CN109207558A - 一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法 - Google Patents

一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法 Download PDF

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陈敦学
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Abstract

本发明公开了一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，属于鳜鱼分子遗传学领域。所述漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，包括如下步骤：步骤1：基因组DNA的提取；步骤2：引物设计；步骤3：PCR扩增；步骤4：载体拼接、转化、克隆测序；步骤5：序列拼接。本发明以漓江斑鳜为研究对象,设计出14对扩增引物对，经过克隆测序并经过软件拼接，即可获得漓江斑鳜线粒体基因的全长，为漓江斑鳜的种群鉴定、种质资源保护以及养殖选种应用等提供资料和依据，对于深度开展漓江斑鳜资源的保护和利用有着重要的理论意义和应用前景。

Description

一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法
技术领域
本发明涉及一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，属于鳜鱼分子遗传学领域。
背景技术
漓江是西江水系重要支流，特殊的岩溶地质地貌，多洞穴暗河，具有生境特有程度高、物种数量多、水生态系统齐全的显著特点，是位居全国前列的水生生物多样性重要地区，是全国鱼类生物多样性研究的热点地区。漓江丰富的生态环境为鱼类物种的生存提供了优越的条件。渔业资源丰富，共有鱼类153种和亚种，是许多经济鱼类的原产地和鱼苗生产基地，也是广西最重要的淡水渔业基地之一，斑鳜是漓江渔业资源的重要组成部分，也是我国鳜鱼种质资源的重要来源。
斑鳜(Siniperca scherzeri Steindachner)隶属于鲈形目、鮨科、鳜亚科、鳜属,又名石鳜、岩鳜、花鲫子等,分布于我国黄河以南的长江至珠江,辽河、鸭绿江及其以南的海河等水系,为典型的肉食性底层鱼类。斑鳜出现遗传分化的时间较早,与同属的翘嘴鳜(S.chuatsi)、大眼鳜(S.kneri)相比,生长速度慢但抗病力较强,因其肉质细嫩、味道鲜美、无肌间刺、营养价值高、具观赏性,又有“淡水石斑”之美誉，广泛受到国内及韩国、日本、新加坡等地消费者欢迎，是我国重要出口创汇水产品种之一。
近年来，随着经济建设的发展和人类活动的加剧，受到游船、工农业污染、酷渔滥捕和气候变化等因素的影响，漓江流域野生斑鳜分布区迅速缩小，资源急剧衰退，已引起科学界和管理层的高度关注。目前漓江流域斑鳜资源家底还未完全清楚；漓江上中下流之间由于斑鳜长期适应性进化形成的明显不同的生态种群的遗转学差异以及多样性形成的分子机制尚未解析；此外，阐明有关品种基因组学特征以及重要经济性状相关功能基因的挖掘对于深度开发利用斑鳜资源，促进名贵鱼类养殖生产的可持续发展具有重大的科学意义和应用价值。
遗传多样性和遗传结构是一个物种的重要特征，遗传多样性是物种繁衍、抵抗疾病和适应环境变化的适应性产物。遗传结构是物种遗传变异的种属特征，与物种进化历史和生物学特性等密切相关，同时反映生态适应进化、环境变迁与自然选择的效应。了解种群的遗传结构和变异是评估资源现状，制定野生种群保护与恢复策略，实施养殖种群种质的遗传改良重要前提。研究表明，斑鳜不同地理群体间的遗传分化明显，如北方的海河和鸭绿江群体，南方的长江和闽江群体。长江水系洞庭湖、鄱阳湖、秋浦河和太湖4个鳜群体以及洞庭湖水系不同地理位置鳜的遗传结构也发生了一定的遗传分化，长江通江湖泊群体、无放流陆封型湖泊群体、放流的陆封型湖泊群体的遗传多样性依次减小，江湖阻隔是导致定居性鱼类鳜种群间发生遗传分化的重要原因之一。然而，上述研究主要集中在长江流域和洞庭湖水系的不同群体，而漓江水系不同地理种群鳜的遗传结构研究资料缺乏。
鉴于此，有必要提供一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，以解决现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法。本发明以漓江斑鳜为研究对象,设计出14对扩增引物对，经过克隆测序并经过软件拼接，即可获得漓江斑鳜线粒体基因的全长，为漓江斑鳜的种群鉴定、种质资源保护以及养殖选种应用等提供资料和依据，对于深度开展漓江斑鳜资源的保护和利用有着重要的理论意义和应用前景。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，包括如下步骤：
