CN109355305A - 水稻OsMADS27基因和蛋白在提高水稻对氮肥利用率中的应用 - Google Patents

水稻OsMADS27基因和蛋白在提高水稻对氮肥利用率中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了水稻OsMADS27基因和蛋白在提高水稻对氮肥利用率中的应用。本发明经研究发现，水稻OsMADS27蛋白能够与硝酸盐转运蛋白辅助因子OsNAR2.1互作，过量表达OsMADS27基因可显著促进硝酸盐转运蛋白的表达，从而促进水稻对硝酸盐的转运及吸收，并促进氮肥利用率。本发明有助于研究与水稻氮素吸收相关的关键调控基因，将对养分高效植物品种的筛选和选育具有重要意义，同时也可为解释水稻氮素利用的生理机制、提高水稻的氮素利用效率及其品种遗传改良提供理论依据和技术支撑，本发明具有重要的理论意义及潜在的应用价值。

Description

水稻OsMADS27基因和蛋白在提高水稻对氮肥利用率中的应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及水稻OsMADS27基因和蛋白在提高水稻对氮肥利用率中的应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，占全世界禾谷类作物种植面积的1/3，我国是世界上水稻种植面积最大的国家。为了满足不断增长的人口需求，就必须提高水稻的产量，氮肥在水稻生产中的投入正成为增产的有力措施之一，但是氮肥的大量投入，不仅降低了氮素利用效率，同时人们对氮肥的不合理利用也带来了资源的浪费以及水体富营养化等一系列环境污染问题。因此，研究水稻吸收氮素的机制，充分了解水稻自身吸收利用氮素的潜力以提高水稻氮素利用效率，对于改良作物品种、减轻施肥对环境造成的压力且对于提高水稻单位面积的产量具有重要的生产实践价值及意义。
在植物所有必需营养元素中，氮(N)是三大营养元素之一，是限制植物生长和形成产量的首要因素，其对作物的生命活动和产量形成具有重要意义。土壤中植物生长过程主要的两种矿质氮源分别是铵态氮(NH4 +)和硝态氮(NO3 -)，而大部分的铵盐在植物的根里就已结合成有机化合物，而硝酸盐则可在木质部内运输，或储存在根、茎和其他储存器官细胞的液泡里。硝酸盐不仅可以作为一种代谢物质，而且作为一种有效的信号物质通过调控基因的表达影响植物的碳氮代谢以及生长和发育，并在液泡里对调节阳离子和阴离子的平衡和渗透势起重要作用，水稻根系泌氧作用使NH4 +氧化成NO3 -的能够被水稻有效利用。水稻虽是喜铵作物，但研究表明，即使水稻在淹水的土壤条件下种植，实际上有高达15％-40％的总氮是以硝态氮的形式加以吸收利用的。与单一的铵营养相比，在增硝营养条件下水稻能获得更大的生物产量和经济产量，且提高氮素利用率。
因此，借鉴模式植物中养分吸收利用研究的思路和技术手段，分离和鉴定水稻中与氮素吸收相关的关键基因，利用现代生物技术手段研究水稻OsMADS27基因与氮素吸收相关的潜在联系，对于阐明水稻的氮素吸收利用机制及提高作物产量具有重要的理论意义。
发明内容
本发明提供了一种水稻OsMADS27基因通过和硝酸盐转运蛋白辅助因子OsNAR2.1互作促进氮肥利用率的应用，该基因可作为目的基因在水稻中过量表达，与硝酸盐转运蛋白辅助因子OsNAR2.1互作可促进水稻体内硝酸盐转运蛋白的表达及对硝酸盐的吸收。
本发明提供了水稻OsMADS27基因在提高水稻对氮肥利用率中的应用。
所述的应用，包括：将所述水稻OsMADS27基因连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体，再将所述的重组表达载体转化受体植物。
重组表达载体的构建可采用常规方法，如可采用Gateway系统(Invitrogen公司)将水稻OsMADS27基因连入植物表达载体中。
所述植物表达载体为pH2GW7或pK2GW7。
所述重组表达载体中启动所述水稻OsMADS27基因表达的启动子为强启动子35S。强启动子能够启动水稻OsMADS27基因过表达，从而促进硝酸盐转运蛋白的表达及对硝酸盐的吸收。
所述水稻OsMADS27基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
所述的应用，先将所述重组表达载体转化农杆菌，再使用该农杆菌侵染受体植物。所述的农杆菌具体可以为农杆菌GV3101、EHA105等。
本发明还提供了水稻OsMADS27蛋白在提高水稻对氮肥利用率中的应用。
所述的应用，水稻OsMADS27蛋白通过与硝酸盐转运蛋白辅助因子OsNAR2.1互作提高水稻对硝酸盐的转运和吸收，从而提高对氮肥的利用率。
本发明经研究发现，水稻OsMADS27蛋白能够与硝酸盐转运蛋白辅助因子OsNAR2.1互作，过量表达OsMADS27基因可显著促进硝酸盐转运蛋白的表达，从而促进水稻对硝酸盐的转运及吸收，并促进氮肥利用率。本发明有助于研究与水稻氮素吸收相关的关键调控基因，将对养分高效植物品种的筛选和选育具有重要意义，同时也可为解释水稻氮素利用的生理机制、提高水稻的氮素利用效率及其品种遗传改良提供理论依据和技术支撑，本发明具有重要的理论意义及潜在的应用价值。
附图说明
图1为OsMADS27对营养元素(N)的响应方式分析结果图，其中图A为OsMADS27对N饥饿及重新供给NO3 -的响应方式，图B为OsMADS27在根中对不同氮源响应方式。
图2为水稻RNAi干扰株系中的OsMADS27表达量分析检测结果图。
图3为OsMADS27基因过表达检测结果图。
图4为OsMADS27蛋白的亚细胞定位图。
