CN106929567A - 评估一个体罹患肝癌之风险以及罹患肝癌预后的方法 - Google Patents

评估一个体罹患肝癌之风险以及罹患肝癌预后的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106929567A
CN106929567A CN201511027187.5A CN201511027187A CN106929567A CN 106929567 A CN106929567 A CN 106929567A CN 201511027187 A CN201511027187 A CN 201511027187A CN 106929567 A CN106929567 A CN 106929567A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
cox2
apc
sequence
rassf1a
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201511027187.5A
Other languages
English (en)
Inventor
吕长益
颜家瑞
陈诗雅
林家如
刘怡贞
甘樸野
彭惠铃
张琬琦
曹超云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Industrial Technology Research Institute ITRI
Original Assignee
Industrial Technology Research Institute ITRI
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Industrial Technology Research Institute ITRI filed Critical Industrial Technology Research Institute ITRI
Publication of CN106929567A publication Critical patent/CN106929567A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks
    • G16B5/20—Probabilistic models
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/30—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for calculating health indices; for individual health risk assessment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Probability & Statistics with Applications (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Primary Health Care (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种评估一个体罹患肝癌之风险的方法，包括：(a)分别测定一个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203(micro RNA-203,miR-203)之基因的甲基化程度；(b)依据该APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度计算出一预测分数；以及(c)根据该预测分数评估该个体罹患肝癌之风险程度。

Description

评估一个体罹患肝癌之风险以及罹患肝癌预后的方法
发明领域
本发明系关于评估一个体罹患肝癌之风险及罹患肝癌预后的方法。
发明背景
一般而言，于所有的癌症中都可以观察到DNA不正常的甲基化现象。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶所催化，在胞嘧啶的第5个碳上增加一个甲基，此作用若发生在基因的5’端或是启动子区域的CpG岛，经常会抑制该基因的转录作用而造成非活化。在肿瘤发生的过程中，不正常的DNA甲基化现象经常参与抑制DNA修复基因以及肿瘤抑制基因的作用。
一般认为不正常的DNA甲基化通常发生在癌症早期，因此，这些不正常的基因甲基化非常适合作为各种不同的癌症标记，例如：癌症分类、诊断、预后、风险评估、化疗反应等。相较于其他的生物标记，DNA甲基化有其独特的优点，其中最重要的优点之一就是具有组织与不同癌症间的专一性。此外，甲基化标记是一种DNA标记，相较于RNA与蛋白质，其稳定性相对较高。特别的是，DNA甲基化不仅能在组织检体中侦测，更能在各种不同的体液中侦测，例如：唾液、痰、精液、肠胃道消化液、呼吸道灌洗液、血浆、血清、尿液及粪便检体等。
目前之肝癌筛检，除了检验胎儿蛋白(Alpha-Fetoprotein，AFP)指数外，还必须合并腹部超音波检查，然而，胎儿蛋白(AFP)指数和腹部超音波检查两者都有其限制。在统计上，整体来说有百分之七十至百分之八十肝癌病人的胎儿蛋白指数会升高，但仍有百分之二十左右的病人即使到肝癌末期胎儿蛋白指数仍然不会升高。对于早期肝癌的诊断，胎儿蛋白的准确度更低，有三分之一小型肝癌(小于三公分)病人的胎儿蛋白指数不会升高。而且还有一些其他因素会导致胎儿蛋白升高，影响肝癌诊断的正确性，例如：肝炎、肝硬化、怀孕、生殖细胞肿瘤等。而，仅管超音波检查没有痛苦，也没有副作用，但，超音波检查需要训练精良的医师操作，因此检出率与医师的训练、经验有关，除此之外，超音波本身也有其限制，例如，有些肿瘤长在超音波监测的死角、无法分辨肿瘤性质、可能遗漏浸润型的肿瘤或是肿瘤太小等无法检测出来。
于现阶段，手术切除是肝癌唯一根治性的治疗。然而，由于肝癌早期不易发现，且大多数病人在肝癌发现时因为肝功能不佳(75％以上的病人有潜在的慢性肝病)、两侧肝叶疾病、或肝外转移而导致无法进行切除。因此，肝癌的整体可切除率只有10～25％。如果肝癌无法切除，预后很差，中位存活期只有几个月。
因此，目前亟需发展新的肝癌检测方法，以提高肝癌初期的检出率。
发明概述
本发明提供一种评估一个体罹患肝癌之风险的方法，包括：(a)分别测定一个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203(micro RNA-203，miR-203)之基因的甲基化程度；(b)依据该APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度计算出一预测分数A；以及(c)根据该预测分数A评估该个体罹患肝癌之风险程度。
本发明也提供一种评估一感染B型肝炎病毒之个体罹患B型肝炎相关肝癌之风险的方法，包括：(a)分别测定该感染B型肝炎病毒之个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度；(b)依据该APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度计算出一预测分数B；以及(c)根据该预测分数B评估该感染B型肝炎病毒之个体罹患罹患B型肝炎相关肝癌的风险程度。
本发明还提供一种APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因于制备一试剂盒中的用途，其中所述试剂盒可用于评估一个体罹患肝癌之风险的方法。
本发明提供另一种APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因于制备一试剂盒中的用途，该试剂盒用于预测一感染B型肝炎病毒之个体是否罹患B型肝炎相关肝癌的方法。
本发明也提供一种评估一已罹患肝癌之个体之预后的方法，包括：(a)分别测定一已罹患肝癌个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度；(b)依据该APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因与微小RNA-203之基因的甲基化程度计算一预测分数A；以及(c)根据该预测分数A评估该已罹患肝癌个体之五年存活机率。
本发明还提供一种评估一已罹患肝癌之个体之预后的方法，包括：(a)分别测定一已罹患肝癌个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度；(b)依据该APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因与微小RNA-203之基因的甲基化程度，以及依据年龄、性别、AFP值、血管侵犯程度、肿瘤大小、临床分期、罹患肝炎病毒与否、罹患肝硬化与否，计算出一预后分数；以及(c)根据该预后分数评估该已罹患肝癌个体之五年存活机率。
本发明更提供一种侦测微小RNA-203的甲基化之试剂盒，包括：一引物对，系由一顺向引物与一逆向引物所构成；以及一第一探针及/或一第二探针，其中该顺向引物之序列包括与SEQ ID No：2之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而该逆向引物之序列包括与SEQ ID No：3之序列具有至少85％序列同源性的一序列，又其中，该第一探针之序列包括与SEQ ID No：4之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而该第二探针之序列包括与SEQ ID No：5之序列具有至少85％序列同源性的一序列。
本发明又提供一种用于评估一个体是否罹患肝癌及/或评估罹患肝癌之个体之预后的试剂盒，包括：用于侦测微小RNA-203的甲基化之引物对与探针；用于侦测APC之基因的甲基化之引物对与探针；用于侦测COX2之基因的甲基化之引物对与探针；以及用于侦测RASSF 1A之基因的甲基化之引物对与探针。
为了让本发明之上述和其他目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图示，作详细说明如下：
附图简述
图1显示，APC基因在不同疾病分群中之甲基化程度。
图2显示，COX基因在不同疾病分群中之甲基化程度。
图3显示，微小RNA-203基因在不同疾病分群中之甲基化程度。
图4显示，RASSF 1A基因在不同疾病分群中之甲基化程度。
图5显示，在肝癌族群中，将ln(APC)单变量以逻辑回归分析后进行接受者操作特征曲线分析之结果。
