发明详述
本发明描述了Schizochytrium sp.的新型三功能域基因,它编码具有三种不同酶活性:即八氢番茄红素脱氢酶(PD),八氢番茄红素合酶(PS),和番茄红素环化酶(LC)的蛋白质。该多功能蛋白质的发现提供了一种用于经济型产生类胡萝卜素的新方法。例如,现在可以克隆和表达具有三个关键连续酶功能的一个基因而不是从其它生物体的类胡萝卜素生物合成途径克隆2,3或4个基因,这极大地方便了对产生型生物体的遗传修饰。另外,可以单独或以各种组合使用Schizoclaytriurn CS基因的酶结构域来构建表达一个,两个,或所有三个结构域的各种重组/合成基因。
更具体地说,本发明一般涉及一种分离的基因,本文称为胡萝卜素合酶基因,且涉及其同源物,涉及由该基因编码的酶或其生物活性部分及其同源物,涉及含有该基因的重组核酸分子,涉及用该基因转化的微生物和植物及其后代,涉及遗传修饰成增加或减少了该基因作用的Schizochytrium和其它Thraustochytrid生物,涉及通过在有效产生类胡萝卜素的条件下培养上述微生物或植物产生类胡萝卜素及其衍生物的方法。
本发明人鉴定了Schizochytrium sp.中与类胡萝卜素生物合成途径相关的一个基因。该基因编码含有三个不同区域(结构域)的单个多肽。比较这三个结构域推定的氨基酸序列与公开获得的数据库表明这些结构域具有下列酶活性(从推断的N-末端到C-末端依次列出):八氢番茄红素脱氢酶(PD),八氢番茄红素合酶(PS)和番茄红素环化酶(LC)。根据确定的类胡萝卜素生物合成的代谢途径系统,这三个酶活性可完成从牻牛儿基牻牛儿焦磷酸向β-胡萝卜素的转化(例如,见图1)。这里,本发明人将本发明的胡萝卜素合酶(CS)基因定义为编码具有PD,PS和LC结构域的酶的核酸序列。应明白酶(活性)名称“八氢番茄红素脱氢酶”和“八氢番茄红素去饱和酶”可以互换且本文任何提及的“八氢番茄红素脱氢酶”或“PD”均包括提及的称为“八氢番茄红素去饱和酶”的酶和活性。
尽管已经鉴定,克隆和测序了许多编码类胡萝卜素途径的酶的基因,但是据本发明人所知,从Schizochytrium-或Thraustochytriales目的任一成员克隆和鉴定与该途径相关的基因还是首次。另外,据本发明人所知,在单个多肽中发现类胡萝卜素途径的三个酶功能也是首次。在一个多肽中发现两个类胡萝卜素合成途径的酶功能(具体地说,PS和LC)的例子确实存在,但是没有三个酶功能的例子。
PS,PD和LC是类胡萝卜素生物合成途径中的连续酶。在单个多肽中存在这三个酶功能表明中间产物在该系列反应中的代谢通道作用。已有PS的量增加导致通过类胡萝卜素合成途径的通量显著增加的例子(例如,参见Shewmaker,等,“八氢番茄红素合酶的种子特异性过表达:增加类胡萝卜素和其它代谢产物”,The Plant Journal 20,401-412(1999))。在异源性宿主或者在Schizochytrium本身中导入(或者增加表达)编码PD,PS和LC酶结构域的Schizochytrium胡萝卜素合酶基因可允许同时提高这三种酶活性。这相对于导入编码这三个功能的两个或三个分离的基因具有明显的优势。预期这些酶活性水平升高可导致在Schizochytrium或异源性宿主中β-胡萝卜素的产量升高,事实上,本发明人表明与对照相比用本发明的胡萝卜素合酶基因转化的Schizochytrium产生的β-胡萝卜素的量增加。这一β-胡萝卜素量的增加本身是有用的,或者增加的β-胡萝卜素水平可用作产生β-胡萝卜素衍生的类胡萝卜素(例如,但不限于,角黄素,玉米黄质或虾青素;参见图2)的底物。本发明人还表明用本发明的胡萝卜素合酶基因转化的Schizochytrium与对照相比产生的虾青素量增加(见实施例)。另外,胡萝卜素合酶基因的修饰可导致产生番茄红素,而番茄红素又可用作产生α-胡萝卜素和叶黄素的底物。
因此,本发明的一个实施方案涉及一种分离的胡萝卜素合酶。本文所用的包括分离的胡萝卜素合酶的分离的蛋白质是指从其天然环境中取出(即,进行了人工操作)的蛋白质(包括多肽或肽)且可包括例如,纯化的蛋白质,部分纯化的蛋白质,重组产生的蛋白质,和合成产生的蛋白质。因此,“分离的”并不反映该蛋白质被纯化的程度。优选的是,本发明的分离的胡萝卜素合酶是重组产生的。另外,作为例子,“Schizochytrium胡萝卜素合酶”是指来自Schizochytrium的胡萝卜素合酶(一般包括天然存在的胡萝卜素合酶的同源物)或者是指根据来自Schizochytrium的天然存在的胡萝卜素合酶的结构(例如,序列)和也许是功能的知识产生的胡萝卜素合酶蛋白质。换句话说,Schizochytrium胡萝卜素合酶包括具有与来自Schizochytrium的天然存在的胡萝卜素合酶基本上相似的结构和功能的任何胡萝卜素合酶或者是本文详细描述的来自Schizochytrium的天然存在的胡萝卜素合酶的生物学活性(即,具有生物学活性的)同源物。因此,Schizochytrium胡萝卜素合酶蛋白可包括纯化的,部分纯化的,重组,突变/修饰的和合成的蛋白质。根据本发明,术语“修饰”和“突变”可交换使用,特别是对于本文所述的胡萝卜素合酶的氨基酸序列(或核酸序列)的修饰/突变。
根据本发明,胡萝卜素合酶的同源物(即,胡萝卜素合酶同源物)包括这样的胡萝卜素合酶,即其中至少一个或几个,但不限于一个或几个,氨基酸缺失(例如,该蛋白质的截短型式,例如肽或片段),插入,颠倒,取代和/或衍生化(例如,通过糖基化,磷酸化,乙酰化,十四烷酰化,异戊二烯化,棕榈酸化,法呢基化,酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇)。在一个优选的实施方案中,胡萝卜素合酶同源物具有可测量或可检测的胡萝卜素合酶活性(即,具有生物学活性)。可测量的或可检测的胡萝卜素合酶活性包括只有一个,或者两个或全部三个本发明的胡萝卜素合酶上的酶结构域(下文详细讨论)的酶活性。在另一实施方案中,胡萝卜素合酶同源物可具有或者没有可测量的胡萝卜素合酶活性,但是用于制备抗体或者形成寡核苷酸用于鉴定其它的胡萝卜素合酶。例如,在实施例中描述了抗胡萝卜素合酶的抗体的产生和用于克隆胡萝卜素合酶的探针和引物的产生。
胡萝卜素合酶同源物可以是天然等位基因变异或天然突变的结果。本发明的胡萝卜素合酶同源物也可使用本领域已知的技术产生,包括,但不限于直接修饰该蛋白质或者使用,例如传统或重组DNA技术进行随机或定向诱变修饰编码该蛋白质的基因。编码胡萝卜素合酶的核酸的天然存在的等位基因变异体是在基因组上与编码SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的基因在基本相同的基因座(或多个基因座)上存在,但是由于例如,突变或重组引起的天然变异而具有相似但不相同的序列的基因。天然等位基因变异体一般编码与所比较的基因编码的蛋白质具有相似活性的蛋白质。一类等位基因变异体可编码相同蛋白质但由于遗传密码的简并性而具有不同核酸序列。等位基因变异体也可在该基因5’或3’非翻译区包含改变(例如,在调控区)。等位基因变异体是本领域的技术人员熟知的。同源物可使用本领域已知的用于产生蛋白质的技术产生,包括,但不限于,直接修饰分离的,天然存在的蛋白质,直接蛋白质合成,或者使用,例如,传统或重组DNA技术进行随机或定向诱变修饰编码该蛋白质的核酸序列。
与野生型蛋白质相比,对胡萝卜素合酶同源物的修饰可增加,减少,或者基本上不改变与天然存在的蛋白质,即胡萝卜素合酶相比,该胡萝卜素合酶同源物的基本生物学活性。一般来说,蛋白质的生物学活性或生物学作用是指体内(即,在该蛋白质的天然生理学环境中)或者体外(即,在实验室条件下)测量或观察到的归因于该蛋白质的天然存在形式的由该蛋白质表现或者完成的任何功能。在诸如同源物或模拟物(下文讨论)中对蛋白质的修饰可产生与天然存在的蛋白质具有相同生物学活性的蛋白质,或者产生与天然存在的蛋白质相比生物学活性降低或提高的蛋白质。导致蛋白质表达下降或者蛋白质活性下降的修饰是指蛋白质的失活(完全或者部分),下调,或者作用下降。同样,导致蛋白质表达增加或者蛋白质活性增加的修饰是指蛋白质的扩增,过度产生,活化,增强,上调或作用提高。
根据本发明的一个实施方案,包括生物学活性同源物或其片段的生物学活性胡萝卜素合酶具有本文所述的野生型,或者天然存在胡萝卜素合酶活性的至少一个特征性生物学活性。胡萝卜素合酶的生物学活性包括上述将牻牛儿基牻牛儿焦磷酸转化成β-胡萝卜素的能力,可包括本文所述的胡萝卜素合酶三个结构域中的任意一种或多个酶活性。根据本发明,本发明的胡萝卜素合酶具有至少一个,且优选两个,且最优选三个酶活性。这些酶活性是:(1)八氢番茄红素脱氢酶(PD)酶活性,(2)八氢番茄红素合酶(PS)酶活性,和(3)番茄红素环化酶(LC)酶活性。一般提及的胡萝卜素合酶生物学活性或酶活性一般是指所有三种酶活性,但是并不排除仅仅是指酶活性中的一种或两种。测量这些酶活性的方法是本领域已知的(例如,参见Fraser和Bramley,Meth.Enzymol.214,365(1993);Camara,Meth.Enzymol.214,352,(1993);Hornero-Mendez和Britton,FEBS Lett.515,133,(2002))。本发明的分离的胡萝卜素合酶也可通过其比活进行鉴定。“比活”是指通过该酶将牻牛儿基牻牛儿焦磷酸转化成β-胡萝卜素的速率。更具体地说,它是指每个时间单位每mg的酶将牻牛儿基牻牛儿焦磷酸转化成β-胡萝卜素的分子数。
根据本发明测量蛋白质表达水平的方法,包括,但不限于:western印迹,免疫细胞化学,流式细胞术或其它基于免疫学的测定法;基于包括,但不限于底物结合的蛋白质特性的测定法。结合测定法也是本领域熟知的。例如,可使用BIAcore机器测定两个蛋白质之间的复合物的结合常数。该复合物的解离常数可通过监测缓冲液通过晶片时折射率对时间的改变来测定(O′Shannessy等,Anal.Biochem.212:457-468(1993);Schuster等,Nature365:343-347(1993))。测量一个蛋白质与另一蛋白质结合的其它合适的测定法包括,例如,诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)的免疫测定法,或者通过荧光,紫外吸收,圆二色性,或核磁共振(NMR)监测该蛋白质的光谱学或光学特性的改变来测定结合。
在一个实施方案中,胡萝卜素合酶(例如,包括从Schizochytrium分离且在本文中详细描述的胡萝卜素合酶的同源物)包括具有至少一种下列活性的蛋白质:(1)八氢番茄红素脱氢酶(PD)酶活性,(2)八氢番茄红素合酶(PS)酶活性,和(3)番茄红素环化酶(LC)酶活性。在本发明的一个实施方案中,分离的胡萝卜素合酶包含选自如下的氨基酸序列:(a)选自SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:3的位置30至1268组成的氨基酸序列,和其生物活性片段中的氨基酸序列;(b)与SEQID NO:3或者与SEQ ID NO:3的位置30至1268组成的氨基酸序列具有至少大约40%相同性的氨基酸序列,其中该氨基酸序列具有下列生物学活性:八氢番茄红素脱氢酶(PD)活性,八氢番茄红素合酶(PS)活性,和番茄红素环化酶(LC)活性;(c)与SEQ ID NO:5具有至少大约40%相同性的氨基酸序列,其中该氨基酸序列具有八氢番茄红素脱氢酶(PD)活性;(d)与SEQ ID NO:7具有至少大约40%相同性的氨基酸序列,其中该氨基酸序列具有八氢番茄红素合酶(PD)活性;或(e)与SEQ ID NO:9具有至少大约40%相同性的氨基酸序列,其中该氨基酸序列具有番茄红素环化酶(LC)活性。
包含所有三个酶结构域和信号序列的本发明的Schizochytrium胡萝卜素合酶的全部氨基酸序列本文以SEQ ID NO:3(由SEQ ID NO:2或者SEQ IDNO:1的位置1406-5212编码)表示。不受理论的约束,本发明人相信SEQ IDNO:3的氨基酸1-29是信号序列,它在某些情况下可裂解产生具有包含SEQID NO:3的位置30至1268的氨基酸序列的胡萝卜素合酶。现在提及的SEQID NO:3,即CS蛋白的第一个结构域,八氢番茄红素脱氢酶(PD)结构域,包含SEQ ID NO:3的氨基酸53至521且本文以SEQ ID NO:5表示。SEQID NO:5由本文以SEQ ID NO:4表示的核酸序列(SEQ ID NO:2的位置157至1563)编码。CS蛋白的第二个结构域,即八氢番茄红素合酶(PS)结构域,包含SEQ ID NO:3的氨基酸586至860且本文以SEQ ID NO:7表示。SEQID NO:7由本文以SEQ ID NO:6表示的核酸序列(SEQ ID NO:2的位置1756至2580)编码。CS蛋白的第三个结构域,即番茄红素环化酶(LC)结构域,包含SEQ ID NO:3的氨基酸911至1132且本文以SEQ ID NO:9表示。SEQ ID NO:5由本文以SEQ ID NO:8表示的核酸序列(SEQ ID NO:2的位置2731至3396)编码。
在本发明的一个方面,胡萝卜素合酶包含在SEQ ID NO:3的至少大约325个氨基酸中与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少大约40%相同性的氨基酸序列。在另一方面,本发明的胡萝卜素合酶包含在至少大约325个氨基酸中与SEQ ID NO:3具有至少45%相同性的氨基酸序列,且在另一方面在SEQ ID NO:3的至少大约325个氨基酸中,且更优选在SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的至少大约350个氨基酸中,且更优选在至少大约375个氨基酸中,且更优选在至少大约400个氨基酸中,且更优选在至少大约500个氨基酸中,且更优选在至少大约600个氨基酸中,且更优选在至少大约700个氨基酸中,且更优选在至少大约800个氨基酸中,且更优选在至少大约900个氨基酸中,且更优选在至少大约1000个氨基酸中,且更优选在至少大约1050个氨基酸中,且更优选在全长中,与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少大约50%,且在另一方面至少大约55%,且在另一方面至少大约60%,且在另一方面至少大约65%,且在另一方面至少大约70%,且在另一方面至少大约75%,且在另一方面至少大约80%,且在另一方面至少大约85%,且在另一方面至少大约90%,且在另一方面至少大约95%的相同性。该蛋白质优选包含选自八氢番茄红素脱氢酶(PD)活性,八氢番茄红素合酶(PS)活性,和番茄红素环化酶(LC)活性的本发明的胡萝卜素合酶的至少一种,两种或全部三种酶活性。
在本发明的一个方面,胡萝卜素合酶包含与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少大约40%相同性的氨基酸序列。在另一方面,本发明的胡萝卜素合酶包含与SEQ ID NO:5具有至少45%的相同性,且在另一方面在SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的全长上与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少大约50%,且在另一方面至少大约55%,且在另一方面至少大约60%,且在另一方面至少大约65%,且在另一方面至少大约70%,且在另一方面至少大约75%,且在另一方面至少大约80%,且在另一方面至少大约85%,且在另一方面至少大约90%,且在另一方面至少大约95%相同性的氨基酸序列。该蛋白质至少包含八氢番茄红素脱氢酶(PD)活性。