图5为OsMADS27过量表达及干扰对水稻中硝酸盐转运蛋白基因的影响结果图，其中图A为OsNAR1.2和OsNAR2.1，图B为OsNAR2.3a和OsNAR2.4。
图6为OsMADS27与OsNAR2.1在酵母细胞中相互作用分析结果图。
图7为OsMADS27与OsNAR2.1在烟草中相互作用分析结果图。
图8为水稻OsMADS27转基因植株中NO3 -、SO4 2-和PO4 3-的含量分析结果图，其中图A为NO3 -含量比较，图B为SO4 2-含量比较，图C为PO4 3-含量比较。
具体实施方式
实施例1
水稻OsMADS27基因的克隆。
(1)总RNA的提取。水稻(日本晴)幼苗至3叶期，取水稻幼苗的根迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右的根，用液氮研碎，研磨充分后放入1.5ml离心管，迅速加入TRIzol试剂(购自Invitrogen公司)，充分摇匀振荡后，抽提总RNA。
(2)cDNA的合成。
cDNA第一链合成采用M-MLV反转录体系(Takara code:D2639A)，步骤如下：
RNA 1-2μg
Oligo d(T)18 Primer(50μM) 2μl
RNase-free H2O补齐至 10μl
70℃水浴10min，冰上放置2min冷却。离心数秒使模板RNA/引物/水的变性溶液聚集于底部，然后加入：
42℃保温1h。70℃保温15min后冰上冷却，取出放-20℃保存。
以该水稻根系的cDNA为模板，通过NCBI网站查询获得OsMADS27(OSNPB_020579600)基因的CDS序列，利用Primer Primer 5.0软件设计引物，开展后续载体构建等实验。
(3)检测OsMADS27基因表达对硝酸盐的响应
将野生型材料日本晴种子消毒、浸种和催芽后均匀播种在培养网上，生长于水稻全营养液中(1.44mM NH4NO3,0.32mM NaH2PO4,0.5mM K2SO4,1mM CaCl2·2H2O,1.6mMMgSO4·7H2O,50mM Fe-EDTA,15mM H3BO3,9mM MnCl2·4H2O,0.12mM CuSO4·5H2O,0.12mMZnSO4·7H2O,40.5mM citric acid and,0.39mM Na2MoO4·2H2O)，用NaOH或HCl调节pH至5.5左右，每3d换一次营养液。10d大小的幼苗转移至以2.88mM KNO3为唯一氮源的水稻改良营养液中生长4d(0.32mM NaH2PO4,0.5mM K2SO4,1mM CaCl2·2H2O,1.6mM MgSO4·7H2O,50mMFe-EDTA,15mM H3BO3,9mM MnCl2·4H2O,0.12mM CuSO4·5H2O,0.12mM ZnSO4·7H2O,40.5mMcitric acid and,0.4μM Na2MoO4.2H2O)。选择生长一致的幼苗，一部分继续生长于2.88mMKNO3为唯一氮源的水稻改良营养液中(CK)，一部分进行N饥饿处理(以2.88mM KCl代替2.88mM KNO3，其它元素不变)。N饥饿3d后，进行N饥饿的部分幼苗重新供给2.88mM KNO3而另一部分继续N饥饿。重新供给KNO3 4h、6h及8h时取幼苗根部样品，液氮速冻，放于-80℃冰箱。以一直生长于KNO3营养液中未经过N饥饿的样品为对照，检测OsMADS27基因表达对硝酸盐变化的响应。
(4)OsMADS27基因表达对其它氮源的响应
将日本晴种子消毒、浸种和催芽后均匀播种在培养网上，生长在2.88mM KNO3为唯一氮源的水稻改良营养液中14d，每3d换一次营养液，用NaOH或HCl调节pH至5.5左右。选择生长一致的幼苗，一部分继续生长于2.88mM KNO3为唯一氮源的水稻改良营养液中(CK)，一部分进行N饥饿处理(以2.88mM KCl代替2.88mM KNO3，其它元素不变)。N饥饿3d后，对N饥饿的植株再分别供应含2.88mM KCl，2.88mM KNO3，2.88mM NH4Cl，2.88mM Gln或1.44mMNH4NO3的新鲜营养液，CK也换为新鲜营养液。3h时取植株根部样品，液氮速冻，保存于-80℃冰箱待用。以一直生长于KNO3营养液中未经过N饥饿的样品为对照，检测OsMADS27基因表达对硝酸盐变化的响应。
以对照基因OsNAR2.1(OSNPB_020595900)作为内参基因，进行qRT-PCR实验，在NCBI网站查询获得OsNAR2.1及OsMADS27的CDS序列，利用该序列通过Primer Primer 5.0软件引物，引物序列如下：
OsNAR2.1-FP：5'-AGGTGTTCCTCTCCAAGCTG-3'；
OsNAR2.1-RP：5'-CAGCTTCACCTTCACGCTCT-3'。
OsMADS27-FP：5'-GAAGCGGAGGAACGGGATCTTCAA-3'；
OsMADS27-RP：5'-TGCCATACCGATCTATAACTGACT-3'。
RT-PCR结果如图1所示，OsNAR2.1基因表达受NO3 -诱导，受N饥饿、NH4 +及谷氨酸盐抑制。OsMADS27基因表达在重新供给NO3 -4h及8h时显著升高，由此说明OsMADS27基因表达受NO3 -诱导(图1A)。且OsMADS27在N饥饿时表达量升高，重新供给KNO3及NH4NO3时表达量显著升高，而供给NH4 +时表达量显著下降，表明该基因主要受硝态氮强烈诱导，受铵以及氮的代谢物的抑制(图1B)。
实施例2
OsMADS27基因干扰载体构建和遗传转化。
(1)RNAi表达载体的构建
