KR101822930B1 - 순환 표적물질 영상화 장치 및 영상 처리 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈류 모방 순환 시스템과 공초점 현미경을 결합하여 순환하는 세포 표적물질의 영상화 장치를 구축하고, 표적물질이 순환 세포를 표적하는 양상을 실시간으로 영상화 및 정량화한다. 이를 통해 표적물질이 순환 세포를 표적하는 양상을 단일세포 분해능 수준의 영상화를 통해 분석하여 실제 혈류 내와 유사한 상황에서 분석할 수 있다.

Description

순환 표적물질 영상화 장치 및 영상 처리 방법{Apparatus and method of processing image of targeting material for circulating cells}
본 발명은 순환하는 표적물질을 영상화하여 성능을 평가하기 위한 영상화 장치 및 영상 처리 방법에 관한 것이다.
순환종양세포(CTCs: Circulating tumor cells)는 암환자의 말초혈액 내에서 순환하는 암세포로 정의되며, 원 발병소 또는 전이 병소로부터 떨어져 나온 세포이다. 혈중 CTC를 검출함으로써, 암의 조기진단 및 효과적인 치료를 가능하게 할 수 있을 것으로 기대된다.
현재, 혈액을 추출하여 혈류 내에 소량 존재하는 순환종양세포와 순환 세포를 감지하기 위한 방법이 사용되고 있다. 하지만 표적물질이 순환세포에 표적될 때는 혈액을 채취하여 체외에서 이를 검사하기 때문에, 혈류 내를 순환하는 실제 상황과는 검사 시의 상황이 많은 차이가 있다.
형광 나노입자를 사용하여 혈중 순환종양세포를 표적하는 양상을 영상화하는 기술인 바이오 이미징 기술이 연구되고 있다. 형광영상은 가시광선 범위에서 형광을 획득하여 영상화하는 것이고 비침습적인 방법으로 생체 내외의 세포의 변화를 실시간으로 관찰할 수 있어 최근 형광기술을 인체에 적용하여 의료기기의 개발에 활용하려는 연구가 진행되고 있다.
공초점(confocal) 현미경은 이차원 영상을 삼차원 또는 입체영상으로 재구축할 수 있는 장치이다. 이를 위한 스캐닝 방법은 크게 시편 또는 광학계 헤드를 직접 움직이는 스테이지 스캔(stage scan) 방식과, 시스템 내부에서 빛의 경로를 조절하는 기구장치를 이용하여 고정된 시편 위로 초점의 위치를 이동시키는 빔 스캐닝(beam scanning) 방식으로 나눌 수 있다. 일반적으로 스테이지 스캔 방식의 시스템은 광학계 구조가 간단하다는 장점이 있지만 측정 속도가 느리기 때문에, 광학계 구조가 복잡하더라도 측정 속도가 빠른 빔 스캐닝 방식이 주로 사용된다.
한국 공개특허번호 제10-2015-0008842호
본 발명의 목적은 혈류 모방 순환 시스템 내에서 살아있는 세포를 영상화하고 순환 세포를 표적하는 표적물질을 주입했을 때 세포를 표적하는 양상을 정량화하여 표적물질의 표적 능력을 평가함에 응용 또는 순환 세포의 특성 분석에 응용하는 것이다.
본 발명의 실시 예를 따르는 순환 표적물질 영상화 장치는 혈류 모방 순환 시스템, 상기 시스템을 순환하는 세포 표적물질을 검출하여 영상화하는 영상화부, 및 상기 영상화를 기반으로 표적물질의 성능을 정량화하는 분석부를 포함한다.
상기 분석부에서 표적물질의 성능을 정량화하는 방법은 상기 영상화부로부터 얻은 영상을 단일 프레임의 이미지로 변경하여 상기 단일 프레임으로부터 특정신호를 분리하여 단일 세포 내외의 제 1 신호와 제 2 신호를 선별할 수 있다.