在本发明的一个方面,胡萝卜素合酶包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少大约40%相同性的氨基酸序列。在另一方面,本发明的胡萝卜素合酶包含与SEQ ID NO:7具有至少45%的相同性,且在另一方面在SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的全长上与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少大约50%,且在另一方面至少大约55%,且在另一方面至少大约60%,且在另一方面至少大约65%,且在另一方面至少大约70%,且在另一方面至少大约75%,且在另一方面至少大约80%,且在另一方面至少大约85%,且在另一方面至少大约90%,且在另一方面至少大约95%相同性的氨基酸序列。该蛋白质至少包含八氢番茄红素合酶(PS)活性。
在本发明的一个方面,胡萝卜素合酶包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少大约40%相同性的氨基酸序列。在另一方面,本发明的胡萝卜素合酶包含与SEQ ID NO:9具有至少45%的相同性,且在另一方面在SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的全长上与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少大约50%,且在另一方面至少大约55%,且在另一方面至少大约60%,且在另一方面至少大约65%,且在另一方面至少大约70%,且在另一方面至少大约75%,且在另一方面至少大约80%,且在另一方面至少大约85%,且在另一方面至少大约90%,且在另一方面至少大约95%相同性的氨基酸序列。该蛋白质至少包含番茄红素环化酶(LC)活性。
在本发明的一个实施方案中,根据本发明的胡萝卜素合酶同源物具有与SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9中任一个有至少大约100%相同性的氨基酸序列。在本发明的另一方面,根据本发明的胡萝卜素合酶同源物具有与任一上面限定的氨基酸序列有至少大约99%相同性,且在另一实施方案中,与任一上面限定的氨基酸序列有至少98%相同性,且在另一实施方案中,与任一上面限定的氨基酸序列有至少97%相同性,且在另一实施方案中,与任一上面限定的氨基酸序列有至少96%相同性,且在另一实施方案中,与任一上面限定的氨基酸序列有至少95%相同性,且在另一实施方案中,与任一上面限定的氨基酸序列有至少94%相同性,且在另一实施方案中,与任一上面限定的氨基酸序列有至少93%相同性,且在另一实施方案中,与任一上面限定的氨基酸序列有至少92%相同性,且在另一实施方案中,与任一上面限定的氨基酸序列有至少91%相同性,且在另一实施方案中,与任一上面限定的氨基酸序列有至少90%相同性,等等以所有整数增加的相同性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中,胡萝卜素合酶包含选自SEQ ID NO:5(PD),SEQ ID NO:7(PS),或SEQ ID NO:9(LC)(或其同源物)的任意两种氨基酸序列,但不必包含第三个序列。例如,可产生仅包含野生型CS的八氢番茄红素脱氢酶(PD)和八氢番茄红素合酶(PS)结构域(即从合成的构建体缺失或省去(omit)番茄红素环化酶(LC)结构域)的本发明的胡萝卜素合酶(即,天然存在的Schizochytrium CS的同源物)。缺失LC结构域的构建体的例子在实施例中描述。该蛋白质可用于例如,产生类胡萝卜素番茄红素。了解本发明的完整胡萝卜素合酶的结构域结构允许本领域的技术人员选择一个或两个结构域来产生仅具有一种或两种酶功能,而不是所有三种酶功能的新型蛋白质。
除非另有说明,本文使用的提及的相同性百分数(%)是指使用:(1)以标准默认参数使用blastp进行氨基酸检索和blastn进行核酸检索的BLAST 2.0Basic BLAST同源性检索,其中查询序列通过默认值过滤低复杂性区域(lowcomplexity regions)(在Altschul,S.F.,Madden,T.L.,Schaaffer,A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.& Lipman,D.J.(1997)“有间隔的BLAST和PSI-BLAST:新一代蛋白质数据库检索程序”,Nucleic Acids Res.25:3389-3402中描述,本文以其整体引用以供参考);(2)BLAST 2序列对比(使用下文所述的参数);(3)和/或用标准默认参数的PSI-BLAST(位点特异性重复的BLAST)进行的同源性评估。应注意由于在BLAST 2.0 Basic BLAST和BLAST 2之间的标准参数的一些差异,两个特定序列使用BLAST 2程序可能认为具有明显同源性,而使用其中一个序列作为查询序列在BLAST 2.0Basic BLAST中进行的检索可能在最高匹配序列中不能鉴定出第二条序列。另外,PSI-BLAST提供了一种自动的,便于使用的“profile”检索类型,它是一种寻找序列同源性的灵敏方法。该程序首先进行有间隔的BLAST数据库检索。PSI-BLAST程序使用来自任何有意义的序列对比的信息返回构建位点特异性记分矩阵,它代替查询序列用于下一轮数据库检索。因此,应明白使用这些程序中的任一种都可测定相同性百分数。
两个具体序列可使用在Tatusova和Madden,(1999),“Blast 2序列-比较蛋白质和核苷酸序列的一种新工具”,FEMS Microbiol Lett.174:247-250(本文以其整体引用以供参考)中所述的BLAST2序列互相进行序列对比。BLAST2序列对比在blastp或blastn中进行,使用BLAST 2.0算法在两个序列之间进行有间隔的BLAST检索(BLAST 2.0),它允许在所得的序列对比中导入间隔(缺失和插入)。本文为了清楚,使用如下标准默认参数进行BLAST 2序列对比。
对于blastn,使用0BLOSUM62矩阵:
匹配得分(reward for match)=1
错配罚分(penalty for mismatch)=-2
open gap(5)和extension gap(2)罚分
gap x_dropoff(50)expect(10)word size(11)filter(on)
对于blastp,使用0 BLOSUM62矩阵:
open gap(11)和extension gap(1)罚分
gap x_dropoff(50)expect(10)word size(3)filter(on)。
胡萝卜素合酶也可包括具有包含SEQ ID NO:3的至少10个连续氨基酸残基(即,与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的10个连续氨基酸具有100%相同性的10个连续氨基酸残基)的氨基酸序列的蛋白质。在另一方面,胡萝卜素合酶氨基酸序列的同源物包括含有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的至少20,或至少大约30,或至少大约40,或至少大约50,或至少大约75,或至少大约100,或至少大约115,或至少大约130,或至少大约150,或至少大约200,或至少大约250,或至少大约300,或至少大约350,或至少大约400,或至少大约500,或至少大约600,或至少大约700,或至少大约800,或至少大约900,或至少大约1000,或至少大约1100,或至少大约1200个连续的氨基酸残基的氨基酸序列。胡萝卜素合酶同源物可包括由包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核酸序列的至少大约30,或至少大约60,或至少大约90,或至少大约150,或至少大约225,或至少大约300,或至少大约750,或至少大约900,或至少大约1050,或至少大约1200,或至少大约1500,或至少大约1800,或至少大约2100,或至少大约2400,或至少大约2700,或至少大约3000个连续核苷酸的核酸序列编码的蛋白质。在一个优选的实施方案中,胡萝卜素合酶同源物具有可测量的上述胡萝卜素合酶生物学活性(即,具有生物学活性),包括本发明的胡萝卜素合酶所述的一种,两种或所有三种酶活性。
根据本发明,对于本文所述的核酸或氨基酸序列,术语“相邻的”或“连续的”是指在不中断的序列中相连。例如,对于第一个序列包含第二个序列的30个相邻(或连续)的氨基酸,是指第一个序列包含与第二个序列中30个氨基酸残基的不中断序列具有100%相同性的30个氨基酸残基的不中断序列。同样,对于第一个序列与第二个序列具有“100%相同性(identity)”是指第一个序列与第二个序列在核苷酸或氨基酸之间无间隔的完全匹配。
在另一实施方案中,包括胡萝卜素合酶同源物的胡萝卜素合酶包括具有这样的氨基酸序列的蛋白质,该氨基酸序列与天然胡萝卜素合酶的氨基酸序列足够相似以致于编码该同源物的核酸序列在中度,高度或极高严格条件(在下文描述)下与编码天然胡萝卜素合酶的核酸分子(即,与编码天然胡萝卜素合酶氨基酸序列的核酸链的互补链)能够杂交。优选的是,胡萝卜素合酶的同源物由这样的核酸分子编码,该核酸分子包含在中度,高度或极高严格条件下与编码包含SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的蛋白质的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。甚至更优选的是,胡萝卜素合酶的同源物由这样的核酸分子编码,该核酸分子包含在中度,高度或极高严格条件下与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
编码本发明的胡萝卜素合酶的核酸序列的核酸序列互补链是指与编码胡萝卜素合酶的链互补的核酸链的核酸序列。可预料到编码给定氨基酸序列的双链DNA包含单链DNA及其具有与该单链DNA互补的序列的互补链。因此,本发明的核酸分子可以是双链或单链的,且包括在严格杂交条件下与编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的核酸序列,和/或与编码SEQ IDNO:3的氨基酸序列的核酸序列的互补序列形成稳定杂交体的那些核酸分子。推定互补序列的方法是本领域的技术人员已知的。应注意由于核酸测序技术不是完全无差错的,因此本文提供的序列最多代表本发明的胡萝卜素合酶表观序列。
本文使用时,提及的杂交条件是指使用核酸分子鉴定相似核酸分子的标准杂交条件。该标准条件在例如,Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press,1989中公开。Sambrook等,出处同上,在此以其整体引用以供参考(特别是参见,第9.31-9.62页)。另外,计算完成允许不同程度的核苷酸错配的杂交的合适的杂交和洗涤条件的公式在例如,Meinkoth等,1984,Anal.Biochem.138,267-284中公开;Meinkoth等,出处同上,在本文中以其整体引用以供参考。
更具体地说,本文提及的中等严格杂交和洗涤条件是指允许分离这样的核酸分子的条件,即该核酸分子与在杂交反应中用于探测的核酸分子具有至少大约70%的核酸序列相同性(即,允许大约30%或更少的核苷酸错配的条件)。本文提及的高度严格杂交和洗涤条件是指允许分离这样的核酸分子的条件,即该核酸分子与在杂交反应中用于探测的核酸分子具有至少大约80%的核酸序列相同性(即,允许大约20%或更少的核苷酸错配的条件)。本文提及的极高严格杂交和洗涤条件是指允许分离这样的核酸分子的条件,即该核酸分子与在杂交反应中用于探测的核酸分子具有至少大约90%的核酸序列相同性(即,允许大约10%或更少的核苷酸错配的条件)。如上所述,本领域的技术人员可使用Meinkoth等,出处同上,中的公式计算达到这些具体核苷酸错配水平的合适的杂交和洗涤条件。该条件依赖于形成的是DNA:RNA还是DNA:DNA杂交体而变化。计算的DNA:DNA杂交体的解链温度比DNA:RNA杂交体低10℃。在具体实施方案中,DNA:DNA杂交体的严格杂交条件包括在离子强度为6X SSC(0.9M Na+),温度在大约20℃和大约35℃之间(低度严格),更优选的是,在大约28℃至大约40℃之间(更严格),且甚至更优选的是,在大约35℃至大约45℃之间(甚至更严格),以合适的洗涤条件进行的杂交。在具体实施方案中,DNA:RNA杂交体的严格杂交条件包括在离子强度为6 X SSC(0.9M Na+),温度在大约30℃和大约45℃之间,更优选的是,在大约38℃至大约50℃之间,且甚至更优选的是,在大约45℃至大约55℃之间,以相似的严格洗涤条件进行的杂交。这些值以计算分子大于大约100个核苷酸,0%的甲酰胺且G+C含量为大约40%时的解链温度为基础。作为选择,Tm可按Sambrook等,出处同上,第9.31至9.62页所述凭经验计算。一般来说,洗涤条件应当尽可能严格,且应当适合于选定的杂交条件。例如,杂交条件可包括盐与在计算的具体杂交体的Tm之下大约20-25℃的温度条件的结合,且洗涤条件一般包括盐与在计算的具体杂交体的Tm之下大约12-20℃的温度条件的结合。适用于DNA:DNA杂交体的一个杂交条件的例子包括在大约42℃下在6XSSC(50%甲酰胺)中杂交2-24小时,接着是包括在大约2X SSC中室温下洗涤一次或多次的洗涤步骤,接着在更高温度和更低离子强度下再洗涤(例如,在大约37℃下在大约0.1X-0.5X SSC中洗涤至少一次,接着在大约68℃下在大约0.1X-0.5X SSC中洗涤至少一次)。
胡萝卜素合酶还包括基因融合体(例如,用于过量表达重组蛋白的可溶性,活性形式)的,诱变基因(例如,具有增强基因转录和翻译的密码子修饰的基因)的,和截短基因(例如,为产生膜蛋白的可溶性形式而去掉了膜结合区的基因,或去掉了在特定重组宿主中耐受性差的信号序列的基因)的表达产物。应注意本发明的胡萝卜素合酶和蛋白质同源物包括没有胡萝卜素合酶活性的蛋白质。该蛋白质可用于例如,产生抗体,或者用于产生缺乏产生一种或多种类胡萝卜素的能力的遗传修饰的生物体。
本发明的蛋白质和/或同源物的最小大小是足以具有胡萝卜素合酶生物学活性的大小,或者当该蛋白质不需具有该酶活性时,是指足以用于与本发明的胡萝卜素合酶相关的另一目的的大小,例如用于产生结合天然存在的胡萝卜素合酶的抗体。因此,本发明的胡萝卜素合酶或同源物的最小大小是指适合于形成可被抗体识别的至少一个表位的大小,且一般至少8个氨基酸长,且优选10个,且更优选15个,且更优选20个,且更优选25个,且甚至更优选30个氨基酸长,且以从1到1268的任一整数增加至达到1268个氨基酸长,优选的大小依赖于是需要该蛋白质的全长,多价(即,具有一个以上结构域的融合蛋白,每个结构域具有一种功能),还是需要该蛋白质的功能部分。除了实用性限制外,对于该蛋白质的最大大小没有限制,该蛋白质可包含胡萝卜素合酶(包括胡萝卜素合酶同源物)的一部分或全长胡萝卜素合酶。
同样,本发明的核酸分子的最小大小是指足以编码具有胡萝卜素合酶活性的蛋白质,足以编码包含与抗体结合的至少一个表位的蛋白质,或足以形成能够与编码天然胡萝卜素合酶的核酸分子的互补序列形成稳定杂交体(例如,在低度,中等或高度严格条件下)的探针或寡核苷酸引物的大小。因此,编码该蛋白质的核酸分子的大小可依赖于核酸组成,该核酸分子与互补序列之间的同源性或相同性百分数以及杂交条件本身(例如,温度,盐浓度,和甲酰胺浓度)。用作寡核苷酸引物或作为探针的核酸分子的最小大小一般是如果该核酸分子富含GC则为至少大约12至大约15个核苷酸长且如果它们富含AT则为至少大约15至大约18个碱基长。除了实用性限制外,对于本发明的核酸分子的最大大小没有限制,该核酸分子可包含胡萝卜素合酶编码序列的一部分,编码全长胡萝卜素合酶的核酸序列(包括胡萝卜素合酶基因),或多基因,或其部分。
