CN110078781A - α-鼠胆酸的制备方法以及用于制备α-鼠胆酸的中间体及其制备方法 - Google Patents
α-鼠胆酸的制备方法以及用于制备α-鼠胆酸的中间体及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种α‑鼠胆酸的制备方法以及用于制备α‑鼠胆酸的中间体及其制备方法，属于药物合成领域。中间体具有如下式(I)所示的结构，其中，R1表示成酯基团，所述成酯基团包括烷基、苄基；其中，R2、R3表示相同或不同的羟基保护基团，所述羟基保护基团包括三甲基硅基。以上述结构的中间体制作α‑鼠胆酸，可以降低制作条件的苛刻要求，从而降低制作难度。
Description
技术领域
本申请涉及药物合成领域，具体而言，涉及α-鼠胆酸的制备方法以及用于制备α-鼠胆酸的中间体及其制备方法。
背景技术
已知鼠胆酸(Muricholic Acid，MCA)主要存在α-鼠胆酸(α-Muricholic Acid)、β-鼠胆酸(β-Muricholic Acid)、ω-鼠胆酸(ω-Muricholic Acid)等三种不同的构型。
鉴于鼠胆酸作为药物方面的应用及其三种不同构型物质的存在，有效地分析其各种不同构型物质的性能，将有利于其在医药领域的进一步的应用。α-鼠胆酸可以采用由鼠胆酸分离或者直接化学合成的方式获得。
因此，提供一种有效合成α-鼠胆酸的方法、路径很有必要。
发明内容
基于上述的不足，本申请提供了一种α-鼠胆酸的制备方法，以部分或全部地改善、甚至解决相关技术中的问题。
本申请是这样实现的：
在第一方面，本申请的示例提供了一种中间体。该中间体能够被用于通过温和条件制作α-鼠胆酸，从而降低合成难度。
该用于制备α-鼠胆酸的中间体具有如下式(I)所示的结构，
其中，R1表示成酯基团，成酯基团包括烷基、苄基；
其中，R2、R3表示相同或不同的羟基保护基团，羟基保护基团包括三甲基硅基、乙酰基。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第一种可能的实施方式的一些可选示例中，成酯基团包括直链烷基或支链化的烷基。
结合第一方面的第一种可能的实施方式，在本申请的第一方面的第二种可能的实施方式的一些可选示例中，直链烷基包括甲基、乙基。
在第二方面，本申请的示例提供了一种用于制备α-鼠胆酸的上述中间体的合成方法。
合成方法包括以猪去氧胆酸为起始物按照下述路径的反应步骤：
其中猪去氧胆酸具有如式(1-I)所示的结构。
结合第二方面，在本申请的第二方面的第一种可能的实施方式的一些可选示例中，步骤a包括：式(1-I)化合物在酸性环境中通过酯化反应得到式(2-I)化合物；
或者，步骤b包括：选择性氧化式(2-I)化合物的6位羟基为羰基得到式(3-I)化合物；
或者，步骤c包括：在碱性条下，分别使式(3-I)化合物的3位羟基发生醇羟基取代反应、6位羰基发生酮羰基发生烯醇化以及醇羟基取代反应得到式(I)化合物。
在第三方面，本申请的示例提供了一种α-鼠胆酸的制备方法。
该制作方法以上述的中间体作为原料进行反应。
且制备方法包括氧化(I)化合物获得式(II)化合物的氧化步骤，再通过还原和水解制备：
结合第三方面，在本申请的第三方面的第一种可能的实施方式的一些可选示例中，氧化物步骤是在冷却条件下反应的。
可选地，氧化步骤在0℃进行。
结合第三方面，在本申请的第三方面的第二种可能的实施方式的一些可选示例中，制备方法包括：将式(II)化合物的6位羰基还原得到式(III)化合物，以及由式(III)化合物水解得到式(IV)化合物；
结合第三方面的第二种可能的实施方式，在本申请的第三方面的第三种可能的实施方式的一些可选示例中，由式(II)化合物反应制备式(III)化合物的步骤是由0℃加热至室温并保持在室温下进行的。
结合第三方面的第二种可能的实施方式，在本申请的第三方面的第四种可能的实施方式的一些可选示例中，由式(III)化合物反应制备式(IV)化合物的步骤是60～80℃的温度下进行的。
在以上实现过程中，本申请实施例提供的中间体作为原料能够以更温和的条件。基于该中间体的α-鼠胆酸合成方法的步骤较短、收率较高，适合大量制备的优点。另外，研究发现，本申请示例中提出的制备式(IV)结构的α-鼠胆酸的路线中，中间体化合物(I)在氧化过程中也不会造成构型翻转，整条路线由于引入该新的中间体化合物(I)，很好的控制了产品式(IV)所示化合物的构型，克服了现有技术缺陷。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例1提供的由猪去氧胆酸合成α-鼠胆酸的反应路线的流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下针对本申请实施例的α-鼠胆酸的制备方法以及用于制备α-鼠胆酸的中间体及其制备方法进行具体说明：
鼠胆酸具有多种重要的生物学功能及药学价值。但是鼠胆酸有三种构型，鉴于众多的多构型化合物的生物活性是对构型敏感的，且三种构型中的α-鼠胆酸(3α,6β,7α-三羟基-5β-胆烷酸；3α,6β,7α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid)表现出更明显应用价值。
有证据表明α-鼠胆酸、牛磺胆酸与甘氨结合型三羟基胆汁酸可成为联合诊断妊娠肝内胆汁淤积症的潜在生物标志物。α-鼠胆酸还表现出抑制艰难梭菌孢子的萌发和生长，从而解决由艰难梭菌引起的感染类疾病的潜力。
肝内积聚的疏水性胆汁酸将诱导细胞损伤，并且可导致各种疾病如肝炎和黄疸等。细胞色素P450酶对疏水性胆汁酸的羟基化反应被认为是防止胆汁酸毒性的一种防御机制，而α-鼠胆酸是这种解毒机制中的潜在代谢物。