图6显示，在肝癌族群中，将ln(COX2)单变量以逻辑回归分析后进行接受者操作特征曲线分析之结果。
图7显示，在肝癌族群中，将ln(miR-203)单变量以逻辑回归分析后进行接受者操作特征曲线分析之结果。
图8显示，在肝癌族群中，将ln(RASSF 1A)单变量以逻辑回归分析后进行接受者操作特征曲线分析之结果。
图9显示，在肝癌族群中，将ln(APC)、ln(COX2)、ln(miR-203)与ln(RASSF 1A)四个变量以逻辑回归分析后进行接受者操作特征曲线分析之结果。
图10显示，在肝癌族群中，将ln(APC)、ln(COX2)、ln(miR-203)与ln(RASSF 1A)四个变量以交互验证法分析后进行接受者操作特征曲线分析之结果。
图11显示，在肝癌族群中，将AFP单变量以逻辑回归分析后进行接受者操作特征曲线分析之结果。
图12显示，在B肝相关肝癌族群中，将ln(APC)单变量以逻辑回归分析后进行接受者操作特征曲线分析之结果。
图13显示，在B肝相关肝癌族群中，将ln(COX2)单变量以逻辑回归分析后进行接受者操作特征曲线分析之结果。
图14显示，在B肝相关肝癌族群中，将ln(miR-203)单变量以逻辑回归分析后进行接受者操作特征曲线分析之结果。
图15显示，在B肝相关肝癌族群中，将ln(RASSF 1A)单变量以逻辑回归分析后进行接受者操作特征曲线分析之结果。
图16显示，在B肝相关肝癌族群中，将ln(APC)、ln(COX2)、ln(miR-203)与ln(RASSF 1A)四个变量以逻辑回归分析后进行接受者操作特征曲线分析之结果。
图17显示，在B肝相关肝癌族群中，将ln(APC)、ln(COX2)、ln(miR-203)与ln(RASSF 1A)四个变量以交互验证法分析后进行接受者操作特征曲线分析之结果。
图18显示，在B肝相关肝癌族群中，将AFP单变量以逻辑回归分析后进行接受者操作特征曲线分析之结果。
图19显示，对于肝癌预测分数A小于等于0.45及大于0.45之5年存活单变量分析的结果。
图20显示，使用Cox比例风险模式(Cox proportional hazards model)计算预后分数，以Breslow方式计算基本存活函数，并以肝癌预测分数A是否大于0.45为分群，调整预后分数中位数，评估5年内存活函数。
图21显示，使用Cox比例风险模式计算预后分数，以Breslow方式计算基本存活函数，并以肝癌预测分数A(是否大于0.45)与AFP指数(是否大于20)为分群，调整预后分数中位数，评估不同次群组之5年内存活函数。
发明详述
在本发明一实施态样中，提供一种评估一个体罹患肝癌之风险的方法。适合以本发明之评估一个体罹患肝癌之风险的方法来评估的肝癌，并无特别限制。而在一实施例中，适合以本发明之评估一个体罹患肝癌之风险的方法来评估的肝癌可包括B型肝炎相关肝癌。
而上述本发明之评估一个体罹患肝癌之风险的方法，可包括下列步骤，但不限于此。
首先，分别测定一个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度。
上述个体，可包括，一哺乳动物，例如，人类、猩猩、猴子、猫、狗、兔子、天竺鼠、大鼠或小鼠，但不限于此。在一实施例中，上述个体可为人类。
又，上述样本的例子，可包括，但不限于，血液、血浆、血清、肝组织、唾液、痰、精液、肠道消化液、呼吸道灌洗液、粪便等。在一实施例中，上述样本可为血浆或血清。
所侦测之APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化位点，并无特别限制。在一实施例中，微小RNA-203之基因的甲基化，可藉由侦测在染色体14之第104,522,452碱基对位置至第104,522,886碱基对位置的序列(根据NCBI Homo sapiens Annotation Release107)(SEQ ID No：1)中，第104,522,554碱基对位置与第104,522,557碱基对位置之间的CpG二核苷酸甲基化及/或第104,522,570碱基对位置与第104,522,571碱基对位置之间的CpG二核苷酸甲基化及/或第104,522,579碱基对位置与104,522,582碱基对位置之间的CpG二核苷酸甲基化等来确认。
此外，适用于侦测APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化的方法，可包括，定量甲基化特异聚合酶链反应(quantitative methylation-specific PCR，qMSP)、重亚硫酸限制组合分析法(combined bisulfite restriction analyse，COBRA)、重亚硫酸定序法(BisulfiteSequencing)、焦磷酸定序法(Pyrosequencing)、下一代定序(Next GenerationSequencing，NGS)、DNA甲基化数组芯片分析法(DNA Methylation Array ChipAnalysis)等，但不限于此。在一实施例中，甲基化程度系由定量甲基化特异聚合酶链反应所侦测。
又，于一特定实施例中，甲基化程度系由定量甲基化特异聚合酶链反应所侦测，而由定量甲基化特异聚合酶链反应所侦测之微小RNA-203之基因的甲基化位点，可如前方实施例中所述之甲基化位点，于此不再进行赘述。
于上述之特定实施例中，微小RNA-203之基因的甲基化可藉由一引物对与一第一探针及/或一第二探针之组合来侦测。上述引物对可包括一顺向引物与一逆向引物，且顺向引物之序列可包括与SEQ ID No：2之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而逆向引物之序列可包括与SEQ ID No：3之序列具有至少85％序列同源性的一序列。又，第一探针之序列可包括与SEQ IDNo：4之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而第二探针之序列可包括与SEQ ID No：5之序列具有至少85％序列同源性的一序列。在一实施例中，微小RNA-203之基因的甲基化可藉由一引物对与一第一探针及/或一第二探针之组合来侦测，其中引物对包括一顺向引物与一逆向引物，且顺向引物之序列可为SEQ ID No：2之序列，而逆向引物之序列可为SEQ ID No：3之序列，又，第一探针之序列可为SEQ ID No：4之序列，而第二探针之序列可为SEQ ID No：5之序列。
依据APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度计算出一预测分数A。
预测分数A可藉由将APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度进行例如逻辑回归分析(logistic regressionanalysis)、判别函数分析(discriminant function analysis)、山脊回归分析(ridgeregression analysis)等来获得，但不限于此。在一实施例中，预测分数A可藉由将APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度进行逻辑回归分析来获得。
在一实施例中，预测分数A可藉由将APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，以下列公式进行计算所获得：
预测分数A＝exp(预测值A)/(1+exp(预测值A))，
其中预测值A＝Xl+X2×ln(APC)+X3×ln(COX2)+X4×ln(miR-203)+X5×ln(RASSF 1A)，
又，其中X1可为1.6148至2.8618，X2可为0.0237至0.1559，X3可为0.1169至0.2581，X4可为0.0058至0.1344，而X5可为0.0436至0.1758。
且，其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然对数值，APC甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然对数值，COX2甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(COX2))*1000；ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然对数值，miR-203甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF 1A)代表RASSF 1A基因甲基化程度之自然对数值，RASSF 1A甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(RASSF 1A))*1000。
在一特定实施例中，于上方所示之公式中，X1为2.238，X2为0.0898，X3为0.1875，X4为0.0701，而X5为0.1097。
在依据APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度计算出预测分数A之后，根据此预测分数A来评估一个体罹患肝癌之风险程度。
若预测分数A高于一预先确认的参考值，则此个体被评估为具有罹患肝癌之风险。
在一实施例中，预先确认的参考值为比较一群已知非肝癌个体以及已知具有肝癌个体中之APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，代入前方所示公式并进一步作出接受者操作特征曲线所获得的一截断值。在一特定实施例中，预先确认的参考值可为0.45，而若预测分数A高于0.45，则该个体被评估为具有罹患肝癌之风险。
在本发明另一实施态样中，提供一种APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因于制备一试剂盒中的用途，其中所述试剂盒可用于前述任一本发明之评估一个体罹患肝癌之风险的方法。
在本发明另一实施态样中，提供一种评估一感染B型肝炎病毒之个体罹患B型肝炎相关肝癌之风险的方法。
而上述本发明之评估一感染B型肝炎病毒之个体罹患B型肝炎相关肝癌之风险的方法，可包括下列步骤，但不限于此。
首先，分别测定一感染B型肝炎病毒之个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度。
有关个体、样本、所侦测微小RNA-203之基因的甲基化位点、适用于侦测基因甲基化的方法、以及所用以侦测微小RNA-203之基因的甲基化的引物对与探针等的例子，如前方相对应段落中之记载所述，故于此不再进行赘述。
依据APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度计算出一预测分数B。
