CN109355323A - 一种低温复合脂肪酶在酯交换中提高甘油酯型ω-3脂肪酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食用油脂工程领域，具体地，本发明涉及一种低温复合脂肪酶在酯交换中提高甘油酯型ω‑3脂肪酸含量的方法。该复合脂肪酶包括Lipozyme TL IM、猪胰脂酶和一种米根霉来源的脂肪酶基因Lip9852及其基因重组培养后表达和纯化的低温脂肪酶，三者质量比依次为1～5：1～8：1～9。本发明采用复合脂肪酶进行复配，应用于含有ω‑3脂肪酸的油脂的酯交换反应中，酯交换温度为10‑35℃，可以将甘油酯型油脂的ω‑3脂肪酸总含量提高50%以上。本发明降低了酶解温度，提高了酶解效率，具有节能和高效等特点，可满足工业化生产要求，经济效益和市场前景广阔。

Description

一种低温复合脂肪酶在酯交换中提高甘油酯型ω-3脂肪酸含 量的方法

技术领域

本发明涉及食用油脂工程领域，具体地，本发明涉及一种低温复合脂肪酶在酯交换中提高甘油酯型ω-3脂肪酸含量的方法。

背景技术

深海鱼油、微微藻油和亚麻籽油等天然油脂中富含二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和α-亚麻酸等ω-3脂肪酸，具有许多对人体有益的生理功能。天然油脂产品中ω-3脂肪酸在深海鱼油、微微藻油和亚麻籽油中是甘油酯型类型，它性质稳定，不易氧化，食用风味较好，而且容易被人体消化吸收，但ω-3脂肪酸含量相对较低。将天然甘油酯型油脂（如鱼油和微藻油）经过甲酯或乙酯酯化合成的甲酯和/或乙酯型油脂，EPA和DHA的可以达到较高的含量，但是可能存在食品安全隐患，同时甲酯和/或乙酯型油脂在人体内的消化吸收率低于甘油酯型油脂；而脂肪酸的直接食用对人体有害，风味也不易被人们接受，口感差，容易出现酸味。因而，研究含有ω-3脂肪酸的甘油酯型油脂与ω-3脂肪酸含量更高的甲酯和/或乙酯型油脂或脂肪酸进行酯交换，从而使大量的ω-3脂肪酸（如EPA和DHA）等经过酯化反应，富集到甘油酯上，可以一举两得地解决了EPA和DHA含量低与人体吸收率低的问题。

利用脂肪酶催化酯交换技术制备各类ω-3脂肪酸产品，刘书成、张超桦、洪鹏志等人（CN 101161819）提出了一种酶法制备ω-3脂肪酸（ω-3PUFA）海洋甘油酯的方法，包括ω-3PUFA浓缩物的制备、脂肪酶催化ω-3PUFA与甘油合成反应、萃取分离ω-3PUFA海洋甘油酯的工艺步骤；马永钧、杨博、范海星等人（CN 101818176）提出了脂肪酸乙酯转化为甘油酯的方法，包括转化步骤、分子蒸馏分离制备甘油酯型产物的工艺步骤；陈洁、何志勇、陈小娥等人（CN 101348807）提出了一种从鱼油中富集ω-3脂肪酸甘油酯的方法，包括鱼油的化学水解、EPA及DHA的分离纯化、脂肪酶催化合成EPA甘油酯和DHA甘油酯的工艺步骤。刑华斌、张肖、杨启炜等人（CN 103396303 A）发明了一种以离子液体或离子液体-极性溶剂组成的二元混合溶剂为萃取剂，分馏萃取酯型微微藻油或鱼油的脂肪酸混合物，得到纯度较高的EPA、DHA型脂肪酸；丁辉、齐金龙（CN 105001997 A）以离子液体为催化剂，以鱼油等动植物油脂与甲醇为原料，将油脂预处理成脂肪酸甲酯型生物柴油，并通过电磁波减压精馏耦合技术，得到高纯度的EPA、DHA的脂肪酸甲酯。上述专利的酯交换反应体系是以各种商品化的脂肪酶，在反应温度为40-60℃进行酯交换反应。