本发明还包括融合蛋白,该融合蛋白包含与一个或多个融合片段连接的含有胡萝卜素合酶的结构域(包括胡萝卜素合酶的同源物或功能结构域)。用于本发明的合适的融合片段包括,但不限于,可增强蛋白质稳定性,提供其它需要的生物学活性(例如,细胞因子或者与类胡萝卜素生物合成相关的另一活性);和/或帮助纯化胡萝卜素合酶(例如,通过亲和色谱法)的片段。合适的融合片段可以是具有所需功能(例如,赋予增强的稳定性,可溶性,作用或生物学活性;和/或简化蛋白质的纯化)的任意大小的结构域。融合片段可连接到该蛋白质含有胡萝卜素合酶的结构域的氨基和/或羧基末端且容易裂解以便能够直接回收胡萝卜素合酶。融合蛋白优选通过培养用融合核酸分子转化的重组细胞产生,该融合核酸分子编码包含连接到含有胡萝卜素合酶的结构域的羧基和/或氨基末端的融合片段的蛋白质。
在本发明的一个实施方案中,本文所述的任一氨基酸序列可在该特定氨基酸序列的C-和/或N-末端的侧翼分别含有从至少一个,到多达20个添加的异源性氨基酸来产生。所得的蛋白质或多肽可称为“基本上由该特定氨基酸序列组成”。根据本发明,该异源性氨基酸是这样的氨基酸序列,即该氨基酸序列在天然状态下在特定氨基酸序列侧翼未发现(即,在体内在天然情况下未发现),或者与特定氨基酸序列的功能不相关,或者如果使用产生该给定氨基酸序列的生物体的标准密码子用法来翻译天然存在的序列中的该核苷酸的话,它在该基因中出现时,不是由编码特定氨基酸序列的天然存在的核酸序列侧翼的核苷酸编码。同样,提及核酸序列时,本文使用的术语“基本上由其组成”是指在编码特定氨基酸序列的核酸序列5’和/或3’端侧翼可分别具有从至少一个,到多至60个添加的异源性核苷酸的编码特定氨基酸序列的核酸序列。该异源性核苷酸在天然基因中出现时,不是在编码特定氨基酸序列的核酸序列侧翼天然发现的(即,体内天然未发现的)或者不编码赋予该蛋白质任何其它的功能或改变具有特定氨基酸序列的蛋白质的功能的蛋白质。
胡萝卜素合酶可从包括Thraustochytriales目的成员的各种微生物中分离。例如,获得本发明的胡萝卜素合酶的优选的微生物包括来自这样一个属的微生物,该属包括,但不限于:破囊壶菌属(Thraustochytrium),Labyrinthuloides,Japonochytrium,和Schizochytrium。这些属中优选的种包括,但不限于:任何Schizochytrium种,包括Schizochytrium aggregatum,Schizochytrium limacinum,Schizochytrium minutum;任何破囊壶菌属的种(包括以前的Ulkenia种,例如U.Visurgensis,U.amoeboida,U.sarkariana,U.Profunda,U.radiata,U.minuta和Ulkenia sp.BP-5601),且包括Thraustochytrium striatum,Thraustochytrium aureum,Thraustochytriumroseum;和任何Japonochytrium种。特别优选的Thraustochytriales菌株包括,但不限于:Schizochytriumsp.(S31)(ATCC20888);Schizochytriumsp.(S8)(ATCC20889);Schizochytrium sp.(LC-RM)(ATCC18915);Schizochytrium sp.(SR21);Schizochytrium aggregatum(Goldstein etBelsky)(ATCC 28209);Schizochytrium limacinum(Honda et Yokochi)(IFO32693);破囊壶菌属菌种(23B)(ATCC 20891);Thraustochytriumstriatum(Schneider)(ATCC 24473);Thraustochytrium aureum(Goldstein)(ATCC34304);Thraustochytrium roseum(Goldstein)(ATCC 28210);和Japonochytriumsp.(L1)(ATCC 28207)。
开发导致了对Thraustochytrids分类学的修正。分类学理论工作者将Thraustochytrids与藻类或藻状原生生物放在一起。然而,由于分类学的不确定性,为了本发明的目的最好将本发明所述的菌株当作Thraustochytrids(目:Thraustochytriales;科:破囊壶菌科;属:破囊壶菌属,Schizochytrium,Labyrinthuloides,或Japonochytrium)。对于本发明,认为labrinthulids的成员包括在Thraustochytrids中。分类学变化在下文中概述。本文公开的某些单细胞微生物的菌株是Thraustochytriales目(也称为Thraustochytrids)的成员。Thraustochytrids是分类史上进化的海洋真核生物。Thraustochytrids的分类学地位问题由Moss(1986),Bahnweb和Jackle(1986)以及Chamberlain和Moss(1988)进行了综述。根据本发明,术语“Thraustochytrid”,“Thraustochytriales微生物”和“Thraustochytriales目的微生物”可交换使用。
为了方便,分类学家首先将Thraustochytrids与藻状菌纲(Phycomycetes)(藻状真菌)中的其它无色游动孢子真核生物放在一起。然而,藻状菌纲的名称最后在分类学上的地位下降了,且将Thraustochytrids保留在卵菌纲(双鞭毛游动孢子真菌)中。起初假定卵菌纲与异鞭毛藻类相关,且由Barr(Barr,1981,Biosystems 14:359-370)总结的广泛的超微结构和生化研究最终支持了该假定。卵菌纲事实上被Leedale(Leedale,1974,Taxon 23:261-270)和其它藻类学家作为异鞭毛藻类部分所接受。然而,由于其异样特性带来的便利性,卵菌纲和Thraustochytrids由真菌学家(研究真菌的科学家)而不是藻类学家(研究藻类的科学家)进行了大量的研究。
从另一分类学角度,进化生物学家对于真核生物如何进化形成了两个总的思想学派。一种理论提出有膜边界的细胞器通过一系列内共生的外源性起源(Margulis,1970,Origin of Eukaryotic Cells.Yale University Press,NewHaven);例如,线粒体起源于细菌性细胞内共生生物,叶绿体起源于蓝藻,鞭毛起源于螺旋体。另一理论认为有膜边界的细胞器从原核生物祖先的无膜边界系统通过自生过程逐渐进化(Cavalier-Smith,1975,Nature(Lond.)256:462-468)。然而,两组进化生物学家都从真菌中去掉了卵菌纲和Thraustochytrids并将它们与chromophyte藻类一起放在Chromophyta界中(Cavalier-Smith,1981,BioSystems 14:461-481)(这一个界最近扩展到包含其它原生生物且该界中的成员现在称为Stramenopiles)或者与所有藻类一起放在Protoctista界中(Margulis和Sagen,1985,Biosystems 18:141-147)。
随着电子显微镜学的发展,对Thraustochytrids的两个属,即破囊壶菌属和Schizochytrium的游动孢子超微结构的研究(Perkins,1976,第279-312页,见“Recent Advances in Aquatic Mycology”(ed.E.B.G.Jones),John Wiley&Sons,New York;Kazama,1980,Can.J.Bot.58:2434-2446;Barr,1981,Biosystems 14:359-370)提供了破囊壶菌科仅与卵菌纲具有较远的亲缘关系的有力证据。另外,代表5S核糖体RNA序列对应分析的遗传数据(多元统计形式)表明Thraustochytriales明显是一个独特的真核生物群体,完全独立于真菌,且与红和褐藻,和与卵菌纲的成员具有最近的亲缘关系(Mannella,等,1987,Mol.Evol.24:228-235)。大多数分类学家同意从卵菌纲去掉Thraustochytrids(Bartnicki-Garcia,1987,第389-403页,见“EvolutionaryBiology of the Fungi”(eds.Rayner,A.D.M.,Brasier,C.M.& Moore,D.),Cambridge University Press,Cambridge)。
总之,采用Cavalier-Smith的分类系统(Cavalier-Smith,1981,BioSystems14:461-481,1983;Cavalier-Smith,1993,Microbiol Rev.57:953-994),将Thraustochytrids与chromophyte藻类一起分类进Chromophyta(Stramenopiles)界中。该分类学位置最近由Cavalier-Smith等使用Heterokonta的18s rRNA标记证实Thraustochytrids是chromists而不是真菌再次得到确认(Cavalier-Smith等,1994,Phil.Tran.Roy.Soc.London Series BioSciences 346:387-397)。这样将它们放在与真菌完全不同的界中,即都放在Eufungi界中。因此Tluaustochytrids的分类学地位总结如下:
界:Chromophyta(Stramenopiles)
门:Heterokonta
目:Thraustochytriales
科:破囊壶菌科
属:破囊壶菌属,Schizochytrium,Labyrinthuloides,或Japonochytrium。
一些早期的分类学家将破囊壶菌属的一些原始成员(具有变形虫状生活期的成员)分进一个称为Ulkenia的独立属中。然而,现在知道如果不是全部的话,大多数的Thraustochytrids(包括破囊壶菌属和Schizochytrium)表现出变形虫状生活期,因此,一些人认为Ulkenia不是一个正确的属。本文所用的破囊壶菌属将包括Ulkenia。
尽管在门和界的高级分类中的分类学地位不确定,但是Thraustochytrids仍然是一个与众不同的和有特色的群体,其成员仍然可分进Thraustochytriales目中。
本发明的另一实施方案包括编码胡萝卜素合酶的核酸分子。本发明的分离的核酸分子包括含有这样核酸序列的核酸分子,即该核酸序列编码任一分离的胡萝卜素合酶,包括上述的胡萝卜素合酶同源物或片段。
在一个实施方案中,该核酸分子包含在中等严格条件,且甚至更优选在高度严格条件,且甚至更优选在极高严格条件下与编码天然存在的胡萝卜素合酶的核酸序列(即,包括编码胡萝卜素合酶的天然存在的等位基因变异体)的互补链杂交的分离的核酸分子。优选的是,编码本发明的胡萝卜素合酶的分离的核酸分子包含在中等,高度,或极高严格条件下与编码含有SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的蛋白质的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。在一个实施方案中,分离的核酸分子包含在中等,高度,或极高严格条件下与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。该条件在上文中进行了详细描述。
根据本发明,分离的核酸分子是从其天然环境中分离的核酸分子(即,进行了人工操作)且可包括DNA,RNA,或者DNA或RNA的衍生物,包括cDNA。因此,“分离的”并不反映该核酸分子被纯化的程度。本发明的分离的胡萝卜素合酶核酸分子可从其天然来源分离或者使用重组DNA技术(例如,聚合酶链反应(PCR)扩增,克隆)或化学合成产生。分离的胡萝卜素合酶核酸分子可包括例如,胡萝卜素合酶基因,胡萝卜素合酶基因的天然等位基因变异体,胡萝卜素合酶编码区或其部分,和以修饰基本上不干扰核酸分子编码本发明的胡萝卜素合酶蛋白的能力或者在严格条件下与天然基因分离物形成稳定杂交体的方式通过核苷酸插入,缺失,取代,和/或倒位修饰的胡萝卜素合酶编码和/或调控区。分离的胡萝卜素合酶核酸分子可包括简并序列。本文使用的核苷酸简并性是指一个氨基酸可被不同核苷酸密码子编码的的现象。因此,编码本发明的胡萝卜素合酶蛋白质的核酸分子的核酸序列可由于简并性而变化。应注意本发明的分离的胡萝卜素合酶的核酸分子不需编码具有胡萝卜素合酶活性的蛋白质。胡萝卜素合酶核酸分子可编码例如,截短的,突变的或无活性的蛋白质。该核酸分子和由该核酸分子编码的蛋白质可用作探针和引物用于鉴定其它胡萝卜素合酶。
根据本发明,提及的胡萝卜素合酶基因包括与天然(即,野生型)胡萝卜素合酶基因相关的所有核酸序列,例如调控由该基因编码的胡萝卜素合酶的产生的调控区(例如,但不限于,转录,翻译或翻译后调控区)以及编码区本身。在另一实施方案中,胡萝卜素合酶基因可以是天然存在的等位基因变异体,包括与编码给定胡萝卜素合酶的核酸序列相似但不相同的序列。等位基因变异体已经在上文中描述。当核酸分子包含上述基因时,术语“核酸分子”和“基因”可交换使用。
使用本领域的技术人员已知的许多方法(参见,例如,Sambrook等)可产生胡萝卜素合酶核酸分子同源物(即,编码胡萝卜素合酶同源物)。例如,核酸分子可使用各种技术进行修饰,该技术包括,但不限于,通过传统诱变和重组DNA技术(例如,定点诱变,化学处理,限制性酶裂解,连接核酸片段和/或PCR扩增),或者合成寡核苷酸混合物并连接混合物组以“构建”核酸分子的混合物及其组合。修饰编码胡萝卜素合酶的重组核酸分子的另一方法是基因改组(即,分子育种)(参见,例如,Stemmer的美国专利号5,605,793;Minshull和Stemmer,1999,Curr.Opin.Chem.Biol.3:284-290;Stemmer,1994,P.N.A.S.USA91:10747-10751,所有这些文献在本文中以其整体引用以供参考)。该技术可用于在胡萝卜素合酶作用中有效导入多个同时发生的改变。核酸分子同源物可通过与胡萝卜素合酶基因杂交或者通过筛选核酸分子编码的蛋白质的功能(即,酶活性)来选择。
本发明的一个实施方案涉及一个寡核苷酸,它含有选自:SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,和与其完全互补的核酸序列中的核酸序列的至少12个连续的核苷酸。用作寡核苷酸引物或作为探针的核酸分子的最小大小一般是如果该核酸分子富含GC则为至少大约12至大约15个核苷酸长且如果它们富含AT则为至少大约15至大约18个碱基长。除了实用性限制外,对于本发明的寡核苷酸探针或引物的最大大小没有限制,该探针或引物可包含适用于该目的用途的本发明的胡萝卜素合酶基因的任一部分,且探针一般比引物更大。因此,本发明的寡核苷酸可包括以所有整数(例如,12,13,14,15,16......3799,3800)的在大约12和大约3800个核苷酸之间的任何长度的片段或者甚至更大的探针。