预测分数B可藉由将APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度进行例如逻辑回归分析、判别函数分析、山脊回归分析等来获得，但不限于此。在一实施例中，预测分数B可藉由将APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度进行逻辑回归分析来获得。
在一实施例中，预测分数B可藉由将APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，以下列公式进行计算所获得：
预测分数B＝exp(预测值)/(1+exp(预测值))，
其中预测值B＝Yl+Y2×ln(APC)+Y3×ln(COX2)+Y4×ln(miR-203)+Y5×ln(RASSF 1A)，
又，其中Y1为1.7至3.34，Y2为0.045至0.213，Y3为0.142至0.32，Y4为0.028至0.193，而Y5为0.038至0.224，
且，其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然对数值，APC甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然对数值，COX2甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(COX2))*1000；其中ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然对数值，miR-203甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF 1A)代表RASSF 1A基因甲基化程度之自然对数值，RASSF 1A甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(RASSF 1A))*1000。
在一特定实施例中，于上方所示之公式中，Y1为2.447，Y2为0.127，Y3为0.226，Y4为0.1091，而Y5为0.1288。
在依据APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度计算出预测分数B之后，根据此预测分数B来评估一B肝患者个体罹患肝癌之风险程度。
若预测分数B高于一预先确认的参考值，则此一B肝患者个体被评估为具有罹患肝癌之风险。
在一实施例中，预先确认的参考值为比较一群已知非B肝相关肝癌个体以及已知具有B肝相关肝癌个体中之APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度代入前方所示公式，并进一步作出接受者操作特征曲线所获得的一截断值。在一特定实施例中，预先确认的参考值可为0.4，而若预测分数B高于0.4，则此一B肝患者个体可被评估为具有罹患肝癌之风险。
在本发明另一实施态样中，提供一种APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因于制备一试剂盒中的用途，其中所述试剂盒可用于前述任一本发明之评估一B肝患者个体罹患肝癌之风险的方法。
在本发明另一实施态样中，提供评估一已罹患肝癌之个体之预后的方法。以上述本发明之评估已罹患肝癌之个体之预后的方法来评估之肝癌病患，并无特别限制。在一实施例中，以前述本发明之评估已罹患肝癌之个体之预后的方法来评估之肝癌病患可包括B型肝炎相关肝癌之病患以及C型肝炎相关肝癌之病患。
而上述本发明之评估已罹患肝癌之个体之预后的方法，可包括，但不限于，下列步骤。
首先，分别测定一已罹患肝癌个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度。
有关个体、样本、所侦测微小RNA-203之基因的甲基化位点、适用于侦测基因甲基化的方法、以及所用以侦测微小RNA-203之基因的甲基化的引物对与探针等的例子，如前方相对应段落中之记载所述，故于此不再进行赘述。
然后，依据前述测得之APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因与微小RNA-203之基因的甲基化程度，计算一预测分数A，并根据预测分数A评估该已罹患肝癌个体之五年存活机率。
预测分数A藉由将APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度以下列公式进行计算所获得：
预测分数A＝exp(预测值A)/(1+exp(预测值A))，
其中预测值A＝Xl+X2×ln(APC)+X3×ln(COX2)+X4×ln(miR-203)+X5×ln(RASSF 1A)，
又，其中X1为1.6148至2.8618，X2为0.0237至0.1559，X3为0.1169至0.2581，X4为0.0058至0.1344，而X5为0.0436至0.1758，
且其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然对数值，APC甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然对数值，COX2甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(COX2))*1000；ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然对数值，miR-203甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF 1A)代表RASSF 1A基因甲基化程度之自然对数值，RASSF 1A甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(RASSF 1A))*1000。
在一实施例中，若预测分数A大于一预先确认的参考值，则5年存活率为约20-30％，而预测分数A小于等于一预先确认的参考值，则5年存活率为约60-70％。
上述预先确认的参考值为比较一群已知非肝癌个体以及已知具有肝癌个体中之APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，代入前方所示公式并进一步作出接受者操作特征曲线所获得的一截断值。上述预先确认的参考值可为在约0.4-0.5之间的一数值，但不限于此。在一实施例中，上述预先确认的参考值可为0.45，而预测分数A大于0.45，则5年存活率为约26.93％，而预测分数A小于等于0.45，则5年存活率为约69.63％。
在本发明又另一实施态样中，提供评估一已罹患肝癌之个体之预后的方法。适合以上述本发明之评估已罹患肝癌之个体之预后的方法来评估之肝癌病患，并无特别限制。在一实施例中，适合以前述本发明之评估已罹患肝癌之个体之预后的方法来评估之该癌病患可包括B型肝炎以及C型肝癌相关肝癌之病患。
而上述本发明之评估已罹患肝癌之个体之预后的方法，可包括，但不限于，下列步骤。
首先，分别测定一已罹患肝癌个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度。
有关个体、样本、所侦测微小RNA-203之基因的甲基化位点、适用于侦测基因甲基化的方法、以及所用以侦测微小RNA-203之基因的甲基化的引物对与探针等的例子，如前方相对应段落中之记载所述，故于此不再进行赘述。
依据前述测得之APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因与微小RNA-203之基因的甲基化程度，并依据年龄、性别、AFP值、血管侵犯程度、肿瘤大小、临床分期、罹患肝炎病毒与否、罹患肝硬化与否，进行多变量存活分析，计算出一预后分数。
在一实施例中，计算预后分数以及存活机率之步骤可进一步包括下列所述步骤，但不限于此：
(i)依据APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因与微小RNA-203之基因的甲基化程度以计算出一预测分数A；与(ii)将预测分数A，结合年龄、性别、AFP值、血管侵犯与否、肿瘤大小、临床分期、罹患肝炎病毒与否与罹患肝硬化与否，计算出预后分数。
于上方所述之步骤(i)中，预测分数A可藉由将APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度进行，例如逻辑回归分析、判别函数分析、山脊回归分析等来获得，但不限于此。在一实施例中，预测分数A可藉由将APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度进行逻辑回归分析来获得。
在一实施例中，于上方所述之步骤(i)中，预测分数A可藉由将APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，以下列公式进行计算所获得：
预测分数A＝exp(预测值A)/(1+exp(预测值A))，
其中预测值A＝Xl+X2×ln(APC)+X3×ln(COX2)+X4×ln(miR-203)+X5×ln(RASSF 1A)，
又，其中X1可为1.6148至2.8618，X2可为0.0237至0.1559，X3可为0.1169至0.2581，X4可为0.0058至0.1344，而X5可为0.0436至0.1758。
又，其中ln(APC)表APC基因甲基化程度之自然对数值，APC甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(APC))*1000；其中ln(COX2)表COX2基因甲基化程度之自然对数值，COX2甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(COX2))*1000；其中ln(miR-203)表miR-203基因甲基化程度之自然对数值，miR-203甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(miR-203))*1000；其中ln(RASSF 1A)表RASSF 1A基因甲基化程度之自然对数值，RASSF 1A甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(RASSF 1A))*1000。
又，在一特定实施例中，于上方所示之公式中，X1为2.238，X2为0.0898，X3为0.1875，X4为0.0701，而X5为0.1097。