步骤1：基因组DNA的提取
采集新鲜的漓江鳜鱼，取尾鳍，立即浸泡在体积分数为95％(v/v)的酒精中固定，于4℃保存；
取20mg-30mg尾鳍，剪碎后,加入到2mL的离心管中，再加入DNA提取缓冲液1mL，再加入蛋白酶K和RNA酶，反复颠倒直至混匀，37℃水浴过夜消化至溶液透明；
取出离心管，室温冷却，加入等体积的Tris-饱和苯酚，上下颠倒，抽提并离心，转移上清液于另一离心管中，重复上述歩骤一次；向转移的上清液中加入等体积的体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，上下颠倒，抽提并离心，重复上述步骤一次；向离心后的上清液中加入等体积的体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，抽提并离心；向离心后的上清液中加入3倍体积的冷无水乙醇，4℃沉淀30min,离心，弃上清并用乙醇洗涤沉淀；自然干燥后溶于100μL的TE溶液中，得到斑鳜基因组DNA，于-20℃保存备用；
步骤2：引物设计
设计14对扩增引物对，14对扩增引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.28所示；
步骤3：PCR扩增
以步骤1得到的斑鳜基因组DNA为模板，利用步骤2的扩增引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化，进行PCR产物测序，得到测序序列；
步骤4：载体拼接、转化、克隆测序
将步骤3中回收的PCR产物，利用SeqMan软件进行连接、转化、克隆、测序，将所得的序列与网上的相近种属的序列用DNAMAN软件进行比对；
步骤5：序列拼接
利用DNAMAN软件或者手动将相邻的引物扩增的序列进行拼接，最终获得漓江斑鳜线粒体全基因组序列。
上述步骤2中的14对扩增引物对的序列表，如表1所示。
表1 14对扩增引物对的序列表
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1中，所述漓江斑鳜取自于桂林市兴安县兴安镇、桂林市兴安县小溶江、桂林市区木龙渡、桂林市灵川县大圩镇、桂林市阳朔县兴坪镇、桂林市阳朔县阳朔镇。
采用上述进一步的有益效果是：上述区域均为漓江水系的典型区域，取样的漓江斑鳜更具有代表性。
进一步，步骤1中，所述DNA提取缓冲液中，含有10mmol/L的Tris-HCl、10mmol/L的EDTA-Na2、1.0mmol/L的NaCl和1.0％的SDS，pH值为8.0；所述蛋白酶K和所述RNA酶的终浓度均为200μg/mL；所述离心的转速均为12000转/min，离心的时间均为10min；所述TE溶液中，含有10mmol/L的Tris-HCl和10mmol/L的EDTA-Na2，pH值为8.0。
进一步，步骤2中，所述扩增引物对的退火温度分别为：引物对1的退火温度范围为56-58℃，引物对2的退火温度范围为54-56℃，引物对3退火温度范围为50-52℃，引物对4退火温度范围为54-56℃，引物对5退火温度范围为50-52℃，引物对6退火温度范围为54-56℃，引物对7退火温度范围为47-49℃，引物对8退火温度范围为54-56℃，引物对9退火温度范围为47-49℃，引物对10退火温度范围为52-54℃，引物对11退火温度范围为54-56℃，引物对12退火温度范围为52-54℃，引物对13退火温度范围为48-50℃，引物对14退火温度范围为53-55℃。
采用上述进一步的有益效果是：上述为14对扩增引物对的合适的退火温度。
进一步，步骤3中，所述PCR的反应体系以50μL计为：浓度为10ng的模板DNA 2μL、10×buffer 5μL、浓度为2.5μmol/L的dNTP 8μL、浓度为5U/μL的Taq DNA酶0.5μL、浓度为20μmol/L的上游引物2μL、浓度为20μmol/L的下游引物2μL，ddH2O补足50μL。
进一步，步骤3中，所述PCR的反应程序为：95℃预变性5min；接着进入循环，95℃变性45s，47-58℃退火45s，72℃延伸1-2.5min，共30个循环；之后，72℃延伸10min；4℃保存。
本发明的有益效果：
