CN109251201B

CN109251201B - 一种抗hbv的含氮杂环化合物

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Publication number: CN109251201B
Application number: CN201811303860.7A
Authority: CN
Inventors: 谭回; 李维平; 唐爱发
Original assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2018-11-03
Filing date: 2018-11-03
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2038-11-03
Also published as: CN109251201A

Abstract

本发明公开了一种抗HBV的含氮杂环化合物，其制备方法及其用途。本发明的化合物具有良好的抑制HBV病毒的活性，因而可以用于制备治疗乙肝的药物，具有良好的开发应用前景，可作为先导化合物进一步优化。

Description

一种抗HBV的含氮杂环化合物

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种抗HBV的含氮杂环化合物、其制备方法及其用途。

背景技术

乙型肝炎是乙肝病毒(Hepatitis B Virus，HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主的一种传染性疾病。目前，治疗慢性乙型肝炎的化学药物主要有核苷类逆转录酶抑制剂如恩替卡韦、替比夫定等，但其长期应用易引起病毒耐药问题，使慢性乙肝的治疗仍面临着巨大的挑战。核衣壳在HBV的感染复制过程中与前基因组pgRNA的包装、包膜蛋白的识别密切相关，已逐渐成为开发新型抗HBV药物的新靶标。二氢嘧啶类化合物(HAPs)是目前发现的一类通过直接作用于核衣壳来达到抑制HBV复制目的的全新结构类型的化合物，研究其结构特点和作用机制将有助于快速寻找高效低毒的抗HBV药物。

二氢嘧啶类核衣壳抑制剂最早是由拜耳公开开发的Bay41-4109和Bay39-5493，随后很多大型药企在此基础上，设计合成了一系列二氢嘧啶类核衣壳抑制剂。但是拜耳开发的上述化合物由于毒性过大，进而研发失败。国内在二氢嘧啶类化合物的研发者中以广东东阳光药业为主要代表，其开发的化合物GLS4目前处于临床阶段。但是全世界范围内尚未有上市的二氢嘧啶类抑制剂，因而设计合成新的二氢嘧啶类抗HBV化合物具有良好的市场前景。

目前，由于天然产物的生物活性大，毒性低，副作用少，生物活性天然产物的衍生化作为发现新型药物的有效策略引起了广泛的关注。黄酮类化合物是多酚类天然化合物，广泛存在于植物中，例如水果，蔬菜，大豆以及浆果等。黄酮类化合物具有显着的生物活性，例如抗肿瘤作用、杀菌、抗病毒等。本发明基于黄酮类化合物的抗病毒活性，以及作为天然化合物的低毒性，首次将黄酮结构引入二氢嘧啶结构中，并通过开展体内外抗HBV病毒活性筛选实验，合成了一种抗HBV的含氮杂环化合物，筛选出高效低毒性的抗HBV候选药物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供了一种抗HBV的含氮杂环化合物，其具备良好的HBV抑制活性，并且对人正常肝细胞具有低毒性。

本发明的第一个方面，是提供一种式I化合物及其药学上可接受的盐：

本发明的另一方面提供一种制备式I化合物的方法，其合成路线如下：

具体反应步骤如下：

步骤1)：在反应瓶中依次加入邻三氟甲基苯甲醛、噻唑-2-基甲脒盐酸盐、乙酰乙酸乙酯、乙酸钠和溶剂，加热回流反应，TLC检测反应进程，待反应完全后，将反应液过滤，滤液脱除溶剂，得粗产物，再经分离纯化，得到中间体1。

步骤2)：在反应瓶中将中间体1加入到甲醇中，加热溶解，然后再分批加入NaBH4和ZnCl2，加料完毕，继续加热搅拌回流，TLC检测反应进程，待反应完全后，经后处理得到中间体2。

步骤3)：在反应瓶中依次加入5-氟-7-羟基黄酮，碱及溶剂，加热搅拌回流，再加入1,2-二溴乙烷，加热回流；TLC检测反应进程，分离纯化即得中间体3。

步骤4)：将中间体2与5-氟-7-(4-溴乙氧基)-4H-色烯-4-酮(中间体3)溶于丙酮，加入碱，加热搅拌回流，TLC监测反应完全，然后减压蒸干丙酮，通过硅胶柱分离纯化，即得产物I。

优选地，步骤1)中邻三氟甲基苯甲醛、噻唑-2-基甲脒盐酸盐、乙酰乙酸乙酯和乙酸钠的摩尔比为：1:0.8-1.2:1-1.5:1-1.6；更优选为：1:1:1.2:1.3。

步骤2)的中间体1与NaBH4的摩尔比为1:1.5-3，更优选为1:2。

步骤3)的5-氟-7-羟基黄酮与1,2-二溴乙烷的摩尔比为：1:1-1.5，更优选为1:1.2；所述碱为碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾。

