CN109196112B - 球状体内部细胞状态的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在培养球状体时，非侵袭性且定量地对内部的细胞状态、特别是细胞死亡进行分析的方法及装置。更具体而言，本发明通过使用以高分辨率为特征的光学设备实施球状体的光学成像，对球状体的内部结构进行分析，提供用于分析细胞状态的方法及装置。

Description

球状体内部细胞状态的分析方法
技术领域
本发明涉及用于对球状体内部的细胞状态进行分析的方法和装置。另外，本发明还涉及用于制造球状体的细胞培养装置。
背景技术
再生医疗是指通过对因受伤或疾病而损伤的组织移植由干细胞制作的细胞或组织来恢复本来功能的医疗，近年来受到关注。已知该再生医疗与注射分散的细胞的悬浮液的治疗方法相比，移植生物体模拟三维组织的方法在患部的成活率更高、治愈效果更好，面向表皮或软骨再生的细胞片已被产品化。另外，作为由多个细胞构成的球状的细胞集块的球状体也作为三维组织的形态之一而受到关注，正在进行面向软骨球状体等的实用化的研究。
已知球状体在培养过程中由于培养基的营养、氧难以到达中心部的细胞，因此主要从中心部发生坏死等的细胞死亡。在此，细胞死亡是指坏死或凋亡(自然死亡)。坏死时，细胞膨胀、细胞质变化、细胞膜破裂。细胞凋亡时，细胞缩小并被免疫细胞吞食。但是，此时球状体外形不发生变化。另外，认为在内部发生细胞死亡的球状体的活细胞的数量少，并且还有可能从死细胞释放出不期望的物质，因此不适于移植。
认为这样的球状体内部有无细胞死亡区域会对球状体的品质产生很大影响。但是，迄今为止球状体主要被用于面向药物开发，球状体内部的细胞死亡并不是严重的问题。另外，作为球状体的评价方法，在活细胞数测量中一直使用用色素来测定活细胞的酶活性的侵袭性方法。在面向药物开发的球状体的情况下，侵袭性方法也没有特别问题。另一方面，为了一边培养面向移植的球状体一边经时地测量并确定移植时机，需要与这些品质评价项目对应的球状体的非侵袭评价技术。目前的情况是，球状体的评价通过利用相位差显微镜进行观察或组织染色等来验证。利用相位差显微镜进行细胞观察是非侵袭性的，但相位差显微镜无法评价球状体三维形状的测量或球状体内部发生的细胞死亡。另外，虽然细胞死亡能够通过组织染色进行评价，但是其是固定、包埋球状体的侵袭性方法，无法在培养中进行评价、或者由于在判断结果之前需要时间而无法评价移植用的球状体本身，评价后的球状体无法用于移植。
因此，必须开发能够非侵袭评价球状体内部的细胞死亡的技术。用于解决这些课题的球状体的三维形状的测量以及内部的细胞死亡的非侵袭性测量技术的确立可以说，通过直接评价移植用球状体的细胞状态而有助于提高移植用再生组织的品质。
迄今为止，几篇文献中报告了非侵袭性的细胞评价方法。例如专利文献1中记载了，使用反射光拍摄皮肤内部的三维图像并在亮度相对明亮的部分确定黑色素的部位的方法。另外，专利文献2中记载了，使用光学相干断层成像仪拍摄细胞片的三维图像并通过亮度判断细胞的缺损部位或细胞片的厚度的方法。专利文献3中记载了，使用反射光拍摄细胞片的三维图像，根据所拍摄的细胞片内部的核的分布来判别细胞片的多层化、分化程度的方法。专利文献4中记载了，使用显微镜拍摄单层培养的细胞并判别活细胞和坏死的细胞的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2003-057170号公报
专利文献2：国际公开WO2015/004762号
专利文献3：日本特开2016-021915号公报
专利文献4：日本特开2014-029287号公报
发明内容
发明所要解决的课题
在上述的任一专利文献中，出于检测生物体组织或细胞中的特定部位的目的，均采用了使用反射光进行三维测定或显微镜观察等非侵袭性手段。但是，在现有技术文献中作为对象的生物体组织或细胞其表面为平面，不是球状体那样的接近球形的形状。在反射光测定时，来自测定对象的信号光在测定对象中行进时受到散射等影响而强度衰减，但在测定对象的表面平坦的情况下，在对表面进行水平的断层图像分析时，不需要对同一平面图像内的亮度的比较进行校正。但是，在用反射光检测存在于球状体这样的接近球形的组织内部的细胞死亡时，即使在同一平面图像内，光从球状体表面行进到测定地点的距离也因每个测定地点的不同而不同，因此无法单纯地比较亮度，通过没有校正的现有方法无法判断细胞死亡。因此，本发明中，对球状体内部的细胞死亡进行分析成为课题。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过实施球状体的光学成像，基于球状体的三维形状和/或从光照位置到测定位置的距离对得到的图像的亮度进行校正，能够非侵袭性地且定量地分析球状体内部的细胞状态，从而完成了本发明。