因此，鉴于以上提及的生物学及药学上潜在的应用价值，α-鼠胆酸的研究备受关注。目前，α-鼠胆酸的来源主要通过从鼠胆汁提取和化学合成两种方法获得。从鼠胆汁中提取是一种重要的方法，但提取麻烦，难以分离得到纯的样品，不能满足科学研究的需要。
Kang等提出了以鹅去氧胆酸为原料的化学合成方法，经过侧链羧酸甲酯化，经7位选择性氧化，3位保护，6位亲电取代，7位羰基还原，6、7位成双键、氧化成环和水解等一系列步骤制备得到α-鼠胆酸。
但是，该工艺路线中主要存在以下缺陷：
1、鹅去氧胆酸是合成熊去氧胆酸和奥贝胆酸的原料，其自身合成工艺难度高，因此原料价格高。
2、6位亲电取代的过程使用到了管制品溴水。
3、环氧开环过程使用到了易燃、遇水易生成有毒气体的三氟化硼乙醚。
有鉴于上述的一些缺陷，本文针对α-鼠胆酸合成工艺的缺陷，创新性地提出了一种新的合成方法：
以获得/使用成本低的具有式(1-I)结构的猪去氧胆酸(3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸；3α,6α-dihydroxy-5β-cholanoic acid)为原料，经酯化、6位选择性氧化、7位羟基化、6位羰基还原和水解等步骤合成α-鼠胆酸。
该方法具有条件温和、步骤较短、收率较高，适合大量制备的优点，同时可以提升猪去氧胆酸的附加值，创造更高的经济效益。
在以上合成路径中，获得了一个中间体，基于该中间体可以降低反应条件的苛刻度(例如避免对污染性或危险原料的使用)。中间体结构如下式(I)所示,
其中，R1表示成酯基团。
该成酯基团能够与猪去氧胆酸的羧酸反应酯化反应而形成酯键，则一些示例中成酯基团可替代地是醇类化合物与羧酸反应而成。例如，其中的醇类化合物是脂肪烃、脂环烃或芳香烃等链中的氢原子被羟基取代而成的化合物。醇类化合物例如可以是脂肪醇、脂环醇、芳香醇等；或者，醇类化合物例如可以是伯醇、仲醇、叔醇；或者，醇类化合物例如可以是一元醇，或如二元醇、三元醇等多元醇。例如在一些示例中，该醇类化合物为甲醇、乙醇、丙醇等等，则R1为烷基(包括直连烷基和支链化的烷基)，直连烷基如甲基、乙基。在另一些示例中，R1被选择为苄基。
其中，R2、R3表示相同或不同的羟基保护基团(或称为离去基团)。对于R2羟基保护基团，其由能够与羟基反应(醇羟基取代反应)以取代羟基氢的化合物生成。对于R3羟基保护基团，其由能够与酮羰基化合物生成烯醇并取代烯醇的羟基氢原子的化合物生成(即通过亲电试剂进攻烯醇负离子而获得)。R2、R3基团根据需要选择使用相同的化合物或者不同的化合物。基于简化反应过程考虑，两个基团选择相同的基团。
本申请示例中，羟基保护基团包括三甲基硅基(-TMS，[-Si(CH3)3])，由此R3基团被结合入烯醇硅醚结构中。其通过烯醇醚中氧原子上的基团(如羟基氧原子上的氢)为硅基取代形成，并构成烯醇的稳定形式。或者，在另一些示例中，羟基保护基团被选择为乙酰基。
为了便于本领域技术人员实施该方案，本申请示例中给出了一种该中间体的制备方法。
该用于制备α-鼠胆酸的中间体的合成方法，合成方法包括以猪去氧胆酸为起始物按照下述路径的反应步骤：
其中猪去氧胆酸具有如式(1-I)所示的结构。
以上反应步骤主要涉及酯化、选择性地使6羟基氧化、羟基取代以及酮羰基的烯醇化反应。
例如，步骤a包括：式(1-I)化合物在酸性环境中通过酯化反应得到式(2-I)化合物。
其中的酸性环境可以采用如盐酸、硫酸等无机酸或如甲基苯磺酸的有机酸提供。羟基化合物如醇与猪去氧胆酸酸性在催化剂的促进下进行酯化。反应过程中反应原料的用量及相互之间的比例、反应温度、反应时间等被考察以便使酯化反应按照预期实施。
通常地该反应是在溶液体系中反应，且通过加热将有助于酯化反应的进行。因此，反应的温度根据反应原料如羟基化合物选择，一些示例中反应温度为60-70℃，如62℃、65℃、67℃、69℃等。为了使猪去氧胆酸充分地反应，选择反应原料之一的羟基化合物过量的。
可替代地，羟基化合物如醇选择使用甲醇，无机酸类型的催化剂选择使用浓盐酸。在这样的条件下，以上酯化反应例如选择如下方式进行：
取3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸(猪去氧胆酸):无水甲醇:浓盐酸＝1:5-15:0.5-1.0质量比(如1:5:0.5；1:7:0.6；1:11:0.7等等)。然后三者放在反应器中搅拌，在搅拌下加热至60℃-70℃进行酯化反应2-6小时(如3小时、4小时、5小时、6小时等等)。反应结束后，停止加热并冷却至室温。
可选地进行如下纯化处理：蒸除甲醇，加入乙酸乙酯(，乙酸乙酯加入量为3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸的10-20倍质量比)，再依次用同体积的饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，在经过无水硫酸镁干燥后，过滤除去干燥剂，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，得到白色固体3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(2-I)。
例如，步骤b包括：选择性氧化式(2-I)化合物的6位羟基为羰基得到式(3-I)化合物。
