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Abstract

本发明涉及一种日本囊对虾放流效果的评估方法，包括：通过对母性遗传的线粒体序列的扩增和测序，运用相关软件分析遗传距离，系统建树，单倍型分析等，分析野生群体和繁育群体的序列差异和单倍型分布，统计各单倍型的群体内频率。通过选定一种或者几种具有特异分子标记的特定母虾来繁育放流用的子一代小虾，从而可以在回捕群体中测定个体所占的比例，与放流前这些分子标记的比例相比较，就可以确定该批次的放流效果。本发明工艺简单，成本低，在此方法基础上制定科学的放流规划、有效促进野生日本囊对虾种群资源恢复，对于放流个体的子代也同样可以检测，本发明还可用于多年连续监测。

Description

一种日本囊对虾放流效果的评估方法
技术领域
本发明属于海水动物增殖放流领域，特别涉及一种日本囊对虾放流效果的评估方法。
背景技术
日本囊对虾，又称日本对虾(Kurumaprawn)，学名Marsupenaeusjaponicas,别名车虾、斑节虾、竹节虾，在分类学上隶属于甲壳纲、十足目、游泳亚目、对虾科、对虾属。原产日本、中国、菲律宾、澳大利亚等国，广泛分布于印度、西太平洋地区，主要在日本列岛、南非红海、阿拉伯湾、孟加拉湾日本及我国等海区，以日本的沿海数量最多。栖息地底质以沙质底为主，有潜沙习性，在自然海域，自仔虾期就潜沙，涨潮时出来觅食，退潮后就潜入浅水的沙中，当体长达2.5～3cm,逐渐改为晚上活动觅食，白天潜入沙中；分布区的底温范围为16～31℃，底层盐度范围在28～34之间；没有长距离洄游现象，仅在小范围内移动；不同生活时期的分布区域有所差异，幼虾主要分布在盐度较低、沙质底的河口水域，随着个体的成长，逐步移向深水区；产卵期较长，周年均有性成熟个体的出现，但主要产卵期为12～3月份；产卵盛期，雌性大于雄性，其它时期个体大小大致相等；雌虾体长和体重范围分别为50～200mm和4～95g，雄虾体长和体重范围分别为50～175mm和4～57g；不同的生长阶段日本囊对虾的饵料组成也不同，总体上以摄食底栖生物为主，兼食底层浮游动物和游泳动物。
日本囊对虾是我国海水虾类养殖的主要种类之一，特别是近年来在对虾养殖业深受病害侵害的情况下，日本囊对虾以其相对抗病力较强、适应性广、经济效益高、离水性较好以及适于长距离运输等优点倍受养殖业者的青睐。近年来，由于捕捞强度的不断加大、生态变迁、水域污染、病害频发以及人工养殖业对野生日本囊对虾的盲目需求等综合因素的影响，日本囊对虾野生资源数量急剧萎缩。为保护、恢复日本囊对虾种群和渔业资源，大规模种苗放流后日本囊对虾资源量得到了一定的恢复。不过由于无法准确区分回捕群体中放流个体和野生个体及数量，因而无法科学评估放流群体对野生资源的补充水平，分析野生资源的动态变化并制定科学的放流规划，这是日本囊对虾放流迫切需要解决的重大问题。
基于线粒体DNA的进化速率为核DNA的5-10倍，筛选到可代表种内变异的分子标记的概率较高；线粒体为母性遗传，重组率极低，还可应用于分析特定放流群体的后代，可避免由杂交原因引入的混淆。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种日本囊对虾放流效果的评估方法，该方法工艺简单，成本低，在此方法基础上制定科学的放流规划、有效促进野生日本囊对虾种群资源恢复，对于放流个体的子代也同样可以检测，还可用于多年连续监测。
本发明的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，包括：
(1)采集日本囊对虾放流区域的野生群体和准备用于放流的繁育群体，选用线粒体序列中的片段作为研究对象，通过PCR扩增和测序，分析野生群体和繁育群体的序列差异和单倍型分布，统计各单倍型的群体内频率；
(2)筛选出代表日本囊对虾种内差异的单倍型作为分子标记，确定该标记的序列特异性，计算分子标记在野生群体中所占的比例，定期监测比例变动范围(根据日本囊对虾的自然繁育周期)；
(3)选定在野生群体中历年所占比例变动小的分子标记，将带有选定的分子标记的母虾用于人工繁育放流用的子一代；
(4)在捕捞期回捕放流区域的个体，检测分子标记，计算带有选定的分子标记的个体在回捕群体中的比例，确定比例变动情况，从而估算放流群体对该区域所有日本囊对虾生态量的贡献值，最终确定该批次的放流效果。
所述步骤(1)中的线粒体序列为细胞色素B基因DNA序列、D-loop区序列或COI序列。
所述细胞色素B基因DNA序列如SEQIDNO:1所示；对应的PCR扩增引物MJ-CYTB-F、MJ-CYTB-R序列如SEQIDNO:2和NO:3所示。用DNA测序的方法确定检测样本的分子标记。测定的每个个体的CYTB基因序列的碱基与序列有少量差异，从而构成各种不同的单倍型。
所述步骤(1)中的PCR反应体系为：30μL反应体系，其中包括3μL10×PCR缓冲液，引物的浓度均为10μM，上游引物和下游引物分别为0.5μL，1μL2.5mMeachdNTP，0.5μLTaqDNA聚合酶，0.5μLDNA模板；补充24μL去离子水至30μL。
所述步骤(1)中的PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸70s，共28个循环，最后72℃延伸7min，10℃保存并结束程序。
所述步骤(2)中的变动范围要求不超过5％。
所述步骤(3)中放流前对增殖群体的母本、子代预先进行检测，以确定选定的分子标记的有效性、可检出性，并确定子一代携带的分子标记与用于繁育的母虾一致。
连续多年对分子标记进行追踪检测，评估该批次放流的长期效果。
不同批次的放流选用不同的分子标记，以分别评估各个批次的放流效果。
不同分子标记的探测根据实际需要可以采用直接测序、荧光定量PCR、寡核苷酸探针、限制性酶切等方法。
本发明通过对母性遗传的线粒体上细胞色素B基因DNA序列的扩增和测序，运用相关软件分析遗传距离，系统建树，单倍型分析等，分析野生群体和繁育群体的序列差异和单倍型分布，统计各单倍型的群体内频率。通过选定一种或者几种具有特异分子标记的特定母虾来繁育放流用的子一代小虾，从而可以在回捕群体中测定具有这些特异分子标记的个体所占的比例(群体内频率)，与放流前这些分子标记的比例相比较，就可以估算放流群体对该区域所有日本囊对虾生态量的贡献值，最终确定该批次的放流效果。
有益效果
本发明工艺简单，成本低，在此方法基础上制定科学的放流规划、有效促进野生日本囊对虾种群资源恢复，对于放流个体的子代也同样可以检测，本发明还可用于多年连续监测。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
日本囊对虾DNA提取和PCR：
(1)提取DNA:Trizol法提取。
A.取1000μLTris-cl加入2ml离心管中；
B.取适量的组织(约2-3mg)，并用已经消毒后的剪刀充分剪碎；
C.浸泡45min后，4℃，12000rpm，10mim；
D.弃上清，加入600μLTris-buffer，50μL10％SDS，7μL蛋白酶K，55℃水浴2h，直至完全消化，溶液澄清；
E.加入350μL苯酚，350μL氯仿：异戊醇(24:1)，振荡至完全混匀；4℃，12000rpm，10mim；
F.取上清于新的2ml离心管中，加入与上清等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，振荡至完全混匀；4℃，12000rpm，10mim；
G.取上清于新的1.5ml离心管中，加入2倍上清体积的冰无水乙醇，充分混匀后，于-20℃下静置1h，4℃，12000rpm，15mim，弃上清，室温晾干；
H.加入60μLddH2O，-20℃保存。
(2)PCR反应体系为：30μL反应体系，其中包括3μL10×PCR缓冲液、引物的浓度均为10μM，上游引物和下游引物分别为0.5μL，1μLdNTP，0.5μLTaqDNA聚合酶，0.5μLDNA模板；补充24μL去离子水至30μL。
扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火45s，，72℃延伸70s，,最后72℃延伸7min，10℃保存并结束程序。
技术分析：
(1)分析野生群体和繁育群体的序列差异和单倍型分布，统计各单倍型的群体内频率；
(2)筛选出代表日本囊对虾种内差异的单倍型作为分子标记，确定该标记的序列特异性，计算分子标记在野生群体中所占的比例，定期监测比例变动范围，以变动范围不超过5％为宜；
(3)选定在野生群体中历年所占比例变动小的分子标记，将带有选定的分子标记的母虾用于人工繁育放流用的子一代；
(4)在捕捞期回捕放流区域的个体，检测分子标记，计算带有选定的分子标记的个体在回捕群体中的比例，确定比例变动情况，从而估算放流群体对该区域所有日本囊对虾生态量的贡献值，最终确定该批次的放流效果。
日本囊对虾CYTB测序所得序列用于分析的片段为1136个碱基对，从中截取测序可信度高，有代表性的731个碱基对的片段作为应用对象，一共发现74个多态性位点，得到46个单倍型。从中选取5个单倍型(5个单倍型具体序列为如SEQIDNO:4-8所示)，放流前预备调查中其对应的个体占全部调查基础野生个体的比例范围为6.3～9.7％，利用该5个单倍型的母虾人工繁育的小虾用于放流，放流后第一次回捕调查结果显示，具备该5个单倍型分子标记的个体占总回捕个体的16.6％。

Claims (7)

1.一种日本囊对虾放流效果的评估方法，包括：
(1)采集日本囊对虾放流区域的野生群体和准备用于放流的繁育群体，选用线粒体序列中的片段作为研究对象，通过PCR扩增和测序，分析野生群体和繁育群体的序列差异和单倍型分布，统计各单倍型的群体内频率；其中，线粒体序列为细胞色素B基因DNA序列如SEQIDNO:1所示；对应的PCR扩增引物MJ-CYTB-F、MJ-CYTB-R序列如SEQIDNO:2和NO:3所示；
(2)筛选出代表日本囊对虾种内差异的单倍型作为分子标记，确定该标记的序列特异性，计算分子标记在野生群体中所占的比例，定期监测比例变动范围；
(3)选定在野生群体中历年所占比例变动小的分子标记，将带有选定的分子标记的母虾用于人工繁育放流用的子一代；
(4)在捕捞期回捕放流区域的个体，检测分子标记，计算带有选定的分子标记的个体在回捕群体中的比例，确定比例变动情况，从而估算放流群体对该区域所有日本囊对虾生态量的贡献值，最终确定该批次的放流效果。
2.根据权利要求1所述的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，其特征在于：所述步骤(1)中的PCR反应体系为：30μL反应体系，其中包括3μL10×PCR缓冲液，引物的浓度均为10μM，上游引物和下游引物分别为0.5μL，1μL2.5mMeachdNTP，0.5μLTaqDNA聚合酶，0.5μLDNA模板；补充24μL去离子水至30μL。
3.根据权利要求1所述的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，其特征在于：所述步骤(1)中的PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸70s，共28个循环，最后72℃延伸7min，10℃保存并结束程序。
4.根据权利要求1所述的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，其特征在于：所述步骤(2)中的变动范围要求不超过5％。
5.根据权利要求1所述的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，其特征在于：所述步骤(3)中放流前对增殖群体的母本、子代预先进行检测，以确定选定的分子标记的有效性、可检出性，并确定子一代携带的分子标记与用于繁育的母虾一致。
6.根据权利要求1所述的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，其特征在于：连续多年对分子标记进行追踪检测，评估该批次放流的长期效果。
7.根据权利要求1所述的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，其特征在于：不同批次的放流选用不同的分子标记，以分别评估各个批次的放流效果。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106960280A (zh) * 2017-03-20 2017-07-18 上海海洋大学 一种基于贝壳微量元素的竹蛏放流效果评估方法
CN110135720B (zh) * 2019-05-09 2021-02-05 集美大学 一种增殖放流效果的定量评估方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102687692A (zh) * 2012-06-04 2012-09-26 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法
CN102888459A (zh) * 2012-10-11 2013-01-23 中国科学院海洋研究所 一种累代选育对虾新品种的鉴定方法
CN102972322A (zh) * 2012-12-20 2013-03-20 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种简化的可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102687692A (zh) * 2012-06-04 2012-09-26 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法
CN102888459A (zh) * 2012-10-11 2013-01-23 中国科学院海洋研究所 一种累代选育对虾新品种的鉴定方法
CN102972322A (zh) * 2012-12-20 2013-03-20 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种简化的可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genetic structure of the oriental river prawn（Macrobrachium nipponense） from the Yangtze and Lancang rivers，inferred from COI gene sequence;Yang Pin et al;《zoological research》;20070430;第28卷(第2期);第113-118页 *
分子标记在渔业资源增殖放流中的应用;宋娜等;《中国渔业经济 》;20100615;第28卷(第3期);第111-117页 *
利用分子标记评估中国对虾放流效果研究;李伟亚;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20130331;D052-243 *

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