CN104726558A - 一种巨魾鱼线粒体全基因组测序的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种巨魾鱼线粒体全基因组测序的方法，属于水产生物技术领域。所述的巨魾鱼线粒体全基因组测序的方法，包括以下步骤：巨魾鱼基因组DNA提取，设计18对同源性引物；进行PCR扩增，回收目的片段，载体连接、转化、克隆、测序；进行序列拼接获得全长巨魾鱼的线粒体基因序列。本发明提供的方法方便巨魾鱼的线粒体全长基因的克隆，为群体遗传分析提供方便，其适合于在巨魾鱼中实现对线粒体基因分子遗传及群体结构的评价；对巨魾鱼的资源保护提供基础性资料。
Description
技术领域
本发明属于水产生物技术领域，特别涉及一种巨魾鱼线粒体全基因组测序的方法。
背景技术
巨魾(Bagariusyarrelli Sykes)属于鲇形目，鮡科，魾属。俗名“黄鱼”，肉呈黄色，个体很大，且食性主要为虾、泥鳅、小鱼和水生昆虫等。通过对其外部形态，消化系统，繁殖和生活习性等多方面的初步研究，已确定巨魾为底栖肉食性淡水鱼类，其消化系统和外部形态结构特征都有较好的适应性，巨魾产漂浮性卵，有良好的繁殖特性。在云南省的澜沧江、怒江、元江都有巨魾的分布。这些江水含泥沙量很大致使江水十分混浊，但巨魾仍能正常生活。可见巨魾对含泥沙的混浊水质适应能力强。
近年来，由于渔业生态环境的破坏加剧，水体污染严重和鱼类的过度捕捞，鱼类资源严重遭到破坏。因此利用线粒体基因克隆技术对巨魾的遗传多样性分析，研究野生巨魾鱼的遗传结构，探讨群体间的遗传变异，对其种质资源保护以及合理开发提供参考。但有关线粒体全基因克隆技术，目前国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种巨魾鱼线粒体全基因组测序的方法。本发明设计出18-20对引物，并找到合适的退火温度和反应体系，经过克隆测序并经过软件拼接，即可获得该巨魾鱼线粒体基因的全长，本发明所用方法方便巨魾鱼的线粒体全长基因的克隆，为群体遗传分析提供方便。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种巨魾鱼线粒体全基因组测序的方法，包括以下步骤：
(1)巨魾鱼基因组DNA提取：取0.1g-0.5g鳍条组织到1.5ml的离心管中，加入DNA提取液600μl，再加入蛋白酶K8-10μl及5μl RNA酶，上下轻轻转动混匀；然后再加入等体积的体积比25：24：1的酚/氯仿/异戊醇，上下轻轻转动混匀，4℃下12000转/分离心10分钟，取上清，然后再加入等体积的体积比为24：1的氯仿/异戊醇，上下轻轻转动混匀，4℃下12000转/分离心10分钟；向上清液中加2倍体积的冰冷无水乙醇，使DNA沉淀10-25分钟，70％乙醇漂洗沉淀，用TE溶解DNA，获得巨魾鱼基因组DNA，于-20℃保存备用；
(2)同源性引物的设计：设计获得18对扩增引物对，18对扩增引物的序列如Seq ID NO 1～36所示；
(3)正式PCR扩增：反应的总体积为50μl，包含100ng的模板DNA，2×TaqPCRMaster Mix 25μl,正向引物2μl，反向引物2μl，ddH2O 19μl；PCR反应程序为94℃4min，然后30个循环：94℃预变性30s，引物退火温度，72℃延伸2min；最后72℃延伸6min；获得PCR扩增产物，4℃保存；
(4)目的片段的回收：用TIANGEN试剂公司的凝胶回收试剂盒，按试剂盒说明对步骤(3)中PCB扩增产物进行割胶回收获得1000-1500bpDNA目的片段；
(5)载体连接、转化、克隆测序：将步骤(4)中回收的PCR产物进行连接、转化、克隆、测序，将所得的序列与网上的相近种属的序列用DNAMAN软件进行比对；
(6)序列拼接：利用DNAMAN软件或者手动将相邻的引物扩增的序列进行拼接，最终获得全长巨魾鱼的线粒体基因序列。