本发明将几种1、3 位置特异性脂肪酶进行复配，包括Lipozyme TL IM、 猪胰脂酶和一种来自于米根霉的脂肪酶基因Lip9852及其基因重组培养表达的低温脂肪酶，将其应用于酯交换反应。其中，经过进一步基因克隆与表达方获得高效脂肪酶米根霉脂肪酶是一种来源于丝状真菌的无毒性的脂肪酶，具有良好的1、3 位置特异性和低温催化特性，因此在酯交换反应温度控制在40℃以下，可以达到提高反应产物中甘油酯型油脂的ω-3脂肪酸的含量的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种低温复合脂肪酶在酯交换中提高甘油酯型ω-3脂肪酸含量的方法。本发明所提供的脂肪酶反应温度为10℃～35℃。该方法能够完善现有技术存在的反应温度高、能耗高、得率低等缺点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种低温复合脂肪酶，所述低温复合脂肪酶包括固定化脂肪酶（Lipozyme TL IM）、 猪胰脂酶和低温脂肪酶，其质量比依次为1～5：1～8：1～9。

所述低温脂肪酶，制备方法为：

一种来源于米根霉的脂肪酶Lip9852培养表达的或者包含该基因的重组载体和重组菌株培养表达的、经过回收纯化后的低温脂肪酶，脂肪酶Lip9852其氨基酸序列可从NCBI数据库中获得（登录号：EIE75333），如SEQ ID NO.1所示。脂肪酶Lip9852总共含390个氨基酸，N端26个氨基酸为信号肽，理论分子量为 42.01 kDa ，理论等电点为 5.08。其作用于酯交换的最佳反应温度为20℃。

重组载体，优选为pPICZαC-Lip9852。

重组菌株，优选所述菌株为酵母菌、芽孢杆菌、丝状真菌和大肠杆菌。

制备低温脂肪酶的方法，包括以下步骤：

（1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

(2) 培养重组菌株，诱导重组脂肪酶表达；

(3) 回收并纯化所表达的低温脂肪酶。

其中，优选所述宿主细胞为酵母，优选将重组表达质粒转化毕赤酵母X33中，得到重组菌株X33/ Lip9852。

一种低温复合脂肪酶在酯交换中提高甘油酯型ω-3脂肪酸含量的方法， 包括如下步骤：

（1）将原料1含有ω-3脂肪酸的甘油酯型油脂与原料2含有ω-3脂肪酸的甲、乙酯型或脂肪酸型油脂搅拌混匀，得到混合油脂，再加入低温复合脂肪酶；

（2）在低温，常压、真空、超临界流体或充惰性气体等条件下反应5min-48h；

（3）反应终止后，分离产物，得到富含ω-3脂肪酸的甘油酯型油脂。

所述进行酯交换反应的原料1甘油酯型油脂与原料2甲、乙酯型或脂肪酸型油脂，两者质量比为1~6:1~8，优选质量比为2：3；其中原料2的ω-3脂肪酸总含量不小于原料1的ω-3脂肪酸总含量，优选原料2的ω-3脂肪酸总含量比原料1的ω-3脂肪酸总含量大于5%以上。

复合脂肪酶的添加量为1-20U/g原料混合油脂质量， 优选复合脂肪酶的添加量为8U/g原料混合油脂质量；

酯交换的反应温度为10-35℃，优选反应温度为25℃。

优选搅拌速度为270-600rpm/min。

本发明的有益效果：

（1）本发明通过添加复合脂肪酶，降低了酯交换温度，提高了脂肪酶催化ω-3脂肪酸的油酯交换反应得率，将原料油甘油酯ω-3脂肪酸含量提高了50%以上。

（2）本发明操作简便、生产耗能与成本低，而且是建立在常规生产的工艺步骤上，可行性度高，为新一代的ω-3脂肪酸保健品的进一步开发、应用和工业化生产提供一个高效有利的技术手段。

（3）本发明生产的鱼油可应用于食品、医药、饲料等多个领域，市场前景广阔，经济效益高，这对于高效利用深海鱼油和微藻油资源具有积极的现实意义。

具体实施方式

实施例1 低温脂肪酶的制备方法

试验材料和试剂

1、菌株及载体：大肠杆菌(Escherichia coli) TransⅠ-T1和BL21(DE3) 购于北京TransGen公司，载体pET-28a(+)和pMD19-T 载体分别购于美国Novagen公司和日本TaKaRa公司。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、DNA聚合酶号和dNTPs购于日本TaKaRa公司。基因组提取试剂盒购于北京Tiangen公司，纯化及质粒提取试剂盒购于美国OMEGA公司。对硝基苯酚（pNP）、对硝基苯酯类（pNP-esters）购于美国Sigma公司；蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)为英国OXOID公司产品，其余试剂为国产分析纯。