将OsMADS27基因的cDNA序列与水稻全长cDNA数据库进行比对，选取非保守区的200-300bp片段作为干扰片段，并以此干扰片段为目的干扰序列设计引物。所用载体为pTCK303，利用Primer Primer 5.0软件设计引物如下：
RiOsMADS27-FP：
5'-GCGACTAGTGGTACCGAATCGGAAGGGAAGTCTAG-3'；
RiOsMADS27-RP：
5'-GCGGAGCTCGGATCCTTGTTCGGCGTCACTATGT-3'。
以实施例1中水稻根系的cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，采用高保真酶PrimeHS DNA Polymerase(Takara Code：DR010A)体系。取50μl PCR产物和5μlDL2000 DNA Marker(Takara Code:D501A)，用1％琼脂糖凝胶电泳检测条带。将胶回收洗脱的DNA和载体质粒pTCK303用BamHI(Takara code:D1010A)/KpnI(Takara code:D1068A)进行双酶切，于37℃水浴锅内酶切3h，将酶切产物用AxyPrep PCR Cleanup Kit试剂盒(AXYGEN)清洗回收，将纯化后的PCR酶切产物与pTCK303载体酶切产物用T4 DNA Ligase(Takara code:D2011A)在16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α，将菌液涂布于含50mg/L Kanamycin的LB平板上，37℃倒置培养12h左右，长出单菌落。挑取单菌落进行PCR扩增，以空载体为阴性对照，PCR扩增鉴定阳性菌落。将阳性菌落于LB液体培养基中振荡培养，用过夜培养的菌液提取质粒进行酶切验证，将正确的菌液进行测序鉴定。
将构建好的RiOsMADS27中间载体和上述PCR产物进行SacI(Takara code:D1078A)和SpeI(Takara code:1086A)双酶切，将反应体系混合后于37℃水浴锅内酶切3h，然后将RiOsMADS27中间载体酶切产物和PCR酶切产物用T4DNA Ligase(Takara code:D2011A)在16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α，用黄枪头将菌液涂布于含50mg/L Kanamycin的LB平板上，37℃倒置培养12h左右，长出单菌落。挑取单菌落进行PCR扩增，以空载体为阴性对照，PCR扩增鉴定阳性菌落。将阳性菌落于LB液体培养基中振荡培养，用过夜培养的菌液提取质粒进行酶切验证，将正确的菌液进行测序鉴定，将获得的序列与OsMADS27的CDS序列通过NCBI网站进行比对，比对正确后转化EHA105农杆菌中。
(2)RNAi转基因植株的获得
将获得的转有表达载体的农杆菌，进一步转化至水稻。将T0代转基因水稻种子消毒后，30℃浸种2d，催芽后，播种于含25mg/L Hygromycin的水稻营养液中。野生型种子晚一天消毒、浸种和催芽，播种于水稻营养液中。7d后，抗性植株与野生型一起继续生长于水稻营养液中，两周后移入土中。移入土中3周后，取野生型和转基因水稻相同部位的根部，提取RNA，以OsActin(Os03g0718100)为参照基因，用qRT-PCR方法检测OsMADS27的基因表达量。所用引物序列如下：
OsActin-FP：5'-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGT-3'；
OsActin-RP：5'-CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCT-3'。
OsMADS27-FP：5'-GAAGCGGAGGAACGGGATCTTCAA-3'；
OsMADS27-RP：5'-TGCCATACCGATCTATAACTGACT-3'。
结果发现(如图2)：其中2个OsMADS27-RNAi转基因株系中OsMADS27基因的表达量受到有效干扰，由此说明通过RNA干扰(RNAi)技术得到了两个OsMADS27 knock-down突变体，后续实验将采用RiOsMADS27-15及RiOsMADS27-11两个株系。
实施例3
OsMADS27基因过量表达载体构建和遗传转化。
(1)过量表达载体的构建
以实施例1中水稻根系的cDNA为模板，所用载体为pENTR 1A，利用Primer Primer5.0软件设计引物如下：
OE-OsMADS27-FP：
5'-GCGGTCGACATGGGGAGGGGGAAGATTGT-3'；
OE-OsMADS27-RP：
5'-GCGCCATGGTCATGGATTCAACTGTAACC-3'。
PCR产物经酶切纯化后连接载体pENTR 1A，测序正确的初级载体，将与Gateway过量表达载体pH2GW7.0进行交换反应，使用Gateway LR ClonaseTM Enzyme Mix(Invitrogen，Cat.No.11791-019)，体系如下：
1)在1.5ml离心管中加入下列试剂，室温下混匀：
Entry clone 50-150ng
Destination vector 150ng
TE buffer(pH＝8.0) 补足至8μl
2)将LR ClonaseTM Enzyme Mix从-80℃冰箱中拿出，放在冰上2min，轻微涡旋混匀，每次2s。
3)每个样品中加入2μl LR ClonaseTM Enzyme Mix，短暂涡旋两次，轻微离心，用完后将LR ClonaseTM Enzyme Mix放回-80℃冰箱。