상기 분석부에서 표적물질의 성능을 정량화하는 방법은 상기 선별된 단일 세포 내외의 제 1 신호와 제 2 신호에 제 1 신호 틀과 제 2 신호 틀을 각각 적용하고 상기 제 1 신호 틀과 제 2 신호 틀을 사용하여 단일 세포 내의 제 1 신호와 제 2 신호를 각각 분석할 수 있다.
상기 제 1 신호 틀은 단일 세포 내의 제 1 신호만을 선별할 수 있다.
상기 제 2 신호 틀은 단일 세포 내의 제 2 신호만을 선별할 수 있다.
상기 현미경은 공초점 현미경일 수 있다.
상기 공초점 현미경은 레이저 광원, 상기 레이저 광원을 반사시켜 X-라인 스캐닝을 수행하는 회전다각거울, 상기 레이저 광원을 반사시켜 Y-라인 스캐닝을 수행하는 갈바노 거울, 및 상기 표적물질에서 방출된 형광 신호를 이용하여 3차원 영상을 검출하는 검출부를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시 예를 따르는 순환 표적물질 영상 처리 방법은 세포를 순환시키는 단계 (단계 1); 상기 단계 1의 세포에 표적물질을 주입하는 단계 (단계 2); 상기 단계 2의 표적물질을 검출하여 영상화하는 단계 (단계 3); 및 상기 단계 3의 영상화를 기반으로 표적물질의 성능을 정량화하는 단계 (단계 4); 를 포함한다.
상기 단계 4의 정량화는 상기 단계3에서 영상화된 영상을 단일 프레임의 이미지로 변경하는 단계 (단계 a); 및 상기 단일 프레임으로부터 특정신호를 분리하여 단일 세포 내외의 제 1 신호와 제 2 신호를 선별하는 단계(단계 b);를 포함할 수 있다.
상기 단계 4의 정량화는 상기 단계 b의 선별된 단일 세포 내외의 제 1 신호와 제 2 신호에 제 1 신호 틀과 제 2 신호 틀을 각각 적용하는 단계(단계 c); 및 상기 제 1 신호 틀과 제 2 신호 틀을 사용하여 단일 세포 내의 제 1 신호와 제 2 신호를 각각 분석하는 단계(단계 d); 를 더 포함할 수 있다.
상기 단계 3의 영상화는 현미경을 사용할 수 있다.
상기 단계 3의 표적물질은 단일 세포 내에서의 표적물질 또는 단일 세포 외에서의 표적물질일 수 있다.
본 발명의 실시 예를 따르는 영상화 장치 및 영상 처리 방법은 생체의 혈류 시스템을 모방하는 체외 순환 시스템을 구축하고, 공초점 현미경을 이용하여 이를 순환하는 세포와 세포를 표적하는 표적물질을 실시간으로 영상화 및 정량화 하는 작업을 수행한다. 이를 통해 표적물질이 순환 세포를 표적하는 양상을 단일 세포 분해능 수준의 영상화를 통해 분석하여 실제 혈류 내의 상황에 가깝게 분석할 수 있다. 단일 세포 분해능 수준으로 순환세포를 고속으로 감지함으로써, 표적물질의 표적 능력 평가 및 표적 양상 분석, 또는 특정 단백질을 발현하는 순환 세포를 정량화하여 이의 특성을 분석할 수 있다.
도 1은 혈류 모방 순환 시스템과 영상화부의 모식도이다.
도 2는 표적 효율을 분석하기 위한 알고리즘의 모식도이다.
도 3은 세포 배양판에 배양된 암세포와 암세포에 표적된 나노 입자를 형광 세기로 시각화한 것이다.
도 4는 플레이트 조건(plate condition)에서 세포 배양판에 배양된 여러 암세포의 상대적 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 쉐이킹 조건(shaking condition)에서 CGKRK가 부착된 형광 자성 나노 입자의 배양 암세포에 대한 상대적 형광 강도를 시간 별로 나타낸 그래프이다.