(醇)羟基到酮羰基的转变通过氧化剂来实现，但是，由于(2-I)化合物3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯中含有两个羟基，因此，基于工艺选择对其中的6位羟基进行氧化。这可以通过适当地选择氧化剂实现。示例中选择2-碘酰基苯甲酸(IBX)作为氧化剂(高价碘试剂)。在多元醇中，IBX具有理想的选择性。且IBX还具有便宜的、易于制备、空气中稳定的优点，并且是一种相对比较“温和”的氧化剂。
IBX能够与如各种适当的溶剂配合对醇羟基进行选择性氧化。例如，通常地，溶剂选择为二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)或其他的离子液体。本申请示例中选择叔丁醇作为溶剂进行反应。
示例中基于叔丁醇的羟基氧化反应如下：
先称取得到的3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(2-I):叔丁醇＝1:10-50质量比，并将它们搅拌溶解。然后，加入2-碘酰基苯甲酸，IBX的加入量为3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(2-I)的1-3倍的摩尔比。升温至回流，并继续搅拌反应0.5-3小时。
反应结束后进行纯化处理：过滤除去不溶物，用CH2Cl2洗涤，滤液浓缩，残余样品用CH2Cl2溶解，依次用5％-10％的NaHSO3(3×25ml)和饱和食盐水(3×25ml)洗涤，有机相用无水MgSO4干燥，过滤，浓缩，粗品柱层析，V乙酸乙酯:V石油醚＝(1:6)～(1:2)，得到白色固体，即为3α-羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯(3-I)。
例如，步骤c包括：在碱性条下，分别使式(3-I)化合物的3位羟基发生醇羟基取代反应、6位羰基发生酮羰基发生烯醇化以及醇羟基取代反应得到式(I)化合物。
其中，一些示例中，3位羟基发生醇羟基取代反应、6位羰基发生酮羰基发生烯醇化以及醇羟基取代反应通过分步骤方式来进行。如先发生3位羟基发生醇羟基取代反应，然后再发生6位羰基发生酮羰基发生烯醇化以及醇羟基取代反应。或者，在另一些示例中，发生6位羰基发生酮羰基发生烯醇化以及醇羟基取代反应，然后再发生3位羟基发生醇羟基取代反应。
本申请示例中，通过“一锅法”反应使以上两个反应在反应体系中共同进行，从而实现“一步”获得式(I)化合物。由于在反应过程中存在羟基的氢取代，预期到反应体系氢离子过高而抑制反应的持续进行，因此，在反应体系中提供氢离子消耗物(如缚酸剂)。缚酸剂通常选择为碱性物质，以便与其进行酸碱中和反应。当然，在另一些示例中，也可以选择其他试剂来俘获多余的氢。
“进攻”羟基以取代其氢原子的物质示例性地被选择为亲电试剂。此外，结合对于酮羰基的反应考量，反应原料选择使用能够共同地促进两个反应进行的物质。在本申请示例中，例如，选择使用三氟甲磺酸三甲基硅酯(Trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate，TMSOTF)，且反应过程如下。
称式(3-I)化合物6α-羟基-3-酮-5β-胆烷酸甲酯:二氯甲烷＝1:10～35倍质量比，然后搅拌溶解。
搅拌下冷却至-10℃～-25℃(零下10摄氏度至零下25摄氏度)，加入三乙胺，三乙胺的加入量为6α-羟基-3-酮-5β-胆烷酸甲酯(3-I)的5-20倍摩尔比，继续搅拌10-40min，缓慢加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTF)的二氯甲烷溶液，三氟甲磺酸三甲基硅酯的加入量为6α-羟基-3-酮-5β-胆烷酸甲酯(3-I)的4-10倍摩尔比。
完毕后继续在该温度(-10℃～-25℃)下搅拌反应0.5-2.5小时，然后将饱和碳酸氢钠溶液加入到反应体系中淬灭(使反应停止)反应，静置分层。有机相分别用同体积的饱和碳酸氢钠溶液、水洗至中性，将得到的有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，有机相在减压下蒸除，得到淡黄色油状液体，即含有中间体式(I)化合物的物质。
基于以上所获得的中间体(I)通常适当的反应路线反应即可获得α-鼠胆酸。作为一般性的描述，这样的反应路线可以由如下反应过程示明。
其中，由式(II)化合物的酮羰基还原得到式(III)化合物，以及由式(III)化合物酯水解为羧酸得到式(IV)化合物(α-鼠胆酸)能够以各种常规试剂(还原剂和水解催化剂)以及各种方法(常规方法和试剂亦可)实施。
由于式(II)化合物中的主要官能团(如3位、7位羟基)具有与α-鼠胆酸相同的构型，且在羰基还原和直接水解过程中不会导致构型的变化，因此，需要对由前述示例中的中间体(式(I)化合物)获得式(II)化合物的反应过程进行考察，以选择适当的反应条件和试剂。式(I)化合物至式(II)化合物的反应过程主要涉及氧化过程，并因此涉及到氧化剂的选择和使用。
本申请示例中选择间氯过氧苯甲酸(meta-Chloroperoxybenzoic acid，m-CPBA)作为氧化剂。m-CPBA为一个有机过氧酸，其中的弱氧-氧单键可以与多电子体系的底物反应，从而将氧原子转移到底物。本申请示例中，间氯过氧苯甲酸氧化烯烃双键上的氢转化为羟基。并且，从烯烃双键转化的羟基在酸性下烯醇式转化为酮式结构，满足产品α-鼠胆酸无需进行构型改变的要求。
示例中，以上反应路线按照如下方式进行。
式I化合物至式II化合物。
在前述的中间体制备过程中，所获得淡黄色油状液体能够被直接使用而无需纯化，直接投入到下一步反应。
将间氯过氧苯甲酸和碳酸氢钠悬浮在二氯甲烷中。间氯过氧苯甲酸的加入量为中间体的1-3倍摩尔比，碳酸氢钠的加入量为中间体IV的2-6倍摩尔比。