即，作为非侵袭性地对球状体内部的细胞状态进行分析的方法及装置，认为使用反射光进行三维测定是有效的。在发生细胞死亡的区域，由于细胞质的变化和细胞膜的破坏，反射光比正常的活细胞弱，因此通过对通过反射光成像获得的图像的亮度进行分析，能够将亮度在某规定值以下的区域判定为细胞死亡。
具体而言，在一个方式中，本发明提供一种细胞分析方法，其是对球状体内部的细胞状态进行分析的细胞分析方法，其特征在于，其包含：
对球状体照射光的工序，
获得距光照位置的距离不同的多个球状体截面图像的工序，以及
考虑信号强度衰减以校正所述图像的亮度的工序。
在另一方式中，本发明提供一种细胞分析装置，其是对球状体内部的细胞状态进行分析的细胞分析装置，其特征在于，其具备：
光源、对培养面上的细胞照射来自所述光源的光的聚光光学系统、检测来自所述细胞的光的检测光学系统、和
对基于从所述检测光学系统获取的信息的图像进行分析的分析部；
所述分析部具有：
获得距所述培养面的垂直方向的距离不同的多个截面图像的图像获得部，
测量所述多个截面图像的亮度的亮度测量部，和
考虑信号强度衰减以校正所述亮度，对球状体内部的细胞状态进行分析的状态分析部。
另外，在另一方式中，本发明提供一种细胞培养装置，其是具有培养球状体的培养部、使用光对所述球状体内部的细胞状态进行分析的分析部、和控制所述球状体的培养及分析的控制部的细胞培养装置，其中，
(1)所述分析部具备：
光源、对培养面上的细胞照射来自所述光源的光的聚光光学系统、检测来自所述细胞的光的检测光学系统，和
对基于从所述检测光学系统获得的信息的图像进行分析的图像分析部；
所述图像分析部具有：
获得距所述培养面的垂直方向的距离不同的多个截面图像的图像获得部，
测量所述多个截面图像的亮度的亮度测量部，和
基于所述亮度，对球状体内部的细胞状态进行分析的状态分析部；
(2)所述控制部控制细胞溶液的供给、培养基的供给、培养基的废弃、细胞的培养、光的照射、光的检测、图像的获得、亮度的测量以及细胞状态的分析中的至少一个。
发明效果
通过本发明，提供用于对球状体内部的细胞状态进行分析的方法及装置，以及基于该方法和装置、用于培养球状体的细胞培养装置。本发明的方法及装置在培养球状体时能够非侵袭性地且定量地对内部的细胞状态(即有无细胞死亡)进行分析，对球状体、特别是用于在移植等再生医疗中使用的球状体的制造是有用的。
附图说明
图1是球状体内部的细胞状态的分析流程概略图。
图2是表示球状体从制作到崩解为止的阶段的示意图。
图3是组装了OCT的自动细胞培养装置的一例的框图。
图4是OCT的基本构成例的构成图。
图5是球状体的测定示意图。
图6是球状体的三维形状与光行进的距离的关系的示意图。
图7是球状体内部有无细胞死亡和OCT图像的示意图。
图8是校正前后的OCT图像的示意图。
图9是球状体内部的细胞状态的分析流程的另一例的概略图。
具体实施方式
使用附图对本发明的实施方式进行详细说明。但是，本发明并不限定性地解释为以下所示的实施方式的记载内容。在不脱离本发明的思想或主旨的范围内，本领域技术人员容易地理解可变更其具体构成。
另外，为了容易理解发明，附图等中所示的各构成的位置、大小、形状、范围等有时并不表示实际的位置、大小、形状、范围等。因此，本发明并不一定限定于附图等中所公开的位置、大小、形状、范围等。
本发明涉及对球状体内部的细胞状态进行分析的方法及装置。球状体是指细胞集合、凝聚化而成的三维状的细胞集合体。本发明中，没有限定，可以使用由干细胞、软骨细胞、肝细胞、角膜细胞、表皮细胞、心肌细胞、神经细胞、以及它们的前体细胞等构成的球状体。另外，细胞的来源也没有特别限定，例如为动物、优选哺乳动物的细胞，具体而言，可以为灵长类(人、猴子、黑猩猩、大猩猩等)、实验动物(小鼠、大鼠等)、家畜动物(牛、猪、兔等)、宠物动物(狗、猫等)来源的细胞。
图2表示球状体从制作到崩解为止的阶段。图2是将培养面201设为图的纵深方向时，从横向观察细胞的结构的图像。在此，作为一例，使用干细胞。球状体经过以下阶段成为三维组织。
(S201)：播种细胞。此时，分离的干细胞202为悬浮在培养基中的状态。
