CN109234279A - 一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法及其应用，首先确定maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛的具体位点和序列信息，设计10对检测maspin编码序列上游调控区域中CpG岛甲基化状态的特异性引物。利用该引物特异性的扩增maspin编码序列上游调控区域中包含CpG岛的不同长度的序列，进行后续甲基化定量检测。该方法可检测乳腺癌患者乳腺癌组织或者乳腺癌转移部位maspin编码序列上游调控区域中CpG岛甲基化状态，诊断该病人是否已经发生乳腺癌转移、恶性程度等，辅助临床上对乳腺癌分期分型及治疗；也可检测正常人乳腺maspin编码序列上游调控区域中CpG岛甲基化状态，判断其发病几率、是否会发生乳腺癌转移、恶性程度等，辅助乳腺癌早期筛查，具有良好的应用前景。

Description

一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法及其 应用

技术领域

本发明涉及生物技术及医学领域，具体涉及一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法及其应用。

背景技术

国际癌症研究机构2012年提供了全球范围内癌症发病率、死亡率和流行率的估计数据，以及国家和地区的数据。该大数据表明，乳腺癌是最常被诊断出的癌症，也是全球女性癌症死亡的主要原因，2012年估计有170万例病例和521,900例死亡。仅乳腺癌就占所有癌症病例的25％，占所有癌症死亡人数的15％。据卫生部最新发布的调查报告显示，在我国，乳腺癌已成为上升幅度最快的恶性肿瘤之一。在过去30年中，上升比例高达96％，仅次于肺癌。在情况最严重的上海，发病率达到了52.98/10万；在北京，乳腺癌的发病率也高达33.7/10万，年均增长速度甚至高出欧美国家1～2个百分点。目前，我国的乳腺癌已步入每年约2％～3％的快速增长期，发病高峰以40岁左右的女性为主。因此对于乳腺癌的预防和诊断的研究具有深远而现实的意义。

目前，乳腺癌筛查最常用的影像学方法是钼靶X线和超声。乳腺钼靶，全称乳腺钼靶X线摄影检查，又称钼钯检查，是目前诊断乳腺疾病的首选和最简便、最可靠的无创性检测手段，痛苦相对较小，简便易行，且分辨率高，重复性好，留取的图像可供前后对比，不受年龄、体形的限制，目前已作为常规的检查。它的特点是可以检测出医生触摸不到的乳腺肿块，特别是对于大乳房和脂肪型乳房，其诊断性可高达95％，对于以少许微小钙化为唯一表现的T0期乳腺癌(临床门诊阴性)，也只有凭借软X线检查才能被早期发现和诊断，对乳腺癌的诊断敏感性为82％～89％，特异性为87％～94％。但乳腺钼靶对肿瘤风险较高的致密性乳腺敏感度不高。超声检查简便易行，对浸润性乳腺癌较钼靶X线检查敏感。随着超声弹性成像、超声造影、超声三维成像等超声影像学新技术的迅猛发展及应用，超声波检查在乳腺癌的早期诊断中发挥越来越重要的作用。随着对乳腺癌研究的深入，钼靶X线和超声检查等现有检测诊断技术仍有以下明显短板：

(1)不能检测早期原位乳腺癌的发生，即当乳腺癌发生早期没有形成明显肿瘤或者肿瘤块较小时，很难检测到。

(2)很难预测乳腺癌是否会转移。

(3)很难检测乳腺癌的早期转移。

总之，现有检测技术已不能满足临床医师对肿瘤患者进行术前病理组织学分级、预估肿瘤分子分型的要求。

失去对增殖的控制和对细胞凋亡/坏死的抗性被认为是包括乳腺癌在内的许多癌症类型的标志。在原发性肿瘤形成之后，可能发生转移，由此细胞获得迁移能力，侵入周围组织，进入血液和淋巴系统，然后渗出并定植于二级位点。转移部位的复发是乳腺癌患者死亡的主要原因。

maspin是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，是蛋白酶抑制剂serpin家族的成员，可作为肿瘤抑制基因，maspin已被证明可抑制细胞运动、侵袭和转移。maspin基因表达的丧失是乳腺癌中的常见事件，其导致侵袭潜力增加和转移性疾病的传播。乳腺癌细胞中maspin基因表达的丧失不是由于maspin基因的丢失或重新排列，而是由于调节maspin表达的因子在癌症进展期间被破坏。肿瘤抑制基因启动子中CpG二核苷酸的异常胞嘧啶甲基化通常与其致癌作用和癌症进展过程中染色质结构的变化及其转录沉默有关。研究表明，DNA高甲基化导致人乳腺癌中maspin基因的沉默。

