CN109258743A - 一种具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干及其制备方法 - Google Patents

一种具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干，其包括以下重量份的原料：面粉66份，黄油20份，白砂糖30份，淀粉3份，食盐0.5份，小苏打0.8份，碳酸氢铵0.4份，红枣渣25份，桑叶水提物5份，海藻酸钠4份。相对于现有技术，本发明所述的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干通过同时添加具有清除自由基作用的红枣渣、桑叶水提物和海藻酸钠，并且红枣渣和桑叶水提物还具有降血脂作用，从而显著提升了饼干降血脂的能力。

Description

一种具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干及其制备方法
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，特别是涉及一种具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干及其制备方法。
背景技术
高血脂症是指血液中一种或多种脂质成分含量异常增高的病症。近年来，随着生活方式的改变，高血脂症的患病率逐年升高。经调查发现，高血脂症已然是世界范围内的常见病，且与肾脏疾病、心脑血管疾病的发病率、死亡率之间存在着明显的相关关系。
为了避免罹患高血脂症，人们更加倾向于食用具有降血脂功能的食品。可见，为了满足人们对于健康食品的需求，市场迫切需要研发具有辅助降血脂功能的食品。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干及其制备方法。
本发明所述的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干，其包括以下重量份的原料：面粉66份，黄油20份，白砂糖30份，淀粉3份，食盐0.5份，小苏打0.8份，碳酸氢铵0.4份，红枣渣25份，桑叶水提物5份，海藻酸钠4份。
相对于现有技术，本发明所述的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干通过同时添加具有清除自由基作用的红枣渣、桑叶水提物和海藻酸钠，并且红枣渣和桑叶水提物还具有降血脂作用，从而显著提升了饼干降血脂的能力。
本发明所述的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干的制备方法，包括以下步骤：
S1面团调制：将面粉、黄油、白砂糖、淀粉、食盐、小苏打、碳酸氢铵、红枣渣、桑叶水提物和海藻酸钠按比例混合，并搅拌均匀，然后边倒水边和面得到面团，并将面团于室温静置；
S2辊压、分块：用擀面杖辊压面团数次，得到厚薄均匀的面带；然后将面带均分成大小一致的小块，得到生饼胚；
S3烘烤：将生饼胚排列于烤盘上，置于烤箱中烘烤成型；烘烤结束后，取出饼干进行包装，并保藏于阴凉干燥的室内。
进一步地，步骤S1中，所述水的温度为37℃～40℃。
进一步地，步骤S1中，面团静止的时间为10min。
进一步地，步骤S2中，将所述面带的表面均匀扎上小孔之后，再均分为小块，得到生饼胚。
进一步地，步骤S2中，所述生饼胚是大小呈3cm×5cm的方形或者直径为4cm的圆形。
进一步地，步骤S3中，所述烘烤温度为面火175℃、底火170℃，烘烤时间为10min。
优选地，步骤S3中，所述生饼胚置于烤盘上之前，所述烤盘表面均匀涂布一层食用油。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为红枣渣添加量对饼干DPPH·自由基的清除率影响的折线图；
图2为桑叶水提物添加量对饼干DPPH·自由基的清除率影响的折线图；
图3为海藻酸钠添加量对饼干DPPH·自由基的清除率影响的折线图；
图4反映桑叶水提物添加量与红枣渣添加量两个因素的交互作用对饼干的DPPH·自由基清除率的影响，其中，A为二维平面上的等高线图，B为三维空间的响应曲面图；
图5反映海藻酸钠添加量与红枣渣添加量两个因素的交互作用对饼干的DPPH·自由基清除率的影响，其中，A为二维平面上的等高线图，B为三维空间的响应曲面图；
图6反映海藻酸钠添加量与桑叶水提物添加量两个因素的交互作用对饼干的DPPH·自由基清除率的影响，其中，A为二维平面上的等高线图，B为三维空间的响应曲面图；
图7为大鼠肝脏石蜡切片的苏木精-伊红染色图；其中，1代表空白组，2代表高脂模型组，3代表阳性对照组，4代表常规饼干组，5代表本发明的红枣渣桑叶饼干组；A代表10倍镜下，B代表20倍镜下，C代表40倍镜下；
图8为不同作用时间下各油酸浓度对HepG2细胞抑制率影响的折线图；
图9为HepG2细胞的红油O染色图，其中，A为空白组，B为模型组，C为阳性对照组，D为加入红枣渣提取物实验组，E为加入桑叶水提物实验组，F为加入红枣渣提取物和桑叶水提物实验组(即复合物实验组)；