3、培养基：

（1）LB培养基（g/l）：酵母粉 5.0，蛋白胨10.0， NaCl 10.0， 用1M的碳酸钠调pH至9.6。

（2）LB固体培养基（g/l）：酵母粉 5.0，蛋白胨10.0， NaCl 10.0， 琼脂15.0，用1 M的碳酸钠调pH至9.6。

（3）PDA 液体培养基：马铃薯去皮200 g，切成小块，加入适量蒸馏水并煮沸半个小时，用8层纱布过滤，加入20 g葡萄糖，定容至1000mL ，于121℃灭菌30 min。

（4）PDA固体培养基：即在PDA液体培养基中加入琼脂粉使其终浓度为2%，于121℃灭菌30 min。

具体制备方法：

根据米根霉全基因组测序的信息，采用序列比对及保守区等生物信息学分析，鉴定得到一个脂肪酶基因，命名为lip9852，该基因的序列在NCBI数据库的登录号为 CH476732。经序列分析发现该基因无内含子序列。此外，该基因编码的蛋白序列经预测其N端前26个氨基酸为信号肽序列（其氨基酸序列可从NCBI数据库中获得（登录号：EIE75333），如SEQ IDNO.1所示）。因此，本专利构建表达载体时所表达的基因序列是去掉信号肽的成熟蛋白所对应的基因序列。因该基因无内含子，可以直接用米根霉的基因组DNA作为模板，以在5’和3’端分别引入了EcoRI和 XbaI酶切位点的引物Lip9852-m-F：GATGAATTCGATTCCTGTCTCTAGTAAAACGCATG和Lip9852-m-R：CTTTCTAGAAAGAGCAATCACCTTCATCAATACC进行PCR 扩增。PCR 反应参数为：94℃预变性5 min； 94℃变性30 sec， 53℃退火30 sec，72℃延伸2 min，30个循环，72℃保温5 min。将表达载体pPICZαC进行双酶切 (EcoRI+ XbaI)，同时将编码脂肪酶的基因Lip9852双酶切(EcoRI+ XbaI)，切好的编码成熟脂肪酶的基因片段与表达载体pPICZα C连接并转化大肠杆菌Top 10，获得含有脂肪酶基因lip9852的重组质粒pPICZαC- lip9852。

大量制备重组表达质粒pPICZαC- lip9852并用PmeI单酶切线性化，电击转化至毕赤酵母Pichia pastoris X33感受态细胞，涂板于含100ug/ml Zeocin的YPDS平板上，30℃培养2-3天，筛选重组毕赤酵母菌株。根据毕赤酵母表达手册，将生长状态良好的重组子挑到BMGY液体培养基中，30°C，200 r/min振荡培养48 h 后，将菌体离心更换至BMMY液体培养基，30°C，200 r/min振荡培养120 h，并且每12h添加0.5%（v/v）甲醇进行诱导表达，表达产物即为低温脂肪酶。

为纯化带有组氨酸标记的重组蛋白Lip9852，首先将诱导培养的菌液离心（13，000×g，4℃离心 10 min)，使用中空纤维将上清液进一步浓缩，并将浓缩液进行硫酸铵分级沉淀，用pH7.6的Tris-HCl缓冲溶液将菌体悬浮。随后将悬浮的浓缩液装入透析袋，用pH7.60.02 M Tris-HCl过夜透析，并更换一次缓冲液，除去硫酸铵。最后，将透析好的酶液过镍柱，并使用含终浓度20-300mM咪唑的Tris-HCl缓冲液（20mM Tris-HCl，500mM NaCl，10%甘油，pH7.6）进行梯度洗脱，最终得到所述低温脂肪酶。SDS-PAGE结果表明，重组脂肪酶在毕赤酵母X33中得到了表达。所表达的木聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的95％以上。