(S202)：干细胞202凝聚，其一部分粘附在培养面201上。在平面培养的情况下，使用底面平坦且细胞粘附性高的培养器材，但在球状体培养中，如图所示，通过使用圆底培养器材、或对培养面实施微细的凹凸、或通过培养面的表面处理使细胞粘附性降低来使细胞凝聚。
(S203)：凝聚的细胞增殖而成为球状体。在培养到适当的球状体时从培养容器取出并移植到患部。
(S204)：已知球状体在培养过程中培养基的营养、氧难以到达中心部的细胞，因此主要从中心部发生坏死等细胞死亡。在此，细胞死亡是指坏死或凋亡(自然死亡)。坏死时，细胞膨胀、细胞质变化、细胞膜破裂。细胞凋亡时，细胞缩小并被免疫细胞吞食。但是，此时球状体外形不发生变化。另外，在内部发生细胞死亡的球状体的活细胞的数量少，并且还有可能从死细胞释放出不期望的物质。
(S205)：最终细胞彼此分散，球状体崩解。
为了保证球状体的品质，需要在培养中和移植前对球状体的内部的细胞状态、即有无细胞死亡(坏死、细胞凋亡)进行分析。优选对培养面附近的球状体(细胞凝聚于培养面附近而成的球状体)进行分析。
本发明中，使用以高分辨率为特征的光学设备实施球状体的光学成像，通过对得到的图像进行分析来分析球状体内部的细胞状态(即有无细胞死亡)。以细胞水平的分辨率对球状体的三维结构进行反射光成像，从多个截面图像、根据球状体的三维形状和光按照三维形状在样品内行进的距离，对各地点的亮度进行校正而得到断层图像，对断层图像进行测量，由此对球状体内部的细胞状态进行分析。在发生细胞死亡的区域，由于细胞质的变化和细胞膜的破坏，反射光比正常的活细胞弱，因此通过对由反射光成像获得的图像的亮度进行分析，能够将亮度在某规定值以下的区域判定为细胞死亡。在反射光测定时，来自测定对象的信号光在测定对象中行进时受到散射等的影响而强度衰减。在用反射光检测球状体这样的接近球形的组织内部存在的细胞死亡时，即使在同一平面图像内，光从球状体表面行进到测定地点的距离也因每个测定地点的不同而不同，因此无法单纯地比较亮度，因此实施上述校正。
本发明的一个方式涉及对培养球状体时的球状体内部的细胞状态进行分析的方法。该方法中，首先进行向培养中或培养结束时的球状体照射光的工序。光的照射使用光源、对球状体的细胞照射来自该光源的光的聚光光学系统、检测来自该细胞的光的检测光学系统、以及检测来自该检测光学系统的光的检测器。例如，光源、聚光光学系统以及检测光学系统只要是三维地具有高分辨率的光学设备即可，优选为非侵袭性(非破坏且非染色)的光学设备。具体而言，例如构成为OCT(Optical Coherence Tomography：光学相干断层成像仪)、反射型共聚焦显微镜、多光子激发显微镜等。
在使用OCT作为光学系统的情况下，其原理是：将光源的光分为信号光和参照光，向细胞照射信号光，将从细胞反射的信号光与参照光进行合波，检测由合波所生成的合成光。OCT中，信号光从细胞的各种深度重合而被反射，但与参照光干涉的成分限定于来自特定的深度位置的信号光成分，因此与光学显微镜不同，能够进行Z分辨率高的测定。
在具有10微米以下程度的高空间分辨率的OCT的情况下，球状体内部的细胞单元的明暗能够从所获得的图像成像。在发生细胞死亡的区域，亮度低于正常的细胞部分，因此能够分析该区域的有无和体积。根据该信息，能够判定球状体的培养过程是否顺利、是否能够移植。另外，该细胞状态的分析方法能够通过现有的图像处理技术自动化。也可以组装到自动细胞培养装置中，利用OCT测定在自动细胞培养装置内的培养容器中培养的球状体。
基于来自所述检测器的信号，获得距光照位置的距离(例如距培养面的垂直方向的距离)不同的多个球状体截面图像。然后，从多个截面图像测量球状体的三维形状和按照三维形状对亮度进行了校正的断层图像，获得各地点的校正后的亮度信息。即，断层图像中的亮度受到球状体的三维形状和/或从光照位置到测定位置的距离的影响，三维形状中的细胞的重叠程度越大，并且距光照位置的距离越远，亮度越低，信号强度越衰减。因此，本发明中，通过考虑这样的信号强度衰减以进行亮度的校正，能够消除球状体特有的问题。信号强度衰减根据所使用的细胞的种类、所使用的光学系统装置、样品组成等的不同而不同，因此能够根据预先学习的与球状体内部的特定细胞状态相关的信号强度衰减的数据来校正亮度。这样的校正可以在分析部自动进行，或者也可以由实施者通过手工作业来进行。
在分析亮度时，优选在球状体截面图像中将图像按多个像素的每一像素分割成格子状，求出每格的平均亮度。在截面图像中，对于每个像素，存在由噪声或局部的细胞内的折射率差等引起的亮度的不均，通过将图像按多个像素的每一像素分割为格子状并以格为单元求出亮度的平均值，从而能够进行更准确且定量的图像评价。