本发明以漓江斑鳜为研究对象,设计出14对扩增引物对，并找到合适的退火温度和反应体系，经过克隆测序并经过软件拼接，即可获得漓江斑鳜线粒体基因的全长，为漓江斑鳜的种群鉴定、种质资源保护以及养殖选种应用等提供资料和依据，对于深度开展漓江斑鳜资源的保护和利用有着重要的理论意义和应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本实施例的漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，包括如下步骤：
步骤1：基因组DNA的提取
在桂林市兴安县兴安镇、桂林市兴安县小溶江、桂林市区木龙渡、桂林市灵川县大圩镇、桂林市阳朔县兴坪镇、桂林市阳朔县阳朔镇，采集新鲜的漓江鳜鱼，取尾鳍，立即浸泡在体积分数为95％(v/v)的酒精中固定，于4℃保存。
取20mg-30mg尾鳍，剪碎后,加入到2mL的离心管中，再加入DNA提取缓冲液(含有10mmol/L的Tris-HCl、10mmol/L的EDTA-Na2、1.0mmol/L的NaCl和1.0％的SDS，pH值为8.0)1mL，再加入蛋白酶K(终浓度为200μg/mL)和RNA酶(终浓度为200μg/mL)，反复颠倒直至混匀，37℃水浴过夜消化至溶液透明。
取出离心管，室温冷却，加入等体积的Tris-饱和苯酚，上下颠倒，抽提并于12000转/min离心10min，转移上清液于另一离心管中，重复上述歩骤一次；向转移的上清液中加入等体积的体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，上下颠倒，抽提并于12000转/min离心10min，重复上述步骤一次；向离心后的上清液中加入等体积的体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，抽提并于12000转/min离心10min；向离心后的上清液中加入3倍体积的冷无水乙醇，4℃沉淀30min,于12000转/min离心10min，弃上清并用乙醇洗涤沉淀；自然干燥后溶于100μL的TE溶液(含有10mmol/L的Tris-HCl和10mmol/L的EDTA-Na2，pH值为8.0)中，得到斑鳜基因组DNA，于-20℃保存备用。
步骤2：引物设计
设计14对扩增引物对，14对扩增引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.28所示，如表1所示。
步骤3：PCR扩增
以步骤1得到的斑鳜基因组DNA为模板，利用步骤2的扩增引物对进行PCR扩增，所述PCR的反应体系以50μL计为：浓度为10ng的模板DNA 2μL、10×buffer 5μL、浓度为2.5μmol/L的dNTP 8μL、浓度为5U/μL的Taq DNA酶0.5μL、浓度为20μmol/L的上游引物2μL、浓度为20μmol/L的下游引物2μL，ddH2O补足50μL。所述PCR的反应程序为：95℃预变性5min；接着进入循环，95℃变性45s，47-58℃退火45s，72℃延伸1-2.5min，共30个循环；之后，72℃延伸10min；4℃保存。
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化，进行PCR产物测序，得到测序序列。
步骤4：载体拼接、转化、克隆测序
将步骤3中回收的PCR产物，利用SeqMan软件进行连接、转化、克隆、测序，将所得的序列与网上的相近种属的序列用DNAMAN软件进行比对。
步骤5：序列拼接
利用DNAMAN软件或者手动将相邻的引物扩增的序列进行拼接，最终获得漓江斑鳜线粒体全基因组序列。
试验结果1：漓江斑鳜13个编码蛋白基因的比较分析
漓江斑鳜编码13种疏水蛋白多肽，包括7个还原酶复合体的亚单位(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6)；3种细胞色素氧化酶的亚单位(CO1、CO2、CO3)，2个ATP酶的亚单位(ATP6、ATP8)和一个细胞色素b(CYTB)。具体详见表2。
表2漓江斑鳜线粒体基因组DNA结构特征
注：表中倾斜字体表示的基因是有轻链编码的。
试验结果2：漓江斑鳜线粒体密码子偏好性分析
比较所克隆的漓江斑鳜线粒体基因组全序列密码子各位点的碱基分布发现，在编码线粒体DNA时基因存在A+T偏好性，这与在脊椎动物中的变化趋势是一致的，同时整个基因组中G碱基所占的比例很小，仅为16.5％。具体详见表3。
表3漓江斑鳜13个编码蛋白基因碱基偏好性统计
A C G T
全基因组 28.4 29.5 16.5 25.6
第一 25.7 27.9 25.7 20.7
第二 18.0 31.1 13.7 37.2
第三 33.3 33.3 8.2 25.2
总数 25.7 30.8 15.8 27.7
tRNA 30.9 25.1 20.0 24.0
rRNA 32.2 25.9 21.1 20.8
控制区 34.0 20.9 15.8 29.3