实施例2：

一种用复合脂肪酶催化酯化富集鱼油ω-3脂肪酸的方法，包括如下步骤：

（1）将60g甘油酯型鱼油（ω-3脂肪酸含量为28%）与40g乙酯型鱼油（ω-3脂肪酸含量为70%）搅拌混匀得到混合鱼油；在搅拌速度270rpm的条件下，加入质量相当于混合鱼油质量10U/g的复合脂肪酶，复合脂肪酶中Lipozyme TL IM、猪胰脂酶和米根霉来源的低温脂肪酶质量比依次为2：3：5；

（2）在温度为25℃，氮气条件下，反应12小时；

（3）通过过滤、离心、蒸馏处理得到的鱼油甘油酯，其ω-3脂肪酸含量为55%。

实施例3：

一种用复合脂肪酶催化酯化富集鱼油ω-3脂肪酸的方法，包括如下步骤：

（1）将40g甘油酯型鱼油（ω-3脂肪酸含量为28%）与60g脂肪酸型鱼油（ω-3脂肪酸含量为80%）搅拌混匀得到混合鱼油；在搅拌速度270rpm的条件下，加入质量相当于混合鱼油质量5U/g的复合脂肪酶，复合脂肪酶中Lipozyme TL IM、 猪胰脂酶和米根霉来源的低温脂肪酶质量比依次为3：2：5；

（2）在温度为30℃，氮气条件下，反应24小时；

（3）通过过滤、离心、蒸馏处理得到的鱼油甘油酯，其ω-3脂肪酸含量为58%。

实施例4：

一种用复合脂肪酶催化酯化富集油脂ω-3脂肪酸的方法，包括如下步骤：

（1）将50g甘油酯型鱼油（ω-3脂肪酸含量为28%）与50g甲酯型微藻油（ω-3脂肪酸含量为80%）搅拌混匀得到原料混合油脂；在搅拌速度400rpm的条件下，加入质量相当于原料混合油脂质量8U/g的复合脂肪酶，复合脂肪酶中Lipozyme TL IM、猪胰脂酶和米根霉来源的低温脂肪酶质量比为3：3：4；

（2）在温度为25℃，抽真空条件下，反应12h；

（3）通过过滤、离心、蒸馏处理得到的甘油酯产品，其ω-3脂肪酸含量为65%。

实施例5：

一种用复合脂肪酶催化酯化富集微藻油ω-3脂肪酸的方法，包括如下步骤：

（1）将40g甘油酯型微藻油（ω-3脂肪酸含量为50%）与60g甲酯型微藻油（ω-3脂肪酸含量为80%）搅拌混匀得到原料混合油脂；在搅拌速度600rpm的条件下，加入质量相当于原料混合油脂质量8U/g的复合脂肪酶，复合脂肪酶中Lipozyme TL IM、猪胰脂酶和米根霉来源的低温脂肪酶质量比为3：4：3；

（2）在温度为25℃，常压条件下，反应24h；

（3）通过过滤、离心、蒸馏处理得到的微藻油甘油酯，其ω-3脂肪酸含量为70%。

实施例6：

一种用复合脂肪酶催化酯化富集微藻油ω-3脂肪酸的方法，包括如下步骤：

（1）将50g甘油酯型微藻油（ω-3脂肪酸含量为50%）与50g脂肪酸型微藻油（ω-3脂肪酸含量为80%）搅拌混匀得到原料混合油脂；在搅拌速度600rpm的条件下，加入质量相当于原料混合油脂质量8U/g的复合脂肪酶，复合脂肪酶中Lipozyme TL IM、 猪胰脂酶和米根霉来源的低温脂肪酶质量比为1：4：5；

（2）在温度为20℃，常压条件下，反应24h；

（3）通过过滤、离心、蒸馏处理得到的微藻油甘油酯，其ω-3脂肪酸含量为70%。

上述方法所得酯交换产品甘油酯中ω-3脂肪酸的含量均得到显著的提高。而且操作简便、生产耗能与成本低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种低温复合脂肪酶在酯交换中提高甘油酯型ω-3脂肪酸含量的方法

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Val Ser Phe Ile Ser Ile Ser Gln Gly Ile Gly Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Val Phe Ser Phe Ile Leu Gly Ser Ser Ala Ile Pro Val Ser Ser Lys

