,7β-二羟基-3α-乙酰氧基-5α-胆烷酸烷基酯(G)，6α，7α-二羟基-3α-乙酰氧基-5α-胆烷酸烷基酯(G)水解得到鼠胆酸(H)。
本发明通过上述合成路线制备得到鼠胆酸，即3α，6β，7β-三羟基-5α-胆烷酸，原料来源广泛，供应充足；并且，经过上述步骤得到的鼠胆酸的产率高，可达24.5％，适合大量制备，可为后续的相关研究提供数据支持及参考。
优选的，步骤(a)包括：在催化剂作用下，化合物A与醇在60-70℃进行酯化反应得到化合物B。优选与甲醇在上述条件下进行酯化反应。反应温度在上述范围内均可，可根据实际需求进行调整，如反应温度可以为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃等等。
可根据酯化反应进度调节反应时间，优选反应时间为3-6h，使酯化反应完全，如可以为3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h等等。催化剂包括浓盐酸、浓硫酸、对甲苯磺酸一水合物中的任一种或多种，优选浓盐酸。
优选的，化合物A、甲醇和催化剂的质量比为1﹕(5-15)﹕(0.5-1)。在这一范围内能够保证化合物A顺利甲酯化，如在不同实施方式中，化合物A和甲醇的质量比可以为1﹕5、1﹕6、1﹕7、1﹕8、1﹕9、1﹕10、1﹕11、1﹕12、1﹕13、1﹕14、1﹕15等等；化合物A和催化剂的质量比可以为1﹕0.5、1﹕0.6、1﹕0.7、1﹕0.8、1﹕0.9、1﹕1等等。
优选的，将步骤(a)反应后的反应液进行提纯，得到化合物B。
优选的，化合物B的提纯的方法包括：反应结束后，将步骤(a)的反应液冷却至室温，除去醇，加入乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，干燥，除去溶剂，得到化合物B。其中，乙酸乙酯的加入质量优选为原料化合物A的10-20倍。
优选的，步骤(b)包括：化合物B、2-碘酰基苯甲酸和第一有机溶剂混合，回流反应，得到化合物C。可根据反应进度调节反应时间，优选反应时间为0.5-2h，使反应完全。第一有机溶剂优选为叔丁醇。优选将化合物B与叔丁醇预先混合，使化合物B溶解后，再加入2-碘酰基苯甲酸，升温至回流反应。
优选的，化合物B和2-碘酰基苯甲酸的摩尔比为1﹕(1-3)，优选为1﹕(1.2-1.5)。如在不同实施方式中可以为1﹕1、1﹕1.2、1﹕1.5、1﹕2、1﹕2.5、1﹕3等等。
优选的，化合物B和第一有机溶剂的质量比为1﹕(10-20)。可在该范围内进行调整。
优选的，将步骤(b)反应后的反应液进行提纯，得到化合物C。更优选的，化合物C的提纯方法包括：反应结束后，将步骤(b)的反应液过滤，收集滤液，浓缩得到残余样品，用二氯甲烷溶解，依次用质量分数为10％的NaHSO3(3×25mL)溶液和饱和食盐水(3×25mL)洗涤，收集有机相，干燥，柱层析分离，得到化合物C。进一步优选的，柱层析分离的洗脱液为乙酸乙酯和石油醚，乙酸乙酯和石油醚的体积比为1﹕6-1﹕2。
优选的，步骤(c)包括：化合物C溶解于第二有机溶剂中，加入4-二甲氨基吡啶、三乙胺、乙酸酐，室温反应1-5h，得到化合物D。更优选的，将反应后的反应液加入水中，调节pH为6-7，分液收集有机相，得到化合物D。第二有机溶剂优选乙酸乙酯。
其中，可采用浓度为0.1-2M的盐酸调节pH。
优选的，化合物C、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、乙酸酐的摩尔比为1﹕(0.1-0.5)﹕(1.5-3)﹕(2-3.5)。其中，化合物C与乙酸酐的摩尔比优选为1﹕(2.5-3.3)。
优选的，化合物C和第二有机溶剂的质量比为1﹕(30-50)。
优选的，将步骤(c)分液收集的有机相进行提纯，得到化合物D。更优选的，化合物D的提纯方法包括：用饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水溶液洗涤有机相，干燥，除去溶剂，得到化合物D。
优选的，步骤(d)包括：化合物D溶解于第三有机溶剂中，加入溴化铜，回流反应，得到化合物E。优选于60-90℃反应4-8h。第三有机溶剂优选乙酸乙酯。
优选的，化合物D和溴化铜的摩尔比为1﹕(0.5-3.5)，优选为1﹕(1-3.5)。
优选的，化合物D和第三有机溶剂的质量比为1﹕(30-50)。
优选的，将步骤(d)反应后的反应液进行提纯，得到化合物E。更优选的，化合物E的提纯方法包括：将反应后的反应液加入水中，分液收集有机相，用水和饱和食盐水溶液洗涤有机相，干燥，除去溶剂，柱层析分离，得到化合物E。进一步优选的，柱层析分离的洗脱液为乙酸乙酯和石油醚，乙酸乙酯和石油醚的体积比为1﹕(10-20)。
优选的，步骤(e)包括：将化合物E、丙酮、水混合后，加入碳酸钾，于40-60℃反应4-10h，得到化合物F。
优选的，化合物E、丙酮、水的质量比为1﹕(18-25)﹕(20-35)。
优选的，化合物E与碳酸钾的摩尔比为1﹕(2-8)。