冷却至0℃，继续搅拌10-30min，加入中间体的二氯甲烷溶液，二氯甲烷的加入量为中间体IV的5-10倍质量比。加完毕后，继续在该温度(0℃)下搅拌0.5-3小时。
反应完全后加入同体积的饱和亚硫酸溶液淬灭，水相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的加入量为中间体的20-50倍质量比，合并有机相，依次用同体积的饱和Na2SO3溶液、1M HCl溶液、饱和食盐水洗涤。然后用无水硫酸镁干燥，过滤后浓缩得粗品，经硅胶柱层析纯化，得白色固体制备3α,7α-二羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯(式II化合物)。
式II化合物至式III化合物。
先称取C步得到的3α,7α-二羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯(II):无水甲醇＝1:5-20倍质量比，搅拌溶解。
降温至0℃～10℃，在搅拌下加入硼氢化钠，硼氢化钠加入量为3α,7α-二羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯(II)量的1-10倍摩尔比，然后缓慢升至室温，再继续搅拌反应1-3小时，薄层色谱法TLC(V乙酸乙酯:V石油醚＝1:6-1:2)监控。
反应结束后，加入蒸馏水，蒸馏水的加入量为反应液体积的10-100倍质量比，加入乙酸乙酯(乙酸乙酯的加入量为3α,7α-二羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯(II)量的30-50倍质量比)，充分搅拌，静置分层，分出有机相，水相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的加入量为3α,7α-二羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯(II)量的10-100倍质量比，合并有机相，依次用同体积的饱和碳酸氢钠,和饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得白色固体3α,6β,7α-三羟基-5β-胆烷酸甲酯(III)。
式III化合物至式IV化合物。
先称取得到的3α,6β,7α-三羟基-5β-胆烷酸甲酯(III):甲醇:水＝1:10-60:2-20倍质量比，搅拌溶解，在搅拌下加入氢氧化钠，氢氧化钠加入量为3α,6β,7α-三羟基-5β-胆烷酸甲酯(III)量的2-10倍摩尔比，在搅拌下加热至60℃至80℃反应1-4小时，停止加热，冷却至室温，加入等体积的水，缓慢加入浓度为1M-3M(摩尔每升，mol/L)的盐酸，直至pH为1-2，析出白色沉淀，过滤沉淀，干燥，得到白色固体，即为3α,6β,7α-三羟基-5β-胆烷酸(IV)。
在以上反应示例中，示例性地，R1为甲基(CH3-)、R2为三甲基硅基(-Si(CH3)3)、R3为三甲基硅基(-Si(CH3)3)，因此：
式(2-I)化合物则为3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯；
(3-I)化合物则为3α-羟基-6-酮5β-胆烷酸甲酯；
(I)化合物则为如下结构所示
(II)化合物则为3α,7α-二羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯；
(III)化合物则为3α,6β,7α-三羟基-5β-胆烷酸甲酯；
(IV)化合物则为3α,6β,7α-三羟基-5β-胆烷酸(示例中，总产率达到29％左右)。该总产率为合成3α,6β,7α-三羟基-5β-胆烷酸的总收率，且通过将每步反应的收率相乘得到。
通过以上工艺流程制作α-鼠胆酸可以获得相比于已有的工艺流程的以下优势：
1，各原料均为市售，来源广泛，供应充足。
2，反应条件相对温和、工艺简单，各步反应可通过常规的操作实现。反应从猪去氧胆酸开始，经过6步反应的到产物(α-鼠胆酸)，反应过程易于控制，无需复杂的设备。
以下结合实施例对本申请的α-鼠胆酸的制备方法以及用于制备α-鼠胆酸的中间体及其制备方法作进一步的详细描述。
实施例1
由猪去氧胆酸制作α-鼠胆酸的制备方法，具体参见图1。
一、中间体的制备。
步骤A.3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(A物质)的制备。
向配有干燥冷凝回流管的25mL烧瓶中加入猪去氧胆酸(1.0g,2.5mmol)、15mL无水甲醇，浓盐酸100μL，加入完毕后将反应温度升至67℃，搅拌反应4.0h。旋转蒸发除去溶剂甲醇，加20mL乙酸乙酯溶解残留物，依次用10mL饱和NaHCO3溶液和水洗涤。无水MgSO4干燥，过滤，减压浓缩溶剂，得到1.0g白色固体，收率：99％。
产物的核磁共振氢谱和碳谱：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝4.08(s,1H),3.68(s,3H),3.64(s,1H),0.93(d,J＝5.4Hz,6H),0.66(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝174.74,71.58,68.07,56.15,55.94,51.48,48.42,42.85,39.95,39.84,35.96,35.57,35.34,35.01,34.85,31.07,30.09,30.23,29.21,28.10,24.19,23.48,20.76,18.25,12.02。