图10为HepG2细胞凋亡散点图，其中，A为空白组，B为模型组，C为阳性对照组，D为加入红枣渣提取物实验组，E为加入桑叶水提物实验组，F为加入红枣渣提取物和桑叶水提物实验组(即复合物实验组)；
图11为为HepG2细胞周期图，其中，A为空白组，B为模型组，C为阳性对照组，D为加入红枣渣提取物实验组，E为加入桑叶水提物实验组，F为加入红枣渣提取物和桑叶水提物实验组(即复合物实验组)；
图12为第一组酸价的折线图；
图13为样品一的第一组线性回归图；
图14为样品二的第一组线性回归图；
图15为样品三的第一组线性回归图；
图16为第二组酸价的折线图；
图17为样品一的第二组线性回归图；
图18为样品二的第二组线性回归图；
图19为样品三的第二组线性回归图。
具体实施方式
实施例一
本发明提供一种具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干，其包括以下重量份的原料：面粉66g，黄油20g，白砂糖30g，淀粉3g，食盐0.5g，小苏打0.8g，碳酸氢铵0.4g，红枣渣25g，桑叶水提物5g，海藻酸钠4g。
实施例二
实施例一所述的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干，采用以下方法制备而成。
S1面团调制：将面粉、黄油、白砂糖、淀粉、食盐、小苏打、碳酸氢铵、红枣渣、桑叶水提物和海藻酸钠按比例混合，并搅拌均匀，然后倒入37℃～40℃的水，边倒水边和面得到面团，并将面团于室温静置10min；
S2辊压、分块：用擀面杖辊压面团数次，辊轧时将面团多次折叠并旋转90°，得到表面光滑、质地细腻、形态平整和厚薄均匀的面带；然后将面带均分成大小为3cm×5cm的方形或者直径为4cm的圆形的小块，得到生饼胚；
S3烘烤：将烤盘表面涂上一层食用油后，将生饼胚排列于烤盘上，置于烤箱中，于面火175℃、底火170℃条件下烘烤10min；烘烤结束后，取出烤盘，将烤盘与饼干一起于室温冷却后，夹取饼干进行包装并于干燥阴凉处保藏。
实施例三：饼干主要原料对DPPH·自由基的清除率影响的单因素分析
由于具有抗氧化能力的食品有助于降低血液中的甘油三酯等脂质含量，因此本实施例对本发明的饼干的抗氧化能力进行调查。具体地，以饼干中的红枣渣、桑叶水和海藻酸钠组分为试验因素，调查上述组分对DPPH·自由基的清除率的影响，通过对DPPH·自由基的清除能力反应饼干的抗氧化能力。
单因素实验所用的饼干配方为：以面粉加上红枣渣、桑叶水提物和海藻酸钠的总质量为基数100％计(根据实验情况调整面粉、红枣渣、桑叶水提物和海藻酸钠的用量)，添加黄油20％、白砂糖30％、淀粉3％、食盐0.5％、小苏打0.8％和碳酸氢铵0.4％。
饼干样品溶液的制备过程：拿取饼干→粉碎→脱脂→抽滤→晾干→称取50g饼干粉→加200mL蒸馏水浸泡过夜→离心→过滤取滤液→定容到250mL→0.2g/mL饼干样品溶液→定容到50mL→0.02g/mL饼干样品溶液
饼干样品溶液的DPPH·自由基清除率测定过程如下所示：
精确吸取2mL不同浓度梯度的样品溶液，分别加入2mL 2×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液作为样品组，摇匀后置于室温下反应30min；以等体积的蒸馏水和无水乙醇混合液作空白调零，在517nm处测定吸光值。同时设置空白组和对照组，空白组以等体积的无水乙醇代替DPPH·溶液，对照组以等体积的蒸馏水代替样品溶液。
根据吸光度，按下式计算样品的DPPH·自由基清除率：
DPPH·自由基的清除率/％＝〔1–(Ai–Aj)/A0〕×100
其中，A0：对照组吸光值；Ai：样品组吸光值；Aj：空白组吸光值。
1.红枣渣添加量对饼干DPPH·自由基的清除率的影响
按照实施例4所述的制备方法，添加5％桑叶水提物和2％海藻酸钠，分别测量红枣渣添加量为8％、16％、24％、32％和40％时(此时面粉的添加量为100％-5％-2％-红枣渣添加量＝53％、61％、69％、77％和85％)，所制得的饼干的DPPH·自由基清除率(抗氧化性)，结果如图1所示。
由图1可知，与基础配方饼干相比(以面粉的总质量为基数100％计，添加黄油20％、白砂糖30％、淀粉3％、食盐0.5％、小苏打0.8％和碳酸氢铵0.4％。即不添加红枣渣、桑叶水提物和海藻酸钠的饼干)，随着红枣渣添加量的增加，饼干对DPPH·自由基清除率逐渐增大，且当红枣渣添加量为24％时，饼干对DPPH·自由基清除率达到80.84％，之后随着红枣渣添加量的增加，饼干对DPPH·自由基清除率的提升趋于平缓。因此，饼干中红枣渣的最适添加量为24％。
2.桑叶水提物添加量对饼干DPPH·自由基的清除率的影响
按照实施例4所述的制备方法，添加24％红枣渣和2％海藻酸钠，分别测量桑叶水提物添加量为3％、4％、5％、6％和7％时(此时面粉的添加量为100％-24％-2％-桑叶水提物添加量＝71％、70％、69％、68％和67％)，所制得的饼干的DPPH·自由基清除率(抗氧化性)，结果如图2所示。
由图2可知，与基础配方饼干相比，随着桑叶水提物添加量的增加，饼干对DPPH·自由基清除率逐渐增大，且当桑叶水提物添加量为5％时，饼干对DPPH·自由基清除率达到70.61％，之后随着桑叶水提物添加量的增加，饼干对DPPH·自由基清除率的提升趋于平缓。因此，饼干中桑叶水提物的最适添加量为5％。