在球状体内部发生细胞死亡的部位，由于细胞质的变化和细胞膜的破坏，反射光比正常的活细胞弱。因此，通过对由反射光成像获得的图像的亮度进行分析，当亮度低于某规定值时，能够推测在该部位存在细胞死亡状态的细胞。另一方面，当亮度高于规定值时，可以推测在该部位不存在细胞死亡状态的细胞。另外，也可以根据亮度的值定量地分析细胞死亡状态的细胞存在何种程度。与细胞状态相关的亮度的值根据所使用的细胞种类、所使用的光学系统装置、样品组成等的不同而不同，因此能够根据预先学习的球状体内部的特定细胞状态、即有无细胞死亡的亮度数据来分析球状体内部的细胞状态。
另外，在本发明的一个实施方式中，也可以在进行上述工序后，在球状体的外形形状或体积没有变化的情况下，再次对球状体照射光，获得球状体的第2截面图像。此时，优选使通过上述工序进行亮度测定时的球状体的位置与第2截面图像中的球状体的位置对准来进行校正。通过将得到的第2图像的亮度与通过上述的工序得到的相同或同等位置的亮度进行比较，能够经时地分析或监视球状体内部的细胞状态。在该情况下，不需要考虑上述那样的信号强度衰减，能够更简便地进行分析。
另外，本发明的另一方式涉及对球状体内部的细胞状态进行非侵袭性地光学分析的细胞分析装置。该装置具备光源、对培养面上的细胞照射来自所述光源的光的聚光光学系统、检测来自所述细胞的光的检测光学系统、以及对基于从所述检测光学系统获得的信息的图像进行分析的分析部。光源、聚光光学系统以及检测光学系统为如上所述的具有三维高分辨率的光学设备，优选为非侵袭性(非破坏且非染色)的光学设备。在优选的实施方式中，光源、聚光光学系统以及检测光学系统构成为光学相干断层成像仪(OCT)。
另外，分析部具有：获得从上述培养面的垂直方向的距离不同的多个截面图像的图像获得部，测量上述多个截面图像的亮度的亮度测量部，以及考虑信号强度衰减以校正上述亮度、并对球状体内部的细胞状态进行分析的状态分析部。分析部可以构成为：根据球状体的三维形状和按照三维形状对亮度进行了校正的断层图像的亮度，对球状体内部的细胞状态(例如有无细胞死亡)进行分析。分析部还可以具有测定球状体的外形形状的测定部，由此能够测定球状体的外形形状和/或体积，辅助考虑了信号强度衰减的亮度校正和球状体内部的细胞状态的分析。
另外，本发明的细胞分析装置可以具备输出装置，或者也可以与外部的输出装置连接。输出装置可以是本技术领域中公知的任意的输出装置，例如可以举出图像和/或数据显示装置、警报装置、打印机等。在该情况下，分析部也可以构成为：将表示校正前后的各图像、及校正后的图像中判定为细胞死亡的部分的图像、以及球状体的体积与细胞死亡部分的体积比显示于显示装置。另外，也可以构成为：基于分析数据从警报装置发出警报，或者进行将基于分析数据的信号输出到细胞培养装置或其他外部装置中的至少一个。
本发明的细胞分析装置优选还具备：存储与球状体内部的特定细胞状态相关的信号强度衰减数据和/或亮度数据的存储部。如上所述，信号强度衰减和与特定的细胞状态相关的亮度的值根据所使用的细胞种类、所使用的光学系统装置、样品组成等的不同而不同，因此通过将与球状体内部的特定细胞状态相关的信号强度衰减的数据存储在存储部中，能够通过与所存储的数据的比较迅速且简便地对亮度进行校正。另外，通过预先将球状体内部的特定细胞状态、即有无细胞死亡的亮度数据存储于存储部，能够通过与所存储的数据的比较迅速且简便地对球状体内部的细胞状态进行分析。
本发明的又一方式涉及用于培养球状体的细胞培养装置，其具有：(1)用于培养球状体的培养部、(2)使用光来对所述球状体内部的细胞状态进行分析的分析部、和(3)用于控制所述球状体的培养及分析的控制部。
细胞培养装置的培养部只要能够培养细胞、形成球状体即可，没有特别限定，本领域技术人员能够根据目标细胞的种类、球状体的使用目的来构成适当的培养部。一个实施方式中，培养部可以具备：恒温室、配置在所述恒温室内并培养球状体的培养容器、与所述培养容器结合并供给细胞溶液的培养瓶、与所述培养容器结合并供给培养基的培养基瓶、和与所述培养容器结合并收纳从培养容器废弃的培养基的废液瓶。