发明内容

为了克服现有技术的上述不足，本发明提供了一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的在于提出了maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛，所述maspin基因编码序列上游调控区域序列如SEQ ID NO.1所示；所述CPG岛位于2072–2173bp之间，长度为102bp。

本发明的第二个目的在于提出了检测maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛甲基化状态的特异性引物，所述特异性引物包括5对针对甲基化序列的引物和5对针对非甲基化序列的引物，所述5对针对甲基化序列的引物如SEQ ID NO.2～11所示，所述5对针对非甲基化序列的引物如SEQ ID NO.12～21所示。

本发明的第三个目的在于提出一种maspin基因甲基化状态检测试剂盒，包括检测maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛甲基化状态的特异性引物和PCR工作液；所述特异性引物包括5对针对甲基化序列的引物和5对针对非甲基化序列的引物，所述5对针对甲基化序列的引物如SEQ ID NO.2～11所示，所述5对针对非甲基化序列的引物如SEQ IDNO.12～21所示。

进一步地，所述试剂盒包括浓度均为10μM的正向引物和反向引物各1μL、10μLSYBR Premix Ex Taq II 2×、2μL DNA模板和6μL灭菌水。

本发明的第四个目的在于提出一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法，包括如下步骤：

(1)提取组织样本基因组DNA并对提取的DNA样本进行质量检测；

(2)亚硫酸氢钠修饰基因组DNA并纯化回收定量；

(3)设计检测maspin编码序列上游调控区域的CpG岛甲基化状态的特异性引物；所述特异性引物包括5对针对甲基化序列的引物和5对针对非甲基化序列的引物，所述5对针对甲基化序列的引物如SEQ ID NO.2～11所示，所述5对针对非甲基化序列的引物如SEQ IDNO.12～21所示；

(4)以回收的DNA为模板、以每对特异性引物为引物分别进行荧光定量PCR；

(5)计算待测样本maspin编码序列上游调控区域CpG岛的甲基化程度W，分析待测样本甲基化检测结果；

20％＜W≤30％时，待测样本为可能发生乳腺癌样本；

30％＜W≤50％时，待测样本为已发生非转移乳腺癌样本；

50％＜W≤80％时，待测样本为已发生转移乳腺癌样本。

进一步地，所述步骤(1)中组织样本选自乳腺组织样本、乳腺癌组织样本、乳腺癌转移部位组织样本。

进一步地，所述步骤(4)中PCR反应体系为：浓度均为10μM的正向引物和反向引物各1μL、10μL SYBR Premix Ex Taq II 2×、2μL DNA模板和6μL灭菌水。

进一步地，所述步骤(4)中PCR反应程序为：95℃5min,(95℃10s,95℃20s,68℃for20Sec)40个循环,95℃10s,melt curve。

本发明的第五个目的在于提出上述任一项的基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法在乳腺癌诊断中的应用。

本发明的技术方案的原理为：

(1)DNA甲基化及甲基化特异性的原理：DNA甲基化主要发生位点是CpG岛。在正常人基因组中，CpG岛外的CpG位点通常是甲基化的，而CpG岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态，这种甲基化的形式在随细胞分裂稳定的遗传。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG位点非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG位点呈高甲基化状态，导致染色体螺旋程度增加，转录抑制，基因表达缺失。

甲基化特异性PCR基本原理为：单链DNA经过亚硫酸氢盐修饰后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化DNA序列区分开来。

(2)本发明确定了maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛的具体位点和序列信息，并针对富集目的基因特定的CpG区域，设计5针对甲基化序列的引物和5对针对非甲基化序列的引物，用于特异性检测对应CpG位点的甲基化状态，反复优化PCR条件，保证引物与模板结合的特异性。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明确定了maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛的具体位点和序列信息，为后续的定量检测提供基础。

(2)本发明针对富集目的基因特定的CpG区域，设计5针对甲基化序列的引物和5对针对非甲基化序列的引物，能够有效的扩增maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛区域片段，用于特异性检测对应CpG位点的甲基化状态。同时，针对CpG岛区域甲基化和非甲基化都设计了多对特异性引物，避免了了偶然性误差，保证了结果的准确性。

(3)本发明建立的基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法，优化了PCR体系及程序，再结合特异性的引物，保证了检测结果的准确性。

(4)本发明建立的基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法，可广泛应用于乳腺癌早期筛查，有效辅助判断乳腺癌恶性程度和是否转移。

附图说明

图1为实施例1中maspin基因编码序列上游调控区域CpG岛的示意图；

图2为实施例2中设计的特异性扩增maspin基因编码序列上游调控区域CpG岛的引物示意图；

图3为实施例4中提取的DNA的琼脂糖凝胶电泳谱图；

图4为实施例4中特异性扩增maspin基因编码序列上游调控区域CpG岛的引物特异性验证结果示意图；其中图4a为SEQ ID NO.2-3的特异性验证结果，图4b为SEQ ID NO.12-13的特异性验证结果，图4c为SEQ ID NO.4-5的特异性验证结果，图4d为SEQ ID NO.14-15的特异性验证结果，图4e为SEQ ID NO.6-7的特异性验证结果，图4f为SEQ ID NO.16-17的特异性验证结果，图4g为SEQ ID NO.8-9的特异性验证结果，图4h为SEQ ID NO.18-19的特异性验证结果，图4i为SEQ ID NO.10-11的特异性验证结果，图4j为SEQ ID NO.20-21的特异性验证结果。

图5为实施例5中对正常样本和乳腺癌样本中maspin基因编码序列上游调控区域CpG岛甲基化检测结果示意图；

图6为实施例6中对未转移样本和已转移乳腺癌样本中maspin基因编码序列上游调控区域CpG岛甲基化程度检测结果示意图。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

实施例1：确定maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛的具体位点和序列信息

本发明的乳腺癌检测方法是基于甲基化特异性PCR原理，单链DNA经过亚硫酸氢盐修饰后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，通过PCR扩增即可将甲

基化与非甲基化DNA序列区分开来。所以需要首先确定maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛的具体位点和序列信息。

利用http://genome.ucsc.edu/index.html网址gene sorter工具，选取物种为human，选择最新的数据库，搜索maspin基因，选取启动子上游2000bp和5’UTR，得到maspin基因编码序列上游调控区域序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。再将得到的序列通过http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi网站，提交分析上述序列中CpG岛信息。结果如图1所示，分析显示在2072-2173bp之间有一个CpG岛，长度为102bp。

实施例2：设计并合成特异性扩增maspin基因编码序列上游调控区域CpG岛的引物

针对实施例1中maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛信息，设计针对甲基化和非甲基化序列的两套引物，利用这10对引物可以特异性的分别扩增maspin编码序列上游调控区域中包含CpG岛甲基化和未甲基化的不同长度的序列，进行后续的甲基化定量分析，从而特异性检测对应CPG位点的甲基化状态。按照SEQ ID NO.1所示序列通过http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi网站，选择Pick MSP primers选项，勾选Use CpG island prediction for primer selection？再点击submit，得到特异性扩增maspin基因编码序列上游调控区域CpG岛的用到的引物，其示意图如图2所示，具体序列信息如SEQ ID NO.2所示。并在武汉擎科生物科技有限公司合成。

实施例3：建立基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法

本发明的检测方法是基于甲基化特异性PCR原理，分别设计针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化DNA序列区分开来。该方法包括如下步骤：

1.提取组织样本基因组DNA并对提取的DNA样本进行质量检测

针对病人是否已发生乳腺癌的转移、恶性程度等诊断需求，组织样本可以是以微创取出的少量乳腺癌临床组织样本，也可以是乳腺癌转移部位的乳腺癌组织样本；针对正常人乳腺癌发病率等早期筛查的需求，组织样本可以是以微创取出的少量乳腺临床组织样本，判断其发病几率及是否会发生乳腺癌转移，恶性程度等，辅助临床上对乳腺癌发生发展的早期筛查。

2.亚硫酸氢钠修饰基因组DNA并纯化回收定量。

3.设计检测maspin编码序列上游调控区域的CpG岛甲基化状态的特异性引物；所述特异性引物包括5对针对甲基化序列的引物和5对针对非甲基化序列的引物，所述5对针对甲基化序列的引物如SEQ ID NO.2～11所示，所述5对针对非甲基化序列的引物如SEQ IDNO.12～21所示。

表1特异性检测引物

4.以回收的DNA为模板、以每对特异性引物为引物分别进行荧光定量PCR。

PCR反应体系为：浓度均为10μM的正向引物和反向引物各1μL、10μL SYBR PremixEx Taq II 2×、2μL DNA模板和6μL灭菌水。

PCR反应程序为：95℃5min,(95℃10s,95℃20s,68℃for 20Sec)40个循环,95℃10s,melt curve

5.计算待测样本maspin编码序列上游调控区域CpG岛的甲基化程度W，分析待测样本甲基化检测结果。

20％＜W≤30％时，待测样本为可能发生乳腺癌样本；

30％＜W≤50％时，待测样本为已发生非转移乳腺癌样本；

50％＜W≤100％时，待测样本为已发生转移乳腺癌样本。

本发明中待测样本maspin编码序列上游调控区域CpG岛的甲基化程度W＝(5-甲基胞嘧啶(5-mC)峰积面积)/(5-mC峰积面积+胞嘧啶(C)峰积面积)×100

取100份正常人样本、100份已发生非转移乳腺癌患者样本和100份已发生转移乳腺癌患者样本进行本发明的maspin基因甲基化状态检测，经统计分析发现，正常人maspin编码序列上游调控区域CpG岛的甲基化程度W平均值为10％，已发生非转移乳腺癌样本maspin编码序列上游调控区域CpG岛的甲基化程度W为30％＜W≤50％，已发生转移乳腺癌样本的maspin编码序列上游调控区域CpG岛的甲基化程度W为50％＜W≤80％。

实施例4：验证扩增maspin基因编码序列上游调控区域CpG岛的引物特异性

1.提取样本基因组DNA

取一份乳腺癌患者的新鲜乳腺癌组织样本(经组织病理学确诊，且患者的一般情况、肿瘤分期、淋巴结转移情况等临床资料均较完整)。利用qiagen公司商品化的组织基因组提取试剂盒，DNeasy Blood&Tissue Kits提取。提取完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整度，从图中可以看出，电泳显示提取的基因组条带单一，无RNA污染，大小都在12，000bp以上，比较完整。并用紫外分光光度计定量，260/280在1.7-2.1之间，DNA样本浓度为7.5ng/μl备用。

2.亚硫酸氢钠修饰基因组DNA并纯化回收定量

将步骤1得到的DNA取出2μg于1.5ml EP管中，使用三蒸水稀释至50μl；加5.5μl新鲜配制的3M NaOH，42℃水浴30min使DNA变性。加30μl 10mM对苯二酚(氢醌)至上述水浴后混合液中，待溶液变成淡黄色,加520μl 3.6M亚硫酸氢钠，pH＝5.0至上述水浴后溶液中混匀。加200μl石蜡油，防止水分蒸发、限制氧化；轻柔颠倒混匀溶液，EP管外裹以铝箔纸，避光；50℃避光水浴16h。将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5ml EP管中，使用Axygen公司清洁试剂盒回收DNA。并用紫外分光光度计定量，260/280在1.7-2.1之间，并将已定浓度的DNA样本用TE稀释成5ng/μl备用。

3.以回收的DNA为模板、以每对特异性引物为引物分别进行荧光定量PCR

取10支PCR管，10对PCR引物对分别加入到10支不同的PCR管中，再向每支PCR管中分别加入相同量的SYBR Premix Ex Taq II 2×、DNA模板和灭菌水。

每支PCR管中PCR反应体系为：浓度均为10μM的正向引物和反向引物各1μL、10μLSYBR Premix Ex Taq II 2×、2μL DNA模板和6μL灭菌水。

PCR反应程序为：95℃5min,(95℃10s,95℃20s,68℃for 20Sec)40个循环,95℃10s,melt curve 65℃to 95℃，increment 0.5℃for 30Sec。

4.结果分析

观察PCR扩增得到的溶解曲线，观察溶解曲线发现，每支PCR管中均得到单一溶解温度，即10对引物特异性良好。

实施例5：验证正常和乳腺癌样本中maspin基因编码序列上游调控区域CpG岛甲基化状态

取20例正常样本和20例乳腺癌样本作为分析样本，每一例样本均采用实施例4相同的处理方法进行处理，分别计算甲基化程度并根据本发明的技术方案的标准定量分析每例样本中maspin基因编码序列上游调控区域CpG岛甲基化状态。结果如图5所示，相较于正常样本，乳腺癌患者样本maspin基因编码序列上游调控区域CpG岛有明显的甲基化。

实施例6：验证转移和非转移性乳腺癌样本中maspin基因编码序列上游调控区域CpG岛甲基化状态

取15例非转移乳腺癌样本和17例转移性乳腺癌样本作为分析样本，每一例样本均采用实施例4相同的处理方法进行处理，分别计算甲基化程度并根据本发明的技术方案的标准定量分析每例样本中maspin基因编码序列上游调控区域CpG岛甲基化状态。结果如图5所示，相较于非转移乳腺癌样本，转移性乳腺癌样本中maspin基因编码序列上游调控区域CpG岛甲基化明显更高。

因此，本发明建立的基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法，可用于诊断该病人是否已经发生乳腺癌转移、恶性程度等，辅助临床上对乳腺癌分期分型及治疗，也可广泛应用于乳腺癌早期筛查，具有良好的应用前景。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉科技大学

<120> 一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法及其应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4583

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atccttcccc agtcatagcc agactgaaaa ggtcacaccc atctctgaac tacttttgtc 60

attttttttt agttatagtt agattgaaaa ggttatattt atttttgaat tatttttgtt 120

atttgcacct ctcttaagtc ccttattaca tgcctccaga tactttcttt tgtttcttgt 180

atttgtattt tttttaagtt ttttattata tgtttttaga tatttttttt tgttttttgt 240

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ctgctgcagt ttacacaaaa agaatggaga tcagagtact ttttgtgcca ccaacgtgtg 3660

ttgttgtagt ttatataaaa agaatggaga ttagagtatt ttttgtgtta ttaacgtgtc 3720

tgagaaattt gtagtgttac tatcatcaca cattactttt atttcatcga atatttcact 3780

tgagaaattt gtagtgttat tattattata tattattttt attttatcga atattttatc 3840

ttccggtcct gcgtgggccg agaggattgc cgtacgcatg tctgtacgta tgcatgtaat 3900

tttcggtttt gcgtgggtcg agaggattgt cgtacgtatg tttgtacgta tgtatgtaac 3960

tcacagcccc ttcctgcccg aacatgttgg aggccttttg gaagctgtgc agacaacagt 4020

ttatagtttt tttttgtttg aatatgttgg aggttttttg gaagttgtgt agataatagt 4080

aacttcagcc tgaatcattt ctttcaattg tggacaagct gccaagaggc ttgagtaggt 4140

aattttagtt tgaattattt tttttaattg tggataagtt gttaagaggt ttgagtagga 4200

gaggagtgcc gccgaggcgg ggcggggcgg ggcgtggagc tgggctggca gtgggcgtga 4260

gaggagtgtc gtcgaggcgg ggcggggcgg ggcgtggagt tgggttggta gtgggcgtgg 4320

cggtgctgcc caggtgagcc accgctgctt ctgcccagac acggtcgcct ccacatccag 4380

cggtgttgtt taggtgagtt atcgttgttt ttgtttagat acggtcgttt ttatatttag 4440

gtctttgtgc tcctcgcttg cctgttcctt ttccacgcat tttccaggat aactgtgacg 4500

gtttttgtgt ttttcgtttg tttgtttttt ttttacgtat tttttaggat aattgtgatt 4560

ccaggcccgc atttaggttc gta 4583

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttttatcgaa tattttattt ttcgg 25