도 6은 쉐이킹 조건에서 시스테인이 부착된 형광 자성 나노 입자의 배양 암세포에 대한 상대적 형광 강도를 시간 별로 나타낸 그래프이다.

도 7은 표적물질 주입 직후부터 관찰되는 단일 세포 내에서의 표적물질의 신호와 단일 세포 외에서의 표적물질의 신호의 시간 별 그래프이다.
도 8은 표적물질 주입 직후부터 6분까지 단일 세포 내에서의 표적물질의 신호와 단일 세포 외에서의 표적물질의 신호를 나타낸 그래프이다.
도 9는 표적효율이 낮은 단일 세포 이미지이다.
도 10은 표적효율이 높은 단일 세포 이미지이다.
도 11은 시간에 따른 표적효율의 변화 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태들을 다음과 같이 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.　 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 도면에서의 요소들의 형상 및 크기 등은 보다 명확한 설명을 위해 과장될 수 있으며, 도면 상의 동일한 부호로 표시되는 요소는 동일한 요소이다. 또한, 유사한 기능 및 작용을 하는 부분에 대해서는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부호를 사용한다. 덧붙여, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명은 상술한 실시 형태 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니며 첨부된 청구범위에 의해 한정하고자 한다. 따라서, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 형태의 치환, 변형 및 변경이 가능할 것이며, 이 또한 본 발명의 범위에 속한다고 할 것이다.
본 발명의 실시 예를 따르는 영상화 장치는 혈류 모방 순환 시스템; 상기 시스템을 순환하는 세포 표적물질을 검출하여 영상화하는 영상화부; 및 상기 영상화를 기반으로 표적물질의 성능을 정량화하는 분석부를 포함한다.
상기 영상화부는 현미경일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시 예에 있어서, 혈류 모방 순환 시스템과 영상화부를 나타낸 것이다. 실시 예에 있어서, 혈류 모방 순환 시스템은 순환 펌프(110), 순환관(120), 유리관(130)이 포함되어 구성된다.
상기 순환 펌프(110)는 세포를 순환시키는데 사용하는 펌프로서, 단위 시간당 일정한 량의 액체를 송출하기 위해 고안된 펌프로서 가압펌프일 수 있다. 상기 순환 펌프(110)는 연동 펌프일 수 있으나, 본 발명이 여기에 한정하는 것은 아니다. 상기 순환 펌프는 생체 내 심장과 같이 순환 시스템 내에서 순환 세포를 지속적으로 일 방향으로 순환시키는 역할을 한다.
상기 순환관(120)은 대 혈관을 모사한 것일 수 있다. 상기 순환관의 원통형 튜브는 상기 순환 펌프(110)에 끼워져 있고 상기 순환 펌프가 일정한 속도로 순환관에 압력을 가하면 순환관 내 세포가 일정한 유량으로 순환하는 통로 역할을 한다.
상기 순환관의 내경은 1.5 내지 2.5 mm, 바람직하게는 2 mm 일 수 있다. 상기 순환관의 내경이 2 mm일 때 순환관 내 세포는 약 30 mm/s의 유량으로 순환하며 이는 생체 내 정맥의 혈류 속도를 모방한다.
상기 순환관의 재질은 합성고무와 같은 고분자 화합물일 수 있다. 상기 합성고무는 혈관과 유사한 재질이고 혈류 내 주입을 모방한 표적물질의 주사에 적합하다.
상기 유리관(130)은 혈관을 모사한 것일 수 있다. 상기 유리관(130)은 순환관(120)의 일부 구간에 구비되어 상기 영상화부(140)을 이용하여 순환세포를 영상화 할 수 있도록 해준다. 상기 유리관의 겉면은 평면일 수 있고, 유리관 내관의 단면적은 90 내지 110 mm2, 바람직하게는 100 mm2 일 수 있다. 상기 유리관의 단면적은 상기 순환관의 단면적보다 약 30배 넓으므로 약 1 mm/s 의 유량으로 순환하며 이는 생체 내 모세혈관의 혈류 속도를 모방한다.