本发明的一个实施方案包括一个重组核酸分子,它包含插入适合于克隆,测序,和/或操作该核酸分子,例如表达和/或将该核酸分子传递进宿主细胞以形成重组细胞的任何核酸载体(例如,重组载体)中的本发明的至少一个分离的核酸分子。该载体含有异源性核酸序列,即核酸序列不是天然发现与本发明的核酸分子相邻的,尽管该载体也可含有天然发现与本发明的核酸分子相邻的调控核酸序列(例如,启动子,非翻译区)(下文详细讨论)。该载体可以是RNA或DNA,是原核的或者真核的,且一般是病毒或质粒。该载体可作为染色体外元件(例如,质粒)维持或者可整合进染色体中。完整载体可在宿主细胞内的适当位置维持,或者在某些情况下,质粒DNA可能缺失,留下本发明的核酸分子。整合的核酸分子可在染色体启动子控制下,在本身或质粒启动子控制下,或者在一些启动子的组合控制下。单个或多个拷贝的核酸分子可整合进染色体中。载体可设计成在宿主细胞中进行组织特异性表达,例如通过使用组织特异性启动子。用于本发明的一些重组核酸分子,包括一些重组载体,在实施例中有详细描述。
一般来说,重组分子包含与一个或多个转录调控序列(例如,启动子,操纵子,阻遏物,增强子,终止子)可操作地相连的本发明的核酸分子。本文使用的术语“重组分子”或“重组核酸分子”主要是指与转录调控序列可操作地相连的核酸分子或核酸序列,但是当核酸分子是本文所述的重组分子时,与术语“核酸分子”可交换使用。根据本发明,术语“可操作地相连”是指以该分子转化(即,转化,转导,转染,或接合)进宿主细胞时能够表达的方式连接核酸分子与转录调控序列。转录调控序列是控制转录开始,延长,或终止的序列。特别重要的转录调控序列是控制转录开始的那些序列,例如启动子,增强子,操纵子和阻遏物序列。合适的转录调控序列包括在用于表达本发明的胡萝卜素合酶的至少一种重组细胞中起作用的任何转录调控序列。各种转录调控序列是本领域的技术人员已知的。优选的转录调控序列包括在Thraustochytriales微生物,细菌,真菌(例如,酵母),或植物细胞中起作用的那些序列。用于植物的特别优选的转录调控序列是在特异性组织(例如,叶,茎,根,花,种子)中启动基因表达的那些序列且本文称为组织特异性转录调控序列。该序列是本领域熟知的。
在本发明的一个实施方案中,合适的转录调控序列包括在本发明的胡萝卜素合酶基因中天然发现的调控序列。例如,包括胡萝卜素合酶启动子的Schizochytrium胡萝卜素合酶的调控序列见SEQ ID NO:1的核苷酸1-1405或SEQ ID NO:1的核苷酸346-1405。
本发明的重组分子可以是DNA或RNA,也可含有其它调控序列,例如转录调控序列,翻译调控序列,复制起点,和与重组细胞相容的其它调控序列。在一个实施方案中,本发明的重组分子,包括整合进宿主细胞染色体中的那些重组分子,还含有使得表达的胡萝卜素合酶能够从产生该蛋白的细胞分泌出去或者靶向特定细胞器或膜的信号(靶向)(即,信号片段核酸序列)。例如,在一个实施方案中,合适的信号片段包括与本发明的胡萝卜素合酶天然相连的信号片段(例如,SEQ ID NO:3的氨基酸1-29)或者能够指导根据本发明的胡萝卜素合酶分泌的任何异源性信号片段。在另一实施方案中,本发明的重组分子包含使得表达的胡萝卜素合酶能够传递到并插入进宿主细胞膜中的信号序列。合适的信号序列包括与本发明的胡萝卜素合酶天然相连的信号序列,或者能够指导胡萝卜素合酶传递并插入进细胞膜的任何异源性信号序列。在另一实施方案中,本发明的重组分子包含将胡萝卜素合酶特异性靶向传递到特定亚细胞器或区室,例如内质网,叶绿体,色质体,其它质体,或细胞质的信号序列。
本发明的一个或多个重组分子可用于产生本发明的编码产物(例如,胡萝卜素合酶)。在一个实施方案中,编码产物可通过在有效产生该蛋白的条件下表达本文所述的核酸分子来产生。产生编码的蛋白质的优选方法是通过用一个或多个重组分子转化宿主细胞以形成重组细胞。用于转化的合适的宿主细胞包括,但不限于,任何显微藻类细胞,包括Thraustochytriales微生物,或任何细菌细胞,真菌(例如,酵母)细胞,其它微生物细胞,或可被转化的植物细胞。宿主细胞可以是未转化的细胞或者已经用至少一个核酸分子转化的细胞。
用于本发明的优选的宿主细胞包括适合于表达本发明的胡萝卜素合酶的任何微生物细胞或植物细胞,包括,但不限于:(1)植物,包括,但不限于,庄稼植物(例如,canola-Brassica napus,水稻,玉米,亚麻,红花,大豆,向日葵,油菜籽,亚麻籽),番茄,和胡萝卜;(2)真菌,包括,但不限于,须霉属(Phycomyces),链孢霉属(Neurospora),白霉属(Mucor),布拉霉属(Blakeslea),和酵母(例如,啤酒糖酵母,Phaffia rhodozyma,Xanthophyllomyces dendrohous,产朊假丝酵母(Candida utilus));(3)藻类,包括但不限于,绿藻(例如,Haematococcus pluvialus,Chlorococcum,Spongiococcum,Neospongiococcum,Dunaliella);(4)细菌,包括,但不限于,蓝细菌(例如,螺旋藻属(Spirulina),聚球蓝细菌属(Synechococcus),集胞蓝细菌属(Synechocystis)),大肠杆菌,黄杆菌属(Flavobacterium),副球菌属(Paracoccus),欧文氏菌属(Erwinia),土壤杆菌属(Agrobacterium),红球菌属(Rhodococcus);和(5)Thraustochytriales目的成员,包括但不限于,破囊壶菌属种类(例如,包括以前的Ulkenia种类,例如U.visurgensis,U.amoeboida,U.sarkariana,U.profunda,U.radiata,U.minuta和Ulkeniasp.BP-5601,且包括Thraustochytrium striatum,Thraustochytrium aureum,和Thraustochytrium roseum);Labyrinthuloides,Japonochytrium(例如,Japonochytrium sp.),和Schizochytrium(例如,Schizochytrium sp.,Schizochytrium aggregatum,Schizochytrium limacinum,Schizochytriumminutum)。
根据本发明,术语“转化的”或“转化”用于指将外源性核酸分子(即,重组核酸分子)插入细胞的任何方法。在微生物系统中,术语“转化”用于描述由于微生物获得外源性核酸的遗传改变且与术语“转染”基本上同义,“转染”更常用于涉及动物细胞的相似方法。术语“转化”在本文中优选用于指将核酸分子导入微生物细胞,例如细菌和酵母,或者导入植物细胞。因此,转化技术包括,但不限于,转染,电穿孔,显微注射,脂转染,生物弹(biolistic)方法(粒子轰击),吸附,土壤杆菌属-介导的转化,感染和原生质体融合。转化原核和真核宿主细胞的方法是本领域熟知的。参见,例如,Maniatis等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor,NY(1982),Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,NY(1989),本文以其整体引用以供参考。转化Thraustochytriales目成员的优选方法在2002年4月16日申请的美国专利申请流水号10/124,807中描述,以其整体引用以供参考。
已经形成了许多用于植物转化的方法,包括生物学和物理转化方法。参见,例如,Miki等,“将外源DNA导入植物的方法”,见Methods in PlantMolecular Biologyand Biotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.Eds.(CRCPress,Inc.,Boca Raton,1993),第67-88页。另外,用于植物细胞的载体和体外培养方法或组织转化和植物再生是可获得的。参见,例如,Gruber等,“植物转化的载体”,见Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.Eds.(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)第89-119页。
用于将表达载体导入植物的最广泛使用的方法以土壤杆菌属的自然转化系统为基础。参见,例如,Horsch等,Science 227:1229(1985)。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌是可遗传转化植物细胞的植物病原性土壤细菌。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。参见,例如,Kado,C.I.,Crit.Rev.Plant.Sci.10:1(1991)。对土壤杆菌属载体系统和土壤杆菌属-介导的基因转移方法的描述在许多文献中提供,包括Gruber等,出处同上,Miki等,出处同上,Moloney等,Plant Cell Reports8:238(1989),和美国专利号4,940,838和5,464,763,本文分别以其整体引用以供参考。
植物转化的一般适用方法是微粒介导的转化,其中在微粒的表面携带DNA。用可将微粒加速到足以穿透植物细胞壁和膜的速度的生物弹装置将表达载体导入植物组织。Sanford等,Part.Sci.Technol.5:27(1987),Sanford,J.C.,Trends Biotech.6:299(1988),Sanford,J.C.,Physiol.Plant 79:206(1990),Klein等,Biotechnology 10:268(1992),本文分别以其整体引用以供参考。
将DNA物理传递到植物的另一方法是超声处理靶细胞。Zhang等,Bio/Technology9:996(1991)。另外,脂质体或原生质球融合已经用于将表达载体导入植物。Deshayes等,EMBO J.,4:2731(1985),Christou等,Proc Natl.Acad.Sci.USA 84:3962(1987),本文分别以其整体引用以供参考。也有报导使用CaCl2沉淀,聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将DNA直接吸收进原生质体。Hain等,Mol.Gen.Genet.199:161(1985)和Draper等,Plant Cell Physiol.23:451(1982),本文分别以其整体引用以供参考。对原生质体和完整细胞和组织的电穿孔也有描述。Donn等,见第VII届国际植物细胞和组织培养物IAPTC会议摘要,A2-38,第53页(1990);D′Halluin等,Plant Cell 4:1495-1505(1992)和Spencer等,Plant Mol.Biol.24:51-61(1994),本文分别以其整体引用以供参考。
在一个实施方案中,本发明的分离的胡萝卜素合酶通过在有效产生该蛋白的条件下培养表达该蛋白的细胞,并回收该蛋白来产生。培养的优选细胞是本发明的重组细胞。有效培养条件包括,但不限于,允许该蛋白质产生的有效培养基,生物反应器,温度,pH和氧条件。有效培养基是指培养细胞以产生本发明的胡萝卜素合酶的任何培养基。该培养基一般包含具有可同化的碳,氮和磷酸来源,和合适的盐,无机物,金属和其它营养成分,例如维生素的含水培养基。本发明的细胞可在常规发酵生物反应器,摇瓶,试管,微量滴定培养皿,和培养板上培养。培养可在适合于重组细胞的温度,pH和氧含量下进行。该培养条件在本领域的普通技术人员的知识范围内。
取决于用于产生的载体和宿主系统,本发明所得的蛋白质可保留在重组宿主细胞内;分泌进培养基中;分泌进两个细胞膜之间的间隙,例如大肠杆菌的壁膜间隙;或者保留在细胞膜的外表面。术语“回收该蛋白质”是指收集含有该蛋白质的全部培养基且不必隐含着另外的分离或纯化步骤。如果需要,本发明的蛋白质可使用各种标准蛋白质纯化技术进行纯化,例如,但不限于,亲和色谱法,离子交换色谱法,过滤,电泳,疏水相互作用色谱法,凝胶过滤色谱法,反相色谱法,伴刀豆球蛋白A色谱法,色谱聚焦和差别溶解。如果纯化本发明的蛋白质,它们优选以“基本上纯”的形式回收。本文使用的“基本上纯”是指允许该蛋白质有效用作生物催化剂或其它试剂的纯度。
为了用本发明的方法产生明显高产的类胡萝卜素,可遗传修饰微生物或植物(或植物的部分,例如,种子,花粉,胚,花,果实,芽,叶,根,茎,外植体,等)以提高胡萝卜素合酶的作用,且优选增强胡萝卜素合酶的产生,从而提高类胡萝卜素终产物的产量。在本发明的一个实施方案中,可遗传修饰含有本发明的内源性胡萝卜素合酶的微生物(例如,Schizochytrium)以增加或减少胡萝卜素合酶的表达和活性。
本文使用的遗传修饰的微生物,例如遗传修饰的细菌,原生生物,显微藻类,真菌,或其它微生物,且特别是本文所述的Thraustochytriales目(例如,Thraustochytrid)的各属中的任一成员(例如,Schizochytrium,破囊壶菌属,Japonochytrium,Labyrinthuloides),具有从其正常(即,野生型或天然存在)的形式修饰(即,突变或改变)的基因组以便实现所需的结果(即,增强或修饰的胡萝卜素合酶表达和/或活性和/或使用胡萝卜素合酶产生所需的产物)。使用传统的菌株开发和/或分子遗传技术可实现对微生物的遗传修饰。用于微生物的该技术是普遍公开的,例如,参见Sambrook等,1989,出处同上,本文以其整体引用以供参考。遗传修饰的微生物可包括以该修饰赋予微生物所需效果的方式插入,缺失或修饰(即,突变;例如通过核苷酸的插入,缺失,取代,和/或倒位)了其核酸分子的微生物。
根据本发明修饰的优选微生物宿主细胞包括,但不限于,任何细菌,原生生物,显微藻类,真菌,或原生动物。在一个方面,遗传修饰的优选微生物包括,但不限于,Thraustochytriales目的任何微生物。用于本发明的特别优选的宿主细胞包括来自这样一个属的微生物,该属包括,但不限于:破囊壶菌属,Labyrinthuloides,Japonochytrium,和Schizochytrium。这些属中优选的种类包括,但不限于:任何Schizochytrium种类,包括Schizochytriumaggregatum,Schizochytrium limacinum,Schizochytrium minutum;任何破囊壶菌属种类(包括以前的Ulkenia种类,例如U.visurgensis,U.amoeboida,U.sarkariana,U.profunda,U.radiata,U.minuta和Ulkenia sp.BP-5601),且包括Thraustochytrium stratum,Thraustochytrium aueum,Thraustochytriumroseum;和任何Japonochytrium种类。特别优选的Thraustochytriales菌株包括,但不限于:Schizochytrium sp.(S31)(ATCC 20888);Schizochytriumsp.(S8)(ATCC 20889);Schizochytrium sp.(LC-RM)(ATCC 18915);Schizochytrium sp.(SR21);Schizochytrium aggregatum(Goldstein etBelsky)(ATCC 28209);Schizochytrium limacinum(Honda et Yokochi)(IFO32693);破囊壶菌属种类(23B)(ATCC 20891);Thraustochytriumstriatum(Schneider)(ATCC 24473);Thraustochytrium aureum(Goldstein)(ATCC34304);Thraustochytrium roseum(Goldstein)(ATCC 28210);和Japonochytriumsp.(L1)(ATCC 28207)。用于遗传修饰的合适宿主微生物的其它例子包括,但不限于,包括啤酒糖酵母,卡尔斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)的酵母,或诸如假丝酵母属(Candida),克鲁维氏酵母属(Kluyieromyces)的其它酵母,或者其它真菌,例如,丝状真菌,例如曲霉属(Aspergillus),链孢霉属(Neurospora),青霉属(Penicillium),等。细菌细胞也可用作宿主。它包括可用于发酵过程的大肠杆菌。另外,诸如乳芽孢杆菌属(Lactobacillus)种类或芽孢杆菌属(Bacillus)种类的宿主也可用作宿主。