3.海藻酸钠添加量对饼干DPPH·自由基的清除率的影响
按照实施例4所述的制备方法，添加24％红枣渣和5％桑叶水提物，分别测量海藻酸钠添加量为1％、2％、3％、4％和5％时(此时面粉的添加量为100％-24％-5％-海藻酸钠添加量＝70％、69％、68％、67％和66％)，所制得的饼干的DPPH·自由基清除率(抗氧化性)，结果如图3所示。
由图3可知，与基础配方饼干相比，随着海藻酸钠提物添加量的增加，饼干对DPPH·自由基清除率逐渐增大，且当海藻酸钠添加量为4％时，饼干对DPPH·自由基清除率最高，达到77.88％，之后随着海藻酸钠添加量的增加，饼干对DPPH·自由基的清除能力有所下降。因此，饼干中海藻酸钠的最适添加量为4％。
4.响应面分析法优化试验结果
在单因素试验基础上，运用Design-Expert.8.0软件，选取X1(红枣渣添加量，％)、X2(桑叶水提物添加量，％)和X3(海藻酸钠添加量，％)海藻酸钠添加量，％)进行三因素三水平的响应面试验设计，优化复合型红枣膳食纤维饼干配方，结果见表1和表2。
表1响应面分析方案与试验结果
表2方差分析
注：R2＝0.9756；Adj R2＝0.9443；Pred R2＝0.7395；*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著。
根据上述实验结果得到，红枣渣桑叶饼干对DPPH·自由基清除率(％)与各因素变量的二次方程模型为：
Y＝80.90+1.03*X1+2.74*X2+0.69*X3+0.48*X1*X2-0.30*X1*X3-0.018*X2*X3-3.62*X1 2-4.45*X2 2-2.27*X3 2
其中，由表2分析结果可知，F＝31.14＞F0.05(9，9)＝3.18，p＜0.0001，表明回归模型显著；失拟项F＝2.29＜F0.05(9，3)＝8.81，p＝0.2199＞0.05，不显著，说明该模型拟合程度良好，试验误差小，可以作为预测模型；且该模型R2＝0.9756，说明该模型有着良好的预测精度。因此，可以用该回归方程模型模拟实验真实点对实验结果进行分析预测。
分析结果如图4、图5和图6所示，其中，图4为桑叶水提物添加量与红枣渣添加量两个因素的交互作用影响饼干的DPPH·自由基清除率的二维平面上的等高线图，以及三维空间的响应曲面图；图5为海藻酸钠添加量与红枣渣添加量两个因素的交互作用影响饼干的DPPH·自由基清除率的二维平面上的等高线图，以及三维空间的响应曲面图；图6为海藻酸钠添加量与桑叶水提物添加量两个因素的交互作用影响饼干的DPPH·自由基清除率的二维平面上的等高线图，以及三维空间的响应曲面图。等高线图和响应曲面图能够直观地反映出该模型各因素之间的交互作用以及对响应值的影响。
通过响应面分析软件对实验结果进行分析，得出最优配方：红枣渣添加量25.26％，桑叶水提物添加量5.32％，海藻酸钠添加量4.14％，DPPH·自由基清除率81.46％；修正为红枣渣添加量25％，桑叶水提物添加量5％，海藻酸钠添加量4％，通过验证实验，进行三次重复，得出该条件下DPPH·自由基清除率为80.72％，与理论预测值相比，其相对误差为0.009％，说明回归模型拟合性较好。
所得的回归方程的最大预测值与验证值非常接近，说明回归方程建立的模型与实际情况较吻合，能真实地反映各因素对响应值的影响。因此，由响应曲面法得到的优化工艺参数比较准确，具有实用意义，故确定最优配比为：红枣渣添加量25％，桑叶水提物添加量5％，海藻酸钠添加量4％。
实施例四：饼干的降血脂能力研究
本实施例通过喂食高脂大鼠，从而在活体实验中检测本发明的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干是否有利于降低血脂，具体地，分别检测本发明的饼干对高脂大鼠机体中总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)和高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(lowdensity lipoprotein cholesterin，LDL-C)含量的影响。
所有实验数据以表示，使用SPSS 19.0统计软件进行差异显著性分析，P＜0.05，显著性差异；P＜0.01，极显著性差异。
取50只雄性SD大鼠50只，随机分为5组，每组10只。5组分别为空白组，高脂模型组，模型组、阳性对照组，常规饼干组，配方饼干组；其中，空白组喂食基础饲料，其余四组喂食高脂饲料，自由饮食饮水，饲养一周。
一周后，空白组继续喂食基础饲料；高脂模型组喂食高脂饲料；阳性对照组喂食混入降血脂药物辛伐他汀的高脂饲料，其中，每千克高脂饲料中混入10mg辛伐他汀；常规饼干组喂食混入基础配方饼干的高脂饲料，其中，每天在100g高脂饲料中混入10mg基础配方饼干；配方饼干组喂食混入按照实施例一的配方制得的饼干的高脂饲料，其中，每千克高脂饲料中混入100mg实施例一中的饼干；自由饮食饮水，喂食42天后检测TC、TG、HDL-C和LDL-C指标，期间每周称量大鼠体重。