상기 영상화부(140)는 공초점 현미경일 수 있다. 공초점(confocal)은 레이저에서 나오는 광 중에서 초점과 일치하지 않은 광은 제거하고, 초점과 일치하는 광을 통과시킴으로써 초점을 조절할 수 있는 기술이다. 공초점 현미경은 레이저를 광원으로 하며, 레이저에서 나오는 광 중에서 초점과 일치하는 광만을 통과시키며, 초점과 일치하는 광에 상응하는 광 신호를 이용하여 영상을 생성하는 장치이다.
일 실시 예에 있어서, 영상화부는 레이저 광원, 상기 레이저 광원을 반사시켜 X-라인 스캐닝을 수행하는 회전다각거울, 상기 레이저 광원을 반사시켜 Y-라인 스캐닝을 수행하는 갈바노 거울, 및 상기 표적물질에서 방출된 형광 신호를 이용하여 3차원 영상을 검출하는 검출부를 포함하는 공초점 현미경일 수 있다.
상기 레이저 광원은 유리관(130)에 조사되는 광을 제공한다. 일 실시 예에 있어서, 상기 레이저 광원은 세 가지 가시광 대역 488 nm, 561 nm, 640 nm의 연속파 레이저 광원을 여기 광원으로 사용할 수 있다. 상기 광원으로부터 여기된 세 가지의 형광신호는 분광기로 전달된다. 상기 세 가지 형광신호에 대한 형광물질을 이용하여 동시에 세 가지 형광영역의 영상화가 가능하다.
상기 분광기는 색 선별 광원분광기 (DBS; dichroic beam splitter)일 수 있다. 상기 색 선별 광원분광기는 광원으로부터 전달된 광을 세 가지 평행광으로 변환하여 유리관에 구비된 대물렌즈로 전달하고, 상기 대물렌즈는 광을 굴절하여 초점평면을 이루며 이러한 광은 순환 세포로 전달될 수 있다.
여기서 초점평면이란, 렌즈를 통과한 광은 렌즈로부터 일정거리 떨어진 위치에 초점을 형성하게 되는데 이 초점을 포함하여 렌즈의 길이방향과 평행한 방향으로 그어진 선들이 모여서 이른 면을 초점평면이라 한다. 초점 평면의 위치를 옮겨 높이 좌표가 다른 평면에서의 2차원 영상을 만들어 이를 적층시키면 3차원 영상이 얻어진다.
상기 평행광은 회전다각거울(polygonal rotation mirror) 및 갈바노 거울에 반사되어 진행경로가 변경된다. 상기 변경된 평행광의 중심이 대물렌즈의 중심에 맺히게 되고, 평행광은 대물렌즈를 통과하여 순환 세포에 입사되었다가 방출될 수 있다. 여기서 방출된 신호는 순환 세포로 입사된 평행광과 같은 경로를 반대 방향으로 진행하여 검출부로 이동할 수 있다. 상기 회전다각거울에 의해 반사된 평행광은 X-라인 직선광원을 반복적으로 생성한다. X-라인 스캐닝이 수행되면 상기 갈바노 거울의 각도가 순차적으로 변함에 따라 반사된 평행광이 Y-라인 스캐닝을 수행한다. 상기 방법으로 2차원 래스터 패턴이 형성된다.
상기 회전다각거울은 특별히 한정되지 않지만, 고해상도(512 픽셀 x 512 픽셀)의 초고속(초당 110장 이상) 영상화를 위해서, 36각과 72각의 다각거울일 수 있다. 상기 회전다각거울의 회전 속도는 45,000 내지 55,000 rpm, 바람직하게는 55,000 rpm 일 수 있다. 상기 고해상도, 초고속 영상화를 수행하기 위해서 X-라인 스캐닝 속도를 최대화 할 수 있는 55,000 rpm 회전속도를 갖는 회전다각거울이 바람직하다.