又于上方所述之步骤(ii)中，预后分数可藉由将年龄、性别、AFP值、血管侵犯、肿瘤大小、临床分期、罹患肝炎病毒与否、罹患肝硬化与否以及前述计算之预测分数A大于一预先确认的参考值与否进行多变量存活分析来获得。
在一实施例中，于上方所述之步骤(ii)中，预后分数可藉由将年龄、性别、AFP值、血管侵犯与否、肿瘤大小、临床分期、罹患肝炎病毒与否、罹患肝硬化与否以及前述计算所获得之预测分数A大于一预先确认的参考值与否，以下列公式进行计算所获得：
预后分数＝B1×(年龄)+B2×(性别)+B3×(α-胎儿蛋白指数是否大于20)+B4×(血管侵犯与否)+B5×(肿瘤大小是否大于5cm)+B6×(临床分期)+B7×(是否为肝硬化)+B8×(预测分数A是否大于一预先确认的参考值)，
B1为-0.0224至0.0426，B2为-0.8233至0.7836，B3为0.1798至1.3902，B4为-0.1089至1.0898，B5为-0.9560至0.4118，B6为0.8525至2.2027，B7为-1.9221至-0.2812，而B8为0.3534至2.2217。
其中，年龄直接代入实际岁数(年)；性别：男性代入1，女性则代入0；血管侵犯与否：是，代入1，否代入0；肿瘤大小是否大于5cm：是，代入1；否，代入0；临床阶段：III/IV代入1，I/II代入0；是否有肝硬化：是，代入1，否，代入0；预测分数A是否大于一预先确认的参考值：是，代入1；否，代入0。
上述预先确认的参考值为比较一群已知非肝癌个体以及已知具有肝癌个体中之APC之基因、COX2之基因、RASSF 1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，代入前方所示公式并进一步作出接受者操作特征曲线所获得的一截断值。上述预先确认的参考值可为在约0.4-0.5之间的一数值，但不限于此。在一实施例中，上述预先确认的参考值可为0.45。
在计算出前述预后分数之后，根据预后分数来评估已罹患肝癌个体在一预估存活时间(年)t的存活机率。在一实施例中，预估存活时间(年)t之存活机率＝(S0(t))exp(预后分数)，其中S0(t)为基础t年存活机率。
又，在一特定实施例中，若预后分数小于0.45之罹癌患者，则5年存活机率约为69.48％，而若预后分数大于等于0.45之罹癌患者，则5年存活机率约为34.19％。
以预测分数A和AFP指数为准，以其他变数复合值中位数调整后，经由Breslow方法来估计调整共变量存活函数，以说明肝癌预测分数A与AFP指数分群之四种组合之存活函数差异，AFP＜＝20(ng/ml)和预测分数A＜＝0.45之罹癌患者五年存活机率为69.48％。AFP＞20(ng/ml)和预测分数A＜＝0.45之罹癌患者，五年存活机率为48.61％。AFP＜＝20(ng/ml)和预测分数＞0.45之罹癌患者，五年存活机率约34.19％，AFP＞20(ng/ml)和预测分数＞0.45之罹癌患者，五年活机率仅剩11.64％。
本发明又另一实施态样，则提供一种侦测微小RNA-203之甲基化的试剂盒。
上述侦测微小RNA-203之甲基化的试剂盒，则可包括，一引物对，系由一顺向引物与一逆向引物所构成，与一第一探针及/或一第二探针，但不限于此。
在一实施例中，顺向引物之序列可包括与SEQ ID No：2之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而逆向引物之序列可包括与SEQ ID No：3之序列具有至少85％序列同源性的一序列。又第一探针之序列可包括与SEQ ID No：4之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而第二探针之序列则可包括与SEQ ID No：5之序列具有至少85％序列同源性的一序列。
在一特定实施例中，上述本发明之侦测微小RNA-203之甲基化的试剂盒，可包括，一引物对，系由一顺向引物与一逆向引物所构成，与一第一探针及/或一第二探针。于此特定实施例中，顺向引物之序列为SEQ ID No：2之序列，逆向引物之序列为SEQ ID No：3之序列，第一探针之序列为SEQ IDNo：4之序列，而第二探针之序列为SEQ ID No：5之序列。
本发明又另一实施态样，则提供一种用于评估一个体是否罹患肝癌及/或评估罹患肝癌之个体之预后的试剂盒。
上述用于评估一个体是否罹患肝癌及/或评估罹患肝癌之个体之预后的试剂盒，可包括，用于侦测微小RNA-203的甲基化之引物对与探针、用于侦测APC之基因的甲基化之引物对与探针、用于侦测COX2之基因的甲基化之引物对与探针，与用于侦测RASSF 1A之基因的甲基化之引物对与探针，但不限于此。
在一实施例中，在用于侦测微小RNA-203的甲基化之引物对与探针中，引物对可包括一顺向引物与一逆向引物，而探针可包括一第一探针及/或一第二探针。顺向引物之序列可包括与SEQ ID No：2之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而逆向引物之序列可包括与SEQ ID No：3之序列具有至少85％序列同源性的一序列。又第一探针之序列可包括与SEQ ID No：4之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而第二探针之序列则可包括与SEQ IDNo：5之序列具有至少85％序列同源性的一序列。
在一实施例中，上述试剂盒适用于定量甲基化特异聚合酶链反应，但不限于此。
实施例
A.基因甲基化之侦测
(1)临床血浆检体
临床血浆检体来自国立成功大学医学院附设医院，计有健康人50例；肝炎47例(包含B型肝炎21例、C型肝炎26例)；肝炎合并肝硬化57例(包含B型肝炎32例、C型肝炎25例)；肝癌203例(包含B型肝炎81例、C型肝炎30例、B型肝炎合并肝硬化42例、C型肝炎合并肝硬化50例)，总计357例血浆检体。此临床研究经国立成功大学医学院附设医院人体试验委员会审查通过。
(2)血浆游离DNA萃取
800μl血浆以QIAGEN QIAamp DNA Blood Mini Kit萃取血浆游离DNA，萃取方法根据供货商建议步骤进行。以实时定量聚合酶连锁反应(Real-time Quantitative Polymerase.Chain Reaction，Q-PCR)来测定血浆游离DNA的浓度。
(3)亚硫酸氢钠处理
使用EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research)来处理临床样本DNA，且执行亚硫酸氢钠处理，处理方法根据供货商建议步骤进行。
(4)实时定量甲基化分析(Real-Time Quantitative Methylation Analysis)
将如上所述经亚硫酸氢钠转化之DNA，以探针基础之实时定量甲基化特异性PCR(qMSP)来进行检测。
各个反应系由1x KAPA PROBE FAST Master Mix(KAPA)、0.5μM顺向引物与0.5μM逆向引物以及0.25μM探针所构成，总体积为20μl。扩增反应(amplification)在StepOnePlus实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific Inc.)中进行，根据下列的热循环条件：95℃、3分钟；之后95℃、3秒，60-68℃、20秒及72℃、10秒的55个循环。根据上述记载，以下列公式计算β-肌动蛋白(β-actin)与目标基因之间的Ct值差，获得甲基化程度：
对于血浆样本：2^[Ct(β-肌动蛋白)-Ct(目标基因)]x1000
侦测微小RNA-203、APC、COX2、RASSF 1A之甲基化所使用之引物对与探针，分别如下所示：
表1
B.基本统计&ANOVA
于以下显示APC、COX2、RASSF 1A以及微小RNA-203四个基因基本叙述统计，并呈现九个组别之个体间差异性。上述九组组别包含，健康成人组、B型肝炎病毒(HBV)感染组、C型肝炎病毒感染组(HCV)、B型肝炎病毒感染+肝硬化组(HBV+Cirrhosis)、C型肝炎病毒感染+肝硬化组(HCV+Cirrhosis)、肝癌-B型肝炎组(HCC-HBV)、肝癌-C型肝炎组(HCC-HCV)、肝癌-B型肝炎+肝硬化组(HCC-HBV+Cirrhosis)以及肝癌-C型肝炎组+肝硬化组(HCC-HCV+Cirrhosis)。
(1)APC基因之甲基化的基本叙述统计
APC基因之甲基化的基本叙述统计结果如表2与第1图所示。
又，上方九组个体之ln(APC)均值，经由ANOVA分析显示其在统计上呈现显著不同。相较于非肝癌群组(包括健康成人组、B型肝炎病毒感染组、C型肝炎病毒感染组、B型肝炎病毒感染+肝硬化组以及C型肝炎病毒感染+肝硬化组)，肝癌群组(包括：肝癌-B型肝炎组、肝癌-C型肝炎组、肝癌-B型肝炎+肝硬化组以及肝癌-C型肝炎组+肝硬化组)之APC基因甲基化程度明显升高。
(2)COX基因之甲基化的基本叙述统计
COX基因之甲基化的基本叙述统计结果如表3与第2图所示。
又，上方九组个体之ln(COX2)均值，经由ANOVA分析显示其在统计上呈现显著不同。相较于非肝癌群组(包括健康成人组、B型肝炎病毒感染组、C型肝炎病毒感染组、B型肝炎病毒感染+肝硬化组以及C型肝炎病毒感染+肝硬化组)，肝癌群组(包括：肝癌-B型肝炎组、肝癌-C型肝炎组、肝癌-B型肝炎+肝硬化组以及肝癌-C型肝炎组+肝硬化组)之COX2基因甲基化程度明显升高。
(3)微小RNA-203基因之甲基化的基本叙述统计
微小RNA-203基因之甲基化的基本叙述统计结果如表4与第3图所示。
又，上方九组个体之ln(miR-203)均值，经由ANOVA分析显示其在统计上呈现显著不同。相较于非肝癌群组(包括健康成人组、B型肝炎病毒感染组、C型肝炎病毒感染组、B型肝炎病毒感染+肝硬化组以及C型肝炎病毒感染+肝硬化组)，肝癌群组(包括：肝癌-B型肝炎组、肝癌-C型肝炎组、肝癌-B型肝炎+肝硬化组以及肝癌-C型肝炎组+肝硬化组)之微小RNA-203基因甲基化程度明显升高。
(4)RASSF 1A基因之甲基化的基本叙述统计
RASSF 1A基因之甲基化的基本叙述统计结果如表5与第4图所示。
又，上方九组个体ln(RASSF 1A)均值，经由ANOVA分析显示其在统计上呈现显著不同。相较于非肝癌群组(包括健康成人组、B型肝炎病毒感染组、C型肝炎病毒感染组、B型肝炎病毒感染+肝硬化组以及C型肝炎病毒感染+肝硬化组)，肝癌群组(包括：肝癌-B型肝炎组、肝癌-C型肝炎组、肝癌-B型肝炎+肝硬化组以及肝癌-C型肝炎组+肝硬化组)之RASSF 1A基因甲基化程度明显升高。
C.逻辑回归与接受者操作特征曲线(Receiver operating characteristiccurve，ROC Curve)
罹患肝癌风险预测