优选的，将步骤(e)反应后的反应液进行提纯，得到化合物F。
优选的，化合物F的提纯方法包括：反应结束后，除去丙酮，加入水、乙酸乙酯，充分搅拌，静置分层，收集有机相，用盐酸和饱和食盐水洗涤，除去溶剂，柱层析分离，得到化合物F。其中，乙酸乙酯的加入质量优选为化合物F的70-80倍。洗涤时，采用相近体积的浓度为1-3M盐酸、饱和食盐水洗涤，优选相同体积。更优选的，柱层析分离的洗脱液为乙酸乙酯和石油醚，乙酸乙酯和石油醚的体积比为1﹕(5-15)。
优选的，步骤(f)包括：化合物F溶解于第四有机溶剂中，于0-10℃加入硼氢化钠，室温反应，得到化合物G。第四有机溶剂优选无水甲醇。其中，反应时间通过薄层色谱法TLC监控，展开剂为体积比为1﹕6-1﹕2的乙酸乙酯和石油醚，如室温反应1-3h。
优选的，化合物F与硼氢化钠的摩尔比为1﹕(2-10)。
优选的，化合物F与第四有机溶剂的质量比为1﹕(100-120)。
优选的，将步骤(f)反应后的反应液进行提纯，得到化合物G。更优选的，化合物G的提纯方法包括：向反应后的反应液中加入水、乙酸乙酯，充分搅拌，静置分层，收集有机相，依次用饱和碳酸氢钠(3×15mL)和饱和食盐水(3×15mL)洗涤，干燥，除去溶剂，得到化合物F。
提纯时，加入水和乙酸乙酯的质量分别优选为反应液质量的250-350倍和250-350倍。
优选的，步骤(g)包括：在碱性条件下，化合物F水解得到化合物G。更优选的，化合物F、甲醇、水、碱金属氢氧化物混合，回流反应，浓缩除去甲醇，加入水、盐酸，调节pH为1-2，析出沉淀，过滤收集沉淀，得到化合物G。进一步优选的，于60-80℃反应0.5-4h。
优选的，化合物F、甲醇和水的质量比为1﹕(150-250)﹕(35-55)。
优选的，化合物F与碱金属氢氧化物的摩尔比为1﹕(8-12)。碱金属氢氧化物包括氢氧化钠和氢氧化钾，优选氢氧化钠。
其中，加入水的量优选与反应液同体积。加入的盐酸的浓度为1-3M。
本发明各步骤的反应条件相对温和，且工艺简单，经过7步反应得到产物，易于控制，无需复杂的设备即可得到目标化合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明开发了一种以猪去氧胆酸(3α，6α-二羟基-5β-胆烷酸)作为原料合成鼠胆酸的方法，原料来源广泛，价格低廉；
(2)本发明的合成路线中，各步骤条件温和，易于控制，收率高，适合大量制备，解决了现有技术中存在的鼠胆酸合成工艺复杂、成本高的技术问题；
(3)本发明对合成路线中各步骤的反应条件进行进一步的优化，提高了鼠胆酸的收率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同构型的鼠胆酸的结构式；
图2为本发明实施例1提供的鼠胆酸的合成路线图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例的鼠胆酸的制备方法，参考图2所示的合成路线图，包括如下步骤：
(a)3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(B)的合成
向配有干燥冷凝回流管的反应容器中加入猪去氧胆酸(1.0g，2.5mmol)、15mL无水甲醇、浓盐酸100μL，加入完毕后将反应温度升至67℃，搅拌反应4h。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂甲醇，加20mL乙酸乙酯溶解残留物，依次用10mL饱和NaHCO3溶液和水洗涤。将有机相用无水MgSO4干燥除水，过滤除去无水MgSO4，收集有机相，减压蒸馏除去溶剂，得到1.0g白色固体，为化合物B，收率：99％。
化合物B的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝4.08(s,1H),3.68(s,3H),3.64(s,1H),0.93(d,J＝5.4Hz,6H),0.66(s,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝174.74,71.58,68.07,56.15,55.94,51.48,48.42,42.85,39.95,39.84,35.96,35.57,35.34,35.01,34.85,31.07,30.09,30.23,29.21,28.10,24.19,23.48,20.76,18.25,12.02。
HRMS:Calcd for C25H42O4[M+Na]+429.2981，Found 429.2976。
(b)3α-羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯(C)的合成