实验所用的雄性SD大鼠(SPF级)，250±20g，由新疆大学生命科学与技术学院阿里木老师提供，实验动物许可证号：SYXK-2016-0002。
高脂饲料：78.8％基础饲料中混入10％蛋黄粉、1％胆固醇、0.2％胆盐和10％猪油。
基础配方饼干：以面粉的总质量为基数100％计，添加黄油20％、白砂糖30％、淀粉3％、食盐0.5％、小苏打0.8％和碳酸氢铵0.4％。
1.红枣渣桑叶饼干对大鼠体重的影响
表3饼干对大鼠体重影响(n＝10)/g
注：“a”表示与空白组比较P<0.05；“b”表示与高脂模型组比较P＜0.05。
由表3可知，经过42天试验期，高脂模型组大鼠体重与空白组相比显著增加(P<0.05)；而与高脂模型组比较，阳性对照组和配方饼干组大鼠体重均显著下降(P<0.05)，说明红枣渣桑叶饼干可以在一定程度上减少高血脂大鼠的体重，有帮助减肥的效果。
2.红枣渣桑叶饼干对大鼠血脂系数的影响
SD大鼠喂养42天后，大动脉取血，迅速分离血清，测定血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C水平。其中，总胆固醇(TC)检测试剂盒，购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；甘油三酯(TG)检测试剂盒；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)检测试剂盒，均购于上海复星长征医学科学有限公司；按照各检测试剂盒所示方法，分别检测各指标。
表4大鼠血清TG、TC、HDL-C以及LDL-C水平/mmol·L-1
注：“a”表示与空白组比较P<0.05；“b”表示与模型组比较P＜0.05。
由表4可知，与空白组比较，高脂模型组的TC水平和LDL-C水平显著增加(P＜0.05)，说明构建高脂模型大鼠成功。与高脂模型组比较，阳性对照组、常规饼干组和配方饼干组的LDL-C水平均显著降低(P＜0.05)，HDL-C水平均显著增加(P＜0.05)；且阳性对照组和配方饼干组的TC水平显著降低。在人体中，TC和LDL-C的含量越低，越不容易换有高血脂类疾病，而HDL-C的含量与动脉粥样硬化等高血脂类疾病的发病率呈负相关。因此，可见，本发明的红枣渣桑叶饼干有利于降低罹患高血脂类疾病的风险，且相对于普通饼干来说，更有利降低胆固醇的含量，更有利于降低罹患高胆固醇类疾病的风险。
3.红枣渣桑叶饼干对大鼠脏器系数的影响
SD大鼠动脉取血后进行解剖，取出肝脏、肾脏和脾脏，将取下的脏器于4℃生理盐水洗净，并进行称重，然后标记分装。按照下式计算脏器系数：
表4各组大鼠脏器系数/％
注：“a”表示与空白组比较P<0.05；“b”表示与高脂模型组比较P＜0.05。
由表4可知，喂食42天后，与空白组比较，高脂模型组大鼠肝脏系数显著升高；而与高脂模型组比较，阳性对照组、常规饼干组和配方饼干组大鼠的肝脏系数均呈现降低，且配方饼干组降低最显著，说明红枣渣桑叶饼干对高脂大鼠的肝脏有一定的保护作用。脾脏系数和肾脏系数各组间并未统计学差异，表明红枣渣桑叶饼干对高脂血症大鼠的脾脏和肾脏也有一定的保护作用。
4.红枣渣桑叶饼干对大鼠肝脏的病理学影响
将各组大鼠肝脏标本用10％甲醛固定，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察肝脏脂肪变性程度。其余脏器均置于-80℃冰箱，保存备用。
如图7所示，其中，图1A为空白组大鼠肝脏石蜡切片在10倍镜下的苏木精-伊红染色图；图1B为空白组大鼠肝脏石蜡切片在20倍镜下的苏木精-伊红染色图；图1C为空白组大鼠肝脏石蜡切片在40倍镜下的苏木精-伊红染色图；图2A为高脂模型组大鼠肝脏石蜡切片在10倍镜下的苏木精-伊红染色图；图2B为高脂模型组大鼠肝脏石蜡切片在20倍镜下的苏木精-伊红染色图；图2C为高脂模型组大鼠肝脏石蜡切片在40倍镜下的苏木精-伊红染色图；图3A为阳性对照组大鼠肝脏石蜡切片在10倍镜下的苏木精-伊红染色图；图3B为阳性对照组大鼠肝脏石蜡切片在20倍镜下的苏木精-伊红染色图；图3C为阳性对照组大鼠肝脏石蜡切片在40倍镜下的苏木精-伊红染色图；图4A为常规饼干组大鼠肝脏石蜡切片在10倍镜下的苏木精-伊红染色图；图4B为常规饼干组大鼠肝脏石蜡切片在20倍镜下的苏木精-伊红染色图；图4C为常规饼干组大鼠肝脏石蜡切片在40倍镜下的苏木精-伊红染色图；图5A为配方饼干组大鼠肝脏石蜡切片在10倍镜下的苏木精-伊红染色图；图5B为配方饼干组大鼠肝脏石蜡切片在20倍镜下的苏木精-伊红染色图；图5C为配方饼干组大鼠肝脏石蜡切片在40倍镜下的苏木精-伊红染色图。
结果显示，空白组的大鼠肝脏颜色红润中央静脉、肝索、肝窦结构清楚，未见淤血，细胞核大小较一致，无异型性；高脂模型组的大鼠肝脏中央静脉、肝索、肝窦结构存在，肝窦扩张，内充满红细胞，肝细胞内见空泡变性，透亮中央静脉周围中间子叶远端均可见，大小不一，部分呈团状，部分融合成大泡，细胞核大小略不一致，细胞浆淡染，浊肿，细胞界限不清，说明高脂模型建立成功；阳性对照组的大鼠肝脏中央静脉、肝索、肝窦结构存在，肝窦扩张，内见红细胞，偶见肝细胞空泡变性，细胞核大小不一致；常规饼干组的大鼠肝脏中央静脉、肝索、肝窦结构存在，肝窦扩张，内充满红细胞，偶见肝细胞空泡变性，可见融合空泡，量略多于阳性对照组，细胞核大小不一致；配方饼干组的大鼠肝脏细胞脂肪液滴气泡明显减少，肝构架基本完整，与高脂模型组相比，肝细胞受损状况明显好转，并有效的改善高脂大鼠肝脏的纤维化现象。