以下将利用基因与肝癌之关连性部份，以逻辑回归进行模式预测，并找到敏感度与精确度较佳之肝癌预测机率为最佳切点。之后透过收方特征操作曲线与其面积估计，评论该预测模式对肝癌有无区分之能力。
九个群组分别如下：
非肝癌群组包括：健康群组、B型肝炎病毒(HBV)感染组、C型肝炎病毒感染组(HCV)、B型肝炎病毒感染+肝硬化组(HBV+Cirrhosis)与C型肝炎病毒感染+肝硬化组(HCV+Cirrhosis)(共154位，N＝154)；肝癌群组包括：B型肝炎病毒感染-肝硬化-肝癌组(HCC-HBV+Cirrhosis)与B型肝炎病毒感染+肝癌组(HBV-HCC)(共203位，N＝203)
1.单一甲基化标记对肝癌之预测
(1)APC
将前述九个群组之ln(APC)建立模式。
预测模式：Ln(P/(1-P))＝0.9753+0.1683*ln(APC)
之后进行接受者操作特征曲线分析，结果如第5图所示。根据第5图可知，于APC之预测模式中，ROC Curve面积为0.6063，而若以0.48为模式最佳截断值，可得到灵敏度为56.2％，专一性为57.1％，整体正确率为56.6％。
(2)COX2
将前述九个群组之ln(COX2)建立模式。
预测模式：Ln(P/(1-P))＝1.2778+0.2479*ln(COX2)
之后进行接受者操作特征曲线分析，结果如第6图所示。根据第6图可知，于COX2之预测模式中，ROC Curve面积为0.683，而若以0.45为模式最佳截断值，可得到灵敏度为61.1％，专一性为66.2％，整体正确率为63.3％。
(3)miR-203
将前述九个群组之ln(miR-203)建立模式。
预测模式：Ln(P/(1-P))＝0.6845+0.0942*ln(miR-203)
之后进行接受者操作特征曲线分析，结果如第7图所示。根据第7图可知，于miR-203之预测模式中，ROC Curve面积为0.518，而若以0.52为模式最佳截断值，可得到灵敏度为49.3％，专一性为43.5％，整体正确率为46.8％。
(4)RASSF 1A
将前述九个群组之ln(RASSF 1A)建立模式。
预测模式：Ln(P/(1-P))＝0.9818+0.1787*ln(RASSF 1A)
之后进行接受者操作特征曲线分析，结果如第8图所示。根据第8图可知，于RASSF 1A之预测模式中，ROC Curve面积为0.6332，而若以0.46为模式最佳截断值，可得到灵敏度为59.8％，专一性为48.6％，整体正确率为55.0％。
2.多重甲基化标记对肝癌之预测
(1)逐步选取法(Stepwise selection)
将以上九个群组之ln(APC)、ln(COX2)、ln(RASSF 1A)与ln(miR-203)进行逐步选取法分析，上述四种因子进入模式顺序为ln(COX2)、ln(RASSF 1A)、ln(APC)以及ln(miR-203)，无移除因子。
(2)最大似然率估计(Maximum Likelihood Estimates)
将以上九个群组之ln(COX2)、ln(RASSF 1A)、ln(APC)与ln(miR-203)进行最大似然率估计分析、参数评估与Wald信赖区间分析，结果如表6所示。
表6
(3)风险胜算比评估与95％信赖区间(Odds Ratio Estimates andProfile-Likelihood Confidence InterVals)
将以上九个群组之ln(APC)、ln(COX2)、ln(RASSF 1A)与ln(miR-203)进行风险胜算比评估与95％信赖区间分析，结果如表7所示。
表7
由表7可以得知，ln(APC)每上升一单位，罹患HCC之风险胜算比(Oddratio)增加9.4％；ln(COX2)每上升一单位，罹患HCC之风险胜算比则会增加20.6％；ln(miRNA-203)每上升一单位，罹患HCC之风险胜算比则会增加7.3％；ln(RASSF 1A每上升一单位，罹患HCC之风险胜算比则会增加11.6％。四种基因之甲基化程度以COX2基因为最具影响程度。
于前述各分析后，以逐步回归分析，选出ln(APC)、ln(COX2)、ln(miR-203)与ln(RASSF 1A)四个变量建立模式。
预测模式A：
Ln(P/(1-P))＝2.238+0.0898*ln(APC)+0.1875*ln(COX2)+0.0701*ln(miRNA-203)+0.1097*ln(RASSF 1A)
之后进行接受者操作特征曲线分析，结果如表8以及第9图所示。
表8.接受者操作特征曲线截断值与灵敏度、特异性、伪阳性、伪阴性及整体正确率关系
根据表8与第9图可知，接受者操作特征曲线面积为0.793，表示以预测模式A对非肝癌及肝癌族群作有无罹患肝癌分类，可得到较佳的分类结果。若以0.45为模式最佳截断值(cutoff value)，可得到灵敏度为73.4％，专一性为73.0％，伪阳性21.5％，伪阴性32.9％，整体正确率为73.2％。
另外以交互验证法(Cross-validation)(Leave-one-out)作模式验证，亦可印证本模式之分类能力，结果如表9以及第10图所示。
表9.接受者操作特征曲线截断值与灵敏度、特异性、伪阳性、伪阴性及整体正确率关系
根据表9，以及第10图可知，以交互验证法Cross-validation(Leave-one-out)作模式验证，接受者操作特征曲线面积为0.7818。若以0.47为模式最佳截断值，可得到灵敏度为72.9％、专一性为73％、伪阳性为21.6％以及伪阴性33.3％，整体正确率为72.9％。证明预测模式之准确度。
3.AFP标记对肝癌之预测
将前述九个群组之ln(AFP)建立模式。
预测模式：ln(P/(1-P))＝0.7865+0.1198*ln(AFP)
之后进行接受者操作特征曲线分析，结果如表10以及第11图所示。最佳切点为0.75时，灵敏度是55.7％，专一性是56.9％，伪阳性是18.8％，伪阴性是72.3％，整体正确率为56.0％。
表10、AFP进行接受者操作特征曲线分析时，最佳切点为0.75之灵敏度、专一性、伪阳性、伪阴性及整体正确率
罹患B型肝炎相关肝癌风险预测
五个群组分别如下：
非肝癌群组包括：健康群组、B型肝炎病毒(HBV)感染组与B型肝炎病毒感染+肝硬化组(HBV+Cirrhosis)(共100位，N＝100)；肝癌群组包括：B型肝炎病毒感染-肝硬化-肝癌组(HCC-HBV+Cirrhosis)与B型肝炎病毒感染+肝癌组(HBV-HCC)(共120位，N＝120)
1.单一甲基化标记对B型肝炎相关肝癌预测
(1)APC
将前述五个群组之ln(APC)建立模式。
预测模式：ln(P/(1-P))＝0.9165+0.1922*ln(APC)
之后进行接受者操作特征曲线分析，结果如第12图所示。
根据第12图可知，于APC之预测模式中，ROC Curve面积为0.644，而若以0.547为模式最佳截断值，可得到灵敏度为62.5％，专一性为92％，整体正确率为75.9％。
(2)COX2
将前述五个群组之ln(COX2)建立模式。
预测模式：ln(P/(1-P))＝1.20072+0.29966*ln(COX2)
之后进行接受者操作特征曲线分析，结果如第13图所示。
根据第13图可知，于COX2之预测模式中，ROC Curve面积为0.758，而若以0.454为模式最佳截断值，可得到灵敏度为74.16％，专一性为92％，整体正确率为82.27％。
(3)miR-203
将前述五个群组之ln(miR-203)建立模式。
预测模式：ln(P/(1-P))＝0.5909+0.1096*ln(miR-203)
之后进行接受者操作特征曲线分析，结果如第14图所示。
根据第14图可知，于miR-203之预测模式中，ROC Curve面积为0.55，而若以0.565为模式最佳截断值，可得到灵敏度为55％，专一性为83％，整体正确率为67.73％。
(4)RASSF 1A
将前述五个群组之ln(RASSF 1A)建立模式。
预测模式：ln(P/(1-P))＝0.99403+0.21392*ln(RASSFIA)
之后进行接受者操作特征曲线分析，结果如第15图所示。
根据第15图可知，于RASSF 1A之预测模式中，ROC Curve面积为0.67，而若以0.582为模式最佳截断值，可得到灵敏度为62.5％，专一性为83％，整体正确率为76.36％。
2.多重甲基化标记对B型肝炎相关肝癌预测
(1)逐步选取法(Stepwise selection)
将以上五个群组之ln(APC)、ln(COX2)、ln(RASSF 1A)与ln(miR-203)进行逐步选取法分析，上述四种因子进入模式顺序为ln(COX2)、ln(APC)、ln(RASSF 1A)以及ln(miR-203)，无移除因子。
(2)最大似然率估计(Maximum Likelihood Estimates)
将以上五个群组之ln(APC)、ln(COX2)、ln(RASSF 1A)与ln(微小RNA-203)进行最大似然率估计分析、参数评估与Wald信赖区间分析，结果如表11所示。
表11
(3)风险胜算比评估与95％信赖区间(Odds Ratio Estimates andProfile-Likelihood Confidence Intervals)
将以上五个群组之ln(APC)、ln(COX2)、ln(RASSF 1A)与ln(miR-203)进行风险胜算比估计与95％信赖区间分析，结果如表12所示。
表12
由表12可以得知，ln(APC)每上升一单位，罹患HCC之风险胜算比(Oddratio)增加13.6％；ln(COX2)每上升一单位，罹患HCC之风险胜算比则会增加25.4％；ln(微小RNA-203)每上升一单位，罹患HCC之风险胜算比则会增加11.5％；ln(RASSF 1A)每上升一单位，罹患HCC之风险胜算比则会增加13.7％。四种基因之甲基化程度以COX2基因为最具影响程度。
于前述各分析后，以逐步回归分析，选出ln(APC)、ln(COX2)、ln(miR-203)与ln(RASSF 1A)四个变量建立模式。
预测模式B：ln(P/(1-P))＝2.447+0.127×ln(APC)+0.226×ln(COX2)+0.1091×ln(miR-203)+0.1288×ln(RASSFIA)
之后进行接受者操作特征曲线分析，结果如表13，以及第16图所示。
表13、接受者操作特征曲线截断值与灵敏度、特异性、伪阳性、伪阴性及整体正确率关系
根据表13以及第16图可知，接受者操作特征曲线面积为0.865，而此表示以预测模式B对非B肝相关肝癌族群及B肝相关肝癌族群作有无罹患肝癌分类，可得到很好的分类结果。若以0.4为模式最佳截断值(cutoff value)，可得到灵敏度为84.2％，专一性为83.0％，伪阳性14.4％，伪阴性18.6％，整体正确率为83.6％。