步骤(3)中所述的引物退火温度优选为：引物对1的退火温度范围为53℃-58.6℃，引物对2的退火温度范围为53℃-58.6℃，引物对3退火温度范围为52.3℃-59.4℃，引物对4退火温度范围为58.4℃-62.7℃，引物对5退火温度范围为50-54.2℃，引物对6退火温度范围为50℃-62℃，引物对7退火温度范围为50℃-61.5℃，引物对8退火温度范围为53℃-58.6℃，引物对9退火温度范围为54.2℃-60.8℃，引物对10退火温度范围为57.2℃-63.8℃，引物对11退火温度范围为50.6-58.3℃，引物对12退火温度范围为50℃-55.7℃，引物对13退火温度范围为47℃-51.6℃，引物对14退火温度范围为55℃-61.9℃，引物对15退火温度范围为50℃-59.8℃，引物对16退火温度范围为55℃-60.2℃，引物对17退火温度范围为50℃-59.8℃，引物对18退火温度范围为50℃-58℃。
步骤(6)中所述的全长巨魾鱼的线粒体基因序列如Seq ID NO：37所示。
巨魾鱼线粒体全基因组的克隆测序需要设计不同的引物，而如果设计不好，就有可能扩增不出所需要的目的片段，本发明就是找到一种方法，设计不同的引物序列，找到适当的退火温度并且克隆测序，最终组装出巨魾鱼的线粒体全基因组序列。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明只需要设计出18对引物，引物序列如Seq ID NO 1～36所示，并找到合适的退火温度和反应体系，经过克隆测序并经过软件拼接，即可获得该巨魾鱼线粒体基因的全长；方便此类鱼的线粒体全长基因的克隆，为群体遗传分析提供方便，其适合于在水产动物中实现对线粒体基因分子遗传及群体结构的评价；本发明建立巨魾鱼的线粒体全基因的克隆体系，实现从分子水平上对巨魾鱼的遗传结构及进化历史进行研究，从而对巨魾鱼的资源保护提供基础性资料。
附图说明
图1为巨魾鱼基因组的DNA检测结果图，其中：M代表DNAMarker；1，2，3，4，5，6分别代表不同的巨魾鱼个体。
图2为巨魾鱼线粒体基因组扩增引物的梯度PCR扩增结果图，其中：M代表DNAMarker；1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12代表不同退火温度下的扩增的PCR产物条带；1为45℃，2为46℃，3为47.3℃，4为49.3℃，5为51.9℃，6为54.4℃，7为56.5℃，8为58.8℃，9为61.3℃，10为63.2℃，11为64.2℃，12为65℃。
图3为设计的引物在适当的退火温度下巨魾鱼线粒体基因组片段扩增图，其中：M代表DNAMarker；1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11代表不同引物在适当的退火温度下扩增的PCR产物片段条带。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种巨魾鱼线粒体全基因组测序的方法，包括以下步骤：
(1)巨魾鱼基因组DNA提取：取0.1g-0.5g鳍条组织到1.5ml的离心管中，加入DNA提取液600μl，再加入蛋白酶K8-10μl及5μl RNA酶，上下轻轻转动混匀；然后再加入等体积的体积比25：24：1的酚/氯仿/异戊醇，上下轻轻转动混匀，4℃下12000转/分离心10分钟，取上清，然后再加入等体积的体积比为24：1的氯仿/异戊醇，上下轻轻转动混匀，4℃下12000转/分离心10分钟；向上清液中加2倍体积的冰冷无水乙醇，使DNA沉淀10-25分钟，70％乙醇漂洗沉淀，用TE溶解DNA，获得巨魾鱼基因组DNA，如图1所示；于-20℃保存用于下一步的PCR扩增；
(2)同源性引物的设计：从GenBank上面查找与鱼近邻属或者科的已有的线粒体全基因组序列，然后用软件DNAMAN进行序列比对，找到保守序列区，并在序列保守区用PRIMER5查找设计引物序列；大约800-1400bp的间隔设计一对引物，送试剂公司进行合成；18对引物序列如表1所示。
表1为18对引物序列
| 序号 | 名称 | S:5-3 |
| 引物对1 | F1 | CCTTCTCCAAGCCTACGTGTA |
| R1 | GATAGAAACTGACCTGGATTGCT | |
| 引物对2 | F2 | CAATCCCCTTTCAGAGYCCA |
| R2 | GTTTGTGCRACTGCTCGKA | |
| 引物对3 | F3 | GGTTCAAATCCTCCTCTTAAT |
| R3 | TGGYCCTTGGGCATTCAGGCAC | |