实施例五：饼干的毒性研究
本实施例就本发明的红枣渣桑叶饼干食用是否安全进行研究。在本实施例中，实验数据以表示，两组间比较采用t检验，所有数据均用SPSS19.0统计软件处理。
SPF级昆明小鼠40只，体重18～22g，雌雄各半，按性别体重，随机分为2组，每组20只。禁食不禁水12h，灌胃浓度50％的红枣渣桑叶饼干0.4mL/10g，一日2次，单次给药量为20.00g/kg；溶媒对照组给予相同量的饮用水。给药后观察小鼠状态，包括体重变化、摄食、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应，连续观察14d。观察期结束后进行大体解剖。
其中，实验所用的昆明种小白鼠由新疆维吾尔自治区实验动物中心提供。实验动物使用许可证号：SCXK(新)2016-0001，实验动物合格证号：NO.65000200000676，NO.65000200000681。
观察发现，给药后的14天中，小鼠的行为和进食未见异常，皮毛、眼和粘膜等外表也未见异常、呼吸、肢体活动和体重等生理特征均无异常，未出现其它毒性反应。可见，昆明小鼠单日灌胃给药红枣渣桑叶韧性饼干的最大给药量为40.00g/kg。最大给药量测定实验小鼠的体重变化情况见表5。
表5最大给药量测定实验小鼠的体重变化情况
实施例六：桑叶水提物和红枣渣醇提物的降血脂协同作用研究
1.造模诱导液浓度和作用时间的筛选
首先，取对数生长期HepG2(购买于上海中乔新舟生物科技有限公司)，调整细胞浓度为3～4×104/mL，接种于96孔板(200μL/孔)中后，置于37℃，5％CO2培养箱培养24h，待细胞贴壁；然后移去原培养液，分别加入0.125mM，0.25mM，0.5Mm，1.0mM，2mM浓度的油酸培养基处理细胞，空白组加无油酸培养基。将培养板置37℃，5％CO2细胞培养箱常规培养24h、48h和72h；细胞培养至预定时间(24h、48h和72h)后，每孔加入20μL，5mg/mL的MTT，继续置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养4h，吸取孔内培养上清液，每孔加入150μL DMSO，震荡10min，用连续光谱酶标仪测定各孔于490nm波长处的吸光度值；最后根据吸光值计算细胞抑制率和IC50值。细胞生长抑制率的计算公式如下：
细胞生长抑制率(％)＝1—实验组OD值/阴性空白组OD值×100％
结果如表6和图8所示，作用24-72h造模诱导液(即油酸培养基)对细胞的IC50值分别为8.439±1.228mM，10.130±1.059mM和6.282±1.065mM；0.125mM-0.5mM造模诱导液对细胞抑制率较小，细胞活性大于90％，而2mM的造模诱导液浓度对细胞的抑制率较大，细胞损伤较严重。综合考虑，选择1mM的造模诱导液对HepG2细胞进行诱导，作用24h后，建立非酒精性脂肪肝病模型(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)。
表6造模诱导液浓度和作用时间的筛选
其中，造模诱导液(油酸培养基)配制：80μL油酸加入10μL DMSO溶解后，用910μL细胞完全培养基稀释得250mM/L油酸母液，0.22um有机滤膜过滤后4℃保存备用。实验中，DMSO溶液浓度<0.1％。由于造模诱导液中富含可以引发高血脂类疾病的油酸物质，因此，通过将细胞培养在造模诱导液中，能够使细胞含有较多脂类，成为非酒精性脂肪肝病模型。下文中的油酸培养基即为造模诱导液，无油酸培养基为没有添加油酸的造模诱导液。
MTT工作液配制：精密称取250mg MTT，置于PBS溶液50mL中，使其完全溶解，终浓度为5mg·mL-1，超净台下0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装于2mL EP管中，长期-20℃保存备用，4℃两周内用完。
2.红枣渣醇提物与桑叶水提物作用浓度筛选
运用实施例八第1节实验得出的非酒精性脂肪肝病模型条件，即造模诱导液的浓度为1mM，作用时间为24h，到红枣渣醇提物与桑叶水提物作用浓度筛选实验中。
具体地，同样取对数生长期HepG2，调整细胞浓度为3～4×104个/mL，接种于96孔板(200μL/孔)；然后置37℃，5％CO2培养箱培养24小时，待细胞贴壁后，加入1mM油酸培养基造模，空白组加无油酸培养基，继续置37℃，5％CO2培养箱培养；培养24小时后，移去原培养基及造模溶液，实验组分别加入100μL浓度为50、100和200mg/mL的红枣渣醇提物培养基，100μL浓度为25、50和100mg/mL桑叶水提物培养基，阳性对照组加入100μL浓度为100mg/mL的非诺贝特培养基(治疗高胆固醇血症和高甘油三酯血症的药物)，空白组加入等量细胞完全培养液，继续培养24h后，进行MTT检测并计算细胞抑制率。