产物的高分辨率质谱：HRMS:Calcd for C25H42O4[M+Na]+429.2981 Found429.2976。
步骤B.3α-羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯(B物质)的制备。
室温下，将A物质(0.5g，1.23mmol)溶于叔丁醇中，加入IBX(0.52g，1.85mmol)，升温至回流，搅拌反应1.0h，过滤沉淀，用CH2Cl2洗涤，滤液浓缩，残余样品用CH2Cl2溶解，依次用10％的NaHSO3(3×25mL)和饱和食盐水(3×25mL)洗涤，有机相用无水MgSO4干燥，过滤，浓缩，粗品柱层析，V乙酸乙酯:V石油醚＝1:2。得白色固体0.41g，收率为82％。
产物的核磁共振氢谱和碳谱：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝3.68(s,3H),3.66-3.59(m,1H),0.94(d,J＝5.9Hz,3H),0.85(s,3H),0.66(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ213.86,174.66,70.12,60.39,59.42,56.83,55.83,51.49,43.10,42.90,40.03,39.62,37.97,37.07,35.27,34.88,34.39,31.05,30.92,29.85,27.97,23.96,23.15,20.84,18.23,14.17,11.95。
产物的高分辨率质谱：HRMS:Calcd for C25H40O4[M+Na]+427.2825,Found427.2814。
步骤C.中间体(C物质)的制备
将B物质(0.50g,1.24mmol)加入到烧瓶中，再加10mL新蒸的DCM(二氯甲烷)溶剂，在氮气保护下搅拌至原料全部溶解，并冷却至-16℃。向反应瓶中一次性加入干燥三乙胺(2.57mL,18.54mmol)反应体系在-16℃搅拌10-30min，然后向反应体系中滴加三氟甲磺酸三甲基硅酯(1.31mL,7.12mmol)，滴加时间为5min，在该温度下保温搅拌1.0h后，薄层色谱法TLC(V乙酸乙酯:V石油醚＝1:4)监控原料转化完全。向反应体系中加入饱和NaHCO3溶液(10mL)，有机相分别用饱和NaHCO3溶液、水洗至中性，将得到的有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，有机相在减压下蒸除，得到0.68g淡黄色油状液体中间体。该中间体作为产物能够在无需纯化的情况下，直接投入下一步用以合成3α,7α-二羟基-6-氧代-5β-胆烷酸甲酯。
因此，在一些示例中，中间体(C物质)的制备步骤—步骤C—以及3α,7α-二羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯(第一物质)的制备步骤—下述步骤1—能够合并在共同的反应容器内通过现有反应操作，而无需将中间体分离提纯。
二、α-鼠胆酸的制备。
步骤1、3α,7α-二羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯(第一物质)的制备。
将间氯过氧苯甲酸(0.32g,1.85mmol)和碳酸氢钠(0.46g,5.44mmol)悬浮在二氯甲烷(10mL)溶液中，不断搅拌中冷却至0℃，然后将中间体(C物质)(0.68g,1.23mmol)的二氯甲烷(4mL)溶液缓慢加入其中，滴加完之后在该温度下继续搅拌1.0h，TLC(V乙酸乙酯:V石油醚＝1:1)监测反应进程，反应结束后，向反应体系中加入饱和Na2SO3溶液(10mL)淬灭反应，水相用乙酸乙酯(3×10mL)萃取，合并有机相，依次用饱和Na2SO3溶液(2×10mL)，1M HCl溶液(3×10mL)，饱和食盐水(3×5mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得粗品，经硅胶柱层析纯化(V乙酸乙酯:V石油醚＝1:4)，得白色固体0.28g，收率54％。
产物的核磁共振氢谱和碳谱：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:3.90(d,J＝4.0Hz,1H),3.67(s,4H),0.94(d,J＝6.7Hz,3H),0.91(s,3H),0.68(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ:215.88,174.76,75.48,68.05,55.43,51.53,49.03,42.60,40.44,39.27,38.92,35.32,32.99,31.43,31.00,30.94,30.18,29.69,29.20,28.01,23.80,22.54,20.96,18.29,11.63。
产物的高分辨率质谱：HRMS:calcd for C25H40O5[M+Na]+443.2774,Found:443.2764。
步骤2、3α,6β,7α-三羟基-5β-胆烷酸甲酯(第二物质)的制备。
将第一物质(0.20g,0.48mmol)加入到25mL的圆底烧瓶中，加入甲醇(10mL)搅拌溶解，降温至0℃，分批加入硼氢化钠(0.09g,2.38mmol)，加毕，反应体系升至室温下搅拌反应，薄层色谱法TLC监控反应(V乙酸乙酯:V石油醚＝1:1)。反应完成后，分别加入水(10mL)和乙酸乙酯(10mL)，充分搅拌后静置分层，分出有机相，水相用乙酸乙酯(2×10mL)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠(3×15mL)和饱和食盐水(3×15mL)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得白色固体0.15g，收率74％。