상기 갈바노 거울(galvanometer mirror)은 레이저 광원 특성의 변형 없이 레이저 경로를 바꾸는 장치로서, 회전하는 축에 거울을 붙인 것이다. 비교적 빠른 스캔 속도를 얻을 수 있으며 광원에 의한 시편 손상을 줄일 수 있다.
상기 분광기를 통해 변환된 세 가지 평행광은 각 영역 별로 설치된 광전자증배관(PMT; photomultiplier tube)으로 감지될 수 있다. 상기 광전자증배관에서 측정한 각 형광 신호는 3-채널 프레임 그래버(Frame Grabber)를 통해 디지털화되고 세 형광영상 이미지를 초당 30 내지 110장 획득할 수 있고 3차원 영상을 획득할 수 있다.
일 실시 예에 있어서, 40배 대물렌즈 (LUCPlanFL 40X, 0.60NA, 올림푸스 제) 와 20배 대물렌즈 (LUCPlanFL 20X, 0.45NA, 올림푸스 제)를 사용하였을 때 초점에서 250 x 250 μm2 와 500 x 500 μm2 의 관측 시야를 가질 수 있다.
일 실시 예에 있어서, 상기 영상화부에 의한 영상화는 암실 분위기 하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시 예에 있어서, 상기 분석부는 상기 영상화부로부터 얻은 영상을 단일 프레임의 이미지로 변경하여 상기 단일 프레임으로부터 특정신호를 분리하여 단일 세포 내외의 제 1 신호와 제 2 신호를 선별할 수 있다. 상기 특정신호는 상기 순환 세포에 발현되어 형광을 방출하는 형광물질의 신호를 나타낸다. 표적물질의 표적 정도를 정량화하기 위한 알고리즘에서 상기 특정신호로부터 세포에 표적된 물질만을 분석할 수 있다. 본 발명의 일 실시 예에 있어서, 형광물질은 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)이 사용될 수 있다.
상기 분석부는 상기 분리된 특정신호로부터 선별된 단일세포 내외의 제 1 신호 및 제 2 신호에 제 1 신호 틀과 제 2 신호 틀을 각각 적용하여 단일 세포 내의 제 1 신호와 제 2 신호를 각각 분석할 수 있다. 본 발명의 일 실시 예에 있어서, 단일세포 내외의 제 1 신호는 형광 단백질이 발현된 순환 세포를 나타낸다. 단일세포 내외의 제 2 신호는 형광 표적 물질을 나타내며 단일세포 내외의 제 1 신호와 구별하여 표적 효율을 분석하기 위한 것이다. 단일세포 내외의 제 1 신호와 제 2 신호는 시각적으로 구별되며 형광 색의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 일 실시 예에 있어서, 제 1 신호 틀은 단일세포 내외의 제 1 신호를 기반으로 만들어져 세포를 선별하고 단일 세포 내의 제 1 신호 크기 등을 선별하여 분석하는 데 사용된다. 제 2 신호 틀은 단일세포 내외의 제 2 신호를 기반으로 만들어져 세포 표면과 세포 내부에 표적된 표적물질의 제 2 신호의 크기, 세포 외 지역의 제 2 신호의 크기 등을 선별하여 분석하는 데 사용된다.
본 발명의 실시 예를 따르는 순환하는 세포 표적물질의 성능을 평가하기 위한 영상 처리 방법은, 세포를 순환시키는 단계 (단계 1); 상기 단계 1의 세포에 표적물질을 주입하는 단계 (단계 2); 상기 단계 2의 표적물질을 검출하여 영상화하는 단계 (단계 3); 및 상기 단계 3의 영상화를 기반으로 표적물질의 성능을 정량화하는 단계 (단계 4); 를 포함한다.
이하, 본 발명의 실시 예를 따르는 순환하는 세포 표적물질의 성능을 평가하기 위한 영상 처리 방법에 대하여 각 단계별로 상세히 설명한다.