另外以交互验证法(Cross-validation)(Leave-one-out)作模式验证，亦可印证本模式之分类能力，结果如表14，以及第17图所示。
表14、接受者操作特征曲线截断值与灵敏度、特异性、伪阳性、伪阴性及整体正确率关系
根据表13与表14，以及第17图可知，以交互验证法Cross-validation(Leave-one-out)作模式验证，接受者操作特征曲线面积为0.8548。若以0.4为模式最佳截断值，可得到与原先模式相同之灵敏度、专一性、伪阳性以及伪阴性，证明预测模式之准确度。
3.AFP标记对B型肝炎相关肝癌预测
将前述五个群组之ln(AFP)建立模式。
预测模式：
ln(P/(1-P))＝0.8159+0.1685*ln(AFP)
之后进行接受者操作特征曲线分析，结果如表15，以及第18图所示。最佳切点为0.775时，相对应之AFP(ng/ml)值为12.1545，灵敏度是50.9％，专一性是62.1％，伪阳性是15.7％，伪阴性是76％，整体正确率为53.1％。
表15
根据上方个结果可知，ln(APC)、ln(COX2)、ln(RASSF 1A)与ln(miR-203)之组合的预测模型具有最高的正确率。
D.存活分析
(1)单变量存活分析
将已罹患肝癌之病患，依据年龄、性别、AFP值、血管侵犯与否、肿瘤大小、临床分期、罹患肝炎病毒与否、罹患肝硬化与否以及肝癌预测分数A是否大于0.45进行分类，并进行5年死亡之单变量分析，结果如表16所示。
表16、5年死亡之单变量分析
注：肝癌预测分数A可由以下公式可获得
预测分数A＝exp(预测值A)/(1+exp(预测值A))
预测值A＝2.238+0.0898×ln(APC)+0.1875×ln(COX2)+0.0701×ln(miR-203)+0.1097×ln(RASSFIA)
表16列出各变量分类群组之五年死亡率，并以对数等级检定(Log-rankTest)进行存活函数检定，结果显示，肝硬化、组织分级、AFP(ng/ml)、病理阶段、临床阶段、血管侵犯、预测分数A等七个变量，各单变量在其分类群组之存活函数有显著不同。
而对于肝癌预测分数A之5年存活单变量分析的结果如第19图所示。预测分数A≤0.45，5年存活机率为75.2％；预测分数A＞0.45，5年存活机率为48.3％，P＝0.0052，具显著差异。
(2)多变量存活分析
将已罹患肝癌之病患，依据年龄、性别、AFP值、血管侵犯与否、肿瘤大小、临床分期、罹患肝炎病毒与否、罹患肝硬化与否以及预测分数A是否大于0.45进行分类，并进行多变量存活分析。
多变量Cox比例风险回归分析
将已罹患肝癌之病患，依照上述分类进行多变量Cox比例风险回归分析，结果如表17所示。
表17
以Cox比例风险回归分析进行多变量存活函数分析，其中AFP、临床分期肝硬化、预测分数A等变量，在其他变量同时调整下仍具统计显著。若受检者AFP＞20，5年内死亡之风险比增加1.0倍；若受检者之临床病理分类为第三期以上，5年内死亡之风险比增加约3.4倍；若受检者预测分数A大于0.45，5年内死亡之风险比增加约1.9倍。
多变量Cox比例风险回归分析所获得之公式如下：
预后分数＝B1×(年龄)+B2×(性别)+B3×(α-胎儿蛋白指数是否大于20)+B4×(血管侵犯与否)+B5×(肿瘤大小是否大于5cm)+B6×(临床分期)+B7×(是否为肝硬化)+B8×(预测分数A是否大于0.45)。
其中，B1为0.01398，B2为-0.04761，B3为0.69494，B4为0.50467，B5为-0.18205，B6为1.47360，B7为0.69139，B8为1.08088。
又，年龄直接代入实际岁数(年)；性别：男性代入1，女性则代入0；血管侵犯与否：是，代入1，否代入0；肿瘤大小是否大于5cm：是代入1；否代入0；临床阶段：III/IV代入1，I/II代入0；是否有肝硬化：是代入1，否代入0；预测分数A是否大于0.45：是代入1；否代入0。
以Breslow方法预估存活t年之存活机率＝(S0(t))exp(预后分数)，S0(t)为基础t年存活机率。基础t年存活机率S0(t)函数如表18所示(依据文献Breslow，N.(1974)Covariance Analysis of Survival Data under the ProportionalHszards Model.International Statistical Review，43，43-54.与Elisa，T.Lee andJohn Wenyu Wang.(2003)Statistical Methods for Survival Data Analysis.P.321.3rd ed.Wiley，New York.所记载之计算方式获得)。
表18、基础t年存活机率S0(t)函数
(a)以肝癌预测分数A估计存活机率
以肝癌预测分数A为准，以其他变数复合值中位数调整后，经由Breslow方法来估计调整共变量存活函数(Covariate-Adjusted Survival Function)，以说明肝癌预测分数A分群之两种组合之存活函数差异，结果如第20图所示。
第20图显示，预测分数A＜＝0.45之罹癌患者，五年存活之机率约为69.48％，而预测分数＞0.45之罹癌患者，五年存活之机率约为34.19％。
(b)以预测分数A及AFP指数评估存活机率
以预测分数A和AFP指数为准，以其他变数复合值中位数调整后，经由Breslow方法来估计调整共变量存活函数，以说明肝癌预测分数A与AFP指数分群之四种组合之存活函数差异，结果如第21图所示。
第21图显示，AFP＜＝20(ng/ml)和预测分数A＜＝0.45之罹癌患者五年存活机率为69.48％。AFP＞20(ng/ml)和预测分数＜＝0.45之罹癌患者，五年存活机率为48.61％。AFP＜＝20(ng/ml)和预测分数＞0.45之罹癌患者，五年存活机率约34.19％，AFP＞20(ng/ml)和预测分数＞0.45之罹癌患者，五年活机率仅剩11.64％。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与润饰，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。

Claims (20)

1.一种评估一个体罹患肝癌之风险的方法，包括：
(a)分别测定一个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203(micro RNA-203,miR-203)之基因的甲基化程度；
(b)依据该APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度计算出一预测分数A；以及
(c)根据该预测分数A评估该个体罹患肝癌之风险程度，
若该预测分数A高于一预先确认的参考值，则该个体被评估为具有罹患肝癌之风险。
2.如权利要求1所述之方法，其中该预先确认的参考值系藉由比较一群已知非肝癌个体以及已知具有肝癌个体中之APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，并根据接受者操作特征曲线所获得的一截断值所决定。
3.如权利要求1所述之方法，其中该预测分数A藉由将APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度以下列公式进行计算所获得：
预测分数A＝exp(预测值A)/(1+exp(预测值A))，
其中预测值A＝X1+X2×ln(APC)+X3×ln(COX2)+X4×ln(miR-203)+X5×ln(RASSF1A)，
又，其中X1可为1.6148至2.8618，X2可为0.0237至0.1559，X3可为0.1169至0.2581，X4可为0.0058至0.1344，而X5可为0.0436至0.1758，
且，其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然对数值，APC甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然对数值，COX2甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(COX2))*1000；ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然对数值，miR-203甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF1A)代表RASSF1A基因甲基化程度之自然对数值，RASSF1A甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(RASSF1A))*1000。
4.如权利要求1所述之方法，其中该微小RNA-203之基因的甲基化系藉由一引物对与一第一探针及/或一第二探针之组合来侦测，
其中该引物对包括一顺向引物与一逆向引物，且该顺向引物之序列包括与SEQ ID No：2之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而该逆向引物之序列包括与SEQ ID No：3之序列具有至少85％序列同源性的一序列，
又其中，该第一探针之序列包括与SEQ ID No：4之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而该第二探针之序列包括与SEQ ID No：5之序列具有至少85％序列同源性的一序列。
5.一种APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因于制备一试剂盒中的用途，该试剂盒用于评估一个体罹患肝癌之风险的方法，该方法包括：
(a)分别测定一个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203(micro RNA-203,miR-203)之基因的甲基化程度；
(b)依据该APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度计算出一预测分数A；以及
(c)根据该预测分数A评估该个体罹患肝癌之风险程度，
若该预测分数A高于一预先确认的参考值，则该个体被评估为具有罹患肝癌之风险。
6.一种评估一感染B型肝炎病毒之个体罹患B型肝炎相关肝癌之风险的方法，包括：
(a)分别测定该感染B型肝炎病毒之个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度；
(b)依据该APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度计算出一预测分数B；以及