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：基因组DNA的提取
采集新鲜的漓江鳜鱼，取尾鳍，立即浸泡在体积分数为95％(v/v)的酒精中固定，于4℃保存；
取20mg-30mg尾鳍，剪碎后,加入到2mL的离心管中，再加入DNA提取缓冲液1mL，再加入蛋白酶K和RNA酶，反复颠倒直至混匀，37℃水浴过夜消化至溶液透明；
取出离心管，室温冷却，加入等体积的Tris-饱和苯酚，上下颠倒，抽提并离心，转移上清液于另一离心管中，重复上述歩骤一次；向转移的上清液中加入等体积的体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，上下颠倒，抽提并离心，重复上述步骤一次；向离心后的上清液中加入等体积的体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，抽提并离心；向离心后的上清液中加入3倍体积的冷无水乙醇，4℃沉淀30min,离心，弃上清并用乙醇洗涤沉淀；自然干燥后溶于100μL的TE溶液中，得到斑鳜基因组DNA，于-20℃保存备用；
步骤2：引物设计
设计14对扩增引物对，14对扩增引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.28所示；
步骤3：PCR扩增
以步骤1得到的斑鳜基因组DNA为模板，利用步骤2的扩增引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化，进行PCR产物测序，得到测序序列；
步骤4：载体拼接、转化、克隆测序
将步骤3中回收的PCR产物，利用SeqMan软件进行连接、转化、克隆、测序，将所得的序列与网上的相近种属的序列用DNAMAN软件进行比对；
步骤5：序列拼接
利用DNAMAN软件或者手动将相邻的引物扩增的序列进行拼接，最终获得漓江斑鳜线粒体全基因组序列。
2.根据权利要求1所述的一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，其特征在于，步骤1中，所述漓江斑鳜取自于桂林市兴安县兴安镇、桂林市兴安县小溶江、桂林市区木龙渡、桂林市灵川县大圩镇、桂林市阳朔县兴坪镇、桂林市阳朔县阳朔镇。
3.根据权利要求1所述的一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，其特征在于，步骤1中，所述DNA提取缓冲液中，含有10mmol/L的Tris-HCl、10mmol/L的EDTA-Na2、1.0mmol/L的NaCl和1.0％的SDS，pH值为8.0；所述蛋白酶K和所述RNA酶的终浓度均为200μg/mL；所述离心的转速均为12000转/min，离心的时间均为10min；所述TE溶液中，含有10mmol/L的Tris-HCl和10mmol/L的EDTA-Na2，pH值为8.0。
4.根据权利要求1所述的一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，其特征在于，步骤2中，所述扩增引物对的退火温度分别为：引物对1的退火温度范围为56-58℃，引物对2的退火温度范围为54-56℃，引物对3退火温度范围为50-52℃，引物对4退火温度范围为54-56℃，引物对5退火温度范围为50-52℃，引物对6退火温度范围为54-56℃，引物对7退火温度范围为47-49℃，引物对8退火温度范围为54-56℃，引物对9退火温度范围为47-49℃，引物对10退火温度范围为52-54℃，引物对11退火温度范围为54-56℃，引物对12退火温度范围为52-54℃，引物对13退火温度范围为48-50℃，引物对14退火温度范围为53-55℃。
5.根据权利要求1所述的一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，其特征在于，步骤3中，所述PCR的反应体系以50μL计为：浓度为10ng的模板DNA 2μL、10×buffer 5μL、浓度为2.5μmol/L的dNTP 8μL、浓度为5U/μL的Taq DNA酶0.5μL、浓度为20μmol/L的上游引物2μL、浓度为20μmol/L的下游引物2μL，ddH2O补足50μL。
6.根据权利要求1所述的一种漓江斑鳜线粒体全基因组测序的方法，其特征在于，步骤3中，所述PCR的反应程序为：95℃预变性5min；接着进入循环，95℃变性45s，47-58℃退火45s，72℃延伸1-2.5min，共30个循环；之后，72℃延伸10min；4℃保存。
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