| 引物对4 | F4 | GTGCCTGAATGCCCAAGGRCCA |
| R4 | TGRGTTGCATTCAGRAGATGTGGGGT | |
| 引物对5 | F5 | GAGTGAAAAYCTCCTAGTCYCT |
| R5 | GTTTCTCATTTAATWGAKCCTCC | |
| 引物对6 | F6 | TAGACACCCGAGCATAYTTYACA |
| R6 | GAAGGYCARGTTTTCGTAGTC | |
| 引物对7 | F7 | GCCTCCCCYRTAATAGAAGAA |
| R7 | GACGGCCAGGCCYATATTTA | |
| 引物对8 | F8 | CCTGAAACTGACCATGRCACT |
| R8 | TGTGCCTTCTCGTACRATGTCT | |
| 引物对9 | F9 | TACAAGAAAACGTATAATGGCC |
| R9 | CCGAAATCAGAGGTCTTRTRT | |
| 引物对10 | F10 | GATCAGCACGACTCCCCTT |
| R10 | CTTCTACGTGGGCTTTDGGT | |
| 引物对11 | F11 | CCAACCATCATRCTATTYCCA |
| R11 | AGGCCTCTTTCGGTGGAYAA | |
| 引物对12 | F12 | AACACCACATAYGARCGAAC |
| R12 | CTTGAKGTTGAGAATGCTACGATT | |
| 引物对13 | F13 | CMGCAATAGAAGGCCCMACC |
| R13 | TGGAATGTTRGTRGTTTTTGC | |
| 引物对14 | F14 | TYTAAACAGCCCGAAGCGCMC |
| R14 | GCACCTCAGAAKGATATTTGWCCYC | |
| 引物对15 | F15 | AACCACCGTTGTAAYTCAACTAT |
| R15 | CTCCGGATTACAAGACCGGTGCT | |
| 引物对16 | F16 | CACACATCHAAACAACAAGGHA |
| R16 | GGTGTGGCRTAGCAAGGCGTC | |
| 引物对17 | F17 | TTATACATGCAAGTATCCGCA |
| R17 | TAAGCTAGCTGTTTRGCTCAGG | |
| 引物对18 | F18 | TTGAATTAGGCTCTGAGACG |
| R18 | TACACGTAGGCTTGGAGAAGG |
(3)聚合酶链式反应引物退火温度的确立：将公司设计好的引物，按照说明书用灭菌的双蒸水进行稀释到所需要的工作浓度；在热反应仪上进行聚合酶链式反应(PCR)的总体积是25μl，包含100ng的模板DNA，2×Taq PCR MasterMix12.5μl,正向引物1μl，反向引物1μl，ddH2O 9.5μl；PCR反应程序为94℃4min，然后30个循环：94℃预变性30s，引物退火温度(根据设计的引物公司的推荐温度上下10℃，在热循环仪上进行梯度PCR)，72℃延伸2min；最后72℃延伸6min；将扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳完成之后，用凝胶成像系统观察并进行拍照保存，梯度PCR扩增结果如图2所示，筛选出条带清晰时的反应温度产物，适宜温度：引物对1的退火温度为54℃，引物对2为48℃，引物对3为50℃，引物对4为51℃，引物对5为48℃，引物对6为52℃，引物对7为47.5℃，引物对8为56.5℃，引物对9为53℃，引物对10为54.4℃，引物对11为49.3℃，引物对12为48℃，引物对13为54℃，引物对14为52℃，引物对15为51℃，引物对16为49.5℃，引物对17为50℃，引物对18为55.5℃；进行下一步的正式PCR扩增；
