CN107805244B

CN107805244B - 一种用于治疗乙型肝炎的药物及其制备方法

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Publication number: CN107805244B
Application number: CN201711125032.4A
Authority: CN
Inventors: 乔宏; 王永波; 韩莹; 刘洋; 毕莉莉; 张春红
Original assignee: Mudanjiang Medical University
Current assignee: Mudanjiang Medical University
Priority date: 2017-11-14
Filing date: 2017-11-14
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2037-11-14
Also published as: CN107805244A

Abstract

本发明涉及一种具有显著抗乙型肝炎作用的药物，其具有通式1所示的结构：

Description

一种用于治疗乙型肝炎的药物及其制备方法

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体而言，本发明涉及一种用于治疗乙型肝炎的药物及其制备方法，以及该药物用于治疗乙型肝炎的应用。

背景技术

乙型肝炎是严重危害人体健康的病毒性传染疾病。据世界卫生组织报道，全球有超过20亿人为乙型肝炎病毒携带者，其中约3亿人为慢性终身感染并发病。这些慢性肝炎的病人易转成慢性肝炎，是肝硬化、肝癌的主要病因。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)属DNA嗜肝病毒科，主要是通过血液制品、母婴和性接触等途径传播，其复制过程涉及5步：结合、侵入、转录、翻译、基因复制和包装。

目前对乙型肝炎尚缺乏专属性较强的治疗药物。国外对治疗病毒性肝炎新药的研制侧重于开发抗肝炎病毒药，在抗肝炎病毒药物的研究中取得一些进展。公认的疗效较好的抗乙型肝炎病毒药物主要为核苷类药物如拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定。这些药物在体外或体内实验中，对HBV病毒有抑制作用。其作用机制为药物进入细胞内成为三磷酸化合物，通过底物的竞争，对病毒的聚合酶或反转录酶抑制，最终抑制病毒DNA的合成、病毒的增殖。核苷类似物抗HBV，具有疗效显著、服用方便、生物利用度高、患者耐受性良好等特点，不足之处是疗效欠持久、停药病情易反复，以及病毒发生耐药性变异。为控制乙型肝炎的蔓延，医学界还研究出有效的乙型肝炎疫苗，对公众进行免疫注射，主要用于预防，获得了良好效果。但对已感染HBV则无效。另外治疗慢性乙型肝炎采用的药物是α-干扰素(IFN)，兼具有抗病毒和免疫调节功能。

综上所述，抗肝炎药物有非常大的市场需求，但是现在临床应用的抗肝炎药物普遍存在耐药性的问题，目前国际国内者在致力于成功地开发出能解决药物的耐药性，临床效率高且毒副作用较小的新一代抗乙型肝炎的药物。

发明内容

本发明人在前期研究成果的基础上，通过对合成的化合物进行抗乙型肝炎活性筛选，发现通式1结构的化合物具有显著的抗乙型肝炎作用。

因此，本发明的目的在于提供一种通式1化合物，或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂化物：

其中，

R₁、R₂可以相同或不同，各自独立地选自：氢、卤素、氰基、羟基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、CF₃、OCF₃、C1-4烷硫基、S(O)(C1-4烷基)、S(O)₂(C1-4烷基)、C(O)₂(C1-4烷基)、芳基、杂芳基或杂环烷基；

各个R可以相同或不同，各自独立地选自：氢、C1-4烷基(任选被羟基、C1-4烷氧基或氨基取代)；

L选自：-CH₂-、-OCH₂-、-NR’CH₂-；

R’选自：氢、C(O)C1-4烷基、C(O)₂(C1-4烷基)；

n选自：1、2或3。

本发明的某些化合物可以不同的异构形式存在(例如对映异构体、非对映异构体、几何异构体或互变异构体)。本发明涵盖所有这些异构体以及这些异构体的任意比例混合物。

合适的盐包括酸加成盐，例如盐酸盐、二盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、乙酸盐、二乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、甲磺酸盐或对甲苯磺酸盐。可选择的酸加成盐为三氟乙酸盐。

本发明的化合物可以溶剂化物(例如水合物)的形式存在，并且本发明涵盖所有这些溶剂化物。

卤素包括氟、氯、溴和碘，例如为氟或氯。

烷基为直链或支链，例如为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基。

芳基具有6-18个、优选6-10个环原子，其实例包括(但不限于)苯基、萘基、二氢茚基、茚基及蒽基。

杂芳基例如为芳族5或6元环，包括至少一个选自氮、氧和硫中的杂原子，任选与一个或多个其它环稠合；或为其N-氧化物或其S-氧化物或S-二氧化物。杂芳基例如为呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、咪唑基、三唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吲哚基。