本文使用的遗传修饰的植物可包括任何遗传修饰的植物,包括高等植物且特别是任何可消费的植物或者用于产生本发明的所需产物(例如,类胡萝卜素或任何其它脂类产品)的植物。该遗传修饰的植物具有从其正常(即,野生型或天然存在)的形式修饰(即,突变或改变)的基因组以便实现所需的结果(即,增强或修饰的胡萝卜素合酶表达和/或活性和/或使用胡萝卜素合酶产生所需的产物)。使用传统的品系开发和/或分子遗传技术可实现对植物的遗传修饰。产生在植物基因组中插入了编码所需氨基酸序列的重组核酸分子的转基因植物的方法是本领域已知的且上文进行了简要描述。根据本发明遗传修饰的优选植物优选是适合于动物,包括人消费的植物。
根据本发明遗传修饰的优选植物(即,植物宿主细胞)包括,但不限于任何高等植物,且特别是可消费的植物,包括庄稼植物且特别是使用其油类的植物。该植物可包括,例如,canola,大豆,油菜籽,亚麻籽,玉米,红花,亚麻,向日葵,烟草,水稻,番茄和胡萝卜。其它优选的植物包括已知产生用作药剂,调味剂,中和剂(neutraceutical agents),功能性食品成份或化妆活性剂的化合物的那些植物或遗传改造成产生这些化合物/试剂的植物。
根据本发明,遗传修饰的微生物或植物包括使用重组技术修饰的微生物或植物。本文使用的导致基因表达,基因功能,或基因产物(即该基因编码的蛋白质)功能下降的遗传修饰是指基因的失活(全部或部分),缺失,中断,阻断或下调。例如,导致该基因编码的蛋白质的功能下降的基因遗传修饰可由该基因的完全缺失(即,该基因不存在,且因此该蛋白质不存在),导致蛋白质不完整或不翻译(例如,该蛋白质不表达)的基因突变,或者降低或消除该蛋白质的天然功能(例如,表达降低或没有酶活性或作用的蛋白质)的基因突变引起。导致基因表达或功能提高的遗传修饰是指基因的扩增,过量产生,过量表达,活化,增强,增加,或上调。
在本发明的一个实施方案中,微生物或植物的遗传修饰提高或者降低了本发明的胡萝卜素合酶的表达和/或活性。该遗传修饰包括任何类型的修饰且特别是包括以重组技术和/或通过传统诱变作出的修饰。应注意提及的提高胡萝卜素合酶的作用(活性)是指在所述微生物或植物中和/或用于转化该生物体的含有胡萝卜素合酶编码DNA的重组核酸中导致该酶的功能提高的任何遗传修饰,且包括该酶活性(例如,比活或体内酶活性)更高,该酶的抑制或降解减少,和酶的过量表达。例如,可增加基因拷贝数,通过使用比天然启动子产生更高表达水平的启动子可提高表达水平,或者通过遗传改造或传统诱变来改变基因以提高酶的作用。在一个方面,胡萝卜素合酶活性或表达可通过修饰与胡萝卜素合酶基因或蛋白质相互作用且正常情况下调控胡萝卜素合酶基因或蛋白质的表达或活性的核酸或蛋白质来修饰。该修饰可通过重组或传统诱变技术完成。
同样,提及的降低胡萝卜素合酶的作用(活性)是指在所述微生物或植物中和/或在用于转化该生物体的含有胡萝卜素合酶编码DNA的重组核酸中导致该酶功能降低的任何遗传修饰,且包括酶活性(例如,比活)降低。酶的抑制或降解增加,和酶表达的减少或消除。例如,本发明的胡萝卜素合酶的作用可通过抑制或降低酶的产生,“敲除”全部或部分编码该酶的基因,降低酶活性,或抑制酶活性(本发明的胡萝卜素合酶的任意一种,两种或三种酶活性)被降低。抑制或降低酶的产生包括将编码该酶的基因放在需要在生长培养基中存在诱导化合物的启动子的控制下。通过建立在培养基中排除诱导剂的条件,可关闭编码该酶的基因的表达(且从而关闭酶合成)。抑制或降低酶活性也可包括使用类似于美国专利号4,743,546中所述的切除技术方案,本文以其整体引用以供参考。为了使用该方案,可将编码目的酶的基因克隆到允许从该基因组特异性地,受控地切除该基因的特异性遗传序列之间。通过例如,按美国专利号4,743,546所述转换培养物的培养温度,或者通过一些其它物理或营养信号可启动切除。实施例中描述了使用同源重组技术删除全部或部分本发明的胡萝卜素合酶基因。在一个实施方案中,可敲除本发明的CS的一个或两个酶结构域(例如,PD,PS,LC)以产生所需产物。例如,敲除CS酶的LC结构域可导致产生番茄红素。该基因可有效产生PD/PS双功能酶,即一种本发明人以前未知的组合。番茄红素本身可以是目的产物。另外,番茄红素可用作诸如α-胡萝卜素和叶黄素的其它潜在的目的产物的底物。
在本发明的一个实施方案中,它涉及将诱变程序与选择性筛选过程相结合以获得感兴趣的微生物。该诱变方法包括,但不限于:化学诱变,基因改组,交换编码特异性酶结构域的基因区域,或者局限于该基因特定区域的诱变,以及其它方法。例如,可使用高通量诱变方法影响或优化所需类胡萝卜素或其它脂类产物的产生。该方法可与通过分子生物学技术对胡萝卜素合酶的选择性(即,靶向或定向)修饰相结合。例如,可使用选择性修饰技术修饰微生物,例如,通过将编码本发明的胡萝卜素合酶的重组核酸分子导入包括含有内源性胡萝卜素合酶的宿主细胞的任何合适的宿主细胞中,然后使用诱变技术优化类胡萝卜素产生并产生类胡萝卜素合成活性提高的菌株或者选择具有其它改进的或所需的品质的微生物。筛选方法也可用于鉴定具有与Schizochytrium的胡萝卜素合酶同源的胡萝卜素合酶基因的其它生物体。在该生物体中鉴定的同源性CS基因可用于类似于本文所述的方法中。
在本发明的一个实施方案中,遗传修饰的微生物或植物包括总体上合成类胡萝卜素的能力增强或合成特定类胡萝卜素的能力增强(即,改变该生物体产生的特定类胡萝卜素的分布)的微生物或植物。根据本发明,“合成某产物的能力增强”是指在与该产物合成相关的途径中使得该微生物或植物与在相同条件下培养或生长的野生型微生物或植物相比产生的该产物量增加的任何增强,或上调。在本发明的一个实施方案中,微生物或植物合成类胡萝卜素的能力增强可通过扩增该胡萝卜素合酶基因的表达来实现。扩增胡萝卜素合酶的表达可在任何合适的宿主细胞(例如,Thraustochytriales细胞,细菌细胞,酵母细胞,植物细胞)中通过例如,导入编码胡萝卜素合酶基因的重组核酸分子,或者对于Thraustochytriales,通过修饰天然胡萝卜素合酶基因的调控区来实现。
根据本发明,生物体或核酸分子的“选择性修饰”是指靶向或定向修饰,其中所作的修饰是通过例如,对本发明的胡萝卜素合酶的基因结构的知识预先确定和设计的。例如,生物体的选择性修饰可通过导入编码胡萝卜素合酶的重组核酸分子(例如,过量表达),或者通过定向修饰内源性基因,例如通过同源重组来完成。选择性修饰不同于随机诱变技术,其中在后一种方法中,突变是通过非靶向特异性方法随机产生的且随后通过筛选突变体的表型选择需要的表型。在本发明中可结合选择性修饰技术和传统随机诱变和筛选技术以产生各种遗传修饰的生物体。
因此,本发明的一个实施方案是提供用含有编码胡萝卜素合酶的核酸序列的重组核酸分子转化的微生物或植物。优选的含有该核酸序列的重组核酸分子包括含有本文前面所述的任一胡萝卜素合酶核酸序列的重组核酸分子。本发明的一个实施方案是提供用含有编码突变的,或同源的胡萝卜素合酶的核酸序列的遗传修饰的重组核酸分子转化的微生物或植物。该胡萝卜素合酶本文称为胡萝卜素合酶同源物,且包含本文所述的天然胡萝卜素合酶的任意一种,两种或三种酶活性。蛋白质同源物在本文已经进行了详细描述。
本发明的另一实施方案是提供通过生物合成法产生类胡萝卜素的遗传修饰的微生物,其中该微生物包含编码胡萝卜素合酶的核酸分子且其中编码胡萝卜素合酶的该核酸分子进行了修饰以提高胡萝卜素合酶的表达或生物学活性。该胡萝卜素合酶可以是本文所述的任何胡萝卜素合酶,包括本文所述的同源物和生物学活性片段。在本发明的一个方面,该微生物含有内源性胡萝卜素合酶(例如,Thraustochytriales的一个成员),且该内源性基因进行了修饰以提高胡萝卜素合酶的表达或活性(例如,通过导入比天然启动子产生的表达水平更高的启动子,通过遗传突变该内源性基因以提高该酶的活性,等等)。在另一实施方案中,通过用编码本发明的胡萝卜素合酶的重组核酸分子转化可遗传修饰该微生物。该微生物可以是任何合适的宿主微生物且在一个实施方案中,它是Thraustochytriales微生物(例如,Schizochytrium),以便该微生物可同时包含内源性胡萝卜素合酶和重组胡萝卜素合酶。在该方案中的胡萝卜素合酶不必相同,因为与本文公开的野生型Schizochytrium胡萝卜素合酶相比,该内源性和重组胡萝卜素合酶之一或两者可进行修饰以产生胡萝卜素合酶同源物。例如,可修饰该内源性和重组胡萝卜素合酶之一或两者以提高胡萝卜素合酶的表达或活性。
因此,本发明的一个实施方案是含有本文所述的任一微生物的生物量,其中该微生物含有编码胡萝卜素合酶的核酸分子,该核酸分子如上所述进行了修饰以提高胡萝卜素合酶的表达或生物学活性。本文使用的生物量是指从发酵或培养过程中收获的微生物细胞群体。用于接种,生长和回收微生物生物量的各种发酵参数在美国专利号5,130,242中详细讨论,本文以其整体引用以供参考。可干燥(例如,喷雾干燥,洞道干燥(tunnel drying),真空干燥,或类似方法)从发酵过程回收的生物量并用于任何食品,药品或其它所需产品。另外,收获并洗涤的生物量可在各种产品中直接使用(不经干燥)。为了延长其货架寿命,该潮湿的生物量可进行酸化(大约pH=3.5-4.5)和/或巴氏消毒或急速加热以灭活酶,然后在真空或非氧化空气(例如N2或CO2)中装罐,装瓶或者包装。
本发明的一个实施方案是通过生物合成过程产生类胡萝卜素的方法,包括在发酵培养基中培养如上所述提高了胡萝卜素合酶的表达或生物学活性的遗传修饰的微生物。例如,该微生物可具有提高的本文所述的任何胡萝卜素合酶蛋白,包括同源物和其酶活性部分的表达或生物学活性。该胡萝卜素合酶可以是根据本发明的内源性胡萝卜素合酶和/或重组胡萝卜素合酶。该微生物可在合适的培养基中,在有效产生所需类胡萝卜素或其它脂类产物的条件下培养或生长。合适的,或有效的培养基是指本发明的遗传修饰的微生物在其中培养时,能够产生所需产物的任何培养基。该培养基一般是含有可同化的碳,氮和磷酸盐来源的含水培养基。该培养基也可包含合适的盐,无机物,金属和其它营养成分。本发明的微生物可在常规发酵生物反应器中培养。该微生物可通过任何发酵方法培养,该发酵方法包括,但不限于,分批,补料分批,细胞再循环,和连续发酵。根据本发明的潜在宿主微生物的优选生长条件是本领域熟知的。该遗传修饰的微生物产生的目的产物可使用常规的分离和纯化技术从发酵培养基中回收。例如,可过滤或离心该发酵培养基以去掉微生物,细胞碎片和其它颗粒性物质,且该产物可通过常规方法,例如,离子交换,色谱法,提取,溶剂萃取,膜分离,电透析,逆向渗透,蒸馏,化学衍生化和结晶,从无细胞上清中回收。另外,产生所需产物的微生物,或提取物及其各种分离成份不需从诸如本发明的生物量的产物中去掉微生物成份就可使用。
本发明的一个实施方案是通过生长或培养本文前面所述的本发明的遗传修饰的植物产生类胡萝卜素的方法。该方法包括在发酵培养基中培养或在合适的环境,例如土壤中生长具有遗传修饰以提高胡萝卜素合酶的作用的植物的步骤。优选的是,该遗传修饰包括用表达具有胡萝卜素合酶生物学活性的蛋白质的重组核酸分子转化或转染该植物。该蛋白质可包括本文所述的任一胡萝卜素合酶,包括天然存在的具有生物学活性的胡萝卜素合酶的任何同源物。
在产生本发明的类胡萝卜素的方法中,具有遗传修饰以增强胡萝卜素合酶作用的植物在发酵培养基中培养或者在诸如土壤的合适培养基中生长以产生胡萝卜素合酶。合适的,或有效的发酵培养基在上文中进行了详细讨论。高等植物合适的生长培养基包括任何植物生长培养基,包括,但不限于,土壤,沙土,支持根生长的任何其它颗粒性培养基(例如,蛭石,perlite,等)或者水培培养基,以及合适的光照,水和优化高等植物生长的营养添加剂。通过增强胡萝卜素合酶的作用可改造本发明的遗传修饰的植物以产生有效量的类胡萝卜素。通过从植物中提取类胡萝卜素的纯化过程可回收该类胡萝卜素。在一个优选的实施方案中,通过收获植物或植物部分(例如,种子)回收该类胡萝卜素。在该实施方案中,该植物或植物部分可以其天然状态被消费或者进一步加工成可消费的产品。
本发明的另一实施方案涉及缺乏色素形成的遗传修饰的微生物,其中该微生物进行了遗传修饰以选择性缺失或失活胡萝卜素合酶基因或其功能域编码部分(例如,任意一种,两个或三个本发明的胡萝卜素合酶的功能性酶结构域,即PD,PS和/或LC)。胡萝卜素合酶基因包括本文前面所述的编码胡萝卜素合酶的核酸分子。在一个优选的实施方案中,该微生物是显微藻类,且在一个更优选的实施方案中,它是Thraustochytriales微生物(例如,Schizochytrium)。通过修饰胡萝卜素合酶基因的编码区或者胡萝卜素合酶基因的调控区可修饰胡萝卜素合酶基因,以便降低,且优选抑制该胡萝卜素合酶基因的表达和/或生物学活性,使得该微生物缺乏色素形成。在一个实施方案中,该胡萝卜素合酶基因被部分或完全缺失或失活,包括通过用无CS的核酸序列取代该基因,例如通过同源重组进行基因破坏。在该方面,通过用与胡萝卜素合酶基因杂交的包含破坏胡萝卜素合酶基因编码区的异源性核酸序列的核酸序列进行靶向同源重组可突变或失活(或缺失)该胡萝卜素合酶基因(见实施例)。
无色(缺乏色素形成)微生物的产生具有商业效益。首先,含有胡萝卜素合酶的微生物包括Thraustochytriales成员,它是已知有价值的生物体,用于产生含有高水平的多不饱和脂肪酸(PUFAs)的脂类,包括诸如ω-3脂肪酸的高度不饱和脂肪酸。PUFAs包括带有三个或更多双键的任何ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸。ω-3PUFAs是最终烯键从脂肪酸的末端甲基基团且包括该基团有三个碳的聚乙烯脂肪酸且包括例如,二十二碳六烯酸C22:6(n-3)(DHA),二十碳五烯酸C20:5(n-3)(EPA),ω-3鲱油酸C22:5(n-3)(DPAn-3),十八碳四烯酸C18:4(n-3)(SDA),和亚麻酸C18:3(n-3)(LNA)。ω-6PUFAs是最终烯键从脂肪酸末端甲基基团且包括该基团有6个碳的聚乙烯脂肪酸且包括,例如,花生四烯酸C20:4(n-6)(ARA),C22:4(n-6),ω-6鲱油酸C22:5(n-6)(DPAn-6),γ亚麻酸C18:3(n-6)(GLA)和二高γ亚麻酸(dihomogammalinolenic acid)C20:3(n-6)(二高GLA)。PUFAs可以是在包括游离脂肪酸的天然脂类和含有PUFA残基的化合物,包括磷脂;脂肪酸的酯;三酰甘油;二酰甘油酯;单甘油酯;溶血磷脂;磷脂;等中发现的任一共有形式。多不饱和脂肪酸(PUFAs)认为可用于营养,制药,工业,和其它目的。来自天然来源和从化学合成的PUFAs的广阔供应仍不足以满足商业需要。Thraustochytriales的成员,例如Schizochytrium积聚大量富含PUFAs的三酰甘油。例如,可培养Schizochytrium以产生大量的二十二碳六烯酸(DHA;22:6ω3)和鲱油酸(DPA;22:5ω-6);例如,占干重30%的DHA+DPA(Barclay等,J.Appl.Phycol.6,123(1994))。其它PUFAs,包括有价值的ω-3脂肪酸,可使用诸如Thraustochytriales成员的生物体,通过遗传修饰该微生物的PUFA产量分布(profile)来产生,这是2002年4月16日申请的,发明名称为“PUFA聚酮化合物合酶系统及其用途”的美国专利申请流水号10/124,800的主题,本文以其整体引用以供参考。