其中，红枣渣培养基：细胞完全培养基中，加入红枣渣醇提物，配制终浓度200mg/mL，4℃保存备用。
桑叶水提物培养基：细胞完全培养基中，加入桑叶水提物，配制终浓度100mg/mL，4℃保存备用。
非诺贝特培养基：细胞完全培养基中，加入非诺贝特，配制终浓度100uM，内含氯仿溶液浓度<0.1％，4℃保存备用。
结果见表7，相对于同样具有治疗高血脂类疾病的非诺贝特，红枣渣醇提物浓度在50-200mg/mL以及桑叶水提物浓度在50-100mg/mL时，对细胞抑制率影响较大，为了提高细胞存活率，故需降低样品浓度进行后续筛选。表8和表9为降低红枣渣提取物浓度和桑叶水提物浓度后的细胞抑制率结果。
表7样品浓度第一次筛选
表8样品浓度第二次筛选
表9样品浓度第三次筛选
由表7、表8和表9可知，红枣渣醇提物浓度为20、25和30mg/mL，桑叶水提物浓度为10、12.5和20mg/mL时，红枣渣醇提物和桑叶水提物对细胞抑制率影响较小，与非诺贝特对细胞抑制率的影响差异不大。故选择红枣渣醇提物浓度为25mg/mL和桑叶水提物浓度为12.5mg/mL进行后续实验。
3.红油O染色
取对数生长期的HepG2细胞，用500μL的0.25％胰酶消化后，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于6孔板中，置37℃、5％CO2孵箱培养；培养过夜后弃去培养基，实验组、阳性对照组和模型组换油酸培养基，空白组换新鲜的细胞完全培养基，继续培养24h；然后三个实验组分别换含有25mg/mL红枣渣提取物，12.5mg/mL桑叶水提物和25mg/mL红枣渣提取物+12.5mg/mL桑叶水提物的细胞完全培养基，阳性对照组加入含有50uM非诺贝特的细胞完全培养基，空白组和模型组的细胞完全培养基，2mL/孔，继续培养24h；接着弃去培养基上清，每孔加入2mL红油O稀释液(由红油O染液用PBS按照体积比6:4稀释得到)，室温避光静置1h，弃去染液后，PBS淋洗三遍，于显微镜下观察并拍照。
红油O染色结果如图9所示，其中，A为空白组的红油O染色图；B为模型组的红油O染色图；C为阳性对照组的红油O染色图；D为加入红枣渣提取物实验组的红油O染色图；E为加入桑叶水提物实验组的红油O染色图；F为加入红枣渣提取物和桑叶水提物实验组(复合物实验组)的红油O染色图。
由图9可知，对照组HepG2细胞形态饱满，边缘清晰，折光度好，胞内未见红色脂肪颗粒堆积；模型组HepG2细胞胞内可见明显的红色脂肪颗粒，可见少量细胞碎片，说明造模成功且造模溶液浓度合适；阳性对照组HepG2细胞与对照组细胞形态相似，但仍可见少量红色脂肪颗粒堆积；红枣渣醇提物组、桑叶水提物组及二者联合用药实验组细胞胞内均可见不同程度的红色脂肪颗粒，其中二者联合用药组胞内脂肪颗粒相对较少。
4.甘油三酯(TG)含量测定
取对数生长期的HepG2细胞，用500μL的0.25％胰酶消化后，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于6孔板中，置37℃、5％CO2孵箱培养；培养过夜后弃去培养基，实验组、阳性对照组和模型组换油酸培养基，空白组换新鲜的细胞完全培养基，继续培养24h；然后三个实验组分别换含有25mg/mL红枣渣提取物，12.5mg/mL桑叶水提物和25mg/mL红枣渣提取物+12.5mg/mL桑叶水提物的细胞完全培养基，阳性对照组加入含有50uM非诺贝特的细胞完全培养基，空白组和模型组的细胞完全培养基，2mL/孔，继续培养24h；接着取出96孔板，于-80℃与37℃反复冻融3次，使细胞破裂，然后按照实施例六所述试剂盒的说明书的测量HepG2细胞中甘油三酯的含量。结果如表10所示。
表10甘油三酯(TG)含量测定结果
注：**P＜0.01，模型组与空白组比较；##P＜0.01，实验组与模型组比较。
由表10的结果可知，与空白对照组比较，模型组TG含量显著升高(P＜0.01)，显示非酒精性脂肪肝病模型建造成功；与模型组比较，阳性药组、桑叶水提物组和复合物组(C+D)TG含量均显著降低(P＜0.01)，红枣渣醇提物组单独作用时TG水平虽有降低，但无显著性差异；桑叶水提物组和复合物组(C+D)TG含量差异显著(P＜0.01)，说明桑叶水提物具有较好的降低TG水平的作用，且与红枣渣醇提物协同作用能够更有效地降低细胞中的TG含量。
5.FCM测定细胞凋亡
取对数生长期的HepG2细胞，用500μL的0.25％胰酶消化，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于6孔板中，置37℃、5％CO2孵箱培养培养；培养过夜后弃去培养基，实验组、阳性对照组和模型组换油酸培养基，空白组换新鲜的细胞完全培养基，继续培养24h；然后三个实验组分别换含有25mg/mL红枣渣提取物，12.5mg/mL桑叶水提物和25mg/mL红枣渣提取物+12.5mg/mL桑叶水提物的细胞完全培养基，阳性对照组加入含有50uM非诺贝特的细胞完全培养基，空白组和模型组的细胞完全培养基，2mL/孔，继续培养24h；接着各孔吸出原培养基，1mL胰酶消化数秒，使用原培养基轻轻吹下所有细胞，移入2mL EP管，1000rpm离心10min后弃去培养基，加入1mL预冷PBS重悬细胞后离心，重复清洗三次，尽量除去培养基残留；使用1×Binding Buffer重悬细胞至1×106个/mL，取100uL至5mL加入流式细胞管内，各组重复三管，各管分别加入5ul FITC和5ul PI，轻轻混匀，避光并于25℃温浴15min后，各管加入400ul 1×Binding Buffer，经200目尼龙滤网过滤后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果如表11和图10所示。