먼저, 일 실시 예에 있어서, 상기 단계 1의 세포는 상기 혈류 모방 순환 시스템을 순환하는 세포일 수 있다. 상기 세포는 혈중암세포 또는 특정 단백질이 발현하는 세포일 수 있다. 상
상기 단계 3의 영상화는 현미경을 사용할 수 있다. 바람직하게는 공초점 현미경을 사용할 수 있다.
상기 단계 2의 표적물질은 주사기를 통해 주입된 것일 수 있다. 표적물질의 주입량은 일정하게 조절될 수 있다. 상기 표적물질은 형광 나노 입자일 수 있다. 일 실시 예에 있어서, 나노 입자에 부착된 형광 물질은 적색을 띠는 Alexa 555 (알렉사플루오르® 555 카복실산, 숙신 에스테르, 인비트로젠 제, A20009) 일 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 않는다. 음성 대조군으로 시스테인이 사용될 수 있다.
상기 단계 3의 표적물질은 단일 세포 내에서의 표적물질 또는 단일 세포 외에서의 표적물질일 수 있다. 단일 세포 내에서의 표적물질은 세포에 결합한 표적물질을 의미하며, 단일 세포 외에서의 표적물질은 세포에 결합하지 않은 표적물질을 의미한다.
본 발명에서는 표적물질의 표적 효율을 영상기반으로 정량화할 수 있도록 하는 알고리즘을 함께 개발하였다. 표적물질이 주입 직후부터 도 2과 같이 영상 분석을 수행하였다.
도 2를 참조하면, 상기 단계 3에서 영상화된 영상을 단일 프레임(1)의 이미지로 변경하는 단계(단계 a); 및 상기 단일 프레임(1)으로부터 특정신호(2)를 분리하여 단일 세포 내외의 제 1 신호와 제 2 신호를 선별하는 단계(단계 b);를 포함할 수 있다. 특정신호(2) 기반의 단일 세포로부터 단일 세포의 정보를 분석하기 위해 제 1 신호 틀(5)과 제 2 신호 틀(6)을 추출할 수 있다. 또한, 상기 단계 b의 선별된 단일세포 내외의 제 1 신호(3)와 제 2 신호(4)에 제 1 신호 틀(5)과 제 2 신호 틀(6)을 각각 적용하는 단계(단계 c); 및 상기 제 1 신호 틀(5)과 제 2 신호 틀(6)을 사용하여 단일 세포 내의 제 1 신호(7)와 제 2 신호(8)를 각각 분석하는 단계(단계 d); 를 더 포함할 수 있다. (7)은 세포 표면과 내부에서만 선택적으로 감지되는 제 1 신호의 이미지이고, (8)은 세포표면과 내부에서만 선택적으로 감지되는 제 2 신호 (표적물질의 신호)의 이미지를 나타낸다. (7), (8)에 존재하는 신호의 강도를 정량화 함으로써 표적물질의 표적 정도를 분석할 수 있다.
본 발명의 일 실시 예에서 세포의 크기, 세포 내외의 표적물질의 신호의 세기를 측정할 수 있다.
본 발명은 상기 혈류 모방 순환 시스템과 공초점 현미경을 결합하여 순환하는 세포 표적물질의 영상화 장치를 구축하고, 상기 정량화 알고리즘을 통해 상기 영상을 실시간으로 분석하여 표적물질의 효율을 평가하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 하기의 실시 예 및 실험 예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시 예 및 실험 예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시 예 및 실험 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시 예 1>
단계 1 : 세포를 순환시키는 단계
도 1에 나타난 영상화 장치의 순환관에 GFP를 발현시킨 세포를 주입하여 순환시켰다. 세포로는 H460-GFP(인체 폐암 세포), PC9-GFP(인체 폐암 세포), 226BR-GFP(인체 폐암 세포), B16F10-GFP(인체 흑색종 세포)를 약 100,000 cells/ml 사용하였다. 유량은 약 30 mm/s 로 하였다.