由于存在类胡萝卜素合成途径,诸如Thraustochytriales成员的微生物的脂类产品一般是有色的。由于脂类产品用于各种食品和其它商品,因此产生无色,或缺乏色素形成的微生物和脂类产品是有用的,它在某些应用中可能是审美需要的。另外,不受理论的约束,有公开的报导表明诸如β-胡萝卜素的类胡萝卜素在某些情况下可充当氧化剂前体(例如,Beutner等,J.Sci.Food Agric.81,559(2001))。因此,用于商品产生的微生物产生的β-胡萝卜素和其它类胡萝卜素减少可提高从其产生的脂类产品的稳定性。
因此,本发明的另一实施方案涉及含有遗传修饰的微生物(例如,Thraustochytriales目的微生物(例如,Schizochytrium,破囊壶菌属))的生物量,该微生物与同种的野生型微生物相比色素形成减少,如上所述。本发明还包括从遗传修饰的微生物(例如,Thraustochytriales目的微生物)的培养物中回收的缺乏色素形成的脂类,其中该微生物如上所述进行了遗传修饰以选择性缺失或失活胡萝卜素合酶基因。应明白可发现含有与本文所述的胡萝卜素合酶同源的胡萝卜素合酶的非Thraustochytriales的生物体。也可修饰该微生物以降低胡萝卜素合酶的表达或活性,特别是如果该微生物或由该微生物产生的产品在例如,商品中有用的话。本发明还包括含有缺乏色素形成的生物量或脂类的产品,例如,食品或药品以及利用本发明产生的脂类的其它产品。
本文使用的术语“脂类”包括磷脂;游离脂肪酸;脂肪酸的酯;单-,双-和三酰甘油;固醇和固醇酯;类胡萝卜素;叶黄素(例如,oxycarotenoids);碳氢化合物(例如,蜡);类异戊二烯衍生的化合物和本领域的技术人员已知的其它脂类。本文使用的食品包括任何食品成份(例如,作为另一食品的一部分的食品,例如油),且还包括,但不限于:精制面包商品,面包卷,早餐谷类食品,加工和未加工的乳酪,调味品(番茄酱,蛋黄酱,等),乳制品(乳,酸乳),布丁和胶质甜点,碳酸饮料,茶,粉末状饮料混合物,加工的鱼类产品,水果饮料,口香糖,硬甜食,冷冻乳制品,加工的肉产品,坚果和坚果涂布品(spreads),意大利面食,加工的禽类产品,肉汁和酱油,马铃薯片和其它薄片或脆片,巧克力和其它甜食,汤和汤混合物,豆制品(奶,饮料,奶油,增白剂),植物油涂布品,和蔬菜饮料。其它产品包括食谱添加剂,药物配制品,人源化动物奶,和婴儿配方。合适的药物配制品包括,但不限于,抗炎症配制品,化疗剂,活性赋形剂,骨质疏松症药品,抗抑郁剂,抗惊厥剂,抗-幽门螺杆菌(Heliobactor pylori)的药物,治疗神经变性疾病的药物,治疗肝脏变性疾病的药物,抗生素,降胆固醇配制品,用于治疗选自由如下组成的组中的一种病症的产品:慢性炎症,急性炎症,胃肠道紊乱,癌症,恶病质,心脏再狭窄,神经变性疾病,肝脏变性疾病,血脂病症,骨质疏松症,骨关节炎,自体免疫疾病,惊厥前期,早产,老年相关性黄斑病,肺病,和过氧化物酶体病症。
因此,本发明的另一实施方案涉及从生物合成过程产生缺乏色素形成的脂类的方法,包含按本文前面所述在有效产生该脂类的条件下培养遗传修饰的微生物(例如,Thraustochytriales目的微生物),其中该微生物按上述进行了遗传修饰以选择性缺失或失活胡萝卜素合酶基因。使用本领域已知的各种回收技术中的任一种可回收该脂类或者可回收该完整的微生物或其提取物。本发明的一个方面涉及从生物合成过程回收缺乏色素形成的脂类的方法,包括从遗传修饰的微生物(例如,Thraustochytriales目的微生物)的培养物中回收脂类,其中该微生物按上述进行了遗传修饰以选择性缺失或失活胡萝卜素合酶基因。从培养物中回收脂类的技术是本领域已知的,且包括,但不限于,离子交换,色谱法,提取,溶剂萃取,相分离,膜分离,电透析,逆向渗透,蒸馏,化学衍生化和结晶。
本发明的另一实施方案是使用分离的胡萝卜素合酶,包括本文所述的胡萝卜素合酶的同源物,产生类胡萝卜素或其衍生物的方法。该方法可分批或者以连续的方式使用搅拌箱,活塞流柱反应器或本领域的技术人员已知的其它装置进行操作。
在一个实施方案中,该胡萝卜素合酶与固相支持物结合,即,固定化酶。本文使用的与固相支持物结合的胡萝卜素合酶(即,固定化胡萝卜素合酶)包括固定的分离的胡萝卜素合酶,固定的含有胡萝卜素合酶的细胞(包括固定的Thraustochytriales,细菌,真菌(例如,酵母),显微藻类,或植物细胞),稳定的完整细胞和稳定的细胞/膜匀浆产物。稳定的完整细胞和稳定的细胞/膜匀浆产物包括来自天然存在的表达胡萝卜素合酶的微生物或来自本文它处公开的遗传修饰的微生物或植物的细胞和匀浆产物。因此,尽管下文讨论了固定化胡萝卜素合酶的方法,但是可预期该方法同样适用于固定化细胞且在这样一个实施方案中,可裂解细胞。
固定化酶的各种方法在Industrial Enzymology,第二版,Godfrey,T.和West,S.Eds.,Stockton Press,New York,N.Y.,1996,第267-272页;Immobilized Enzymes,Chibata,I.Ed.,Halsted Press,New York,N.Y.,1978;Enzymes and Immobilized Cells in Biotechnology,Laskin,A.Ed.,Benjamin/Cummings Publishing Co.,Inc.,Menlo Park,California,1985;和Applied Biochemistry and Bioengineering,Vol.4,Chibata,I.和Wingard,Jr.,L.Eds,Academic Press,NewYork,N.Y.,1983中公开,本文以其整体引用。
简单的说,固相支持物是指与胡萝卜素合酶(或细胞)形成键而不明显影响分离的胡萝卜素合酶的活性的任何固相有机支持物,人工膜,生物聚合物支持物,或无机支持物。举例性的有机固相支持物包括多聚体,例如聚苯乙烯,尼龙,酚-醛树脂,丙烯酸共聚物(例如,聚丙烯酰胺),稳定的完整全细胞,和稳定的粗制全细胞/膜匀浆产物。举例性的生物聚合物支持物包括纤维素,多聚葡聚糖(polydextrans)(例如,
),琼脂糖,胶原和几丁质。举例性的无机支持物包括玻璃珠(多孔或无孔),不锈钢,金属氧化物(例如,多孔陶瓷,例如ZrO
2,TiO
2,Al
2O
3,和NiO)和沙子。优选的是,该固相支持物选自由稳定的完整细胞和/或粗制的细胞匀浆产物组成的组中。该支持物的制备需要操作和花费最少。另外,该支持物给该酶提供优良的稳定性。
例如,通过使用双功能交联剂(例如,戊二醛)稳定细胞和细胞匀浆产物可产生稳定的完整细胞和/或细胞/膜匀浆产物。在完整细胞和细胞膜中,细胞壁和膜充当固定化支持物。在该系统中,整合的膜蛋白在“最佳”脂类膜环境中。无论以完整细胞还是以匀浆产物开始,在该系统中细胞不再是“活的”或者“有新陈代谢的”,或者作为选择,细胞是“静息的”(即,该细胞维持代谢潜力和有活性的胡萝卜素合酶,但在培养条件下不生长);在任一情况下,固定化细胞或膜可用作生物催化剂。
胡萝卜素合酶可通过各种方法结合到固相支持物上,包括吸附,交联(包括共价键),和包埋。吸附可通过范德华力,氢键,离子键,或疏水键。用于吸附固定化的举例性固相支持物包括聚合物吸附剂和离子交换树脂。小珠形式的固相支持物是特别合适的。可选择吸附固相支持物的颗粒大小以便该固定化酶可被网孔滤器留在反应器中而底物(例如,用作起始原料以产生所需类胡萝卜素的前体或底物)以所需速率流过反应器。对于多孔颗粒支持物,可控制吸附过程以允许胡萝卜素合酶或微生物细胞包埋在该颗粒的空穴中,从而提供保护而无不可接受的活性损失。
胡萝卜素合酶与固相支持物的交联包括在固相支持物和胡萝卜素合酶之间形成化学键。可预期尽管交联一般包括使用中间化合物交联胡萝卜素合酶与固相支持物,但是也可不使用中间化合物在酶与固相支持物之间直接形成共价键。交联通常使用双官能或多官能试剂将酶的羧基,氨基,巯基(sulfur group),羟基或其它官能团活化并附着到固相支持物上。术语“活化”是指允许在官能团上形成键的官能团的化学转化。举例性的氨基活化剂包括水溶性碳二亚胺,戊二醛,溴化氰,N-羟基琥珀酰亚胺酯,三嗪,氰尿酰氯和羰基二咪唑(carbonyl diimidazole)。举例性的羧基活化剂包括水溶性碳二亚胺,和N-乙基-5-苯基异唑(phenylisoxazolium)-3-磺酸。举例性的酪氨酰活化剂包括重氮化合物。举例性的巯基活化剂包括二硫基双-5,5′-(2-硝基苯甲酸),和谷胱甘肽-2-吡啶基二硫化物。用于将酶与固相支持物直接共价交联的系统包括Eupergit
,即可从Rohm Pharma(Darmstadt,Germany)获得的聚甲基丙烯酸酯珠粒支持物,可从Sterling Organics获得的硅藻土(Macrosorbs),可从English China Clay作为“Biofix”支持物获得的高岭石,可从W.R.Grace获得的,通过硅烷化活化的硅胶,和可从UOP(Des Plaines,IL)获得的高密度矾土。
也可使用包埋固定化胡萝卜素合酶。包埋胡萝卜素合酶包括形成,特别是凝胶(使用有机或生物多聚体),囊泡(包括微囊化),半透膜或其它基质。用于包埋酶的举例性的材料包括胶原,明胶,琼脂,三醋酸纤维,藻酸盐,聚丙烯酰胺,聚苯乙烯,聚氨酯,环氧树脂,角叉菜胶,和卵清蛋白。一些多聚体,特别是三醋酸纤维可用于包埋该酶,因为它们可掺入纤维中。诸如聚丙烯酰胺凝胶的其它材料可在溶液中聚合以包埋该酶。还有其它材料,例如用可聚合的乙烯基末端基团官能化的聚乙二醇寡聚体,通过在光敏剂存在下用紫外光照射形成交联多聚体可包埋酶。
用本文所述的本发明的任一方法产生的类胡萝卜素可通过常规方法回收。使用本发明的任一方法产生的优选的类胡萝卜素包括,但不限于:β-胡萝卜素,虾青素,角黄素,羟基-角黄素,玉米黄质,β-隐黄素,海胆酮,堇菜黄素,α-胡萝卜素,叶黄素,番茄红素,和任一上述类胡萝卜素的酯和糖苷。
本发明还包括能够选择性结合本发明的胡萝卜素合酶的分离的(即,从其天然环境取出的)抗体,或其抗原结合片段(例如,胡萝卜素合酶抗体)。术语“选择性结合”是指一个蛋白与另一蛋白的特异性结合(例如,抗体,其片段,或抗原的结合配偶体),其中通过任何标准测定法(例如,免疫测定法)测定的结合水平比该测定的背景对照在统计学上显著更高。例如,当进行免疫测定时,对照一般包括仅含有抗体或抗原结合片段(即,不存在抗原)的反应孔/管,其中在不存在抗原时抗体或其抗原结合片段的反应量(例如,与孔的非特异性结合)认为是背景。结合可使用本领域的各种标准方法测量,包括酶免疫测定(例如,ELISA),免疫印迹测定,等。本发明的抗体可以是多克隆或单克隆的,功能等价物,例如抗体片段和遗传改造的抗体,包括单链抗体或嵌合抗体,包括可结合一个以上表位的双特异性抗体。
一般来说,在抗体产生中,将需要其抗体的抗原与合适的的实验动物,例如,但不限于,兔,绵羊,仓鼠,豚鼠,小鼠,大鼠,或鸡接触。一般来说,用注射进动物的有效量的抗原免疫动物。抗原的有效量是指诱导动物产生抗体所需的量。然后允许动物的免疫系统在预定的时期内应答。重复该免疫过程直到发现该免疫系统产生抗该抗原的抗体。为了获得抗原特异性的多克隆抗体,可从含有所需抗体的动物回收血清(或对于鸡,可从鸡蛋中收集抗体)。该血清可作为试剂使用。可通过例如,用硫酸铵处理血清从血清(或鸡蛋)中进一步纯化多克隆抗体。
单克隆抗体可根据Kohler和Milstein(Nature 256:495-497,1975)的方法产生。例如,可从免疫的动物脾脏(或任何合适的组织)中回收B淋巴细胞且然后与骨髓瘤细胞融合以获得能够在合适培养基中持续生长的杂交瘤细胞群体。产生所需抗体的杂交瘤可通过检测杂交瘤产生的抗体与目的抗原结合的能力来选择。
本发明的遗传工程抗体包括通过标准重组DNA技术产生的那些抗体,该技术包含操作和重表达编码抗体可变区和/或恒定区的DNA。具体例子包括,嵌合抗体,其中该抗体的VH和/或VL结构域来自与抗体剩余部分不同的来源,和CDR嫁接抗体(及其抗原结合片段),其中至少一个CDR序列和任选至少一个可变区构架氨基酸来自一种来源而可变区和恒定区的剩余部分(如果合适的话)来自不同的来源。嵌合和CDR-嫁接抗体的构建在例如,欧洲专利申请:EP-A 0194276,EP-A 0239400,EP-A 0451216和EP-A 0460617中描述。
2002年5月14日申请的,发明名称为“胡萝卜素合酶基因及其用途”的美国临时申请系列号60/380,721的完整说明书在本文中作为参考文献引用。
提供的下列实施例是用于例证的目的而不打算限制本发明的范围。
实施例
实施例1
下面的实施例描述了本发明的胡萝卜素合酶基因的鉴定,克隆和测序。
使用以前从Schizochytrium cDNA文库测序的,但不能公开获得的,内部来源的8500个克隆,用该克隆序列进行BLAST检索。这些cDNA克隆中命名为LIB3033-014-Q1-E1-C9的一个克隆的翻译序列与已知的八氢番茄红素合酶(PS)基因表现出强大的同源性。
以该DNA序列的大约400个碱基对开始,本发明人努力分离了与已知PS基因具有同源性的Schizochytrium基因。设计了一系列DNA引物并用于以Schizochytrium染色体DNA为模板的“基因组步查”PCR方法以顺序鉴定相邻DNA区。使用商业试剂盒(Clonetech,Inc.;Palo Alto,CA)和Schizochytrium基因组DNA构建文库。将成功的PCR产物克隆进大肠杆菌并纯化质粒DNA用于测序。另外,使用“逆向PCR”的一个应用(iPCR;Sambrook等,Molecular Cloning,1989,出处同上)。这些工作得到了一个含有与已知八氢番茄红素脱氢酶(PD)和番茄红素环化酶(LC)基因以及与PS基因同源的不同区域的大约5085bp的“毗连序列群(contig)”。尽管在PCR-产生的片段中本身存在序列差错,但是很可能这三个同源性区域以5’-PD-PS-LC-3’的顺序形成单个阅读框(ORF)。该预期的基因命名为胡萝卜素合酶(CS)。这些活性代表了类胡萝卜素生物合成中的三个连续的步骤,即如果有功能,可足以将牻牛儿基牻牛儿焦磷酸(GGPP)转化成β-胡萝卜素。
对EST文库更详细的检查后来鉴定了与CS毗连序列群同源的两个其它成员。第一个克隆命名为LIB81-022-Q1-E1-G1,它与刚好位于LIB3033-014-Q1-E1-C9上游的CS ORF同源而无重叠。第二个克隆命名为LIB81-021-Q1-E1-H1,从CS毗连序列群的上游(在其之外)开始并延伸进该毗连序列群大约208bp。该EST可能代表上游相邻基因,但通过BLAST检测与已知基因无同源性。该EST成员的出现强有力地表明CS毗连序列群含有包括调控(启动子)序列的CS基因的完整5’区。