4)将混好的样品于25℃反应1h。
5)加入1μl Proteinase K solution混匀，37℃放置10min结束反应。
将上述5μl反应产物转化大肠杆菌DH5α，PCR验证阳性克隆，菌液培养后提取质粒进行双酶切验证。验证正确的质粒转化农杆菌GV3101。
(2)过量表达转基因植株的获得
将获得的转有表达载体的农杆菌，进一步转化至水稻。将T0代转基因水稻种子消毒后，30℃浸种2d，催芽后，播种于含25mg/L Hygromycin的水稻营养液中。野生型种子晚一天消毒、浸种和催芽，播种于水稻营养液中。7d后，抗性植株与野生型一起继续生长于水稻营养液中，两周后移入土中。移入土中3周后，取野生型和转基因水稻相同部位的根部，提取RNA，以OsActin(Os03g0718100)为参照基因，用qRT-PCR方法检测OsMADS27的基因表达量，所用引物同实施例2中所列。
在获得的转基因株系中，结果发现如图3所示，其中有四个株系的OsMADS27表达量与野生型相比显著升高，这说明我们得到了OsMADS27超量表达株系，后续试验将选用OEOsMADS27-20株系。
实施例4
OsMADS27蛋白的亚细胞定位。
(1)亚细胞定位载体构建
将OsMADS27ORF的N端与pCAMBIA1300::35S::YFP的C端融合，构建YFP::OsMADS27载体。从Rice Genome Annotation Project数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu)下载OsMADS27全长cDNA序列，利用Primer Primer 5.0软件设计引物，用带有限制性内切酶位点的引物：
OsMADS27-yfpN-FP：
5'-GCGGTCGACATGGGGAGGGGGAAGATTGT-3'
OsMADS27-yfpN-RP：
5'-CGAGCTCTCATGGATTCAACTGTAACCCTAGC-3'。
进行PCR扩增，采用高保真酶PrimeHS DNA Polymerase(TaKaRa Code:DR010A)体系。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，割胶回收后，产物用SalI/SacI进行双酶切，体系如下：
16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，用黄枪头将菌液涂布于含50mg/LKanamycin的LB平板上，37℃倒置培养12h左右。挑取单菌落进行PCR扩增，以空载体为阴性对照，PCR扩增鉴定阳性菌落，振荡培养阳性菌落然后提取质粒进行SalI/SacI双酶切验证，将酶切验证正确的菌液进行测序鉴定。测序正确的命名为YFP::OsMADS27载体，然后质粒转化农杆菌EHA105。
(2)烟草材料的准备
将含有核marker的转基因本氏烟种子消毒后种于MS培养基上，7d后生长一致良好的烟草移入穴盘中，每株一穴。放于16h光照，8h黑暗，27℃的生长室内培养。2-4周大小的烟草可作为转化材料。
(3)农杆菌浸染及结果观察
将鉴定正确的含有目的基因载体的农杆菌菌液接种于5ml LB液体培养基(100mg/L Rifampicin+50mg/L Hygromycin)中，28℃振荡培养过夜。将1ml农杆菌菌液转接到27mlLB液体培养基中(100mg/L Rifampicin+50mg/L Hygromycin，另外经抽滤灭菌的乙酰丁香酮)，28℃，160rpm振荡培养过夜。检测过夜培养菌液OD600的数值。5000g，15min集菌，用重悬液重悬菌体，最终OD600为0.4。室温放置2-3h后注射烟草表皮。将侵染液装入1ml注射器内，先用针头在叶片反面避开大叶脉处刺小洞，用拇指按压注射器将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内(勿使用子叶)。注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。注射24h后，在激光共聚交显微镜(Zeiss LSM 510)下检测YFP和RFP信号。
重悬液的配方如下：10mM MgCl2，10mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(pH5.6)高温高压灭菌15min，100μM乙酰丁香酮，高温高压灭菌。
结果发现：因OsMADS27蛋白的亚细胞位置决定了其功能，首先用亚细胞定位软件(http://psort.hgc.jp/)预测了OsMADS27蛋白位置，可知OsMADS27蛋白在细胞质、细胞核和线粒体上都有表达。为验证上述结果，采取农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法再次对OsMADS27蛋白进行亚细胞定位，由图4所示，OsMADS27蛋白主要在细胞核和细胞质中表达(cale bars＝20μm)，该结果与软件预测结果部分相同。
实施例5
OsMADS27转基因株系中硝酸盐转运蛋白的变化。
为检测OsMADS27与硝态氮积累转运的关系，在10mM NO3 -下检测野生型及转基因株系中4个硝酸盐转运因子(序列如表1)的表达变化。
表1
结果如图5所示，与WT相比，OsMADS27过量表达株系中根系和地上部分OsNRT1；2，OsNRT2；1，OsNRT2；3a和OsNRT2；4的表达量都显著升高，而干扰株系中根系和地上部分OsNRT1；2，OsNRT2；1，OsNRT2；3a和OsNRT2；4的表达量显著降低。以上结果表明：OsMADS27能够显著促进植物体内硝酸盐转运蛋白的表达，从而促进硝酸盐的转运及水稻对硝酸盐的吸收。