表11 HepG2细胞凋亡实验结果
注：**P＜0.01，模型组与空白组比较；##P＜0.01，实验组与模型组比较。
采用FITC标记的膜联蛋白(AnnexinV)染色细胞进行细胞凋亡分析。磷脂酰丝氨酸(PS)通常只存在于质膜内侧，在细胞凋亡早期，细胞膜外翻，可被FITC染色，此时细胞膜仍未失去整合性，PI无法进入细胞，而在细胞凋亡晚期，膜的整合性发生改变，PI进入细胞染色。
细胞凋亡是由于细胞内外的环境变化或者触发死亡信号而导致细胞主动死亡的过程，不同的样品及其浓度在不同作用时间下可以影响细胞不同的反应，如表11所示。与空白组比较，模型组早期和晚期凋亡率都有显著性增加(P＜0.01)；与模型组比较，阳性对照组、桑叶水提物组和复合物组(C+D)早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均显著性降低(P＜0.01)，晚期凋亡率降低趋势更为明显，与空白对照组无显著性差异，而红枣渣醇提物组凋亡率与模型组比较无显著性差异；桑叶水提物组和复合物组(C+D)两组之间差异显著(P＜0.01)；综合显示，复合物组(C+D)细胞的凋亡率较低，说明红枣渣醇提物与桑叶水提物在降低HepG2脂肪肝模型细胞凋亡上起到了重要的作用。
6.FCM测定细胞凋亡
取对数生长期的HepG2细胞，用500μL的0.25％胰酶消化，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于6孔板中，置37℃、5％CO2孵箱培养培养；培养过夜后弃去培养基，实验组、阳性对照组和模型组换油酸培养基，空白组换新鲜的细胞完全培养基，继续培养24h；然后三个实验组分别换含有25mg/mL红枣渣提取物，12.5mg/mL桑叶水提物和25mg/mL红枣渣提取物+12.5mg/mL桑叶水提物的细胞完全培养基，阳性对照组加入含有50uM非诺贝特的细胞完全培养基，空白组和模型组的细胞完全培养基，2mL/孔，继续培养24h；接着各孔吸出原培养基，1mL胰酶消化数秒，使用原培养基轻轻吹下所有细胞，移入2mL EP管，1000rpm离心10min后弃去培养基，加入1mL预冷PBS重悬细胞后离心，重复清洗三次，尽量除去培养基残留；加入1mL 75％乙醇重悬细胞，4℃固定至少过夜，测定前1000rpm离心10min后弃去固定液，加入1mL预冷PBS重悬细胞后离心，重复清洗三次，尽量除去乙醇固定液，随后加入500μL PI/Rnase染液，于37℃避光染色15min，经200目尼龙滤网过滤后，用流式细胞仪检测细胞处于哪个周期。结果如表12和图11所示。
表12 HepG2细胞周期实验结果
注：**P＜0.01，模型组与空白组比较；##P＜0.01，实验组与模型组比较。
在细胞周期的各个时期(G0、G1、S、G2、M)中DNA含量随各时相呈现出周期性变化，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测，结果见表12。与空白组比较，模型组G0/G1期和S期比例显著增加(P＜0.01)，G2期比例显著降低(P＜0.01)；与模型组比较，阳性药组、桑叶水提物组和复合物组(C+D)G0/G1期和S期比例显著降低(P＜0.01)，G2期比例显著增加(P＜0.01)，红枣渣醇提物组G0/G1期比例有所增加，但无显著性差异，S期和G2期比例有所降低，也无显著性差异。由结果可知，油酸造模后，可将细胞周期阻滞于S期，影响HepG2细胞分裂，药物干预后，S期细胞比例显著较低，因此可知红枣渣醇提物与桑叶水提物联合后，可有效改善油酸对HepG2细胞分裂的阻滞，使细胞分裂与增殖趋于正常。
实施例七：红枣渣桑叶饼干货架期预期
随着人民生活水平的不断提高，消费者对食品的质量提出了越来越高的要求，人们希望所购得的食品在购买后直至消费前这段时间内能维持一个较高的质量，食品货架期作为反应食品品质及安全性的标识，对它进行研究具有现实意义。本实验分别采用传统法和烘箱法，以酸价和过氧化值为考察指标，对复合型红枣膳食纤维饼干的货架期进行了预测。
表13温度与油脂货架寿命系数关系
1.传统法
常规饼干(样品一)、TBHQ饼干(TBHQ：特丁基对苯二酚，是国际公认的食品抗氧化剂，样品二)、红枣渣桑叶饼干(样品三)三种样品于常温放置，每周定期取样一次(200g)，将样品粉碎，过100目筛，进行酸价和过氧化值测定，平行测定3次，取平均值，共5周。依据《GB7100—2003饼干卫生标准》规定：酸价(KOH)≤50mg/g作为储藏期判定终点。而酸价测定按GB/T5009.56—2003执行。
2.烘箱法
S1：将样品一、样品二、样品三各1000g分装后贮藏于恒温干燥箱中，于65℃贮藏，每周定期取样一次(200g)进行酸价过氧化值测定(按国标测定)，共5周；
S2：以样品贮藏时间和对应酸价(即过氧化值)的对数值作回归拟合曲线，得到线性回归方程，将国标中规定的最高酸价值(5mg KOH/g)代入方程(最高过氧化值0.25g/100g)，得到65℃加速氧化实验中该饼干的两个货架期，取平均值；
S3：依据氧化一级动力学方程，应用Arrhenius公式(即表13)预测复合型红枣膳食纤维饼干在常温25℃下的货架期。
第一组酸价测定结果见表14和图12，从图13可知，样一的线性回归方程为y＝1.1581x-2.9483，R2＝0.9839；从图14可知，样二的线性回归方程为y＝1.5214x-4.873，R2＝0.9935；从图15可知，样三的线性回归方程为y＝1.0317x-2.5469，R2＝0.9828。饼干允许的最高过氧化值0.25g/100g，将其代入回归方程，得到在65℃加速氧化实验中，样品一的第一货架期为27.5天、样品二的第一货架期为29.8天、样品三的第一货架期为28.2天。
表14第一组酸价测定结果
第二组酸价测定结果见表15和图16，从图17可知，样一的线性回归方程为y＝0.3892x-2.757，R2＝0.9718；从图18可知，样二的线性回归方程为y＝0.4146x-3.125，R2＝0.962；从图19可知，样三的线性回归方程为y＝0.3473x-2.6917，R2＝0.9875。饼干允许的最高过氧化值0.25g/100g，将其代入回归方程，得到在65℃加速氧化实验中，样品一的第二货架期为24.6天、样品二的第二货架期为29.3天、样品三的第二货架期为26.3天。
表15第二组酸价测定结果
第一货架期与第二货架期求平均值得到，样品一的平均货架期为26天、样品二的平均货架期为29.5天、样品三的平均货架期为27.3天。
根据表13给出的温度与油脂货架寿命系数的关系：25℃的货架寿命系数为16，65℃的货架寿命系数为1。预测在25℃条件下，样品一(即普通饼干)的货架期为26×16＝416天、样品二(即TBHQ饼干)的货架期为29.5×16＝472天，样品三(即红枣渣桑叶饼干)的货架期为436.8天。可见，本样品的饼干相对于普通饼干的保藏期限较长。
相对于现有技术，本发明所述的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干通过同时添加具有清除自由基作用的红枣渣、桑叶水提物和海藻酸钠，并且红枣渣和桑叶水提物还具有降血脂作用，从而显著提升了饼干降血脂的能力；同时，本发明的饼干相对于普通饼干的保藏期限较长。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干，其特征在于，包括以下重量份的原料：包括以下重量份的原料：面粉66份，黄油20份，白砂糖30份，淀粉3份，食盐0.5份，小苏打0.8份，碳酸氢铵0.4份，红枣渣25份，桑叶水提物5份，海藻酸钠4份。
2.根据权利要求1所述的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1面团调制：将面粉、黄油、白砂糖、淀粉、食盐、小苏打、碳酸氢铵、红枣渣、桑叶水提物和海藻酸钠按比例混合，并搅拌均匀，然后边倒水边和面得到面团，并将面团于室温静置；
S2辊压、分块：用擀面杖辊压面团数次，得到厚薄均匀的面带；然后将面带均分成大小一致的小块，得到生饼胚；
S3烘烤：将生饼胚排列于烤盘上，置于烤箱中烘烤成型；烘烤结束后，取出饼干进行包装，并保藏于阴凉干燥的室内。
3.根据权利要求2所述的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述水的温度为37℃～40℃。
4.根据权利要求2所述的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干的制备方法，其特征在于：步骤S1中，面团静止的时间为10min。
5.根据权利要求2所述的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述水的温度为28～30℃，面团在保鲜膜中静置的时间为25～30min。
6.根据权利要求2所述的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干的制备方法，其特征在于：步骤S2中，将所述面带的表面均匀扎上小孔之后，再均分为小块，得到生饼胚。
7.根据权利要求2所述的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述生饼胚是大小呈3cm×5cm的方形或者直径为4cm的圆形。
8.根据权利要求2所述的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述烘烤温度为面火175℃、底火170℃，烘烤时间为10min。
9.根据权利要求2所述的具有辅助降血脂作用的红枣渣桑叶饼干的制备方法，其特征在于：所述生饼胚置于烤盘上之前，所述烤盘表面均匀涂布一层食用油。
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