(c)根据该预测分数B评估该感染B型肝炎病毒之个体罹患罹患B型肝炎相关肝癌的风险程度，
若该预测分数B高于一预先确认的参考值，则该感染B型肝炎病毒之个体被评估为具有罹患B型肝炎相关肝癌之风险。
7.如权利要求6所述之方法，其中该预先确认的参考值系藉由比较一群已知非B肝相关肝癌个体以及已知B肝相关肝癌个体中之APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，并根据接受者操作特征曲线所获得的一截断值所决定。
8.如权利要求6所述之方法，其中该预测分数B藉由将APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度以下列公式进行计算所获得：
预测分数B＝exp(预测值B)/(1+exp(预测值B))，
其中预测值B＝Y1+Y2×ln(APC)+Y3×ln(COX2)+Y4×ln(miR-203)+Y5×ln(RASSF1A)，
又，其中Y1为1.7至3.34，Y2为0.045至0.213，Y3为0.142至0.32，Y4为0.028至0.193，而Y5为0.038至0.224，
且，其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然对数值，APC甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然对数值，COX2甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(COX2))*1000；其中ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然对数值，miR-203甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF1A)代表RASSF1A基因甲基化程度之自然对数值，RASSF1A甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(RASSF1A))*1000。
9.如权利要求6所述之方法，其中该微小RNA-203之基因的甲基化系藉由一引物对与一第一探针及/或一第二探针之组合来侦测，
其中该引物对包括一顺向引物与一逆向引物，且该顺向引物之序列包括与SEQ ID No：2之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而该逆向引物之序列包括与SEQ ID No：3之序列具有至少85％序列同源性的一序列，
又其中，该第一探针之序列包括与SEQ ID No：4之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而该第二探针之序列包括与SEQ ID No：5之序列具有至少85％序列同源性的一序列。
10.一种APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因于制备一试剂盒中的用途，该试剂盒用于评估一感染B型肝炎病毒之个体罹患B型肝炎相关肝癌之风险的方法，该方法包括：
(a)分别测定该感染B型肝炎病毒之个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度；
(b)依据该APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度计算出一预测分数B；以及
(c)根据该预测分数B评估该感染B型肝炎病毒之个体罹患罹患B型肝炎相关肝癌的风险程度，
若该预测分数B高于一预先确认的参考值，则该感染B型肝炎病毒之个体被评估为具有罹患B型肝炎相关肝癌之风险。
11.一种评估一已罹患肝癌之个体之预后的方法，包括：
(a)分别测定一已罹患肝癌个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度；
(b)依据该APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因与微小RNA-203之基因的甲基化程度计算一预测分数A；以及
(c)根据该预测分数A评估该已罹患肝癌个体之五年存活机率。
12.如权利要求11所述之方法，其中该预测分数A藉由将APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度以下列公式进行计算所获得：
预测分数A＝exp(预测值A)/(1+exp(预测值A))，
其中预测值A＝X1+X2×ln(APC)+X3×ln(COX2)+X4×ln(miR-203)+X5×ln(RASSF1A)，
又，其中X1为1.6148至2.8618，X2为0.0237至0.1559，X3为0.1169至0.2581，X4为0.0058至0.1344，而X5为0.0436至0.1758，
且其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然对数值，APC甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然对数值，COX2甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(COX2))*1000；ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然对数值，miR-203甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF1A)代表RASSF1A基因甲基化程度之自然对数值，RASSF1A甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(RASSF1A))*1000。
13.一种评估一已罹患肝癌之个体之预后的方法，包括：
(a)分别测定一已罹患肝癌个体之一样本中APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度；
(b)依据该APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因与微小RNA-203之基因的甲基化程度，以及依据年龄、性别、AFP值、血管侵犯程度、肿瘤大小、临床分期、罹患肝炎病毒与否以及罹患肝硬化与否，计算出一预后分数；以及
(c)根据该预后分数评估该已罹患肝癌个体在一预估存活时间(年)t的存活机率。
14.如权利要求13所述之方法，其中该预估存活时间(年)t的存活机率系由下列公式所获得：
预估存活时间(年)t之存活机率＝(S0(t))exp(预后分数)，
其中S0(t)为基础t年存活机率。
15.如权利要求13所述之方法，其中步骤(b)中包括：
(i)依据该APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因与微小RNA-203之基因的甲基化程度以计算出一预测分数A；以及
(ii)依据该预测分数A，结合年龄、性别、AFP值、血管侵犯与否、肿瘤大小、临床分期、罹患肝炎病毒与否与罹患肝硬化与否，计算出该预后分数。
16.如权利要求15所述之方法，其中该预测分数A藉由将APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度以下列公式进行计算所获得：
预测分数A＝exp(预测值A)/(1+exp(预测值A))，
其中预测值A＝X1+X2×ln(APC)+X3×ln(COX2)+X4×ln(miR-203)+X5×ln(RASSF1A)，
又，其中X1为1.6148至2.8618，X2为0.0237至0.1559，X3为0.1169至0.2581，X4为0.0058至0.1344，而X5为0.0436至0.1758，
且其中ln(APC)代表APC基因甲基化程度之自然对数值，APC甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(APC))*1000；ln(COX2)代表COX2基因甲基化程度之自然对数值，COX2甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(COX2))*1000；ln(miR-203)代表miR-203基因甲基化程度之自然对数值，miR-203甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(miR-203))*1000；ln(RASSF1A)代表RASSF1A基因甲基化程度之自然对数值，RASSF1A甲基化程度由下列公式获得：2^(Ct(β-肌动蛋白)-Ct(RASSF1A))*1000。
17.如权利要求16所述之方法，其中该预后分数藉由将年龄、性别、AFP值、血管侵犯与否、肿瘤大小、临床分期、罹患肝炎病毒与否、罹患肝硬化与否以及该预测分数A大于一预先确认的参考值与否，以下列公式进行计算所获得：
预后分数＝B1×(年龄)+B2×(性别)+B3×(α-胎儿蛋白指数是否大于20)+B4×(血管侵犯与否)+B5×(肿瘤大小是否大于5cm)+B6×(临床分期)+B7×(是否为肝硬化)+B8×(预测分数A是否大于一预先确认的参考值)，B1为-0.0224至0.0426，Β2为-0.8233至0.7836，Β3为0.1798至1.3902，Β4为-0.1089至1.0898，Β5为-0.9560至0.4118，Β6为0.8525至2.2027，Β7为-1.9221至-0.2812，而B8为0.3534至2.2217，
其中，年龄直接代入实际岁数(年)；性别：男性代入1，女性则代入0；血管侵犯与否：是，代入1，否代入0；肿瘤大小是否大于5cm：是代入1；否代入0；临床阶段：III/IV代入1，I/II代入0；是否有肝硬化：是代入1，否代入0；预测分数A是否大于0.45：是代入1；否代入0。
18.如权利要求17所述之方法，其中该预先确认的参考值系藉由比较一群已知非肝癌个体以及已知具有肝癌个体中之APC之基因、COX2之基因、RASSF1A之基因以及微小RNA-203之基因的甲基化程度，并根据接受者操作特征曲线所获得的一截断值所决定。
19.一种侦测微小RNA-203之基因之甲基化的试剂盒，包括：
一引物对，系由一顺向引物与一逆向引物所构成；以及
一第一探针及/或一第二探针，
其中该顺向引物之序列包括与SEQ ID No：2之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而该逆向引物之序列包括与SEQ ID No：3之序列具有至少85％序列同源性的一序列，