上述5085bp的毗连序列群从该可能的基因起始密码子上游大约1400bp开始延伸并延伸通过大部分的LC结构域。即,没有检测到与预期基因结构一致的终止密码子。另外,在PCR产生的片段和“单向(one pass)”测序反应的典型毗连序列群中存在明显的序列错误。因此,必需获得并仔细测序从Schizochytrium基因组DNA获得的CS基因的克隆。在本发明人的实验室中已经构建了在λ噬菌体载体(Lambda Fix II;Stratagene,La Jolla,CA)中的一些基因组文库。本发明人设计了一种策略,其中如果其DNA明显与两种探针杂交,则该噬菌体只能认为是“预期的CS克隆”。评价了许多来自PS,LC,和“上游”(可能的ORF起点的5’区,或上游)区域的PCR引物对使用Schizochytrium基因组DNA作模板产生的强信号单产物PCR片段。选择最佳来自PS的片段并用于探测由插入载体λFIX II的来自Schizochytriumsp.ATCC20888基因组DNA的DNA片段组成的重组基因组文库。PS探针是洋地黄毒苷标记的相应于预期胡萝卜素合酶阅读框的部分PS结构域的探针。随后用洋地黄毒苷标记的从胡萝卜素合酶基因预期起点上游(“5’-前(prime)”)的序列产生的片段探测产生阳性信号的克隆。
与两种探针都产生杂交信号的一个λ克隆通过亚克隆和测序进一步鉴定。限制性分析表明来自该噬菌体的DNA含有一个大约18-20kb的克隆插入片段。该插入片段显示出除了在插入的DNA两侧的噬菌体载体上有两个NotI位点外还含有两个内部NotI限制性位点。因此,该插入的DNA可鉴定为大约1.2,6,和12kb大小的三个NotI片段。如果该毗连序列群和PCR片段的限制性图谱推测出可能的ATG起始密码子下游大约140bp处有一个特征性NotI位点(即,SEQ ID NO:1中的bp1542-1549),则将这三个NotI片段亚克隆进质粒载体(pBluescript II SK+)中用于测序。获得了6个构建体,代表分别以两种方向的3个片段。同样,使用XbaI酶获得了包含全部20kb插入片段的两个亚克隆(即,噬菌体载体中的两个XbaI位点在插入片段两侧且无内部XbaI位点)。
pCX010,pCX01 11.2kb NotI插入片段
pCX012,pCX013 6kb NotI插入片段
pCX014,pCX015 12kb NotI插入片段
pCX016,pCX017 20kb XbaI插入片段
从载体引物(越过NotI克隆位点并延伸进Schizochytrium DNA)测序三个NotI片段清楚地揭示获得了完整的CS基因(假定没有或仅有小内含子,据信Schizochytrium基因组DNA不含内含子)。具体地说,1.2kb NotI片段代表预期的CS ORF的上游和前140bp(很可能含有启动子元件),且12kb NotI片段代表该基因的剩余部分。显然,6kb NotI片段代表明显在CS基因下游的序列。
1.2kb和12kb的NotI克隆用于多序列反应。XbaI片段克隆用于证实该序列包含CS基因中的NotI位点。从两条链测序展开的毗连序列群中的每个碱基(除了5’上游和3’下游端尽头的那些碱基;见下文)至少一次。
这些成果产生了一个序列,测定为由6525bp组成的CS毗连序列群。CS ORF含有1268个氨基酸,通过BLAST分析清楚地分成上述具有明显同源性的PD(大约469aa),PS(大约275aa),和LC(大约222aa)结构域。这三个结构域通过与已知序列无可测同源性的50-60个氨基酸的区域分开。这些结构域之间的区域可能是单纯的接头区或酶“铰链”。通过BLAST发现这三个活性结构域内部是连续的。因此,似乎不可能在CS基因中存在内含子。
含有CS ORF和调控区的6525bp的毗连序列群的前5898bp本文以SEQ ID NO:1表示。包含SEQ ID NO:2的位置1406到5212(包含终止密码子)的CS ORF本文以SEQ ID NO:2表示。SEQ ID NO:2编码本文以SEQ IDNO:3表示的1268个氨基酸的本发明的胡萝卜素合酶。现在参照SEQ IDNO:3,CS蛋白的第一个结构域,即八氢番茄红素脱氢酶(PD)结构域,包含SEQ ID NO:3的氨基酸53到521且本文以SEQ ID NO:5表示。SEQ IDNO:5由本文以SEQ ID NO:4(SEQ ID NO:2的位置157至1563)表示的核酸序列编码。CS蛋白的第二个结构域,即八氢番茄红素合酶(PS)结构域,包含SEQ ID NO:3的氨基酸586至860且本文以SEQ ID NO:7表示。SEQID NO:7由本文以SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:2的位置1756至2580)表示的核酸序列编码。CS蛋白的第三个结构域,即番茄红素环化酶(LC)结构域,包含SEQ ID NO:3的氨基酸911至1132且本文以SEQ ID NO:9表示。SEQID NO:5由本文以SEQ ID NO:8(SEQ ID NO:2的位置2731至3396)表示的核酸序列编码。
CS蛋白(SEQ ID NO:3)的开始(N-末端)50-52个氨基酸显示与PD基因无同源性。相反,其前29个氨基酸预期极有可能代表信号序列(丹麦科技大学,生物序列分析中心)。很可能该序列将酶靶向细胞内的细胞器,很可能是内质网。有一个大约135的C-末端氨基酸序列与已知基因无明显的同源性。
该毗连序列群的上游区域由起始密码子ATG之前的1405bp组成(SEQID NO:1的位置1-1405)。SEQ ID NO:1的位置1-345代表从原始PCR产生的片段的序列数据且应谨慎看待,因为通过PCR本身会引入一些序列错误。对1.2kb NotI片段的测序清楚地鉴定了在该毗连序列群的bp346-349(SEQ ID NO:1的位置346-349)处的Sau3AI位点有一个“终点”,它在λ文库构建期间可能是部分裂解反应的位点。对上游序列的BLAST揭示与已知基因无显著同源性,尽管有一个EST位于该区域(见上文)。为了本发明的目的,位置1-1405,或至少位置346-1405代表了本发明的CS基因的调控区,它很可能含有CS基因的启动子。
对下游区域的分析揭示了从该毗连序列群外侧开始并向CS基因末端阅读的一个ORF(ORF2)。ORF2的终止密码子很可能产生一个大约690bp的基因间区域。在该区域中间具有功能未知的有趣特征:链长42bp(SEQ IDNO:1中的bp5698-5739),具有完整的交替TATAT,等。对ORF2的625bp进行BLAST揭示与广泛的各种真核来源的蛋白激酶具有强大同源性(数据未显示)。对两条链的测序证实该毗连序列群的核苷酸多达bp6479。因此,“6525bp CS毗连序列群”从bp346到bp6479的核苷酸序列具有高度可靠性,其位置346-5898在SEQ ID NO:1中显示。SEQ ID NO:1中缺少的部分6525bp毗连序列群是上文刚讨论的ORF2基因编码区的开始部分。
将SEQ ID NO:3(CS),SEQ ID NO:5(PD结构域),SEQ ID NO:7(PS结构域)和SEQ ID NO:9(LC结构域)分别与公共序列数据库比较揭示了下列相似序列的信息。SEQ ID NO:5代表八氢番茄红素脱氢酶结构域,它与来自盐杆菌属种类(Halobacterium sp.)(NC_002607)的八氢番茄红素脱氢酶在488个氨基酸中有34%的相同性(50%的同源性);与来自Methanothermobacter thermautotrophicus(NC_000916)的八氢番茄红素脱氢酶在476个氨基酸中有32%的相同性(51%同源性);与来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)(NC_003450)的八氢番茄红素脱氢酶在491个氨基酸中有33%的相同性(47%的同源性)。
SEQ ID NO:7代表八氢番茄红素合酶结构域,它与来自Mycobacteriumaureum(AJ133724)的八氢番茄红素合酶在292个氨基酸中有29%的相同性(39%的同源性);与来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(AL109962)的可能的八氢番茄红素合酶在269个氨基酸中有30%的相同性(39%的同源性);与来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(AF272737)的八氢番茄红素合酶在138个氨基酸中有37%的相同性(47%的同源性)。
SEQ ID NO:9代表番茄红素环化酶结构域,它与来自布拉氏须霉(Phycomyces blakesleeanus)(AJ278287)的番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶在230个氨基酸中有31%的相同性(45%的同源性);与来自布拉氏须霉(AJ276965)的八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶在230个氨基酸中有31%的相同性(45%的同源性);与来自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(L27652)的八氢番茄红素合酶在245个氨基酸中有29%的相同性(45%的同源性);且与来自稻恶苗赤霉(Gibberella fujikuroi)(AJ426417)的胡萝卜素环化酶在193个氨基酸中有30%的相同性。
SEQ ID NO:3代表本发明的完整胡萝卜素合酶蛋白,它与来自盐杆菌属种类(NP_280452.1)的八氢番茄红素脱氢酶在488个氨基酸中具有34%的相同性(51%的同源性);与来自Methanogthermobacterthermoautotrophicus(NP_276913.1)的八氢番茄红素脱氢酶在480个氨基酸中具有33%的相同性(52%的同源性);与来自谷氨酸棒状杆菌(NP_599858.1)的八氢番茄红素脱氢酶在480个氨基酸中具有33%的相同性(47%的同源性)。
实施例2
下面的实施例证实了本发明的胡萝卜素合酶基因的表达和功能。
接下来的工作集中在证实CS基因的功能。CS基因在同源和异源宿主中的成功表达和功能对于将CS基因及其产物用于各种应用具有极大的益处。针对这些目标,准备了三个平行的表达质粒方案。另外,构建了设计成通过单交换的同源重组或双交换的重组“敲除”染色体CS基因表达的质粒并通过转化检测(见实施例3)。质粒构建的详情如下。PCSZEO1和 DCSZEO2:(用于从其天然启动子表达CS和LC-缺陷型CS)。
将来自pCX017的大约5.1kb的EcoRI片段(含有完整的CS ORF(SEQ IDNO:1的位置1406-5212)),全部上游克隆的DNA(SEQ ID NO:1的位置1-1405),和大约270bp的下游DNA(SEQ ID NO:1的位置5213至位置5485)克隆进pBluescript SK(+)(Stratagene)的EcoRI位点。具有所需插入方向的构建体是pBSKCS6。
通过消化,稀释,和再连接从pBSKCS6中去掉HindE片段(大约950bp)以产生pBSKCS6ΔH。该缺失利用了LC结构域中的HindIII位点(SEQ IDNO:1中的bp4552-4557)并去掉了LC结构域的远端一半和所有下游的Schizochytrium序列。
接着,通过消化,稀释,和再连接分别从pBSKCS6和pBSKCS6ΔH去掉载体序列的小(大约60bp)XbaI片段以产生pBSKCS6ΔX和pBSKCS6ΔHΔX。去掉小XbaI片段有利于随后的步骤。
然后将含有Schizochytrium微管蛋白基因启动子(tub启动子),bleZeocin抗性基因,和病毒SV40终止子(“TZS”序列盒)的来自pTUBZEO11-2(Schizochytrium转化载体,详情参见共同未决的美国专利申请系列号10/124,807,出处同上)的大约1060bp XbaI片段克隆进pBSKCS6ΔX和pBSKCS6ΔHΔX的XbaI位点以分别产生pCSZEO1和pCSZEO2。
pTUBCS 11,pTUBCS 12,pTUBCS 13,和pTUBCS 14(用于从微管蛋白启动子表达CS,LC-缺失的CS,和信号序列缺失的CS)
将含有tub启动子邻近一半的来自pTUBZEO11-2的213bp的PstI/EcoRI片段定向克隆进载体pUC9的合适位点以产生pUC-TUB。
通过将来自pTUBZEO11-2的大约880bp的EcoRI片段(如上所述,含有tub启动子的远侧一半,Zeocin抗性基因,和SV40终止子)插入pUC-TUB的单一EcoRI位点以构建质粒pTZS5。通过特征性限制消化测定合适的方向。该程序将“TZS”序列盒有效转移进pUC9以便在随后的步骤中利用某些限制性位点。
接着,从CS基因的起点产生PCR片段以便克隆进在起始密码子处含有NcoI位点的所需大肠杆菌表达载体中。设计了两个反应:一个产生具有天然N-末端的蛋白质且第二个产生缺失了推定的信号序列的蛋白质(见实施例1)。然后将这些含有NcoI位点的构建体转移进pTZS5中用于Schizochytrium的微管蛋白启动子驱动的表达。另外,形成这些构建体还用于在大肠杆菌中表达(见下文)。设计PCR引物CAX049以便将CS起始ATG密码子(SEQ ID NO:1中的bp1406-1408)转换成NcoI限制性位点(CCATGG)。同样,设计引物CAX050同时将aa29的密码子(SEQ ID NO:1中的bp1490-1492)转换成起始ATG和NcoI位点。任一引物分别在下游密码子aa2或aa30处没有产生改变。反向引物(CAX048)选择KpnI位点(SEQ IDNO:1的bp1859-1864)的下游以便使用pCX016作模板与CAX049产生510bp的产物且与CAX050产生426bp的产物。
来自上文刚描述的PCR反应的DNA用NcoI和KpnI消化,凝胶纯化该片段并分别克隆进商业上可获得的表达载体pTrcHis2B(Invitrogen;Carlsbad,CA)的合适位点,产生质粒pCSNK2(天然N末端)和pCSNKI8(截短的N末端)。该载体在大肠杆菌中从高活性的trc启动子驱动表达。它还含有用于诱导型表达调控(用IPTG)的lacIq基因和多克隆位点下游的有效转录终止子。该载体还设计成在表达蛋白的C末端添加一个(His)6标记,但是该特征与本文所述的克隆步骤无关。测定了pCSNK2和pCSNK18的插入片段的DNA序列并显示出含有所需的NcoI位点且还与已知的CS基因序列匹配。
pTZS5(和pTUBZEO11-2)中的ble(Zeocin抗性)基因以NcoI/PmlI片段存在,其中NcoI位点的ATG是起始密码子。用PmlI消化产生平端。为了将N-末端CS编码区从pCSNK2和pCSNK18转移进pTZS5,采用紧靠(His)6标记编码区下游的pTrcHis2B载体中的DraI位点(平端)。限制性酶消化后通过凝胶纯化获得pCSNK2和pCSNK18的NcoI/DraI片段。同样获得用NcoI和PmlI消化的pTZS5的大载体片段(缺少ble基因)。将NcoI/DraI片段克隆进pTZS5载体片段中产生CS基因片段位于微管蛋白启动子“之后”的pTUBCS2(全长N-末端)和pTUBCS3(截短的N末端)。