将化合物B(0.5g，1.23mmol)溶于叔丁醇中，加入2-碘酰基苯甲酸(0.52g，1.85mmol)，升温至回流，搅拌反应1h，过滤除去沉淀，用CH2Cl2洗涤沉淀，收集滤液并浓缩得到残余样品，残余样品用CH2Cl2溶解，并依次用质量分数为10％的NaHSO3(3×25mL)和饱和食盐水(3×25mL)洗涤，有机相用无水MgSO4干燥除水，过滤除去无水MgSO4，浓缩得到粗品，粗品经柱层析分离，洗脱液为体积比为1﹕2的乙酸乙酯和石油醚，分离得白色固体0.358g，为化合物C，收率为72％。
化合物C的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝3.68(s,3H),3.66-3.59(m,1H),0.94(d,J＝5.9Hz,3H),0.85(s,3H),0.66(s,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ213.86,174.66,70.12,60.39,59.42,56.83,55.83,51.49,43.10,42.90,40.03,39.62,37.97,37.07,35.27,34.88,34.39,31.05,30.92,29.85,27.97,23.96,23.15,20.84,18.23,14.17,11.95。
HRMS:Calcd for C25H40O4[M+Na]+427.2825，Found 427.2814。
(c)3α-乙酰基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯(D)的合成
在反应容器中加入化合物C(0.2g，0.49mmol)和乙酸乙酯(10mL)搅拌溶解；然后依次加入DMAP(6mg，0.049mmol)、三乙胺(170μL，1.23mmol)，加入乙酸酐(151μL，1.61mmol)，室温搅拌反应3.5h。加入0.5N盐酸调节pH至中性，依次用水(3×8mL)和饱和食盐水(3×8mL)洗涤，无水MgSO4干燥除水，抽滤除去无水MgSO4，浓缩除去溶剂，得白色固体0.22g，为化合物D，收率为99.5％。
化合物D的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝4.76-4.63(m,1H),3.68(s,3H),2.04(s,3H),0.94(d,J＝6.4Hz,3H),0.86(s,3H),0.68(d,J＝10.4Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝212.81,174.63,170.27,72.41,59.11,56.85,55.89,51.50,43.13,42.80,39.94,39.61,37.95,37.10,35.28,34.14,31.06,31.00,30.93,27.99,26.20,23.94,23.13,21.28,20.86,18.25,11.97。
HRMS:Calcd for C27H42O5[M+Na]+469.2930，Found 469.2930。
(d)3α-乙酰基-7α-溴-6-酮-5α-胆烷酸甲酯(E)的合成
将化合物D(1.0g，2.24mmol)加入到反应容器中，加入乙酸乙酯(50mL)搅拌溶解，加入溴化铜(1.5g，6.72mmol)后，升温至回流，薄层色谱法TLC(V乙酸乙酯﹕V石油醚＝1﹕4)监控，反应结束后，加入水稀释，充分搅拌，静置分层，分出有机相，并依次用水(3×20mL)和饱和食盐水洗涤(3×20mL)洗涤，无水MgSO4干燥除水，过滤除去无水MgSO4，浓缩得粗品，粗品经柱层析分离，洗脱液为体积比为1﹕10的乙酸乙酯和石油醚，得黄色油状液体1.0g，为化合物E，收率85.5％。
化合物E的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝5.14(d,J＝2.6Hz,1H),4.21(t,J＝5.5Hz,1H),3.68(s,3H),3.59(dd,J＝11.2,4.4Hz,1H),2.07(s,3H),0.95(d,J＝8.0Hz 3H),0.76(s,3H),0.71(s,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝205.28,174.59,170.37,68.47,58.69,55.46,52.37,51.51,46.18,45.87,42.71,41.61,40.21,38.71,35.25,32.19,30.99,30.87,27.69,25.22,24.84,22.72,21.41,20.50,18.25,12.40,12.02。
HRMS:Calcd for C27H41BrO5[M+Na]+547.2035，Found 547.2018。
(e)3α-乙酰氧基-7β-羟基-6-酮-5α-胆烷酸甲酯(F)的合成