细胞培养装置的分析部具备光源、对培养面上的细胞照射来自所述光源的光的聚光光学系统、对来自所述细胞的光进行检测的检测光学系统、以及对基于从所述检测光学系统获得的信息的图像进行分析的图像分析部。该图像分析部具有：获得距所述培养面的垂直方向的距离不同的多个截面图像的图像获得部、测量所述多个截面图像的亮度的亮度测量部、以及根据所述亮度对球状体内部的细胞状态进行分析的状态分析部。图像分析部具有下述功能：基于来自检测光学系统的信号，获得距培养面的垂直方向的距离不同的多个截面图像的功能；和根据多个截面图像，测量球状体的三维形状和按照三维形状对亮度进行了校正的断层图像，根据图像的亮度对球状体内部的细胞状态进行分析的功能。具体而言，状态分析部考虑信号强度衰减以校正截面图像中的亮度，对球状体内部的细胞状态进行分析。
细胞培养装置的控制部控制细胞溶液的供给、培养基的供给、培养基的废弃、细胞的培养、光的照射、光的检测、图像的获得、亮度的测量以及细胞状态的分析中的至少一个。例如，控制部构成为：基于来自所述状态分析部的输出，控制所述培养部中的球状体的培养。控制部可以使用本技术领域中公知的任意的控制手段，例如可以是计算机。
本发明的细胞培养装置还可以具备输出装置，输出装置能够进行下述中的至少一个：显示所测定的信息、基于所测定的信息发出警报、向外部装置输出、或者对控制部或输入部进行反馈。在此，警报包括通知异常的警报和通知正常的警报这两者。
上述说明的功能可以由硬件构成，也可以由软件构成。
此外，本发明的另一方式涉及一种细胞状态分析装置，其从培养球状体的细胞培养装置(细胞培养部)接收数据，对在细胞培养装置中培养的球状体内部的细胞状态进行分析。细胞培养装置与细胞状态分析装置可以一体化，或者也可以配置于通过网络连接而地理上分开的位置。
在该方式中，细胞培养装置具备光源、对培养面上的细胞照射来自光源的光的聚光光学系统、检测来自细胞的光的检测光学系统、检测来自检测光学系统的光的检测器、以及输出装置。细胞状态分析装置所具备的处理装置具有下述功能：基于从细胞培养装置的输出装置发送来的来自检测器的信号，获得与培养面垂直方向的距离不同的多个截面图像的功能；和根据多个截面图像，测量球状体的三维形状和按照三维形状对亮度进行了校正的断层图像，基于图像的亮度，对球状体内部的细胞状态(例如有无细胞死亡)进行分析的功能。上述测定的信息可以显示在显示装置上。另外，能够作为数据存储在存储装置中。另外，能够作为数据经由网络向外部的装置发送。或者，也可以构成为根据所测定的信息控制细胞培养装置的至少一部分。
以下，基于实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
本实施例中，以自动细胞培养装置中的球状体的非侵袭三维测量和球状体内部的细胞状态的分析为例进行说明。
图3表示组装有OCT(光学相干断层成像仪)的自动细胞培养装置的一例。图3的自动细胞培养装置301具有进行细胞培养的恒温室302。恒温室内设置有拍摄部303。恒温室的外部设置有包含分析部304、存储部305的计算机306和输出装置307。输出装置307例如有向操作人员显示各种信息的图像显示装置、通过声音发出警报的警报装置、打印机等。另外，还能够经由网络等向外部的存储装置或信息终端发送数据。或者，也能够经由各种接口向控制部308发送指示。自动细胞培养装置的控制由控制部308实施。细胞培养在设置于恒温室302内部的多个培养容器314中实施。所需要的细胞溶液的供给通过培养基流路312从细胞瓶309供给。培养基的供给通过培养基流路312从培养基瓶310向培养容器314实施。培养中使用的不需要的培养基通过废液流路313向废液瓶311废弃。
球状体的品质评价可通过使用了从培养容器的外部拍摄球状体的拍摄部303的测定来实施。本实施例中，拍摄部303使用OCT(光学相干断层成像仪)。进行非侵袭三维测量的部分的整体构成具有：拍摄球状体的拍摄部303、对所拍摄的图像进行分析来分析球状体内部的细胞状态的分析部304、预先存储有分析所需的信息的存储部305、显示分析结果的输出装置(在此设想为图像监视器)307。图3的自动细胞培养装置还可以具备包含氨基酸分析装置的氨基酸分析单元(未图示)。在培养基更换时成为废液的旧培养基从培养容器314通过废液流路313向废液瓶311废弃，但培养上清液的一部分能够通过从废液流路313分支的培养上清液分析去向流路(未图示)被运送到氨基酸分析单元，对上清液中的氨基酸浓度进行分析。