产物的核磁共振氢谱和碳谱：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:3.71(d,J＝4.6Hz,2H),3.55-3.45(m,1H),1.09(s,3H),0.95(d,J＝6.4Hz,3H),0.70(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ:174.86,76.40,72.72,71.50,55.82,51.54,49.94,47.87,42.65,39.56,36.15,35.78,35.36,35.06,34.79,32.83,31.00,30.11,28.18,25.34,23.66,20.45,18.32,11.75。
产物的高分辨率质谱：HRMS:Calcd for C25H42O5[M+Na]+445.2930,Found445.2927。
步骤3、3α,6β,7α-三羟基-5β-胆烷酸(α-鼠胆酸)的制备。
室温下，将第二物质(0.20g，0.47mmol)加入到25mL的圆底烧瓶中，加入甲醇(10mL)和水(2mL)的混合溶液搅拌溶解，加入氢氧化钠(0.09g，2.37mmol)，回流搅拌2.0h，浓缩甲醇，加入水(3mL)稀释，然后用1M盐酸调pH至1～2，析出白色沉淀，过滤，干燥，得白色固体0.17g，收率89％。该收率由如下式计算获得：
0.17/(0.47×408.2876/1000)×100％＝88.6％。
产物的核磁共振氢谱和碳谱：1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ:3.66(d,J＝5.2Hz,2H),3.46-3.35(m,1H),1.09(s,3H),0.99(d,J＝6.4Hz,3H),0.74(s,3H).13C NMR(101MHz,MeOH-d4)δ:176.79,76.35,71.61,71.15,55.96,49.70,47.52,42.25,39.61,35.92,35.76,35.39,34.94,34.58,32.48,30.96,30.60,29.60,27.84,24.57,23.25,20.21,17.42,10.74。
产物的高分辨率质谱：HRMS:Calcd for C24H40O5[M+Na]+431.2774,Found431.2767。
实施例2
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤A中，催化剂为浓硫酸。
在装置有磁力搅拌装置，温度计和回流冷凝管的50mL烧瓶中加入3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸(猪去氧胆酸)1.0g，加入无水甲醇15mL，开动磁力搅拌，加入质百分比浓度为36％-38％的浓硫酸100μL，搅拌溶解后，搅拌下加热至67℃进行酯化反应4小时，停止加热，冷却至室温，蒸除甲醇，残余物中加入乙酸乙酯30mL，溶解后乙酸乙酯层依次用10mL饱和NaHCO3溶液和20mL饱和食盐水洗涤，在经过无水硫酸镁干燥后，过滤除去干燥剂，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，得到白色固体3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯1.0g，收率98.5％。
实施例3
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤A中，催化剂位为对甲苯磺酸。
在装置有磁力搅拌装置，温度计和回流冷凝管的50mL三颈烧瓶中加入3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸(1.0g，2.5mmol)，加入无水甲醇15mL，开动磁力搅拌，加入对甲苯磺酸一水合物(0.95g，5.0mmol)，搅拌溶解后，搅拌下加热至67℃进行酯化反应4小时，停止加热，冷却至室温，蒸除甲醇，残余物中加入乙酸乙酯30ml，溶解后乙酸乙酯层依次用10mL饱和NaHCO3溶液和20ml饱和食盐水洗涤，在经过无水硫酸镁干燥后，过滤除去干燥剂，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，得到白色固体3α,6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯0.97g，收率95.5％。
实施例4
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤B中，2-碘酰基苯甲酸的用量为1.48mmol。
将化合物3α，6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(0.5g，1.23mmol)溶于叔丁醇中，加入2-碘酰基苯甲酸(0.41g，1.48mmol)，升温至回流，搅拌反应1.0h，过滤除去沉淀，用CH2Cl2洗涤沉淀，收集滤液并浓缩得到残余样品，残余样品用CH2Cl2溶解，并依次用质量分数为10％的NaHSO3(3×25mL)和饱和食盐水(3×25mL)洗涤，有机相用无水MgSO4干燥除水，过滤除去无水MgSO4，浓缩得到粗品，粗品经柱层析分离，洗脱液为体积比为1﹕2的乙酸乙酯和石油醚，分离得白色固体0.40g，为化合物3α-羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯，收率为80％。