将化合物E(0.18g，0.34mmol)溶于丙酮(5mL)和水(5mL)的混合溶液中，将反应体系升温至50℃，加入碳酸钾(95mg，0.68mmol)，搅拌反应，薄层色谱法TLC(V乙酸乙酯﹕V石油醚＝1﹕4)监控。反应结束后，加入蒸馏水，减压蒸馏除去丙酮，加入乙酸乙酯(15mL)萃取，充分搅拌，静置分层，分出有机相，水相用乙酸乙酯(3×15mL)萃取，合并有机相，依次用1M盐酸(3×25mL)和饱和食盐水(3×25mL)洗涤，无水MgSO4干燥除水，过滤除去无水MgSO4，浓缩得粗品，粗品柱层析分离，洗脱液为体积比为1﹕5的乙酸乙酯和石油醚，分离得白色固体80mg，为化合物F，收率50.6％。
化合物F的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝5.18-5.10(m,1H),3.81(dd,J＝9.6,1.9Hz,1H),3.67(s,4H),2.04(s,3H),0.94(d,J＝6.4Hz,3H),0.71(d,J＝5.8Hz,3H),0.68(s,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝211.57,174.66,170.20,78.93,68.46,56.90,55.32,51.63,51.49,50.13,46.96,43.61,41.52,39.52,35.34,32.52,31.12,31.00,28.32,26.15,25.20,24.86,21.37,21.06,18.37,12.48,12.12。
HRMS:Calcd for C27H42O6[M+Na]+485.2879，Found 485.2876。
(f)6β,7β-二羟基-3α-乙酰氧基-5α-胆烷酸甲酯(G)的合成
将化合物F(34mg，0.074mmol)溶于甲醇(5mL)中，降温至0℃，分批加入硼氢化钠(14mg，0.368mmol)，加毕，反应体系缓慢升至室温下搅拌反应，薄层色谱法TLC(V乙酸乙酯﹕V石油醚＝1﹕2)监控。反应结束后，加入蒸馏水(10mL)，加入乙酸乙酯(10mL)，充分搅拌，静置分层，分出有机相，水相用乙酸乙酯(2×10mL)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠(3×15mL)和饱和食盐水(3×15mL)洗涤，无水MgSO4干燥，过滤除去无水MgSO4，浓缩得白色固体30mg，为化合物G，收率88％。
化合物G的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝5.16-5.10(m,1H),3.67(s,3H),3.65-3.61(m,1H),3.34(dd,J＝9.8,3.7Hz,1H),2.04(s,3H),1.00(s,3H),0.94(d,J＝6.3Hz,3H),0.71(s,3H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝174.73,170.60,74.43,70.16,55.41,54.98,52.32,51.50,43.68,41.21,39.83,38.26,35.30,35.12,34.78,31.09,31.04,30.15,28.60,27.18,26.12,21.52,20.52,18.41,15.12,12.15。
HRMS:Calcd for C27H44O6[M+Na]+487.3036，Found 487.3031。
(g)3α，6β，7β-三羟基-5α-胆烷酸(H，鼠胆酸)的合成
室温下，将化合物G(20mg，0.043mmol)加入到甲醇(5mL)和水(1mL)的混合溶液中，加入氢氧化钠(17mg，0.425mmol)，回流搅拌2h，浓缩除去甲醇，加入3mL水稀释，然后用1N盐酸调pH至1-2，析出白色沉淀，过滤，干燥，得白色固体16mg，为化合物H，收率90.9％。
化合物H的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ＝4.08-4.04(m,1H),3.56-3.46(m,1H),3.21(dd,J＝10.0,3.7Hz,1H),0.98(s,3H),0.96(d,J＝6.5Hz,3H),0.73(s,3H)。
13C NMR(101MHz,CD3OD)δ＝176.78,76.56,75.09,65.94,55.86,55.20,52.95,43.36,40.37,39.98,37.83 35.29,35.12,34.03,32.66,30.99,30.63,28.30,28.21,26.88,20.37,17.56,14.20,11.30。
HRMS:Calcd for C24H40O5[M+Na]+431.2774，Found 431.2768。
实施例2
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤(a)中，催化剂为浓硫酸。