杂环烷基为5或6元饱和环基，包括至少一个选自氮、氧和硫中的杂原子，其实例包括(但不限于)：四氢呋喃基、四氢噻吩基、吗啉基、硫代吗啉基、吡咯烷基、噻唑烷基、咪唑烷基、哌嗪基、哌啶基。

本发明的另一个方面提供通式1化合物，其中R₁为氢、羟基、C1-4烷基、C1-4烷氧基或苯基。

本发明的另一个方面提供通式1化合物，其中R₂为氢或C1-4烷基。

本发明的另一个方面提供通式1化合物，其中L为-CH₂-、-OCH₂-或-NR’CH₂-，R’为氢或C(O)C1-4烷基。

在实施例中描述本发明的化合物。实施例化合物中的每个为本发明的另一个方面。因而，本发明提供以下化合物或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂化物：

(E)-3-((5-甲基嘧啶-4-基)亚甲基)-6-(吡咯烷-1-基甲基)异吲哚-1-酮(MIDO-1)；

(E)-3-((6-羟基嘧啶-4-基)亚甲基)-6-(哌嗪-1-基甲基)异吲哚-1-酮(MIDO-2)；

(E)-5-乙基-3-((6-甲氧基嘧啶-4-基)亚甲基)-6-(吗啉-1-基甲基)异吲哚-1-酮(MIDO-3)；

(E)-6-((4-乙酰基哌嗪-1-基)甲基)-3-((2-氯嘧啶-4-基)亚甲基)异吲哚-1-酮(MIDO-4)；

(E)-6-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-((6-苯基嘧啶-4-基)亚甲基)异吲哚-1-酮(MIDO-5)。

通过下述方法或通过调整的本领域已知方法制备本发明的化合物。

本发明的另一个方面提供用于制备通式1化合物的方法，所述方法包括：

其中，通式2化合物和通式3化合物在有机溶剂中，在碳酸铯作为碱的条件下，反应获得通式4化合物；

通式4化合物和通式5化合物在有机溶液中，在无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾，或者有机碱例如三乙胺或吡啶的存在下，反应获得通式1化合物；

其中，R₁、R₂、R、L、n的定义如本文所述，X表示卤素，优选氯或溴。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其中含有上述的本发明化合物和药学上可接受的稀释剂或载体。在进一方面，本发明提供了制备所述组合物的方法，所述方法包括将活性成分与稀释剂或载体混合。根据给药模式，药物组合物可以含有0.05-99wt％，例如0.05-80wt％，例如0.10-70wt％，例如0.10-50wt％活性成分，所有重量百分数基于整个组合物计算。

本发明的药物组合物可以按照标准方式给药用于希望被治疗的病症，例如通过局部、口服、直肠或肠胃外给药。为了实现上述目的，可以将本发明化合物通过本领域已知的方式配制成例如气溶剂、干粉制剂、片剂、胶囊剂、糖浆剂、散剂、颗粒剂、水或油性溶液剂或混悬剂、乳剂、可分散散剂、栓剂、软膏剂、霜剂、滴剂和无菌注射水或油性溶液剂或混悬剂。

本发明的合适药物组合物适合以单位剂型用于口服给药，例如片剂或胶囊剂形式口服给药，其中含有0.1mg-1g活性成分。

在另一方面，本发明的药物组合物适合用于静脉内、皮下或肌内注射。每个患者可以接受的例如静脉内、皮下或肌内剂量为0.01mg/kg至100mg/kg的化合物，例如为0.1mg/kg至20mg/kg的本发明化合物，该组合物每天给药1-4次。静脉内、皮下和肌内剂量可以通过单次快速静脉注射方式给药。或者，静脉内剂量可以通过在一段时间内连续输注的方式给予。或者，每个患者可以服用大约相当于非肠道日剂量的口服日剂量，所述组合物每天给药1-4次。

本发明的目的还在于提供所述化合物或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂化物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗乙型肝炎。

有益效果

本发明化合物在体外对于Hep G2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg具有很好的抑制作用，而且毒性较低，具有显著高于拉米夫定的治疗指数。因此，本发明化合物具有优异的抗乙型肝炎病毒活性，适合用作用于治疗乙型肝炎的药物。