实施例5
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤B中，2-碘酰基苯甲酸的用量为1.60mmol。
将化合物3α，6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(0.5g，1.23mmol)溶于叔丁醇中，加入2-碘酰基苯甲酸(0.45g，1.60mmol)，升温至回流，搅拌反应1.0h，过滤除去沉淀，用CH2Cl2洗涤沉淀，收集滤液并浓缩得到残余样品，残余样品用CH2Cl2溶解，并依次用质量分数为10％的NaHSO3(3×25mL)和饱和食盐水(3×25mL)洗涤，有机相用无水MgSO4干燥除水，过滤除去无水MgSO4，浓缩得到粗品，粗品经柱层析分离，洗脱液为体积比为1﹕2的乙酸乙酯和石油醚，分离得白色固体0.38g，为化合物3α-羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯，收率为72％。
实施例6
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤B中，2-碘酰基苯甲酸的用量为1.85mmol。
将化合物3α，6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(0.5g，1.23mmol)溶于叔丁醇中，加入2-碘酰基苯甲酸(0.516g，1.85mmol)，升温至回流，搅拌反应1.0h，过滤除去沉淀，用CH2Cl2洗涤沉淀，收集滤液并浓缩得到残余样品，残余样品用CH2Cl2溶解，并依次用质量分数为10％的NaHSO3(3×25mL)和饱和食盐水(3×25mL)洗涤，有机相用无水MgSO4干燥除水，过滤除去无水MgSO4，浓缩得到粗品，粗品经柱层析分离，洗脱液为体积比为1﹕2的乙酸乙酯和石油醚，分离得白色固体0.38g，为化合物3α-羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯，收率为75％。
实施例7
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤B中，2-碘酰基苯甲酸的用量为1.23mmol。
将化合物3α，6α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(0.5g，1.23mmol)溶于叔丁醇中，加入2-碘酰基苯甲酸(0.34g，1.23mmol)，升温至回流，搅拌反应1.0h，过滤除去沉淀，用CH2Cl2洗涤沉淀，收集滤液并浓缩得到残余样品，残余样品用CH2Cl2溶解，并依次用质量分数为10％的NaHSO3(3×25mL)和饱和食盐水(3×25mL)洗涤，有机相用无水MgSO4干燥除水，过滤除去无水MgSO4，浓缩得到粗品，粗品经柱层析分离，洗脱液为体积比为1﹕2的乙酸乙酯和石油醚，分离得白色固体0.36g，为化合物3α-羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯，收率为72％。
实施例8
本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：步骤2中，硼氢化钠的用量为0.826mmol。
将化合物3α,7α-二羟基-6-酮-5β-胆烷酸甲酯(50mg，0.119mmol)溶于甲醇(5mL)中，降温至0℃，分批加入硼氢化钠(31.5mg，0.833mmol)，加毕，反应体系缓慢升至室温下搅拌反应，薄层色谱法TLC(V乙酸乙酯﹕V石油醚＝1﹕2)监控。反应结束后，加入蒸馏水(10mL)，加入乙酸乙酯(10mL)，充分搅拌，静置分层，分出有机相，水相用乙酸乙酯(2×10mL)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠(3×15mL)和饱和食盐水(3×15mL)洗涤，无水MgSO4干燥，过滤除去无水MgSO4，浓缩得白色固体41mg，为化合物3α,6β,7α-三羟基-5β-胆烷酸甲酯，收率87.8％。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于制备α-鼠胆酸的中间体，其特征在于，所述中间体具有如下式(I)所示的结构，
其中，R1表示成酯基团，所述成酯基团包括烷基、苄基；
其中，R2、R3表示相同或不同的羟基保护基团，所述羟基保护基团包括三甲基硅基、乙酰基。
2.根据权利要求1所述的用于制备α-鼠胆酸的中间体，其特征在于，所述成酯基团包括直链烷基或支链化的烷基。
3.根据权利要求2所述的用于制备α-鼠胆酸的中间体，其特征在于，所述直链烷基包括甲基、乙基。
4.一种根据权利要求1至3中任意一项所述的用于制备α-鼠胆酸的中间体的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括以猪去氧胆酸为起始物按照下述路径的反应步骤：
其中所述猪去氧胆酸具有如式(1-I)所示的结构。
5.根据权利要求4所述的用于制备α-鼠胆酸的中间体的合成方法，其特征在于，步骤a包括：式(1-I)化合物在酸性环境中通过酯化反应得到式(2-I)化合物；
或者，步骤b包括：选择性氧化式(2-I)化合物的6位羟基为羰基得到式(3-I)化合物；