在装置有磁力搅拌装置，温度计和回流冷凝管的50mL三颈烧瓶中加入3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸(猪去氧胆酸)1.0g，加入无水甲醇15mL，开动磁力搅拌，加入质百分比浓度为36％-38％的浓硫酸100μL拌溶解后，搅拌下加热至67℃进行酯化反应4小时，停止加热，冷却至室温，蒸除甲醇，残余物中加入乙酸乙酯30ml，溶解后乙酸乙酯层依次用10mL饱和NaHCO3溶液和20mL饱和食盐水洗涤，在经过无水硫酸镁干燥后，过滤除去干燥剂，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，得到白色固体3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(2)1.0g，收率98.5％。
实施例3
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤(a)中，催化剂位为对甲苯磺酸。
在装置有磁力搅拌装置，温度计和回流冷凝管的50mL三颈烧瓶中加入3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸(猪去氧胆酸)(1.0g,2.5mmol)，加入无水甲醇15mL，开动磁力搅拌，加入对甲苯磺酸一水合物(0.95g,5.0mmol)，搅拌溶解后，搅拌下加热至67℃进行酯化反应4小时，停止加热，冷却至室温，蒸除甲醇，残余物中加入乙酸乙酯30mL，溶解后乙酸乙酯层依次用10mL饱和NaHCO3溶液和20mL饱和食盐水洗涤，在经过无水硫酸镁干燥后，过滤除去干燥剂，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，得到白色固体3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(2)0.97g，收率95.5％。
实施例4
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤(b)中，2-碘酰基苯甲酸的用量为1.48mmol。
将化合物B(0.5g，1.23mmol)溶于叔丁醇中，加入2-碘酰基苯甲酸(0.41g，1.48mmol)，升温至回流，搅拌反应1h，过滤除去沉淀，用CH2Cl2洗涤沉淀，收集滤液并浓缩得到残余样品，残余样品用CH2Cl2溶解，并依次用质量分数为10％的NaHSO3(3×25mL)和饱和食盐水(3×25mL)洗涤，有机相用无水MgSO4干燥除水，过滤除去无水MgSO4，浓缩得到粗品，粗品经柱层析分离，洗脱液为体积比为1﹕2的乙酸乙酯和石油醚，分离得白色固体0.398g，为化合物C，收率为80％。
实施例5
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤(c)中，乙酸酐的用量为1.23mmol。
在反应容器中加入化合物C(0.2g，0.49mmol)和乙酸乙酯(10mL)搅拌溶解；然后依次加入DMAP(6mg，0.049mmol)、三乙胺(170μL，1.23mmol)，加入乙酸酐(116μL，1.23mmol)，室温搅拌反应3.5h。加入0.5N盐酸调节pH至中性，依次用水(3×8mL)和饱和食盐水(3×8mL)洗涤，无水MgSO4干燥除水，抽滤除去无水MgSO4，浓缩除去溶剂，得白色固体0.211g，为化合物D，收率为96.5％。
实施例6
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤(d)中，溴化铜的用量为2.24mmol。
将化合物D(1.0g，2.24mmol)加入到反应容器中，加入乙酸乙酯(50mL)搅拌溶解，加入溴化铜(1.75g，7.84mmol)后，升温至回流，薄层色谱法TLC(V乙酸乙酯﹕V石油醚＝1﹕4)监控，反应结束后，加入水稀释，充分搅拌，静置分层，分出有机相，并依次用水(3×20mL)和饱和食盐水洗涤(3×20mL)洗涤，无水MgSO4干燥除水，过滤除去无水MgSO4，浓缩得粗品，粗品经柱层析分离，洗脱液为体积比为1﹕10的乙酸乙酯和石油醚，得黄色油状液体0.998g，为化合物E，收率85.5％。
实施例7
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤(d)中，溴化铜的用量为5.6mmol。
将化合物D(1.0g，2.24mmol)加入到反应容器中，加入乙酸乙酯(50mL)搅拌溶解，加入溴化铜(1.25g，5.6mmol)后，升温至回流，薄层色谱法TLC(V乙酸乙酯﹕V石油醚＝1﹕4)监控，反应结束后，加入水稀释，充分搅拌，静置分层，分出有机相，并依次用水(3×20mL)和饱和食盐水洗涤(3×20mL)洗涤，无水MgSO4干燥除水，过滤除去无水MgSO4，浓缩得粗品，粗品经柱层析分离，洗脱液为体积比为1﹕10的乙酸乙酯和石油醚，得黄色油状液体0.88g，为化合物E，收率75％。
实施例8
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤(f)中，硼氢化钠的用量为0.148mmol。