实施例6
验证OsMADS27与硝酸盐转运蛋白辅助因子OsNAR2.1的关系
(1)酵母双杂交方法验证OsMADS27和OsNAR2.1蛋白之间的相互作用关系
A.酵母双杂交的引物设计
利用Primer Primer 5.0软件设计引物。引物如下：
OsMADS27-BD-FP：5'-CGGAATTCGAGATCGATCGAGATAGCGGC-3'；
OsMADS27-BD-RP：5'-GCGTCGACATCCCTTCAGCATACAAGGGTG-3'。
OSNAR2.1-AD-FP：5'-CGGAATTCATCCAGAATCAGTCGGTTTG-3'；
OSNAR2.1-AD-RP：5'-CCATCGATGAACTTGCGTTTGCAGC-3'。
PCR程序：95℃变性5min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸时间，循环30次；72℃总延伸10min，22℃保温。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，割胶回收后，产物分别用EcoR I，Sal I及EcoR I，Cla I进行双酶切，于37℃酶切过夜并回收。
B.pGBKT7，pGADT7载体线性片段准备
克隆载体为pGBKT7，pGADT7，构建载体结构如下：用EcoR I，Sal I对pGBKT7双酶切，用EcoR I，Cla I对pGADT7双酶切，于37℃酶切过夜并回收。
C.OsMADS27和OsNAR2.1片段分别连入pGBKT7，pGADT7片段
16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，用黄枪头将菌液分别涂布于含50mg/L Kanamycin及100mg/L Ampicillin的LB平板上，37℃倒置培养12h左右。挑取单菌落进行PCR扩增，以空载体为阴性对照，PCR扩增鉴定阳性菌落，振荡培养阳性菌落然后提取质粒进行双酶切验证，将酶切验证正确的菌液进行测序鉴定。测序正确的命名为BD-OsMADS27及AD-OsNAR2.1载体。
D.酵母感受态的制备
1)挑取AHl09克隆接种于5ml YPAD液体培养基，30℃振荡培养20h(过夜)，OD600达到1.0左右。
2)将此5ml菌液接入大体积(体积视转化个数定)YPAD中培养4h左右，使培养液OD600达到1.5以上；
3)50ml离心管收集菌液，1000g，离心5min弃上清，收集菌体；
4)27ml ddH20重悬菌体，3000g，离心5min弃上清，收集菌体；
5)900μl ddH20重悬菌体，再移至1.5ml EP管中；
6)13000rpm，1min离心收集菌体，弃上清。用0.1mMLiAc重悬使终体积约为lml(约加700μl LiAc)，30℃摇10min；
7)分于EP管中，每管加入100ul LiAc悬浮的溶液，13000rpm，1min，移去上清；此时的酵母感受态细胞可接受外源质粒DNA。
E.将质粒OsMADS27-pGBKT7(Bait质粒)，OsNAR2.1-pGADT7质粒(Prey质粒)和无Bait基因共转化入AHl09中
1)每管加约300ng基因质粒，10μl预变性的ssDNA，240μl 50％PEG，36μl 1M LiAc，再加ddH20，使终体积为360μl；
2)放置于30℃培养箱或者水浴中孵育30min，15min时混匀一次；
3)30min后，42℃水浴热激30min；
4)冰上放置5min，13000rpm离心5min，弃上清，收集菌体；
5)lml ddH20洗涤一次菌体；
6)利用残余液体重悬菌体，涂布于SD/-Leu-Trp平板上。30℃培养箱培养2-4天；
7)将长起来克隆挑取溶于ddH20，再点于SD/-Leu-Trp-His-Leu+3-AT平板上。30℃培养箱培养2-4天；
ssDNA在使用之前，先沸水变性30min，每隔10min打开将EP管的盖子打开，放气一次，以免液体受热冲出EP管。时间到后立即将其置于冰上备用。
结果发现：如图6所示，将BD-OsMADS27及AD-OsNAR2.1的质粒共转入酵母感受态细胞后，获得的酵母菌既能在二缺培养基(SD/-Trp/-Leu)上生长，又能在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His)上生长，由此说明，OSMADS27蛋白与OSNAR2.1蛋白在酵母体内存在阳性互作。
(2)BIFC(双分子荧光互补)方法验证OsMADS27和OsNAR2.1蛋白之间的相互作用关系
A.BIFC的引物设计
利用Primer Primer 5.0软件设计引物。引物如下：
OsMADS27-bifc-FP：5'-CCTTAATTAAGAGATCGATCGAGATAGCGGC-3'
OsMADS27-bifc-RP：5'-GGACTAGTTGGATTCAACTGTAACCCTAG-3'
OsNAR2.1-bifc-FP：5'-CCTTAATTAAATCCAGAATCAGTCGGTTTG-3'
OsNAR2.1-bifc-RP：5'-GGACTAGTCTTGTCCTTCTTGCGCTTCT-3'