或者，步骤c包括：在碱性条下，分别使式(3-I)化合物的3位羟基发生醇羟基取代反应、6位酮羰基发生烯醇化以及醇羟基取代反应得到式(I)化合物。
6.一种α-鼠胆酸的制备方法，其特征在于，以权利要求1至3中任意一项所述的中间体作为原料进行反应，且所述制备方法包括氧化式(I)化合物获得式(II)化合物的氧化步骤，再通过还原和水解制备：
7.根据权利要求6所述的α-鼠胆酸的制备方法，其特征在于，所述氧化步骤是在冷却条件下反应的；
可选地，氧化步骤在0℃进行。
8.根据权利要求6所述的α-鼠胆酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将式(II)化合物的6位羰基还原得到式(III)化合物，以及由式(III)化合物水解得到式(IV)化合物；
9.根据权利要求8所述的α-鼠胆酸的制备方法，其特征在于，由式(II)化合物反应制备式(III)化合物的步骤是由0℃加热至室温并保持在室温下进行的。
10.根据权利要求8所述的α-鼠胆酸的制备方法，其特征在于，由式(III)化合物反应制备式(IV)化合物的步骤是60～80℃的温度下进行的。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110878113A (zh) * | 2019-11-07 | 2020-03-13 | 成都贝诺科成生物科技有限公司 | 一种具有抗菌活性的胆酸衍生物及其药用组合物 |
| CN113336818A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-09-03 | 中山百灵生物技术股份有限公司 | 一种α-鼠胆酸的制备方法 |
| CN114634543A (zh) * | 2022-04-22 | 2022-06-17 | 华南理工大学 | α-鼠胆酸的制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106749469A (zh) * | 2016-12-08 | 2017-05-31 | 青州市欣泰生物制品有限公司 | 一种熊去氧胆酸的制备方法 |
| CN107245089A (zh) * | 2017-02-22 | 2017-10-13 | 厦门海乐景生化有限公司 | 一种奥贝胆酸的制备方法 |
| WO2017207648A1 (en) * | 2016-05-31 | 2017-12-07 | Bionice, S.L.U | Process and intermediates for the preparation of obeticholic acid and derivatives thereof |
| CN109369765A (zh) * | 2018-12-10 | 2019-02-22 | 华南理工大学 | 一种鼠胆酸的制备方法 |
-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017207648A1 (en) * | 2016-05-31 | 2017-12-07 | Bionice, S.L.U | Process and intermediates for the preparation of obeticholic acid and derivatives thereof |
| CN106749469A (zh) * | 2016-12-08 | 2017-05-31 | 青州市欣泰生物制品有限公司 | 一种熊去氧胆酸的制备方法 |
| CN107245089A (zh) * | 2017-02-22 | 2017-10-13 | 厦门海乐景生化有限公司 | 一种奥贝胆酸的制备方法 |
| CN109369765A (zh) * | 2018-12-10 | 2019-02-22 | 华南理工大学 | 一种鼠胆酸的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| A FACILE ROUTE TO URSODEOXYCHOLIC ACID BASED ON STEREOCONTROLLED: "A Facile Route to Ursodeoxycholic Acid Based on Stereocontrolled Conversion and Aggregation Behavior Research", 《SYNTHESIS》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110878113A (zh) * | 2019-11-07 | 2020-03-13 | 成都贝诺科成生物科技有限公司 | 一种具有抗菌活性的胆酸衍生物及其药用组合物 |
| CN110878113B (zh) * | 2019-11-07 | 2021-02-02 | 成都贝诺科成生物科技有限公司 | 一种具有抗菌活性的胆酸衍生物及其药用组合物 |
| CN113336818A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-09-03 | 中山百灵生物技术股份有限公司 | 一种α-鼠胆酸的制备方法 |
| CN114634543A (zh) * | 2022-04-22 | 2022-06-17 | 华南理工大学 | α-鼠胆酸的制备方法 |
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