最后,将CS基因的C-末端部分添加到pTUBCS2和pTUBCS3上。通过用KpnI消化将各质粒线形化并用虾碱性磷酸酶(SAP)处理以最小化随后载体末端的再连接。通过消化和凝胶纯化制备pBSKCS6和pBSKCS6ΔH(见上文)的KpnI片段。这些片段从早先在CS基因中的KpnI位点(通过上述PCR片段设计保留的)延伸到CS基因下游的载体KpnI位点。因此,它们分别含有CS C-末端的全长或截短(LC-缺失)部分。将各插入片段与各载体制品连接产生+/-信号序列(SS)和+/-LC结构域的4个可能的变异体。通过限制性消化证实插入片段的合适方向。命名如下(见下面表格):pTUBCS11:SS+,LC+;pTUBCS12:SS+,LC-;pTUBCS13:SS-,LC+;pTUBCS14:SS-,LC-。这些质粒有效导致tub/ble/SV40构建体中的ble基因被各种形式的CS基因取代而保持翻译起始位点在相同位置。它们不含用于转化Schizochytrium的选择标记且必需通过共转化导入。
PTHCS1,pTHCS2,pTHCS3,pTHCS4,DATCS1,pATCS2,pATCS3 和DATCS4:(用于在大肠杆菌中表达CS,LC-缺失的CS,和信号序列缺失的CS)
质粒pCSNK2和pCSNK18(见上文)分别用KpnI+EcoRI或KpnI+HindIII处理以制备载体片段(SS+/-)用于随后添加C-末端DNA片段。质粒pBSKCS6(见上文)同样用KpnI+EcoRI或KpnI+HindIII处理以释放分别含有或不含CS结构域的C-末端片段。(HindIII和KpnI位点的相关性已有描述;EcoRI位点位于CS基因下游的载体序列中)。载体片段与插入片段的连接如下:
载体片段 | 来自pBSKCS6的插入片段 | 所得质粒 |
pCSNK2KpnI+EcoRI(SS+)pCSNK2KpnI+HindIIII(SS+)pCSNK18KpnI+EcoRI(SS-)pCSNK18KpnI+HindIII(SS-) | KpnI+EcoRI(LC+)KpnI+HindIII(LC-)KpnI+EcoRI(LC+)KpnI+HindIII(LC-) | pTHCS1(SS+/LC+)pTHCS2(SS+/LC-)pTHCS3(SS-/LC+)pTHCS4(SS-/LC-) |
设计质粒pTHCS1到4用于在大肠杆菌中表达CS基因及其变异体。使用针对CS基因产生的抗血清/抗体通过Western印迹可检测这些质粒的表达(见下文)。然而,在大肠杆菌中从这些质粒功能性表达CS不会导致类胡萝卜素产生,因为该细菌正常情况下不会合成CS酶的预期底物,即牻牛儿基牻牛儿焦磷酸(GGPP)。由于存在某些克隆基因而合成GGPP的各种大肠杆菌菌株在文献中已有描述。这些克隆基因一般在与pTHCS 1到4不相容的克隆载体上携带。因此,构建了一组新的质粒,将它们设计成在相容载体中表达CS基因(和变异体)。选择质粒pACYC184作为相容载体用于有效共表达CS变异体与文献所述的产生GGPP的质粒。选择pACYC184和pTHCS1-4构建体中的限制性位点以允许或者将trc/CS/终止子和lacIq区转移到无ori(pTrcHis2B中的质粒复制起点)的pACYC184或者转移β-内酰胺酶基因(产生GGPP的质粒携带β-内酰胺酶基因且需要氨苄青霉素维持)。具体地说,用AseI和NruI消化pACYC184以产生含有pACYC184的ori和氯霉素抗性基因而无四环素抗性基因的载体片段。用NdeI和ScaI消化pTHCS1-4质粒以提供具有上述属性的片段。NruI和ScaI消化产生平端,且AseI和NdeI消化产生匹配的2bp 5’突出端的事实有利于将所得的trc/CS/终止子/lacIq片段克隆进部分pACYC184载体中。因此,定向克隆产生在pACYC184中的来自pTHCS1,2,3,和4的4个CS构建体,分别命名为pATCS1,2,3,和4。预期在合成GGPP的大肠杆菌菌株中从pATCS1到4功能性表达CS基因(和变异体)可产生以肉眼和分光光度法都可检测的类胡萝卜素色素。该产生可证实CS基因在异源性生物体中的功能性表达。
生物弹(Biolistic)转化方法
转化方法基本上按照最初在美国专利申请系列号10/124,807,出处同上所述的方法。使用生物弹PDS-1000/He粒子传递系统(Bio-Rad)。对于每次轰击,将大约5μg质粒DNA覆盖到3mg M-10钨微载体上。使用1100或1350psi爆破盘(rupture discs)对Schizochytrium进行轰击。“长满(grow-out)”4-6小时后,将轰击的细胞接种到含有150-300μg/ml Zeocin(Invitrogen)的琼脂板上。一般在4-8天回收转化子。
实验设计和结果
1.由其天然启动子驱动并在其后面有天然终止子的CS基因表达。
产生含有CS基因的质粒且包括上述Zeocin-抗性序列盒(“TZS”;Schizochytrium微管蛋白基因启动子,Zeocin[博莱霉素]抗性基因[ble],和病毒SV40终止子)。
用pCSZEO1(全长CS基因)和pCSZEO2(LC结构域缺失,见上文)转化Schizochytrium导致各质粒每μgDNA产生大约800个Zeocin-抗性菌落,而对照质粒pTUBZEO11-2的转化子为大约300个/μg。对照转化子一般颜色均一,而pTUBCS的转化子表现出从正常浅黄到黄/橙的逐渐色素形成。保存了产生最大色素形成的菌落的菌株用于进一步研究。一个pTUBZEO1转化子,即B4-2,和一个pTUBZEO2转化子,即B4-15,在实验中分别含有92和40ppm胡萝卜素,其中对照转化子含有16 ppm β-胡萝卜素。这些结果表明CS基因具有功能,且过量表达,并表现出“基因拷贝数”效应。令人感兴趣的是,pTUBZEO2转化子不能按预期产生可检测的番茄红素。也许由该构建体中截短的CS基因产生的番茄红素被原始全长拷贝的CS基因有效转化成β-胡萝卜素。
2.由微管蛋白基因启动子驱动且在其后为SV40终止子的CS基因
在概念上,使用上述“TUB/ZEO/SV40”启动子与CS基因代替Zeocin抗性基因。不需阳性选择,该质粒构建体通过共转化导入Schizochytrium。如美国专利申请系列号10/124,807,出处同上中所述,使用该系统的共转化可产生50%或更大的转化效率。
在用pTUBCS11或pTUBCS13与pTUBZEO11-2共转化的起始实验中,获得了极少的Zeocin抗性菌落(大约1/μgDNA)。至今从每个质粒获得了大约10个Zeocin-抗性转化子。一个pTUBCS11的转化子,即B5-1,是肉眼观察色素形成最强的菌株且在一个实验中显示含有115ppmβ-胡萝卜素(对照:16ppm;见下文)。色素产量显著高于对照,但仅略高于上文第一个实验中所述的假定“基因拷贝数”效应。
总之,上述表达设计多达4个ORF变异体。第一个是全长CS基因。第二个是缺失SEQ ID NO:3前29个氨基酸,即推定的信号序列的ORF;在该情况下,将ORF在氨基酸29处改造为ATG起始密码子和有用的限制性位点。可能全长CS基因在Schizochytrium中的过量表达可毒害(poison)该蛋白质的细胞内靶。同样,有可能信号序列可毒害该细菌系统。第三个变异体是在LC结构域中间截短的CS ORF。如果有功能,所得的PD/PS酶应将GGPP转换成番茄红素。该PD/PS酶本身与类胡萝卜素生物合成酶相比具有独特活性。第四个变异体是信号序列和LC联合缺失。质粒命名如下:
| 质粒 | 启动子 | 信号序列 | LC结构域 | 选择 |
12 | pCSZEO1pCSZEO2pTUBCS 11pTUBCS 12 | 天然天然微管蛋白微管蛋白 | ++++ | +-+- | zeocinzeocin(无)(无) |
3 | pTUBCS 13pTUBCS 14pATCS1pATCS2pATCS3pATCS4 | 微管蛋白微管蛋白trctrctrctrc | --++-- | +-+-+- | (无)(无)CmCmCmCm |
实施例3
本实施例描述了失活Schizochytrium中的胡萝卜素合酶基因
质粒构建
pCSKO1,DCSKO2,和pCSKO3
将内部CS ORF片段(KpnI至HindIII;2689bp)克隆进商业载体pTrcHis2B的合适位点以产生质粒pL35-4。
通过用XbaI线形化pL35-4,用虾碱性磷酸酶处理,并与来自pTUBZEO11-2的凝胶纯化的1122bp XbaI片段连接进一步改良质粒pL35-4以包含作为1122bp XbaI片段的来自pTUBZEO11-2的“TZS”序列盒。所得的质粒,即pCSKO1设计成转化进Zeocin抗性选择的Schizochytrium后通过单交换同源重组失活(“敲除”)染色体CS基因。
为了设计通过双交换同源重组敲除CS基因的质粒,将来自pCX017(见上文)的在大约5.1kb的EcoRI片段上的全长CS基因(包括全部已知的上游区和大约270bp的下游区(到SEQ ID NO:1的bp5480-5485的EcoRI位点))克隆进(限制性酶消化和磷酸酶处理后的)载体pUC9的EcoRI位点产生pL36-3。
pL36-3用DraIII(单个位点;SEQ ID NO:1的bp275-2773),Klenow片段,和虾碱性磷酸酶处理以便在CS基因中间“打开”质粒并产生平端。TUB/ZEO/SV40序列盒的XbaI片段(见上文)同样用Klenow片段处理以产生平端并连接进线形化载体中。获得了两个插入方向,且所得的质粒称为pCSKO2和pCSKO3。测序DraIII/XbaI接头表明四个接头中的三个具有预期的序列;pCSKO3中的一个接头具有单个额外的碱基对。
实验设计
用pCSKO1转化Schizochytrium 20888(设计成通过单交换事件敲除)时,以大约325/μg质粒DNA的频率获得Zeocin抗性菌落。(注意:对照质粒pTUBZEO 11-2的频率为60-140/μg质粒DNA,且在不存在DNA时的假转化不产生Zeocin抗性菌落)。在来自pCSKO1的Zeocin抗性转化子中,大约1/220形成白色,无色素的“白化”菌落。这些数据代表了CS基因按预期起作用的第一手证据。生长来自对照质粒pTUBZEO 11-2的两个“白化”转化子和正常色素形成的转化子用于类胡萝卜素分析。分析干生物量样品的类胡萝卜素含量。“白化”菌株没有检测到类胡萝卜素,而对照菌株具有适度含量(16ppm)的β-胡萝卜素。
设计质粒pCSKO2使得转化产生的大多数“白化”菌落预期是通过双交换同源重组进行基因破坏的结果。用该质粒转化Schizochytrium产生每μgDNA大约400个Zeocin-抗性菌落,且其中大约5%是“白化”菌落。类胡萝卜素分析揭示在两个选择的菌株中无可检测的色素(见下文)。另外,从这些菌株制备的染色体DNA的PCR分析表明CS基因确实被“TZS”序列盒破坏且不存在质粒载体序列。为了检测CS基因结构,使用与TZS序列盒插入位点两侧的CS基因序列同源的PCR引物CAX037(SEQ ID NO:1的bp2575-2594)和CAX046(SEQ ID NO:1的bp3006-3025)。破坏的基因预期用该引物对可产生大约1570bp的产物。为了检测载体序列的存在,设计了在β-内酰胺酶基因区任一端的两个引物对。具体地说,bla3/bla4引物对预期从β-内酰胺酶基因的邻近部分产生627bp的片段,而bla2/bla5对从β-内酰胺酶基因的远侧部分产生354bp的产物。在pCSKO2质粒在β-内酰胺酶基因内或者在任意两个PCR引物的位置之间发生重组的事件中用两个引物对进行分析是必需的。PCR分析来自pCSKO2转化子的DNA的结果如下。
菌株 | 色素形成 | CAX037 x CAX046 | bla3 x bla4 | bla2 x bla5 |
B6-1B6-2B6-4(<sup>*</sup>) | 无无黄/橙 | ~1600bp~1600bp~450bp(主要)~1600bp(次要) | 无无~630bp | 无无~350bp |
(*)pCSKO2的色素形成转化子
“白化”转化子仅具有破坏的CS基因且不含载体序列(至少无β-内酰胺酶基因区)。色素形成的转化子具有β-内酰胺酶基因区和未破坏的CS基因。后一菌株似乎也含有破坏的CS基因,因为如果pCSKO2质粒异位整合进宿主染色体则是可预期的。很可能在两个PCR产物之间强度的差异反应了大小和扩增效率的差异。因此,这些结果与在pCSKO2的“白化”转化子中通过双交换同源重组进行CS基因破坏完全一致。
下面是对从实施例2和3选择的转化子进行类胡萝卜素分析的小结。
下表显示了对摇瓶中生长的选定转化子通过HPLC进行类胡萝卜素分析的结果。为了进行这些实验,根据肉眼评估最高色素形成选择转化子。该转化子已经在上面实施例2和3中进行了描述。
在选择的转化子中的类胡萝卜素
菌株 CS质粒 β-胡萝卜素<sup>*</sup> 虾青素<sup>*</sup> 总类胡萝卜素<sup>*</sup> |
实验I B3-1 pCSKO1 n.d. n.d. n.d. |
(培养基 B3-2 pCSKO1 n.d. n.d. n.d. |
M50-20) B3-15 pTUBZEO11-2 16 n.d. 16 |
B4-2 pCSZEO1 92 n.d. 92 |
B4-15 pCSZEO2 40 n.d. 40 |
B5-1 pTUBCS11 115 n.d. 115 |
B6-2 pCSKO2 n.d. n.d. n.d. |
B6-3 pCSKO2 n.d. n.d. n.d. |
B6-4 pCSKO2 49 n.d. 49 |
|
实验II B3-15 pTUBZEO11-2 25 62 87 |
(培养基 B4-2 pCSZEO1 120 58 178 |
M2B) B5-1 pTUBCS11 133 127 260 |
n.d.:未检测到
*ppm(μg/g dcw);没有检测到可测量的其它类胡萝卜素。
如实验I所示,pCSKO1(单交换:B3-1,B3-2)和pCSKO2(双交换:B6-2,B6-3)的“白化”转化子不含可检测的类胡萝卜素。pCSKO2的有色素形成的转化子,即B6-4,产生49ppm的β-胡萝卜素。由于pCSKO2仅含有CS基因的内部片段(且无启动子),预期非“白化”转化子产生的色素代表基础或正常水平。与“基因拷贝数”解释一致,B4-2,即pCSKO1的转化子含有大约两倍基础水平的β-胡萝卜素。令人感兴趣的是,B4-15,即LC-缺陷型pCSZEO2的代表性转化子,含有接近基础水平的β-胡萝卜素且无番茄红素。该结果可能表明在该质粒中修饰的CS基因完全无功能。在菌株B5-1,即微管蛋白启动子驱动CS基因的pTUBCS11与pTUBZEO11-2的共转化子中可见最高的β-胡萝卜素水平。然而,B5-1中的β-胡萝卜素水平仅略高于B4-2,表明该强微管蛋白启动子的效益最小或者上游底物的量有限。
在实验II中,除了β-胡萝卜素外,生长条件导致产生叶黄素,虾青素(但是无有效含量的中间产物类胡萝卜素)。在检测的菌株中,类胡萝卜素产生水平表现出与实验I所述相同的相关性。“拷贝数”构建体,即pCSZEO1,产生大约两倍的对照(pTUBZEO11-2)总类胡萝卜素水平,且“过量表达”构建体,即pTUBCS11,产生略高的产量。
实施例4
下面的实施例描述了胡萝卜素合酶抗体的产生。
将翻译的(部分)CS阅读框一级结构的氨基酸序列提交到StrategicBiosolutions(Ramona,CA)上用于通过其所有人的软件进行分析以预测大多数抗原区/肽。认为来自PD结构域的如下12肽具有高抗原性:RLVDRLMDEAKA(SEQ ID NO:3的aa176-187)。通过ResGen(Huntsville,AL)合成该肽并用于在兔中产生多克隆抗血清。具体地说,在第1天,第2周,第6周,和第8周通过皮下注射0.5mg肽免疫两只新西兰白兔。在第0天(预抽血)和第4,8,和10周收集血液并制备血清。血清冷冻贮存。
尽管详细描述了本发明的各种实施方案,显然本领域的技术人员可对这些实施方案进行修饰和改编。然而,应明确理解该修饰和改编在下面权利要求书所提出的本发明的范围内。