20 25 30

Thr His Val Val Lys Arg Thr Thr Thr Lys Thr Thr Ser Ala Leu Pro

35 40 45

Ser Leu Ile Thr Ser Arg Cys Ser Pro Pro Thr Ser Thr Gly Ser Ala

50 55 60

Ser Asp Leu Glu Ser Glu Ser Tyr Asn Ile Lys Lys Asn Thr Glu Trp

65 70 75 80

Tyr Thr Ala His Gly Gly Asn Leu Thr Ser Ile Ser Lys Arg Asp Asp

85 90 95

Thr Glu Val Gly Gly Met Thr Leu Asp Leu Pro Ser Asp Ala Pro Ser

100 105 110

Ile Glu Ala Ser Asp Ser Thr Ala Asn Ala Ser Glu Asp Glu Val Val

115 120 125

Thr Ala Ser Ala Ala Gln Val Glu Val Leu Thr Met Tyr Ala Gly Val

130 135 140

Ala Ser Thr Gly Tyr Cys Lys Ser Val Val Pro Gly Asn Ser Trp Asn

145 150 155 160

Cys Thr Gln Cys Leu Lys Trp Val Pro Asp Gly Lys Val Val Thr Ser

165 170 175

Phe Thr Ser Thr Leu Ser Asp Thr His Gly Phe Ile Leu Arg Ser Asp

180 185 190

Glu Gln Glu Thr Leu Tyr Val Val Phe Arg Gly Thr Ser Ser Phe Arg

195 200 205

Ser Ala Ile Thr Asp Leu Val Phe Val Phe Thr Asp Tyr Thr Pro Val

210 215 220

Asp Gly Ala Lys Val His Ala Gly Phe Tyr Ser Ser Tyr Asn Gln Ile

225 230 235 240

Val Asp Asp Tyr Phe Pro Ile Leu Gln Asp Gln Leu Thr Ala Tyr Pro

245 250 255

Ser Tyr Gln Val Ile Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala

260 265 270

Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Ser Arg Leu Ser Ser

275 280 285

Lys Asn Leu Ser Ile Tyr Thr Val Gly Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro

290 295 300

Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ser Thr Gly Ile Pro Phe Tyr Arg Ser

305 310 315 320

Val Asn Lys Arg Asp Ile Val Pro His Val Pro Thr Gln Ala Met Gly

325 330 335

Phe Leu His Pro Gly Val Glu Ser Trp Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn

340 345 350

Val Gln Ile Cys Thr Ala Glu Ile Glu Thr Lys Tyr Cys Ser Asn Ser

355 360 365

Ile Val Pro Phe Thr Ser Ile Ser Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile

370 375 380

Asp Glu Gly Asp Cys Ser

385 390

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatgaattcg attcctgtct ctagtaaaac gcatg 35

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctttctagaa agagcaatca ccttcatcaa tacc 34

Claims (5)

1.一种低温复合脂肪酶，其特征在于：所述低温复合脂肪酶包括Lipozyme TL IM、猪胰脂酶和低温脂肪酶，其质量比依次为1～5：1～8：1～9。

2.根据权利要求1所述的一种低温复合脂肪酶，其特征在于：所述的低温脂肪酶制备方法：通过来源于米根霉的脂肪酶Lip9852培养表达的或者包含该基因的重组载体和重组菌株培养表达的、经过回收纯化后的低温脂肪酶，脂肪酶Lip9852的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.一种低温复合脂肪酶在酯交换中提高甘油酯型ω-3脂肪酸含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将原料1含有ω-3脂肪酸的甘油酯型油脂与原料2含有ω-3脂肪酸的甲、乙酯型或脂肪酸型油脂搅拌混匀，得到混合油脂，再加入低温复合脂肪酶；

（2）在低温，常压、真空、超临界流体或充惰性气体条件下反应5min-48h；

（3）反应终止后，分离产物，得到富含ω-3脂肪酸的甘油酯型油脂。

4.根据权利要求3所述的一种低温复合脂肪酶在酯交换中提高甘油酯型ω-3脂肪酸含量的方法，其特征在于：所述原料1：甘油酯型油脂与原料2：甲、乙酯型或脂肪酸型油脂，两者质量比为1~6:1~8，其中原料2中的ω-3脂肪酸总含量不小于原料1中的ω-3脂肪酸总含量。

5.根据权利要求3所述的一种低温复合脂肪酶在酯交换中提高甘油酯型ω-3脂肪酸含量的方法，其特征在于：低温复合脂肪酶的添加量为1-10U/g原料混合油脂质量，酯交换的反应温度为10-35℃。