步骤4)的中间体2与中间体3的摩尔比为：1:1-1.5，更优选为1:1.2。

本发明的另一方面提供式I化合物的可药用盐，所述药学上可接受的盐选自：盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、乙酸盐、草酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、三氟乙酸盐、甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、对甲苯磺酸盐或水杨酸盐。

本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、赋形剂。

本发明另一方面涉及一种式I化合物或包含其的药物组合物在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途；优选地，所述治疗乙型肝炎药物以抑制HBV病毒为靶点。

定义：

在某些实施方案中，药学上可接受的形式是药学上可接受的盐,药学上可接受的盐在本领域中是熟知的。药学上可接受的盐的实例是诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、高氯酸、乙酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸或丙二酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、乳酸、三氟乙酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。

“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体或赋形剂不破坏公开的化合物的药理学活性，并且在以足以递送治疗量的化合物的剂量施用时是无毒的。药物活性物质的所述介质和试剂的使用在本领域中是熟知的。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一类新的具有抗HBV活性的含氮杂环化合物，拓宽了现有抗HBV化合物的范围，可作为先导化合物继续优化。

本发明的化合物具备良好的抑制HBV活性的同时，对人体正常肝细胞具有较低的生理毒性，进而克服现有技术中的二氢嘧啶类化合物存在的对人体正常肝细胞有的毒副作用。

具体实施方式

下面通过实施例来具体说明本发明的内容。在本发明中，以下实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1式I化合物的制备

步骤1)：在三口烧瓶中依次加入邻三氟甲基苯甲醛(8.7g，50mmol)、噻唑-2-基甲脒盐酸盐(8.2g，50mmol)、乙酰乙酸乙酯(7.8g，60mmol)、乙酸钠(5.3g，65mmol)和无水乙醇(100mL)，在氮气保护下加热回流反应，TLC检测反应进程，待反应完全后(约11-13h)，将反应液真空抽滤，滤液减压脱除溶剂，得黄色油状物，再经柱层析纯化(以石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂，经梯度洗脱)，得到黄色固体(即中间体1)(13.35g，67.6％)。

m/z:396.1(M+1)；

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.78(d,1H),7.73(d,1H),7.64-7.28(m,4H),6.18(s,1H),5.13(bts,1H),3.97(q,2H),2.59(s,3H),1.02(t,3H)。

步骤2)：在三口烧瓶中将中间体1(9.9g，25mmol)加入到100ml甲醇中，加热溶解，然后再分批加入NaBH4(1.9g，50mmol)和少量ZnCl2，2h加料完毕，继续加热搅拌回流，TLC检测反应进程，待反应完全后，将反应液倾倒入冰水中(75mL)，缓慢滴加稀盐酸，滴加到反应体系不再冒泡即可。乙酸乙酯(50mL)萃取三次，合并有机相，无水硫酸镁干燥，真空脱溶，粗产物经柱层析得到淡黄色固体5.2g，即中间体2(收率60.9％)。

m/z:340.1(M+1)；

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.57(s,1H),7.80(d,1H),7.74(d,1H),7.63-7.26(m,4H),6.16(s,1H),5.12(bts,1H),2.57(s,3H)。

步骤3)：在三口烧瓶中依次加入(9.0g，50mmol)5-氟-7-羟基黄酮，无水碳酸钾及200ml丙酮，加热搅拌回流，再逐滴加入(11.3g，60mmol)1,2-二溴乙烷，60℃加热冷凝回流，溶液变澄清再变浑浊；薄层色谱法检测反应进程，柱色谱纯化即得7.3g中间体3，洗脱剂为：甲醇：二氯甲烷＝1:50-150:1；收率约为50.9％。

步骤4)：将中间体2(1.70g，5mmol)与5-氟-7-(4-溴乙氧基)-4H-色烯-4-酮(中间体3)(1.72g，6mmol)溶于50ml丙酮，加入碳酸钾(0.89g，6mmol)，加热搅拌回流，TLC监测反应完全。然后减压蒸干丙酮，通过硅胶柱分离纯化即得浅黄色粉末1.50g，即产物I，(洗脱剂为二氯甲烷：甲醇，梯度洗脱)，收率55％。

m/z:546.1(M+1)；

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.80(d,1H),7.76(d,1H),7.67(d,1H),7.64-7.21(m,6H),6.34(s,1H),6.17(s,1H),5.10(bts,1H),4.13(m,2H),3.79(m,2H),2.58(s,3H)。

实施例2：体外抗HBV药效活性测定实验

细胞株选用HBV HepG2.2.15细胞株

qPCR检测细胞培养液病毒DNA含量并计算化合物对病毒的抑制百分率(％，Inh)，具体实验方法如下：

接种HepG2.2.15细胞到96孔微孔板(40,000细胞/孔)，第二天加入含待检验化合物的细胞培养液处理细胞，测抑制百分比的化合物做双副孔，化合物终浓度为500nmol。第五天更换含药物的培养液，第八天收集培养上清并提取上清中的DNA。