细胞状态由分析部304分析，作为培养结束时机的确定、培养组织的品质评价而向自动细胞培养装置的控制部308反馈。或者，细胞状态显示于输出装置307，操作人员判定细胞状态，进行培养结束时机的确定、培养组织的品质评价。另外，操作人员为了根据需要操作自动细胞培养装置的控制部308、计算机306，向输入部(未图示)进行输入。输入部也可以构成为能够经由网络输入来自远程地的指示。本实施例中，作为分析部304的实现方法，构成为在通用的计算机306上运行的软件，但也可以由硬件构成。
另外，图3的实施例中，示出了计算机306、控制部308等靠近自动细胞培养装置301地配置或一体化的例子。但是，计算机306、控制部308等的位置并不限定于此。在有线或无线的网络发达的现在，将它们经由输出装置307通过网络连接，配置在远程位置也在本发明的公开范围内。
以下列举具体例对本发明的特征进行进一步的说明。其中，实施例中，使用OCT作为拍摄部303。
图4表示作为拍摄部303的OCT(光学相干断层成像仪)的基本构成例。OCT由光源401、分束器402、物镜403、参照光反射镜404、检测器405构成。将来自光源401的光分支为信号光407和参照光408，向上述细胞406照射信号光407。检测器405检测通过将从细胞反射的信号光与参照光进行合波而生成的干涉光409。由此，细胞的结构被可视化。图4中生成一个干涉光，但也可以构成为具备生成相位相互不同的三个以上的干涉光的干涉光学系统。
图1表示利用OCT的球状体的测定以及球状体内部的细胞状态的分析流程概略图。图5表示球状体的测定图像。图5的左侧为球状体的立体图的示意图。在此，如图所示，定义xyz轴。图5的右侧是在从OCT获得的不同z位置处的xy图像的示意图。图6表示与图1(S106)相关的球状体的三维形状与光行进的距离的关系的示意图。图7表示球状体内部有无细胞死亡和OCT图像的示意图。图8表示与图1(S105)和(S107)相关的校正前后的OCT图像的示意图。
以图1的测量和分析流程为中心进行说明。首先，在设置于恒温室302内部的OCT拍摄部303中，拍摄球状体的XZ断层图像(S101)。XYZ的方向如图5所示，XY平面是与培养面平行的面，Z轴是与培养面垂直的轴。由于通过XZ断层图像判明球状体的Z厚度(Z＝0至N)，因此将其作为XY图像获得范围(S102)。接着，在该XY视野中从Z＝0到N连续拍摄XY图像(S103～S104)。此时Z＝0至N的拍摄间隔越小，越能够进行高精度的分析，但可以任意设定。作为优选的一例，设定比所设想的细胞的Z方向的大小小的间隔。在所获得的各XY图像中，球状体的活细胞被明亮地拍摄，如果在球状体的一部分有细胞死亡的区域，则该区域被拍摄得较暗。但是，球状体为接近球形的形状，表面下部的细胞不一定附着于培养底面，因此即使在同一Z位置的XY图像内，不校正各地点的亮度就无法进行比较。例如，如图6所示，即使是相同球状体A的Z＝M的测定，在球状体中心部，与端部相比，光进入球状体内部的距离大，因此信号光衰减，外观上的亮度变小。另外，如图6所示，在球状体的形状如B那样偏离球形的情况下，在球状体的端部也存在如中心部那样、光进入球状体内部的距离大、外观上的亮度变小的情况。因此，通过后述的校正，能够首次判别图7所示的球状体内部的细胞死亡。
在实际的XY图像中，如果针对每个像素精细地观察，则即使在较窄的区域内也存在亮度的不均，因此按多个像素的每一像素将图像分割为格子状来求出每格的平均亮度(图1的(S105)、图8的(S801)-(S802))。另外，使用所有的XY图像来检测球状体的外周(边缘)(图1的(S105))。接着，根据XY图像或XZ像计算各格中的光在球状体内部行进的距离(距球状体下侧的外周的Z距离)(S106，图6)。接着，使用预先存储在存储部305中的作为训练数据(trainning data)之一的球状体内的光的衰减相关数据，针对每格计算校正了光的衰减量的亮度(S107、S803)。在此使用的训练数据认为根据构成球状体的细胞的组成而发生变化，因此优选对能够成为测定对象的每个细胞预先进行测定。进而，与校正后的各格的亮度和预先存储在存储部305中的训练数据之一即细胞死亡和校正后的亮度的相关数据进行比较，判定各格是否发生了细胞死亡。如果亮度为阈值以下，则判断为细胞死亡，除此之外判断为正常的活细胞。这里使用的训练数据优选与能够判断组织染色等其他的细胞死亡的方法组合地预先测定并确定利用反射光的亮度测定与细胞死亡的相关性。最终的分析结果即球状体的三维形状、大小以及球状体内部有无细胞死亡、细胞死亡区域的体积等由作为输出装置307的显示部显示。如果实时地显示结果，则能够监视细胞的状况。另外，通过经由网络向外部装置发送，也能够进行远程操作。或者，在分析结果满足特定条件的情况下，还能够通过声音或影像等发出警报。