又其中，该第一探针之序列包括与SEQ ID No：4之序列具有至少85％序列同源性的一序列，而该第二探针之序列包括与SEQ ID No：5之序列具有至少85％序列同源性的一序列。
20.一种用于评估一个体是否罹患肝癌及/或评估罹患肝癌之个体之预后的试剂盒，包括：
用于侦测微小RNA-203的甲基化之引物对与探针；
用于侦测APC之基因的甲基化之引物对与探针；
用于侦测COX2之基因的甲基化之引物对与探针；以及
用于侦测RASSF1A之基因的甲基化之引物对与探针。
CN201511027187.5A 2015-12-29 2015-12-31 评估一个体罹患肝癌之风险以及罹患肝癌预后的方法 Pending CN106929567A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW104144178A TWI569012B (zh) 2015-12-29 2015-12-29 評估一個體罹患肝癌之風險以及罹患肝癌預後的方法
TW104144178 2015-12-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106929567A true CN106929567A (zh) 2017-07-07

Family

ID=58608338

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511027187.5A Pending CN106929567A (zh) 2015-12-29 2015-12-31 评估一个体罹患肝癌之风险以及罹患肝癌预后的方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20170183737A1 (zh)
CN (1) CN106929567A (zh)
TW (1) TWI569012B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753979A (zh) * 2018-07-09 2018-11-06 安徽达健医学科技有限公司 一种用于肝癌早期筛查的试剂盒及其使用方法
CN111471766A (zh) * 2020-03-16 2020-07-31 南方医科大学 miRNA及其靶基因在肝癌中的应用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI740533B (zh) 2020-06-11 2021-09-21 國立中央大學 評估個體罹患腹膜硬化症之風險的方法、其分析器及其套組
CN112063717B (zh) * 2020-09-17 2022-09-20 山东大学深圳研究院 Mdm2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒
CN113897434A (zh) * 2021-11-02 2022-01-07 北京艾克伦医疗科技有限公司 鉴定肝癌状态的方法和试剂盒
CN115862850B (zh) * 2023-02-23 2023-05-16 南方医科大学南方医院 基于纵向多维数据的肝细胞癌监测模型的建模方法及装置
TWI839307B (zh) * 2023-05-06 2024-04-11 華聯生物科技股份有限公司 利用電腦評估肝癌患者治療後病變進展及預後的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103374630A (zh) * 2012-04-30 2013-10-30 财团法人工业技术研究院 侦测罹患肝癌机率的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5378687B2 (ja) * 2007-03-02 2013-12-25 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー Ｂａｓｐ１遺伝子および／またはｓｒｄ５ａ２遺伝子中のメチル化シトシンを利用する、肝臓癌、肝臓癌発症リスク、肝臓癌再発リスク、肝臓癌悪性度および肝臓癌の経時的進展の検出方法
US8846316B2 (en) * 2012-04-30 2014-09-30 Industrial Technology Research Institute Biomarker for human liver cancer

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103374630A (zh) * 2012-04-30 2013-10-30 财团法人工业技术研究院 侦测罹患肝癌机率的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ERIC L. SCEUSI ET AL.: "Clinical implications of DNA methylation in hepatocellular carcinoma", 《HPB》 *
NISHIDA N ET AL.: "Characteristic patterns of altered DNA methylation predict emergence of human hepatocellular carcinoma", 《HEPATOLOGY》 *
WOLFGANG TRÄNKENSCHUH ET AL.: "Frequent and distinct aberrations of DNA methylation patterns in fibrolamellar carcinoma of the liver", 《PLOS ONE》 *
XUEDAN CHEN ET AL.: "CpG island methylation status of miRNAs in esophageal squamous cell carcinoma", 《EARLY DETECTION AND DIAGNOSIS》 *
王乐等: "ADAMTS9基因甲基化检测对预测肝细胞癌发生及判断预后的价值", 《肿瘤》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753979A (zh) * 2018-07-09 2018-11-06 安徽达健医学科技有限公司 一种用于肝癌早期筛查的试剂盒及其使用方法
CN108753979B (zh) * 2018-07-09 2021-10-26 安徽达健医学科技有限公司 一种用于肝癌早期筛查的试剂盒及其使用方法
CN111471766A (zh) * 2020-03-16 2020-07-31 南方医科大学 miRNA及其靶基因在肝癌中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
TW201723479A (zh) 2017-07-01
US20170183737A1 (en) 2017-06-29
TWI569012B (zh) 2017-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11783915B2 (en) Convolutional neural network systems and methods for data classification
CN106929567A (zh) 评估一个体罹患肝癌之风险以及罹患肝癌预后的方法
CN108138233B (zh) Dna混合物中组织的单倍型的甲基化模式分析
ES2908347T3 (es) Detección de mutaciones para cribado de cáncer y análisis fetal
TW201833329A (zh) 腫瘤檢測之方法及系統
ES2959360T3 (es) Mejora del cribado del cáncer mediante ácidos nucleicos víricos acelulares
JP6606554B2 (ja) Ｙ染色体のメチル化部位を前立腺ガンの診断用マーカとする使用
CN105603101B (zh) 检测8个miRNA表达量的系统在制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用
JP2012521772A (ja) 癌の診断及び癌処置のモニタリングのための方法
US20220145399A1 (en) Kit for early screening of liver cell cancer and preparation method and use thereof
Abern et al. Clinical performance and utility of a DNA methylation urine test for bladder cancer
Ferlizza et al. Colorectal cancer screening: Assessment of CEACAM6, LGALS4, TSPAN8 and COL1A2 as blood markers in faecal immunochemical test negative subjects
KR101914348B1 (ko) 암 리스크를 검출하는 방법
CN115851951A (zh) 含多组学标志物组合物的早期肝癌检测模型构建及试剂盒
CN114507731B (zh) 一种用于辅助癌症诊断的甲基化标志物及试剂盒
JP5522348B2 (ja) 成人ｔ細胞白血病・リンパ腫の予後推定法およびキット
JP6611411B2 (ja) 膵臓がんの検出キット及び検出方法
JP6383541B2 (ja) 胆管がんの検出キット及び検出方法
KR20210149052A (ko) 바이러스 관련 암의 위험의 계층화
CN111363818B (zh) 基于pax3基因的肺癌诊断剂及试剂盒
US20230103637A1 (en) Sequencing of viral dna for predicting disease relapse
KR20240063745A (ko) Cell-free DNA 를 이용한 건강 및 질병관리 시스템 및 방법
CN117568473A (zh) 一种可用于辅助诊断癌症的甲基化分子标志物
CN114891892A (zh) 用于诊断胰胆道癌的甲基化标志物组合
CN115074436A (zh) 一种肺癌早期诊断标志物在制备肺癌早期诊断试剂中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination