CN109200088A - 神香草总黄酮的制备方法 - Google Patents

神香草总黄酮的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了神香草总黄酮的制备方法。本发明所提供的神香草黄酮的制备方法，包括用乙醇溶液作为提取剂从神香草中提取黄酮，收集提取液，得到神香草黄酮。其中，所述乙醇溶液的体积百分比浓度为50％‑70％。所述制备方法包括对所述提取液进行大孔树脂吸附分离得到神香草黄酮，对所述提取液进行大孔树脂吸附分离包括对所述提取液进行大孔树脂吸附和洗脱。本发明的神香草黄酮的制备方法可以提高神香草总黄酮的提取率，缩短提取时间，增大大孔树脂的利用率，从而大大的提升神香草的价值，提高经济效益，促进新疆地区民族中药的发展。

Description

神香草总黄酮的制备方法
技术领域
本发明涉及神香草总黄酮的制备方法。
背景技术
神香草为唇形花科多年生芳香植物，在印度被熟知为药用植物，在我国新疆作为维吾尔族的常用草药，全株都具有利用价值。叶子可以用来增加酸辣菜的口感，并具有分解脂肪等的作用。药用可以被制成收敛剂，祛痰剂，神经镇定剂，发汗剂等多种内服药剂。花可以用来制成花草茶，有镇定祛痰，温肺平喘，消肿止痛等的作用，并可改善感冒等症状。很多学者对于其药理成分进行了研究，证实了神香草具有抗衰老、消炎、治疗慢性哮喘、降血糖、抑菌、改善慢性阻塞性肺病等功效。最近几年，在新疆地区种植人工的神香草已经获得了成功，因此为神香草的研究与利用提供了充分的物质资源。《中华草本》中的维吾尔族卷记载：药用全草，主要含有黄酮类，挥发油，生物碱类等化学成分。其中的黄酮类化合物具有较强的药理活性和利用价值，所以研究神香草总黄酮的提取工艺与纯化工艺对于提高神香草的利用率具有实际意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何制备神香草黄酮。
为了解决以上技术问题，本发明提供了神香草黄酮的制备方法。
本发明所提供的神香草黄酮的制备方法，包括用乙醇溶液作为提取剂从神香草中提取黄酮，收集提取液，得到神香草黄酮。
上述制备方法中，所述乙醇溶液的体积百分比浓度可为50％-70％(如55％)。
上述制备方法中，所述乙醇溶液和神香草的配比可为为20-30ml乙醇溶液：1g神香草，如20ml乙醇溶液：1g神香草。其中，所述神香草的质量以干重计。
上述制备方法中，所述用乙醇溶液作为提取剂从神香草中提取黄酮在40-70℃(如70℃)下进行。
上述制备方法中，所述用乙醇溶液作为提取剂从神香草中提取黄酮在超声处理下进行45-60分钟(如60分钟)，所述超声处理采用的超声波的频率是40kHz、超声强度是2-3瓦/平方厘米。
上述制备方法中，所述制备方法包括对所述提取液进行大孔树脂吸附分离得到神香草黄酮，对所述提取液进行大孔树脂吸附分离包括对所述提取液进行大孔树脂吸附和洗脱，得到神香草黄酮。
上述制备方法中，所述大孔树脂吸附分离所采用的大孔树脂为AB-8大孔树脂，所述大孔树脂吸附中的上样液中黄酮的质量浓度为0.20-0.24mg/ml(如0.20mg/ml)，所述大孔树脂吸附中的上样液的pH值为5-7(如5)。
上述制备方法中，所述大孔树脂吸附中的上样液的上样量为12-14BV(如14BV)，上样液的流速为4BV·h-1。
上述制备方法中，所述洗脱先用第一种洗脱剂进行第一步洗脱，然后再用第二种洗脱剂进行第二步洗脱，所述第一种洗脱剂为蒸馏水，所述第二种洗脱剂为体积百分比浓度为50％-70％(如70％)的乙醇溶液。
上述制备方法中，所述第一步洗脱中第一种洗脱剂的用量为4BV，第一种洗脱剂的流速为4BV·h-1；所述第二步洗脱用第二种洗脱剂进行两次洗脱；每次洗脱中，第二种洗脱剂的用量为4BV，第二种洗脱剂的流速为10BV·h-1。
本发明的神香草黄酮的制备方法可以提高神香草总黄酮的提取率，缩短提取时间，增大大孔树脂的利用率，从而大大的提升神香草的价值，提高经济效益，促进新疆地区民族中药的发展。
附图说明
图1为芦丁的标准曲线。
图2为料液比与总黄酮浓度的关系。
图3为乙醇浓度与总黄酮浓度的关系。
图4为提取时间与总黄酮浓度的关系。
图5为提取温度与总黄酮浓度的关系。
图6为提取次数与总黄酮浓度的关系。
图7为上样液质量浓度与吸附量的关系。
图8为上样流速与吸附量的关系。
图9为上样量与总黄酮浓度的关系。
图10为pH与吸附率的关系。
图11为洗脱剂浓度与黄酮浓度的关系。
图12为洗脱流速与洗脱率的关系。
图13为蒸馏水体积与黄酮损失量的关系。
图14为洗脱剂用量与总黄酮浓度的关系。
图15为洗脱次数与洗脱率的关系。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的溶液，如无特别说明，其溶剂均为水。
实施例1、神香草总黄酮的制备
本实施例对于民族中药神香草总黄酮的超声波提取工艺以及大孔树脂分离纯化工艺进行优化，选出最佳方案。方法如下：第一部分，以总黄酮的质量浓度为指标，使用单因素实验以及L9(34)正交试验，考察提取部分的料液比，提取液浓度，提取时间以及提取温度；第二部分，先利用单因素考察树脂类型以及吸附条件中的上样液浓度、上样流速、上样量、上样液pH，并证实超声波提取方法的优越性。再以洗脱率为指标，利用单因素实验以及L9(34)正交试验考察洗脱条件中的洗脱剂浓度，洗脱流速，洗脱剂用量以及洗脱次数,通过紫外分光光度法对神香草总黄酮含量进行检测，确定最佳提取工艺以及分离工艺。选择完最佳方案之后对其进行重复验证，确定其稳定性。结果表明最佳提取工艺为料液比1:20，用55％(体积百分浓度)乙醇溶液在70℃下超声波提取60分钟。大孔树脂吸附的最佳优化条件为用质量浓度为0.2mg/ml，pH值为5的总黄酮上样液，以4BV·h-1上样流速，总共上样12BV。最佳洗脱工艺为使用70％(体积百分浓度)的乙醇溶液作为洗脱剂，在流速为4BV·h-1的条件下使用10BV的洗脱剂洗脱两次(每次洗脱用的70％的乙醇溶液的体积均是10BV)。其中，BV为柱体积，液体是大孔树脂体积的倍数。
具体的实验方法和结果如下：
一、神香草总黄酮的提取
(一)实验材料
1.1原料及试剂
神香草全草采购于新疆维吾尔族自治区，D-101,AB-8,HPD-600,D-3520,NKA-9,X-5,DM-130,S-8型大孔树脂，芦丁标准品，水为蒸馏水，无水乙醇NaNO2,Al(NO3)3,NaOH,盐酸溶液等均为分析纯。
1.2仪器
SY-5000旋转蒸发仪，L6紫外可见分光光度计，KQ5200DV型数控超声波清洗器，BSA224S电子天平，TD5K-III离心仪，HZQ-C空气浴振荡器。
(二)方法及结果
2.1芦丁标准曲线的绘制
精确称取芦丁标准品50.00mg，使用无水乙醇定容到50ml，从而芦丁标准液的浓度为1mg/ml。精确移取标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml，分别加入蒸馏水至3ml，5％亚硝酸钠溶液0.5ml，静置6分钟，10％硝酸铝溶液0.5ml，摇匀，静置6分钟后加入5％的氢氧化钠溶液2.5ml，摇匀，放置15分钟后加入蒸馏水定容至10ml。使用紫外分光光度计在510nm处分别测量分光度值，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。并求得回归方程为y＝11.676x-0.00542,R2＝0.99969,线性关系良好，见图1。
2.2神香草总黄酮提取工艺的单因素实验
2.2.1料液比的考察
精确称取干燥的神香草全草4份，每份各5g，剪碎，使用75％的乙醇溶液，料液比(神香草全草与75％的乙醇溶液的质量比)分别为1:10，1:20,1:30,1:40的条件下,在60℃下超声处理60分钟。其中，超声处理采用的超声波的频率是40kHz、超声强度是2瓦/平方厘米。离心(4000r/min，5min)，取上清液在紫外可见分光光度计下检测吸光度，计算总黄酮的质量浓度，结果见图2。由图可知，料液比为1:20的时候提取效果最佳。
2.2.2提取液浓度的考察
精确称取干燥的神香草全草4份，每份各5g，剪碎，在料液比为1:20,60℃的条件下，分别使用30％，50％，70％，90％(均为体积百分比浓度)的乙醇溶液进行超声处理60分钟。其中，超声处理采用的超声波的频率是40kHz、超声强度是2瓦/平方厘米。过滤，离心(4000r/min，5min)，取上清液在紫外可见分光光度计下检测吸光度，计算总黄酮的质量浓度，结果见图3。由图3可知，当乙醇溶液浓度为70％时，提取的效果最佳。
2.2.3提取时间的考察
精确称取干燥的神香草全草4份，每份5g，剪碎，在料液比为1:20,60℃的条件下，利用70％的乙醇溶液分别进行超声波提取15分钟、30分钟、45分钟、60分钟。其中，超声波提取采用的超声波的频率是40kHz、超声强度是2瓦/平方厘米。过滤，离心(4000r/min，5min)，取上清液在紫外可见分光光度计下检测吸光度，计算总黄酮的质量浓度，结果见图4。由图4可知，当提取到60分钟时，黄酮含量最高，处于原料利用率与节能考虑，选择提取60分钟为最佳。
2.2.4提取温度的考察
精确称取干燥的神香草全草4份，每份各5g，剪碎，在料液比为1:20的条件下，利用70％的乙醇溶液，分别在40,50,60,70℃下进行超声波提取60分钟。其中，超声波提取采用的超声波的频率是40kHz、超声强度是2瓦/平方厘米。过滤，离心(4000r/min，5min)，取上清液在紫外可见分光光度计下检测吸光度，计算总黄酮的质量浓度，结果见图5。由图5可知，提取温度为70℃的时候提取效果最佳。
2.2.5提取次数的考察
精确称取干燥的神香草全草4份，每份各5g，剪碎，在料液比为1:20，70℃的条件下，利用70％的乙醇溶液，进行超声波提取60分钟1，2，3，4次。其中，超声波提取采用的超声波的频率是40kHz、超声强度是2瓦/平方厘米。过滤，离心(4000r/min，5min)，取上清液在紫外可见分光光度计下检测吸光度，计算总黄酮的质量浓度，结果见图6。由图6可知，虽然一直都有上升，但是第三次与第四次上升的程度太低，可以被忽略，所以综合提取效率与节能的考虑，选择提取两次为最佳条件。
2.3神香草总黄酮提取工艺的正交试验
精确称取干燥的神香草全草9份，每份5g，剪碎，分别以料液比、提取剂浓度、提取时间、提取温度为影响因素，以神香草总黄酮的质量浓度为指标，进行L9(34)正交试验。设计因素水平，见表1，正交试验实验结果见表2。
表1、正交设计因素水平表
水平 A料液比 B提取剂浓度/％ C提取时间/min D提取温度/℃
1 1:20 95 15 50
2 1:30 75 30 60
3 1:40 55 60 70
表2、正交试验设计表及结果
实验号 A B C D 总黄酮含量/(mg·ml<sup>-1</sup>)
实验1 1 1 1 1 0.0099
实验2 1 2 2 2 0.0138
实验3 1 3 3 3 0.0211
实验4 2 1 2 3 0.0079
实验5 2 2 3 1 0.0134
实验6 2 3 1 2 0.0135
实验7 3 1 3 2 0.0052
实验8 3 2 1 3 0.0077
实验9 3 3 2 1 0.011
均值1 0.015 0.008 0.010 0.011
均值2 0.012 0.012 0.011 0.011
均值3 0.008 0.015 0.013 0.012
极差 0.007 0.007 0.003 0.001
由表2极差分析的结果可知，各个因素对于总黄酮提取的影响顺序为A＝B&gt;C&gt;D,即料液比＝提取剂浓度&gt;提取时间&gt;提取温度。料液比和提取剂浓度为主要的影响因素，提取时间和提取次数为次要的影响因素。根据表二分析，应选择A1B3C3D3,提取工艺为最佳，即1:20的料液比，55％乙醇溶液浓度(体积百分比浓度)，70℃下超声波提取60分钟。
2.2.7最佳提取工艺的验证
为了考察上述选定的最佳提取工艺的稳定性，按照该工艺条件A1B3C3D3进行重复试验三次，分别测定总黄酮质量浓度，计算其RSD(相对标准偏差)。具体方法如下：精确称取干燥的神香草全草3份，每份各5g，剪碎，每份各加入100ml的55％(体积百分比浓度)的乙醇溶液(料液比为1:20)，均在70℃的条件下，分别利用55％的乙醇溶液，进行超声波提取60分钟。过滤，离心(4000r/min，5min)，收集上清液，该上清液即为神香草总黄酮提取液。其中，超声波提取采用的超声波的频率是40kHz、超声强度是2瓦/平方厘米。
在紫外可见分光光度计下检测神香草总黄酮提取液的吸光度，计算总黄酮的质量浓度。结果见表3。由表3可知，黄酮平均含量为0.0211mg/ml,与实验时该组基本持平且远远优于其他组，RSD为0.7488％，说明该工艺稳定。
表3、最佳提取工艺的RSD
二、神香草总黄酮的纯化
下述步骤中的术语含义如下：
吸附量＝(原溶液浓度—滤液浓度)×溶液体积/干树脂质量。
吸附率＝(原溶液浓度—滤液浓度)/原溶液浓度×100％。
洗脱量＝洗脱后溶液浓度×溶液体积/干树脂质量。
洗脱率＝洗脱量/吸附量×100％。
1、大孔树脂预处理
取适量的大孔树脂在95％乙醇溶液中浸泡8h，充分溶胀过后采用湿法装柱，用蒸馏水洗至没有乙醇味，再于5％HCl溶液中浸泡三小时，蒸馏水洗至流出的液体为中性，再于5％氢氧化钠溶液中浸泡三小时，蒸馏水洗至流出的液体为中性。并且每次上样洗脱完毕，进行下一次上样之前，先用3％的HCl溶液洗至无色，蒸馏水洗至中性，再用3％氢氧化钠溶液洗至无色，蒸馏水洗至中性。
2、上样液的制备(神香草总黄酮提取液的制备)
精确称取干燥的神香草全草200g，剪碎，加入4000ml的55％(体积百分比浓度)的乙醇溶液(料液比为1:20)，70℃的条件下，进行超声波提取60分钟。过滤，离心(4000r/min，5min)，收集上清液，该上清液即为神香草总黄酮提取液，也是上样液。在紫外可见分光光度计下检测神香草总黄酮提取液的吸光度，计算上清液总黄酮的质量浓度为0.178mg/ml。其中，超声波提取采用的超声波的频率是40kHz、超声强度是2瓦/平方厘米。
3、大孔树脂型号的选择
取8种经过预处理的大孔树脂(D-101,AB-8,HPD-600,D-3520,NKA-9,X-5,DM-130,S-8)各4g(干重)，八种大孔树脂的极性对比见表4。分别置于500ml锥形瓶中，分别加入400ml上样液，于恒温震荡箱中振摇吸附10h,取吸附后的溶液测吸光度，计算各大孔树脂对神香草总黄酮的吸附率。取静态吸附的树脂过滤，干燥，分别加入75％的乙醇溶液40ml进行静态洗脱，振摇6h，静置24小时，收集乙醇洗脱液，测定吸光度，计算其中总黄酮的量，计算洗脱率。结果见表5。
表4、大孔树脂对比
型号 极性
D-101 非极性
AB-8 非极性
HPD-600 极性
D-3520 非极性
NKA-9 极性
X-5 非极性
DM-130 弱极性
S-8 极性
表5、大孔树脂的静态吸附与解吸
树脂类型 吸附率/％ 解吸率/％
D-101 32.9 14.1
AB-8 65.2 54.9
HPD-600 29.6 23.3
D-3520 40.1 15.3
NKA-9 34.8 12.7
X-5 10.3 15.6
DM-130 20.4 26.9
S-8 33.5 40.0
结果表明8种大孔树脂对于神香草总黄酮具有强弱各异的吸附能力，其中X-5,DM-130的解吸率大于吸附率，出现这种状况的原因可能是部分上样液附着在大孔树脂表面，以至于洗脱时浓度略高，而D-101以及NKA-9的洗脱率远远小于吸附率，原因可能是这两种树脂对于神香草总黄酮的死吸附非常严重。综合吸附率以及解吸率，选用AB-8型大孔树脂。
5、吸附条件的优化
5.1上样液质量浓度的考察
取四份已经处理好的AB-8型大孔树脂，湿法装柱，将步骤2的上样液分别用55％(体积百分比浓度)的乙醇溶液进行稀释或浓缩，得到总黄酮质量浓度分别为0.12mg/ml,0.16mg/ml,0.20mg/ml,0.24mg/ml的神香草总黄酮提取液，分别作为上样液,分别过柱，控制体积流量为2BV·h-1,分别收集过柱液，测定总黄酮质量浓度，并计算吸附量。结果见图7。所以选择总黄酮质量浓度为0.2mg/ml的上样液比较合适。
5.2上样流速的考察
分别称取10g四份经过预处理的AB-8型大孔树脂，湿法装柱，精确量取总黄酮质量浓度为0.2mg/ml的神香草总黄酮提取液50ml作为上样液,控制上样流速分别为2,3,4,5BV·h-1，收集流出液，测定吸光度，计算总黄酮浓度，结果见图8。所以选择上样流速为4BV·h-1。
5.3上样量的考察
取10gAB-8型大孔树脂湿法上柱，按照上述选择的条件进行吸附，每1BV流出液收集一次，总共收集15份，以流出液的体积为横坐标，总黄酮的质量浓度的纵坐标，绘制出梯度洗脱曲线。结果见图9。9BV之前，图中斜率比较平缓，9BV之后上升急速，12BV后开始下降(原因为黄酮质量浓度降低)，因此选择12BV的上样液量比较好，此时总黄酮开始泄露。
5.4上样液pH值的考察
上样液的pH情况无疑也会对AB-8大孔树脂的吸附产生一定影响，将上样液的pH调成3-8六种不同的酸碱度，进行吸附试验，结果发现，pH不同，上样液的澄清度也不同，当pH为3的时候，上样液产生沉淀，甚至使树脂结块，pH&gt;5时，上样液比较澄清，上柱的效果很好。结果见图10。由图可知，pH＝5的时候，回收率最佳，因此应该选择pH＝5的上样液进行吸附。
5.5综合最佳吸附条件的验证
根据之前的单因素实验结果，可以得出最佳的吸附工艺，即使用质量浓度为0.2mg/ml，pH值为5的总黄酮上样液，以4BV·h-1上样流速，上样量为12BV。
为了验证此工艺的稳定性，进行3次重复性实验，取三份经过预处理的AB-8大孔树脂进行湿法装柱，将步骤2的上样液进行浓缩，得到总黄酮质量浓度为0.20mg/ml、pH值为5的神香草总黄酮提取液作为上样液，取12BV的上样液以4BV·h-1的上样流速进行上样，测定吸光度值，计算吸附率，然后计算RSD值。结果见表6。
表6、最佳吸附工艺的验证试验结果
由表6可知，吸附率的平均值为60.14％，优于之前所做的所有实验，表明选择正确，并且RSD值为0.0762％，表明该工艺比较稳定。
6、洗脱条件的优化
6.1洗脱剂浓度的考察
取经过预处理的AB-8大孔树脂10g进行湿法装柱，将步骤2的上样液进行浓缩，得到总黄酮质量浓度为0.20mg/ml、pH值为5的神香草总黄酮提取液作为上样液，取12BV的上样液以4BV·h-1的上样流速进行上样，首先用4BV蒸馏水洗脱，再各用50％，70％，90％的乙醇溶液5BV洗脱，收集流出液，测定吸光度，计算流出液中的总黄酮质量浓度，结果见图11。由图11可见，70％的乙醇溶液洗脱最有效。
6.2洗脱流速的考察
取四份经过预处理的AB-8大孔树脂各10g进行湿法装柱，将步骤2的上样液进行浓缩，得到总黄酮质量浓度为0.20mg/ml、pH值为5的神香草总黄酮提取液作为上样液，取12BV的上样液以4BV·h-1的上样流速进行上样，首先用5BV蒸馏水以5BV·h-1的流速洗脱，再加70％的乙醇溶液共5BV洗脱，洗脱的流速分别为1BV·h-1，2BV·h-1，3BV·h-1，4BV·h-1，收集流出液，测量吸光度，计算其中总黄酮质量浓度，从而计算洗脱率。结果见图12。由图12可知，应选择4BV·h-1的洗脱流速。
6.3洗脱剂蒸馏水用量的考察
由于糖类物质与黄酮类物质都属于非离子型化合物，但是因为糖类物质的分子量较小，明显小于黄酮类物质，并且糖类物质较易溶于水，在大孔树脂中时容易被蒸馏水洗脱掉，所以在用乙醇洗脱前要用蒸馏水洗脱，这样做可以提高黄酮的浓度。
经过预处理的AB-8大孔树脂30ml进行湿法装柱，将步骤2的上样液进行浓缩，得到总黄酮质量浓度为0.20mg/ml、pH值为5的神香草总黄酮提取液作为上样液，取12BV的上样液以4BV·h-1的上样流速进行上样，分别用1,2,3,4,5BV的蒸馏水洗脱以5BV·h-1的流速洗脱，再加70％的乙醇溶液共5BV洗脱，收集流出液，测量吸光度，计算其中总黄酮质量浓度，计算黄酮损失率，如下图13。同时，做了多糖反应试验，试验结果见表7。
表7、蒸馏水体积与多糖反应
蒸馏水体积/BV 多糖反应
1 +
2 +
3 +
4 —
5 —
由上表可知，蒸馏水体积为1到3时，多糖反应为正，说明多糖没有洗脱干净，蒸馏水体积为4BV时已经把多糖洗脱干净，并且随着蒸馏水体积增加，黄酮损失量越来越多，综合考虑，选择4BV的蒸馏水洗脱多糖比较合适。
6.4洗脱剂乙醇用量的考察
经过预处理的AB-8大孔树脂进行湿法装柱，将步骤2的上样液进行浓缩，得到总黄酮质量浓度为0.20mg/ml、pH值为5的神香草总黄酮提取液作为上样液，取12BV的上样液以4BV·h-1的上样流速进行上样，首先用4BV蒸馏水洗脱多糖(流速为4BV·h-1)，再用70％的乙醇溶液，以4BV·h-1的流速进行洗脱，每1BV收集一份洗脱液，一直收集十份，计算5到10BV的总黄酮质量浓度，并且以洗脱剂的用量为横坐标，总黄酮的质量浓度为纵坐标作图，见图14。
由图14可知，当洗脱剂用量在5到9BV之间的时候，虽然黄酮的浓度在减少，但是减少的并不多，但是当洗脱剂用量达到10BV的时候，总黄酮的质量浓度骤减，所以，综合考虑，洗脱剂用量应选择9BV。
6.5洗脱次数的考察
经过预处理的AB-8大孔树脂进行湿法装柱，将步骤2的上样液进行浓缩，得到总黄酮质量浓度为0.20mg/ml、pH值为5的神香草总黄酮提取液作为上样液，取12BV的上样液以4BV·h-1的上样流速进行上样，首先用4BV蒸馏水洗脱多糖(流速为4BV·h-1)，再用70％的乙醇溶液，以4BV·h-1的流速进行洗脱，分别洗脱1,2,3,4次，收集流出液，测吸光度，计算洗脱率，结果见图15。
6.6洗脱条件的正交试验优化
经过预处理的AB-8大孔树脂进行湿法装柱，将步骤2的上样液进行浓缩，得到总黄酮质量浓度为0.20mg/ml、pH值为5的神香草总黄酮提取液作为上样液，取12BV的上样液以4BV·h-1的上样流速进行上样，洗脱率为指标，考察洗脱剂乙醇溶液的浓度，洗脱流速，洗脱剂用量，洗脱次数四个因素。选择L9(34)正交试验表，以洗脱率为指标，设计因素水平表，见表8。通过正交试验，研究四个因素对于洗脱率的影响，结果见表9。并且对洗脱率进行方差分析，见表10。
表8、正交试验设计因素表
由实验结果，根据极差分析的数据可以看出，四个因素对于洗脱率的影响大小顺序为A&gt;D&gt;B&gt;C,即洗脱液浓度&gt;洗脱次数&gt;洗脱流速&gt;洗脱剂用量。洗脱液浓度及洗脱次数为其中的主要因素，洗脱流速与洗脱剂用量为其中的次要因素。根据均值的大小可知，最佳洗脱工艺为A2B2C3D2,即使用70％的乙醇溶液，在4BV·h-1的洗脱流速下用10BV的洗脱液洗脱两次。
表9、正交试验设计表及结果
表10、方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 P
乙醇浓度 74.682 2 2.668 4.460 &gt;0.05
洗脱流速 17.236 2 0.616 4.460 &gt;0.05
洗脱剂用量 0.202 2 0.007 4.460
洗脱次数 19.842 2 0.709 4.460 &gt;0.05
误差 111.96 8
由方差分析表可以观察出，对洗脱率影响较大的三个因素，洗脱液浓度，洗脱流速，洗脱次数不同的差别具有各自的统计学意义，即表明洗脱液浓度、洗脱流速，洗脱次数对于洗脱率的影响有一定的意义。
6.7最佳吸附洗脱工艺的验证
为了考察所选取的最佳工艺的操作稳定性，按照该工艺A2B2C3D2进行3次重复性实验，分别测定其吸光度，计算洗脱率，然后计算其RSD，结果见表11。具体实验方法如下：经过预处理的AB-8大孔树脂进行湿法装柱，将步骤2的上样液进行浓缩，得到总黄酮质量浓度为0.20mg/ml、pH值为5的神香草总黄酮提取液作为上样液，取12BV的上样液以4BV·h-1的上样流速进行上样，首先用4BV蒸馏水(第一洗脱剂)以4BV·h-1的流速进行第一步洗脱，再用70％(体积百分浓度)的乙醇溶液，在4BV·h-1的洗脱流速下用10BV的70％的乙醇溶液(第二洗脱剂)洗脱两次进行第二步洗脱(每次洗脱用的70％的乙醇溶液的体积均是10BV)，收集流出液。
表11、最佳工艺的验证实验结果
根据表11可知，该工艺的重复性试验的洗脱率为58.67％,高于实验的任意一组，RSD％为0.5207％，说明选择的该工艺很稳定。

Claims (10)

1.神香草黄酮的制备方法，包括用乙醇溶液作为提取剂从神香草中提取黄酮，收集提取液，得到神香草黄酮。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述乙醇溶液的体积百分比浓度为50％-70％。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述乙醇溶液和神香草的配比为20-30ml乙醇溶液：1g神香草。
4.根据权利要求1至3中任一所述的制备方法，其特征在于：所述用乙醇溶液作为提取剂从神香草中提取黄酮在40-70℃下进行。
5.根据权利要求1至4中任一所述的制备方法，其特征在于：所述用乙醇溶液作为提取剂从神香草中提取黄酮在超声处理下进行45-60分钟，所述超声处理采用的超声波的频率是40kHz、超声强度是2-3瓦/平方厘米。
6.根据权利要求1至5中任一所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括对所述提取液进行大孔树脂吸附分离得到神香草黄酮，对所述提取液进行大孔树脂吸附分离包括对所述提取液进行大孔树脂吸附和洗脱。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂吸附分离所采用的大孔树脂为AB-8大孔吸附树脂，所述大孔树脂吸附中的上样液中黄酮的质量浓度为0.20-0.24mg/ml，所述大孔树脂吸附中的上样液的pH值为5-7。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂吸附中的上样液的上样量为12-14BV，上样液的流速为4BV·h-1。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于：所述洗脱先用第一种洗脱剂进行第一步洗脱，然后再用第二种洗脱剂进行第二步洗脱，所述第一种洗脱剂为蒸馏水，所述第二种洗脱剂为体积百分比浓度为50％-70％的乙醇溶液。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述第一步洗脱中第一种洗脱剂的用量为4BV，第一种洗脱剂的流速为4BV·h-1；所述第二步洗脱用第二种洗脱剂进行两次洗脱，每次洗脱中，第二种洗脱剂的用量为4BV，第二种洗脱剂的流速为10BV·h-1。
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