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gataactcac ctaaacaaca ccg 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttttatcgaa tattttattt ttcgg 25

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gataactcac ctaaacaaca ccg 23

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttttatcgaa tattttattt ttcgg 25

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ataactcacc taaacaacac cgc 23

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attttatcga atattttatt tttcgg 26

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gataactcac ctaaacaaca ccg 23

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttttatcgaa tattttattt ttcgg 25

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taactcacct aaacaacacc gc 22

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttttattgaa tattttattt tttgg 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caataactca cctaaacaac accac 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttttattgaa tattttattt tttgg 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aataactcac ctaaacaaca ccacc 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttttattgaa tattttattt tttgg 25

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ataactcacc taaacaacac cacc 24

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttttattgaa tattttattt tttgg 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

caataactca cctaaacaac accac 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttttattgaa tattttattt tttgg 25

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ataactcacc taaacaacac cacc 24

Claims (9)

1.maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛，其特征在于，所述maspin基因编码序列上游调控区域序列如SEQ ID NO.1所示；所述CPG岛位于2072–2173bp之间，长度为102bp。

2.检测maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛甲基化状态的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括5对针对甲基化序列的引物和5对针对非甲基化序列的引物，所述5对针对甲基化序列的引物如SEQ ID NO.2～11所示，所述5对针对非甲基化序列的引物如SEQ ID NO.12～21所示。

3.一种maspin基因甲基化状态检测试剂盒，其特征在于，包括检测maspin基因编码序列上游调控区域的CpG岛甲基化状态的特异性引物和PCR工作液；所述特异性引物包括5对针对甲基化序列的引物和5对针对非甲基化序列的引物，所述5对针对甲基化序列的引物如SEQ ID NO.2～11所示，所述5对针对非甲基化序列的引物如SEQ ID NO.12～21所示。

4.根据权利要求3所述的一种maspin基因甲基化状态检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括浓度均为10μM的正向引物和反向引物各1μL、10μL SYBR Premix Ex Taq II 2×、2μL DNA模板和6μL灭菌水。

5.一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取组织样本基因组DNA并对提取的DNA样本进行质量检测；

(2)亚硫酸氢钠修饰基因组DNA并纯化回收定量；

(3)设计检测maspin编码序列上游调控区域的CpG岛甲基化状态的特异性引物；所述特异性引物包括5对针对甲基化序列的引物和5对针对非甲基化序列的引物，所述5对针对甲基化序列的引物如SEQ ID NO.2～11所示，所述5对针对非甲基化序列的引物如SEQ IDNO.12～21所示；

(4)以回收的待测样本DNA为模板、以每对特异性引物为引物分别进行荧光定量PCR；

(5)计算待测样本maspin编码序列上游调控区域CpG岛的甲基化程度W，分析待测样本甲基化检测结果；

20％＜W≤30％时，待测样本为可能发生乳腺癌样本；

30％＜W≤50％时，待测样本为已发生非转移乳腺癌样本；

50％＜W≤80％时，待测样本为已发生转移乳腺癌样本。

6.根据权利要求5所述的一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法，其特征在于，所述步骤(1)中组织样本选自乳腺组织样本、乳腺癌组织样本、乳腺癌转移部位组织样本。

7.根据权利要求5所述的一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法，其特征在于，所述步骤(4)中PCR反应体系为：浓度均为10μM的正向引物和反向引物各1μL、10μLSYBR Premix Ex Taq II 2×、2μL DNA模板和6μL灭菌水。

8.根据权利要求5所述的一种基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法，其特征在于，所述步骤(4)中PCR反应程序为：95℃5min,(95℃10s,95℃20s,68℃for 20Sec)40个循环,95℃10s,melt curve。

9.如权利要求5-8任一项所述的基于定量PCR检测maspin基因甲基化状态的方法在乳腺癌诊断中的应用。