具体实施方式

在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。

所属领域的技术人员将认识到：本发明所描述的化学反应可以用来合适地制备许多本发明的其他化合物，且用于制备本发明的化合物的其它方法都被认为是在本发明的范围之内。例如，根据本发明那些非例证的化合物的合成可以成功地被所属领域的技术人员通过修饰方法完成，如适当的保护干扰基团，通过利用其他已知的试剂除了本发明所描述的，或将反应条件做一些常规的修改。另外，本发明所公开的反应或已知的反应条件也公认地适用于本发明其他化合物的制备。

实施例

实施例1：(E)-3-((5-甲基嘧啶-4-基)亚甲基)-6-(吡咯烷-1-基甲基)异吲哚-1-酮(MIDO-1)的合成

步骤一：在-5℃下，在氮气氛下将6-(溴甲基)异吲哚-1-酮3.71g、四氢吡咯1.42g、碳酸铯7.31g在50mL的THF中混合。使所述反应溶液升至室温并搅拌过夜。将所得到的溶液用200mL水稀释，然后以3×100mL乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用100mL水、100mL盐水各洗涤一次并经无水氯化钙干燥。旋蒸除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱层(乙酸乙酯：石油醚＝1：5)纯化，得到中间体6-(吡咯烷-1-基甲基)异吲哚-1-酮3.17g，产率89.0％。

ESI-MS：217.13[M+H]⁺

步骤二：将5-甲基嘧啶-4-甲醛1.46g用150ml无水乙醇溶解后，再加入6-(吡咯烷-1-基甲基)异吲哚-1-酮2.16g和2ml三乙胺，室温下反应5h，出现大量沉淀。抽滤，用少量冰冻的无水乙醇洗涤，干燥，得白色固体即标题化合物2.98g，收率93.2％。

ESI-MS：321.16[M+H]⁺

元素分析：理论值/实测值，C(71.23/71.34),H(6.29/6.16),N(17.49/17.57),O(4.99/4.93)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.12(s,1H),8.44(s,1H),8.03(s,1H),7.71(s,1H),7.44(m,2H),6.17(s,1H),3.62(s,2H),2.53(t,4H),2.33(s,3H),1.67(m,4H)。

实施例2：(E)-3-((6-羟基嘧啶-4-基)亚甲基)-6-(哌嗪-1-基甲基)异吲哚-1-酮(MIDO-2)的合成

步骤一：在-5℃下，在氮气氛下将6-(溴甲基)异吲哚-1-酮3.71g、哌嗪1.72g、碳酸铯7.31g在80mL的THF中混合。使所述反应溶液升至室温并搅拌过夜。将所得到的溶液用200mL水稀释，然后以3×100mL乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用100mL水、100mL盐水各洗涤一次并经无水氯化钙干燥。旋蒸除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱层(乙酸乙酯：正己烷＝1：3)纯化，得到中间体6-(哌嗪-1-基甲基)异吲哚-1-酮3.33g，产率87.3％。

ESI-MS：232.14[M+H]⁺

步骤二：将6-羟基嘧啶-4-甲醛1.48g用100ml无水乙醇溶解后，再加入6-(哌嗪-1-基甲基)异吲哚-1-酮2.32g和1.5g碳酸钾，室温下反应4h，出现大量沉淀。抽滤，用少量冰冻的无水乙醇洗涤，干燥，得白色固体即标题化合物3.12g，收率92.5％。

ESI-MS：338.15[M+H]⁺

元素分析：理论值/实测值，C(64.08/64.19),H(5.68/5.53),N(20.76/20.67),O(9.48/9.61)

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ11.67(s,1H),8.46(s,1H),8.03(s,1H),7.71(s,1H),7.44(m,2H),6.87(s,1H),6.17(s,1H),3.63(s,2H),2.67(s,4H),2.31(s,4H),2.07(s,1H)。

按照与实施例1类似的方法，合成以下化合物：

生物活性实施例1

1材料和方法

拉米夫定(lamivudine)(葛兰素史克制药(苏州)有限公司，国药准字H20030581)；Hep G2.2.15细胞(引自广州空军医院)；高糖DMEM(GIBICO)；G418(GIBICO)；胎牛血清(天津血研所)；L-谷氨酰胺(AMRESCO)；青霉素，链霉素(石药集团中诺药业(石家庄)有限公司)。