病毒DNA提取：参照QIAamp96DNABlood Kit(QIAGEN51161)。

定量PCR：按照PCR体系配置反应混合液；将混合液加入384孔PCR反应板(定量专用)；加入按比例稀释好的标准品模板(标准品模板最高浓度为1×10⁷copies/uL，9倍稀释7个点，最低浓度为10copies/ul)；加入样本模板；用封板膜将384孔板封上；按照程序运行定量PCR仪。

化合物对HBV复制抑制百分率计算：％Inh.＝[1-加化合物处理HBV DNA量/DMSO对照处理HBV DNA量]×100。

实验结果：本发明的化合物的体外抑制HBV复制的抑制百分率(％Inh)

上述结果表明本发明所述的化合物显示出较强的抗HBV病毒活性，可以用于治疗HBV病毒感染引起的乙型肝炎。

实施例3体外测试对于人正常肝细胞株L02的毒副作用

1)L02细胞分别用含1％双抗和10％FBS的1640培养基培养于含5％CO₂、37℃的饱和湿度培养箱中，2天传代一次。

选取对数生长期的L02细胞，用含10％FBS的培养基配成浓度为5×10⁴/mL的细胞悬液，接种到96孔培养板中，每孔加入100μL细胞悬液。在5％CO₂、37℃的饱和湿度培养箱中继续培养24h后，移弃培养液，再分别加入化合物浓度为8、16、32、64、128uM的培养基200μL(设置3个副孔)，继续培养48h后，加入20μL MTT，放入培养箱培养4h后，弃去培养基，每孔加入150uLDMAO，置摇床上低速、避光振摇10min使结晶溶解完全，用酶标仪于490nm波长处测定吸光度值(OD)。平行重复3次。

细胞存活率(cell viability)计算公式如下：Cellviability＝(OD_Drug-OD_Blank)/(OD_Control-OD_Blank)×100％

测试结果如下：

化合物	IC<sub>50</sub>(μM)±SD
		实施例1	>100

结果显示本发明的化合物对于人正常肝细胞L02具有较低的毒性，在抑制HBV病毒的同时，能够避免或减少对人体的毒副作用。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐，其结构如下：

2.根据权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，所述药学上可接受的盐选自：盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、乙酸盐、草酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、三氟乙酸盐、甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、对甲苯磺酸盐或水杨酸盐。

3.一种制备如权利要求1所述的式I化合物的方法，其反应路线如下：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体反应过程包括如下步骤：

步骤1)：在反应瓶中依次加入邻三氟甲基苯甲醛、噻唑-2-基甲脒盐酸盐、乙酰乙酸乙酯、乙酸钠和溶剂，加热回流反应，TLC检测反应进程，待反应完全后，将反应液过滤，滤液脱除溶剂，得粗产物，再经分离纯化，得到中间体1；

步骤2)：在反应瓶中将中间体1加入到甲醇中，加热溶解，然后再分批加入NaBH4和ZnCl2，加料完毕，继续加热搅拌回流，TLC检测反应进程，待反应完全后，经后处理得到中间体2；

步骤3)：在反应瓶中依次加入5-氟-7-羟基黄酮，碱及溶剂，加热搅拌回流，再加入1,2-二溴乙烷，加热回流；TLC检测反应进程，分离纯化即得中间体3；

步骤4)：将中间体2与5-氟-7-(4-溴乙氧基)-4H-色烯-4-酮即中间体3溶于丙酮，加入碱，加热搅拌回流，TLC监测反应完全，然后减压蒸干丙酮，通过硅胶柱分离纯化，即得产物I。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

步骤1)中邻三氟甲基苯甲醛、噻唑-2-基甲脒盐酸盐、乙酰乙酸乙酯和乙酸钠的摩尔比为1:0.8-1.2:1-1.5:1-1.6；

步骤2)的中间体1与NaBH4的摩尔比为1:1.5-3。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

步骤1)中邻三氟甲基苯甲醛、噻唑-2-基甲脒盐酸盐、乙酰乙酸乙酯和乙酸钠的摩尔比为1:1:1.2:1.3；

步骤2)的中间体1与NaBH4的摩尔比为1:2。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

步骤3)的5-氟-7-羟基黄酮与1,2-二溴乙烷的摩尔比为1:1-1.5；所述碱为碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾；

步骤4)的中间体2与中间体3的摩尔比为1:1-1.5。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

步骤3)的5-氟-7-羟基黄酮与1,2-二溴乙烷的摩尔比为1:1.2；

步骤4)的中间体2与中间体3的摩尔比为1:1.2。

9.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、赋形剂。

10.权利要求1所述的式I化合物或权利要求9所述的药物组合物在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述治疗乙型肝炎药物以抑制HBV病毒为靶点。