PCR程序：95℃变性5min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸时间，循环30次；72℃总延伸10min，22℃保温。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，割胶回收后，产物分别用Pac I，Spe I进行双酶切，于37℃酶切过夜并回收。
B.P2YN，P2YC载体线性片段准备
克隆载体分别为P2YN及P2YC，用Pac I，Spe I限制性内切酶，于37℃酶切过夜并跑胶回收。
C.OsMADS27和OsNAR2.1片段分别连入P2YN，P2YC片段
16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，用黄枪头将菌液分别涂布于含50mg/LKanamycin的LB平板上，37℃倒置培养12h左右。挑取单菌落进行PCR扩增，以空载体为阴性对照，PCR扩增鉴定阳性菌落，振荡培养阳性菌落然后提取质粒进行双酶切验证，将酶切验证正确的菌液进行测序鉴定。测序正确的命名为OSMADS27-nYFP；OSMADS27-cYFP；OsNAR2.1-nYFP；OsNAR2.1-cYFP，然后质粒转化农杆菌GV3101。
D.烟草材料的准备
将本氏烟种子消毒后种于MS培养基上，7d后生长一致良好的烟草移入穴盘中，每株一穴。放于16h光照，8h黑暗，27℃的生长室内培养。2-4周大小的烟草可作为转化材料。
E.烟草注射及结果观察
将鉴定正确的含有目的基因载体的农杆菌菌液接种于5ml LB液体培养基(100mg/L Rifampicin+50mg/L Kanamycin)中，28℃振荡培养过夜。将1ml农杆菌菌液转接到27mlLB液体培养基中(100mg/L Rifampicin+50mg/L Kanamycin，另外加入经抽滤灭菌的乙酰丁香酮)，28℃，160rpm振荡培养过夜。检测过夜培养菌液OD600的数值。5000g，15min集菌，用重悬液重悬菌体，最终OD600为1.0。将以OSMADS27-nYFP；OsNAR2.1-cYFP及OSMADS27-cYFP；OsNAR2.1-nYFP两两的重悬液室温放置2-3h后注射烟草表皮。将侵染液装入1ml注射器内，先用针头在叶片反面避开大叶脉处刺小洞，用拇指按压注射器将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内(勿使用子叶)。注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。注射24h后，在激光共聚交显微镜(Zeiss LSM 510)下检测YFP重悬液的配方如下：10mM MgCl2，10mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(pH5.6)高温高压灭菌15min，100μM乙酰丁香酮，高温高压灭菌。
结果发现：如图7所示，OSMADS27-nYFP；OsNAR2.1-cYFP及OSMADS27-cYFP；OsNAR2.1-nYFP的两两组合在烟草细胞核中都能检测到荧光信号，而阴性对照在烟草细胞中并未检测到任何荧光信号，由此可证明实验结果的可靠性，也可进一步验证上述酵母双杂实验结果，即OSMADS27蛋白与OSNAR2.1蛋白在细胞核中存在阳性互作。
实施例7
分析水稻OsMADS27转基因植株中NO3 -、SO4 2-和PO4 3-的含量。
4周大小的水稻苗，取鲜样用水提法获得提取液，然后用离子色谱仪测定了WT和OsMADS27过量表达及干扰株系中NO3 -、SO4 2-和PO4 3-的含量。
结果发现，与WT相比，RiOsMADS27-15根系的NO3 -含量显著降低(图8A)，RiOsMADS27-15根系和地上部分SO4 2-含量显著降低(图8B)，RiOsMADS27-15根系的PO4 3-含量显著降低(图8C)，OEOsMADS27-20根系SO4 2-含量显著升高(图8B)，OEOsMADS27-20地上部分PO4 3-含量显著升高(图8C)。由此说明，OsMADS27过量表达能够增加水稻体内SO4 2-和PO4 3-含量而OsMADS27干扰则会降低水稻NO3 -、SO4 2-和PO4 3-含量。由此也进一步说明OsMADS27能促进水稻体内硝酸盐的转运，从而促进对硝酸盐的吸收，提高氮肥利用率。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 水稻OsMADS27基因和蛋白在提高水稻对氮肥利用率中的应用
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 723
<212> DNA
<213> 水稻( Oryza sativa)
<400> 1
atggggaggg ggaagattgt gatccgccgg atcgacaact cgacgagccg gcaggtgacg 60
ttctcgaagc ggaggaacgg gatcttcaag aaggccaagg agctggccat cctctgcgac 120
gccgaggtcg gcctcatgat cttctccagc accggccgcc tctacgagta ctccagcacc 180
agcatgaagt cagttataga tcggtatggc aagtccaagg atgagcagca agccgtcgca 240
aatcccaact cggagcttaa gttttggcaa agggaggcag caagcttgag acaacaactg 300
cacaacttgc aagaaaatca tcggcagttg atgggcgaag atctatctgg gctgaatgtt 360