如上所述，在本发明的实施例中，通过对球状体的三维形状和按照三维形状、根据光在样品内行进的距离而对各地点的亮度进行了校正的断层图像进行分析，能够判别球状体内部的细胞死亡部分。另外，通过将球状体的三维形状、体积、或者球状体内部有无细胞死亡区域及其体积显示在显示装置上，或者存储在存储装置中，能够向操作人员通知与球状体的细胞状态有关的信息。
本发明的实施例中说明的自动细胞培养装置以非侵袭方式获得细胞的三维信息，并基于此自动地将警告或指示反馈给装置或操作人员。
本实施例中，也可以通过硬件实现与由软件构成的功能相同的功能。这样的方式也包含在本发明的范围内。
实施例2
本实施例中，说明自动细胞培养装置中的球状体的非侵袭三维测量和球状体内部的细胞状态的分析的另一例。
装置构成的例子与实施例1相同，例如能够形成为具备图3以及图4所示的构成的装置。
图9表示利用OCT(光学相干断层成像仪)的球状体的测定以及球状体内部的细胞状态的分析流程概略图。图5表示球状体的测定示意图。图5的左侧是球状体的立体图的示意图。在此，如图所示地定义xyz轴。右侧是在从OCT获得的不同z位置处的xy图像的示意图。图8表示与图9(S105)相关的OCT图像的示意图。
以图9的测定和分析流程为中心进行说明。首先，在设置于恒温室302内部的OCT拍摄部303中，拍摄球状体的XZ断层图像(S101)。XYZ的方向如图5所示，XY平面是与培养面平行的面，Z轴是与培养面垂直的轴。由于通过XZ断层图像判明球状体的Z厚度(Z＝0至N)，因此将其作为XY图像获得范围(S102)。接着，在该XY视野中从Z＝0到N连续拍摄XY图像(S103～S104)。此时Z＝0至N的拍摄间隔越小，越能够进行高精度的分析，但可以任意设定。作为优选的一例，设定比所设想的细胞的Z方向的大小小的间隔。在所获得的各XY图像中，球状体的活细胞被明亮地拍摄，如果在球状体的一部分有细胞死亡的区域，则该区域被拍摄得较暗。在实际的XY图像中，如果针对每个像素精细地观察，则即使在较窄的区域内也存在亮度的不均，因此针对多个像素的每个像素将图像分割为格子状来求出每格的平均亮度(图9的(S105)、图8的(S801)-(S802))。另外，使用所有的XY图像来检测球状体的外周(边缘)(图9的(S105))。在球状体增殖到某个程度的大小以上的情况下等，球状体的大小不会大幅变化，能够通过与上次测定时的数据的比较来评价球状体内部的坏死是否进行。在这样的情况下，不一定需要根据光在实施例1所示的细胞内行进的距离来校正OCT图像的方法。因此，根据球状体的三维形状计算出体积(S901)，当其体积与上次测定时相比没有变化时，能够通过下述方法判定球状体的坏死状态。球状体在培养容器内大幅移动的情况少，但为了在相同位置之间准确地比较亮度，使用球状体的3D图像，实施对准上次测定时的球状体的位置的校正(S902)。因此，将球状体的相同位置的亮度与上次测定进行比较，在亮度经时地下降时判定坏死(S903)。
作为最终的分析结果的球状体的三维形状、大小以及球状体内部有无细胞死亡、细胞死亡区域的体积等由作为输出装置307的显示部显示。如果实时地显示结果，则能够监视细胞的状况。另外，通过经由网络向外部装置发送，还能够进行远程操作。或者，在分析结果满足特定条件的情况下，还能够通过声音或影像等发出警报。
如上所述，本发明的实施例中，通过将球状体的测定结果与以前得到的同一球状体的测定结果进行比较，比较相对亮度，能够判别球状体内部的细胞死亡部分。另外，通过将球状体的三维形状、体积、并且球状体内部有无细胞死亡区域及其体积显示在显示装置上，或者存储在存储装置中，能够向操作人员通知与球状体的细胞状态有关的信息。
本发明的实施例中说明的自动细胞培养装置能够以非侵袭方式获得细胞的三维信息，并基于此自动地将警告或指示反馈给装置或操作人员。
本实施例中，还可以通过硬件实现与由软件构成的功能相同的功能。这样的方式也包含在本发明的范围内。
本发明并不限于上述实施方式，包括各种变形例。例如，能够将某实施例的构成的一部分替换为其他实施例的构成，另外，还能够在某实施例的构成中添加其他实施例的构成。另外，对于各实施例的构成的一部分，能够进行其他构成的追加、删除、替换。
符号说明
201：干细胞
202：培养面
301：自动细胞培养装置
302：恒温室
303：拍摄部
304：分析部
305：存储部
306：计算机
307：输出装置
308：控制部
309：细胞瓶