将化合物F(50mg，0.108mmol)溶于甲醇(5mL)中，降温至0℃，分批加入硼氢化钠(12mg，0.324mmol)，加毕，反应体系缓慢升至室温下搅拌反应，薄层色谱法TLC(V乙酸乙酯﹕V石油醚＝1﹕2)监控。反应结束后，加入蒸馏水(10mL)，加入乙酸乙酯(10mL)，充分搅拌，静置分层，分出有机相，水相用乙酸乙酯(2×10mL)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠(3×15mL)和饱和食盐水(3×15mL)洗涤，无水MgSO4干燥，过滤除去无水MgSO4，浓缩得白色固体43.8mg，为化合物G，收率87.5％。
实施例9
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤(f)中，硼氢化钠的用量为0.756mmol。
将化合物F(50mg，0.108mmol)溶于甲醇(5mL)中，降温至0℃，分批加入硼氢化钠(28.6mg，0.756mmol)，加毕，反应体系缓慢升至室温下搅拌反应，薄层色谱法TLC(V乙酸乙酯﹕V石油醚＝1﹕2)监控。反应结束后，加入蒸馏水(10mL)，加入乙酸乙酯(10mL)，充分搅拌，静置分层，分出有机相，水相用乙酸乙酯(2×10mL)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠(3×15mL)和饱和食盐水(3×15mL)洗涤，无水MgSO4干燥，过滤除去无水MgSO4，浓缩得白色固体44mg，为化合物G，收率87.8％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (26)
1.一种鼠胆酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以3α，6α-二羟基-5β-胆烷酸为原料经如下反应制备得到鼠胆酸；
其中R为烷基；
步骤(e)包括：将化合物E、丙酮、水混合后，加入碳酸钾，于40-60℃反应4-10h，得到化合物F。
2.根据权利要求1所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，所述R为甲基、乙基、异丙基中的任一种。
3.根据权利要求2所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，所述R为甲基。
4.根据权利要求2所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，步骤(a)包括：在催化剂作用下，化合物A与醇在60-70℃进行酯化反应得到化合物B。
5.根据权利要求4所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，所述醇为甲醇和乙醇中的任一种。
6.根据权利要求5所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，所述化合物A、所述甲醇和所述催化剂的质量比为1﹕(5-15)﹕(0.5-1)；
所述催化剂为浓盐酸、浓硫酸、对甲苯磺酸一水合物中的任一种或多种。
7.根据权利要求4所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，将所述步骤(a)反应后的反应液进行提纯，得到所述化合物B；
所述化合物B的提纯的方法包括：反应结束后，除去步骤(a)的反应液中的醇，加入乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，干燥，除去溶剂，得到所述化合物B。
8.根据权利要求1所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，步骤(b)包括：化合物B、2-碘酰基苯甲酸和第一有机溶剂混合，回流反应，得到化合物C；
所述第一有机溶剂为叔丁醇。
9.根据权利要求8所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，所述化合物B和所述2-碘酰基苯甲酸的摩尔比为1﹕(1-3)；
所述化合物B和所述第一有机溶剂的质量比为1﹕(10-20)。
10.根据权利要求8所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，将所述步骤(b)反应后的反应液进行提纯，得到所述化合物C；
所述化合物C的提纯方法包括：反应结束后，将步骤(b)的反应液过滤，收集滤液，浓缩得到残余样品，用二氯甲烷溶解，用NaHSO3水溶液和饱和食盐水洗涤，收集有机相，干燥，柱层析分离，得到所述化合物C。
11.根据权利要求1所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，步骤(c)包括：化合物C溶解于第二有机溶剂中，加入4-二甲氨基吡啶、三乙胺、乙酸酐，室温反应1-5h，得到化合物D；所述第二有机溶剂为乙酸乙酯。