aaggaattgc aatctctaga gaatcagctg gaaataagtc tacgtagtgt ccgtacaaag 420
aaggaccacg tcttgattga tgaaattcat gaactgaatc ggaagggaag tctagttcac 480
caagaaaaca tggaattata caagaagatc agtttaattc gtcaagaaaa tgctgagtta 540
tataagaaga tctacgagac tgaaggacca agtgaagtca atcgggattc accaactcct 600
tacaattttg cagtaattga aaaaacaaat gttcctgtgc aacttggact cagcacacta 660
ccacaacata gtgacgccga acaatcaact gctcctaagc tagggttaca gttgaatcca 720
tga 723
<210> 2
<211> 240
<212> PRT
<213> 水稻( Oryza sativa)
<400> 2
Met Gly Arg Gly Lys Ile Val Ile Arg Arg Ile Asp Asn Ser Thr Ser
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Ile Phe Lys Lys Ala
20 25 30
Lys Glu Leu Ala Ile Leu Cys Asp Ala Glu Val Gly Leu Met Ile Phe
35 40 45
Ser Ser Thr Gly Arg Leu Tyr Glu Tyr Ser Ser Thr Ser Met Lys Ser
50 55 60
Val Ile Asp Arg Tyr Gly Lys Ser Lys Asp Glu Gln Gln Ala Val Ala
65 70 75 80
Asn Pro Asn Ser Glu Leu Lys Phe Trp Gln Arg Glu Ala Ala Ser Leu
85 90 95
Arg Gln Gln Leu His Asn Leu Gln Glu Asn His Arg Gln Leu Met Gly
100 105 110
Glu Asp Leu Ser Gly Leu Asn Val Lys Glu Leu Gln Ser Leu Glu Asn
115 120 125
Gln Leu Glu Ile Ser Leu Arg Ser Val Arg Thr Lys Lys Asp His Val
130 135 140
Leu Ile Asp Glu Ile His Glu Leu Asn Arg Lys Gly Ser Leu Val His
145 150 155 160
Gln Glu Asn Met Glu Leu Tyr Lys Lys Ile Ser Leu Ile Arg Gln Glu
165 170 175
Asn Ala Glu Leu Tyr Lys Lys Ile Tyr Glu Thr Glu Gly Pro Ser Glu
180 185 190
Val Asn Arg Asp Ser Pro Thr Pro Tyr Asn Phe Ala Val Ile Glu Lys
195 200 205
Thr Asn Val Pro Val Gln Leu Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gln His Ser
210 215 220
Asp Ala Glu Gln Ser Thr Ala Pro Lys Leu Gly Leu Gln Leu Asn Pro
225 230 235 240
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggtgttcct ctccaagctg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagcttcacc ttcacgctct 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaagcggagg aacgggatct tcaa 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgccataccg atctataact gact 24
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcgactagtg gtaccgaatc ggaagggaag tctag 35
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcggagctcg gatccttgtt cggcgtcact atgt 34
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cttcatagga atggaagctg cgggt 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgaccacctt gatcttcatg ctgct 25
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaagcggagg aacgggatct tcaa 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgccataccg atctataact gact 24