各供试所测样品溶解于DMSO(二甲基亚砜)中，用培养基配置成母液浓度，保存于4℃冰箱中，用于抗HBV活性检测。拉米夫定作为实验的药物对照。

2实验过程

用胰蛋白酶将Hep G2.2.15细胞消化，用添加了0.03％L-谷氨酰胺，100mg/LG418，100IU青酶素，100IU链霉素的高糖DMEM液制成单细胞悬液，每孔按3×105×0.1mL^-1分种于96孔板，0.1mL/孔，24h后换用含2％的胎牛血清，380μg/mL的含药培养液，每种药物设四个药物浓度，每个浓度设三孔，四倍稀释，同时设三孔不加药物的细胞对照组及一孔空白细胞组，并以拉米夫定做阳性药物对照；7天后收集上清，用ELISA法测定HBsAg和HBeAg的分泌情况。同时用MTT法测定药物对细胞的毒性。

3目标化合物对细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用

ELISA法测定各待测样品对细胞上清液中HBsAg和HBeAg的影响，选择小于无毒性浓度的一系列浓度作为筛选浓度，将Hep G2.2.15细胞按2.5×10⁴个/ml密度接种于96孔培养板中，每孔200μl，24h后待细胞贴于孔底，弃去上清，加入含有不同浓度待测样品的培养液，每个浓度设3个复孔，并设加完全培养基的细胞做为正常对照，5％CO₂ 37℃下培养，根据需要换液，收集第6天细胞上清液，保存于-20℃。按照ELISA方法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg含量，按下列公式计算各待测样品对抗原分泌的抑制率：

根据抗原分泌抑制率，用Excel软件按待测样品对Hep G2.2.15细胞抗原抑制率对待测样品浓度作图，拟合出量效关系曲线，求出半数抑制浓度IC₅₀，即抗原分泌受到抑制达50％时的待测样品浓度。

4目标化合物对细胞半数毒性浓度(TC₅₀)的测定

MTT法(Y.Nakajima,Y.Saton,M.Katsumata,K.Tsujiyama,Y.Ida,and J.Shoji，Phytochemistry 1994,36,119-127)测定各待测样品对Hep G2.2.15细胞的毒性。收集对数期细胞，细胞计数板计数，调整细胞悬液浓度，配成1×10⁵个/ml，96孔细胞培养板中每孔加入100μl，每个浓度设三个复孔，细胞培养箱中(5％CO₂，37℃)孵育24h，细胞长成单层铺满孔底，加入含有不同待测样品浓度的培养基，并设调零孔，对照孔。连续培养72h后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即终浓度为0.5％MTT)，继续培养4h后，小心吸去孔内培养液，每孔加入DMSO 200μl，置摇床上低速避光振荡10min，使结晶物充分溶解，酶标仪(检测波长490nm，参考波长630nm)测定，并读取各孔OD值，按下面的公式计算各药物对Hep G2.2.15细胞的抑制率：

根据各待测样品对细胞抑制率，用Excel软件按待测样品对Hep G2.2.15细胞抑制率对待测样品浓度作图，拟合出量效关系曲线，求出半数毒性浓度TC₅₀，即抑制细胞生长达50％时药物浓度。

5.判断药物的抗HBV效果

根据治疗指数TI＝TC₅₀/IC₅₀，按以下标准评价药物的抗HBV效果，TI<1.0表明药物有毒无效，1.0≤TI≤2.0表明药物低效有毒即弱阳性，2.0<TI<10.0表明药物有效低毒即阳性，TI≥10.0表明药物高效低毒即强阳性。

试验结果表明，本发明化合物在体外对于Hep G2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg具有很好的抑制作用，而且毒性较低，具有显著高于拉米夫定的治疗指数。因此，本发明化合物具有优异的抗乙型肝炎病毒活性，适合用作用于治疗乙型肝炎的药物。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims

1.一种通式1化合物，或其药学上可接受的盐：

其中，

所述R₁为氢、羟基、C1-4烷基、C1-4烷氧基；所述R₂为氢或C1-4烷基；

各个R可以相同或不同，各自独立地选自：氢、任选被羟基、C1-4烷氧基或氨基取代的C1-4烷基；

所述L为-CH₂-、-OCH₂-或-NR’CH₂-，R’为氢或C(O)C1-4烷基；

n选自：1、2或3。

2.一种化合物，其选自：

3.一种根据权利要求1所述的通式1化合物的制备方法，所述制备方法包含以下步骤：

通式4化合物和通式5化合物在有机溶液中，在无机碱氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾，或者有机碱三乙胺或吡啶的存在下，反应获得通式1化合物；

其中，R₁、R₂、R、L、n的定义如权利要求1所述，X表示卤素。

4.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的通式1化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的稀释剂或载体。

5.根据权利要求1所述的通式1化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的应用，所述药物用于治疗乙型肝炎。