(4)正式PCR扩增：反应的总体积为50μl，包含100ng的模板DNA，2×TaqPCR Master Mix 25μl,正向引物2μl，反向引物2μl，ddH2O 19μl；；PCR反应程序为94℃4min，然后30个循环：94℃预变性30s，引物退火温度(根据步骤(3)的梯度PCR确定的适宜温度进行)，72℃延伸2min；最后72℃延伸6min；将扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳完成之后，用凝胶成像系统观察并进行拍照保存，基因组片段扩增图如图3所示，筛选出条带清晰时的反应温度的PCR扩增产物，4℃保存；
(5)目的片段的回收：用TIANGEN试剂公司的凝胶回收试剂盒，按试剂盒说明对上述预扩增产物进行割胶回收获得1000-1500bpDNA目的片段；
(6)载体连接、转化、克隆测序：将上述回收的PCR产物按照试剂盒说明进行连接、转化、克隆、测序，将所得的序列与网上的相近种属的序列用DNAMAN进行比对；
(7)序列拼接：利用DNAMAN软件将相邻的引物扩增的序列进行拼接，最终获得全长的巨魾鱼的线粒体基因序列如Seq ID NO：37。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种巨魾鱼线粒体全基因组测序的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)巨魾鱼基因组DNA提取：取0.1g-0.5g鳍条组织到1.5ml的离心管中，加入DNA提取液600μl，再加入蛋白酶K 8-10μl及5μl RNA酶，上下轻轻转动混匀；然后再加入等体积的体积比25：24：1的酚/氯仿/异戊醇，上下轻轻转动混匀，4℃下12000转/分离心10分钟，取上清，然后再加入等体积的体积比为24：1的氯仿/异戊醇，上下轻轻转动混匀，4℃下12000转/分离心10分钟；向上清液中加2倍体积的冰冷无水乙醇，使DNA沉淀10-25分钟，70％乙醇漂洗沉淀，用TE溶解DNA，获得巨魾鱼基因组DNA，于-20℃保存备用；
(2)同源性引物的设计：设计获得18对扩增引物对，18对扩增引物的序列如Seq ID NO 1～36所示；
(3)正式PCR扩增：反应的总体积为25μl，包含100ng的模板DNA，2×TaqPCR MasterMix 12.5μl,正向引物1μl，反向引物1μl，ddH2O 9.5μl；PCR反应程序为94℃4min，然后30个循环：94℃预变性30s，引物退火温度，72℃延伸2min；最后72℃延伸6min；获得PCR扩增产物，4℃保存；
(4)目的片段的回收：用TIANGEN试剂公司的凝胶回收试剂盒，按试剂盒说明对步骤(3)中PCB扩增产物进行割胶回收获得1000-1500bpDNA目的片段；
(5)载体连接、转化、克隆测序：将步骤(4)中回收的PCR产物进行连接、转化、克隆、测序，将所得的序列与网上的相近种属的序列用DNAMAN软件进行比对；
(6)序列拼接：利用DNAMAN软件或者手动将相邻的引物扩增的序列进行拼接，最终获得全长巨魾鱼的线粒体基因序列。
2.根据权利要求1所述的巨魾鱼线粒体全基因组测序的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的引物退火温度为：引物对1的退火温度范围为53℃-58.6℃，引物对2的退火温度范围为53℃-58.6℃，引物对3退火温度范围为52.3℃-59.4℃，引物对4退火温度范围为58.4℃-62.7℃，引物对5退火温度范围为50-54.2℃，引物对6退火温度范围为50℃-62℃，引物对7退火温度范围为50℃-61.5℃，引物对8退火温度范围为53℃-58.6℃，引物对9退火温度范围为54.2℃-60.8℃，引物对10退火温度范围为57.2℃-63.8℃，引物对11退火温度范围为50.6-58.3℃，引物对12退火温度范围为50℃-55.7℃，引物对13退火温度范围为47℃-51.6℃，引物对14退火温度范围为55℃-61.9℃，引物对15退火温度范围为50℃-59.8℃，引物对16退火温度范围为55℃-60.2℃，引物对17退火温度范围为50℃-59.8℃，引物对18退火温度范围为50℃-58℃。
3.根据权利要求1所述的巨魾鱼线粒体全基因组测序的方法，其特征在于：步骤(6)中所述的全长巨魾鱼的线粒体基因序列如Seq ID NO：37所示。
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