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcggtcgaca tggggagggg gaagattgt 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcgccatggt catggattca actgtaacc 29
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcggtcgaca tggggagggg gaagattgt 29
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgagctctca tggattcaac tgtaacccta gc 32
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcggcgagtc cctgag 16
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgacggcgta gatgaatga 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acggcacaaa gtacaagacg 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccactgcggg aagtagatg 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gaatgccacg gacaataagg 20
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gggagcaaac caccaacaa 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ccttcggcat cgttccctt 19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
catcatcgtc atcaacatcg 20
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cggaattcga gatcgatcga gatagcggc 29
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gcgtcgacat cccttcagca tacaagggtg 30
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cggaattcat ccagaatcag tcggtttg 28
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ccatcgatga acttgcgttt gcagc 25
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccttaattaa gagatcgatc gagatagcgg c 31
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggactagttg gattcaactg taaccctag 29
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ccttaattaa atccagaatc agtcggtttg 30
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggactagtct tgtccttctt gcgcttct 28

Claims (8)

1.水稻OsMADS27基因在提高水稻对氮肥利用率中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：将所述水稻OsMADS27基因连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体，再将所述的重组表达载体转化受体植物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体为pH2GW7或pK2GW7。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体中启动所述水稻OsMADS27基因表达的启动子为强启动子35S。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水稻OsMADS27基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，先将所述重组表达载体转化农杆菌，再使用该农杆菌侵染受体植物。
7.水稻OsMADS27蛋白在提高水稻对氮肥利用率中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，水稻OsMADS27蛋白通过与硝酸盐转运蛋白辅助因子OsNAR2.1互作提高水稻对硝酸盐的转运和吸收，从而提高对氮肥的利用率。
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