12.根据权利要求11所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，将所述步骤(c)中反应后的反应液加入水中，调节pH为6-7，分液收集有机相，得到化合物D。
13.根据权利要求11所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，所述化合物C、所述4-二甲氨基吡啶、所述三乙胺、所述乙酸酐的摩尔比为1﹕(0.1-0.5)﹕(1.5-3)﹕(2-3.5)；
所述化合物C和第二有机溶剂的质量比为1﹕(30-50)。
14.根据权利要求12所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，将所述步骤(c)中分液收集的有机相进行提纯，得到所述化合物D；
所述化合物D的提纯方法包括：用饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水溶液洗涤有机相，干燥，除去溶剂，得到化合物D。
15.根据权利要求1所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，步骤(d)包括：化合物D溶解于第三有机溶剂中，加入溴化铜，回流反应，得到化合物E；所述第三有机溶剂为乙酸乙酯。
16.根据权利要求15所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)中，于60-90℃反应4-8h。
17.根据权利要求15所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，所述化合物D和所述溴化铜的摩尔比为1﹕(0.5-3.5)；
所述化合物D和所述第三有机溶剂的质量比为1﹕(30-50)。
18.根据权利要求15所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，将所述步骤(d)反应后的反应液进行提纯，得到所述化合物E；
所述化合物E的提纯方法包括：将所述步骤(d)反应后的反应液加入水中，分液收集有机相，用水和饱和食盐水溶液洗涤有机相，干燥，除去溶剂，柱层析分离，得到化合物E。
19.根据权利要求1所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，所述化合物E、丙酮、水的质量比为1﹕(18-25)﹕(20-35)；
所述化合物E与碳酸钾的摩尔比为1﹕(2-8)。
20.根据权利要求1所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，将所述步骤(e)反应后的反应液进行提纯，得到所述化合物F；
所述化合物F的提纯方法包括：步骤(e)反应结束后，除去丙酮，加入水、乙酸乙酯，充分搅拌，静置分层，收集有机相，用盐酸和饱和食盐水洗涤，除去溶剂，柱层析分离，得到化合物F。
21.根据权利要求1所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，步骤(f)包括：化合物F溶解于第四有机溶剂中，于0-10℃加入硼氢化钠，室温反应，得到化合物G；
所述第四有机溶剂为无水甲醇。
22.根据权利要求21所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，所述化合物F与硼氢化钠的摩尔比为1﹕(2-10)；
所述化合物F与第四有机溶剂的质量比为1﹕(100-120)。
23.根据权利要求21所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，将所述步骤(f)反应后的反应液进行提纯，得到所述化合物G；
所述化合物G的提纯方法包括：向步骤(f)反应后的反应液中加入水、乙酸乙酯，充分搅拌，静置分层，收集有机相，用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗涤，干燥，除去溶剂，得到所述化合物F。
24.根据权利要求1所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，步骤(g)包括：在碱性条件下，化合物F水解得到化合物G。
25.根据权利要求24所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，所述化合物F、甲醇、水、碱金属氢氧化物混合，回流反应，浓缩除去甲醇，加入水、盐酸，调节pH为1-2，过滤收集沉淀，得到所述化合物G；
于60-80℃反应0.5-4h。
26.根据权利要求25所述的鼠胆酸的制备方法，其特征在于，所述化合物F、甲醇和水的质量比为1﹕(150-250)﹕(35-55)；
所述化合物F与碱金属氢氧化物的摩尔比为1﹕(8-12)。
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