310：培养基瓶
311：废液瓶
312：培养基流路
313：废液流路
314：培养容器
401：光源
402：光束器
403：物镜
404：参考光反射镜
405：检测系统
406：球状体
407：信号光
408：参照光
409：干渉光
601：光源
602：物镜
603：光
604：测定地点的Z位置
605：光在球状体内部行进的距离
701：正常的活细胞的区域
702：细胞死亡的区域。

Claims (10)

1.一种细胞分析方法，其是对球状体内部的细胞死亡状态进行分析的细胞分析方法，其特征在于，其包含：
对球状体照射光的工序，
获得距光照位置的距离不同的多个球状体截面图像的工序，
将所述图像按所述图像中的多个像素的每一像素分割成格子状，求出每格的平均亮度的工序，
测定所述球状体的三维形状的工序，以及
考虑信号强度衰减以校正所述图像的每格的平均亮度的工序，所述信号强度衰减受所述球状体的三维形状和从所述光照位置到测定位置的距离的影响。
2.根据权利要求1所述的细胞分析方法，其中，
所述球状体是细胞聚集在培养面附近而成的球状体，获得距作为所述照射位置的所述培养面的距离不同的多个球状体截面图像。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其还包含：
基于所述球状体的外形XYZ坐标，校正所述球状体位置的工序。
4.根据权利要求1或2所述的细胞分析方法，其特征在于，在进行权利要求1或2所述的工序后，还包含：
向所述球状体照射光的工序，
获得所述球状体的第2截面图像的工序，以及
将所述第2图像的亮度与通过权利要求1或2所述的工序得到的亮度进行比较的工序。
5.一种细胞分析装置，其是对球状体内部的细胞死亡状态进行分析的细胞分析装置，其特征在于，其具备：
光源、对培养面上的细胞照射来自所述光源的光的聚光光学系统、检测来自所述细胞的光的检测光学系统、
对基于从所述检测光学系统获取的信息的图像进行分析的分析部，和
测定所述球状体的三维形状的测定部；
所述分析部具有：
获得距所述培养面的垂直方向的距离不同的多个截面图像的图像获得部，
测量所述多个截面图像的亮度的亮度测量部，
将所述图像按所述图像中的多个像素的每一像素分割成格子状，求出每格的平均亮度的测量部，和
考虑信号强度衰减以校正所述图像的每格的平均亮度，对球状体内部的细胞死亡状态进行分析的状态分析部，所述信号强度衰减受所述球状体的三维形状和从所述光照位置到测定位置的距离的影响。
6.根据权利要求5所述的细胞分析装置，其中，
所述光源、所述聚光光学系统以及所述检测光学系统构成为光学相干断层成像仪即OCT。
7.根据权利要求5或6所述的细胞分析装置，其还具备：
存储与球状体内部的特定细胞死亡状态相关的信号强度衰减数据和/或亮度数据的存储部。
8.一种细胞培养装置，其是具有培养球状体的培养部、使用光对所述球状体内部的细胞死亡状态进行分析的分析部、和控制所述球状体的培养及分析的控制部的细胞培养装置，其中，
(1)所述分析部具备：
光源、对培养面上的细胞照射来自所述光源的光的聚光光学系统、检测来自所述细胞的光的检测光学系统，
对基于从所述检测光学系统获得的信息的图像进行分析的图像分析部，和
测定所述球状体的三维形状的测定部；
所述图像分析部具有：
获得距所述培养面的垂直方向的距离不同的多个截面图像的图像获得部，
测量所述多个截面图像的亮度的亮度测量部，
将所述图像按所述图像中的多个像素的每一像素分割成格子状，求出每格的平均亮度的测量部，和
考虑信号强度衰减以校正所述图像的每格的平均亮度，对球状体内部的细胞死亡状态进行分析的状态分析部，所述信号强度衰减受所述球状体的三维形状和从所述光照位置到测定位置的距离的影响；
(2)所述控制部控制细胞溶液的供给、培养基的供给、培养基的废弃、细胞的培养、光的照射、光的检测、图像的获得、亮度的测量以及细胞死亡状态的分析中的至少一个。
9.根据权利要求8所述的细胞培养装置，其中，所述培养部具备：
恒温室，
配置在所述恒温室内、培养球状体的培养容器，
与所述培养容器结合、供给细胞溶液的细胞瓶，
与上述培养容器结合、供给培养基的培养基瓶，和
与上述培养容器结合、收纳从所述培养容器废弃的培养基的废液瓶。
10.根据权利要求8或9所述的细胞培养装置，其中，
所述控制部基于来自所述状态分析部的输出，控制所述培养部中的球状体的培养。
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