단계 2 : 순환 세포에 표적물질을 주입하는 단계
표적물질은 적색 형광을 띠는 자성 나노 입자에 CGKRK를 혼합하여 사용하였으며, 아래의 1) 내지 3)과 같이 표적물질을 합성하였다. 유리관의 반대편에 위치한 튜브 내로 10초 내지 5분 동안 주사기를 사용하여 주입하였다. 주입량은 100 μl 이내로 하였다.
1) 류코노스톡 메센테로이데스에서 얻은 4.5g의 덱스트란 (15K~30K(M.W.), D4626, 씨그마알드리치 제)과 0.63g의 FeCl3*6H2O (염화철 (III) 육수화물, 씨그마알드리치 제, 31232)을 10 ml의 증류수에 녹인 후, 30분 간 냉장 보관한다. 이후에 0.25 g의 FeCl2*4H2O (염화철 (II) 사수화물 (II), 씨그마알드리치 제, 44939)를 섞고 둥근 바닥 플라스크에서 교반한다. 이 후 교반 용액에 1 ml의 30 % 수산화암묘늄 용액 4 (암모니아 용액, 준세이 제, 13370-0301)를 천천히 떨어뜨린다. 10 분 후에 교반 용액을 75~80 물 중탕으로 옮기고 1시간 유지한다. 이후에 원심 여과기(MWCO : 100k)를 통해 남은 덱스트란을 제거하고, 1.5ml의 용액을 2.5 ml의 5 M NaOH와 1 ml의 에피클로로하이드린((+-)-에피클로로하이드린, 플루카 제, 45340-500 ml-F)와 혼합한 후 밤새 교반한 후, 투석을 통해 반응하지 않은 물질들을 제거한다. 이 후 0.45 μm, 0.22 μm, 및 0.1 μm 의 큰 크기의 나노 입자를 분리하고, MACS 분리기 (밀테니바이오텍 제)를 통해 자성이 큰 나노 입자만을 분리한다.
2) 자성 나노 입자에 아민기를 부착하기 위해, 10 mgFe/ml 농도인 2 ml의 자성 나노 입자 당 1 ml의 30% 수산화암모늄 용액을 섞고 밤새 교반한 후, 원심 여과기를 통해 반응하지 않은 수산화암모늄을 제거한다. 이 후 500 μg의 자성 나노 입자당 12 μg의 Alexa 555 (알렉사플루오르® 555 카복실산, 숙신 에스테르, 인비트로젠 제, A20009) 적색 형광물질을 부착하고, 반응하지 않은 형광물질을 원심 여과기를 통해 제거한다.
3) 형광물질이 부착된 자성 나노 입자에 표적물질을 부착하기 위해, 1 mg의 자성 나노 입자 당 0.541 mg의 설포-SMCC를 혼합한 후 30분간 교반하고, 반응하지 않은 물질을 원심 여과기를 통해 제거한다. 이 후에 0.366 mg의 CGKRK 또는 0.01 mg의 시스테인(음성 대조군)을 혼합한 후 30분간 교반하고, 반응하지 않은 물질을 원심 여과기를 통해 제거한다.
단계 3 : 표적물질을 검출하여 영상화 및 정량화하는 단계
표적물질 주입 직후부터 공초점 현미경을 사용하여 영상화한 후 모든 프레임의 이미지를 단일 프레임의 이미지로 변경하였다. 같은 세포가 반복적으로 분석되지 않도록 프레임 간격을 설정하였다. 단일세포에 표적된 표적물질만을 분석하기 위해 단일 프레임의 원본이미지로부터 녹색신호만을 분리하여 단일세포를 선별하였다. 녹색신호 기반의 단일 세포로부터 녹색신호 틀과 적색신호 틀을 추출하였다. 상기 추출한 틀을 사용하여 단일세포 내외의 신호를 각각 분석하였다.
<실험 예 1>
도 7 및 도 8은 표적물질 주입 직후부터 관찰되는 단일 세포 내에서의 표적물질의 신호(Targeted NP_Sinal)와 단일 세포 외에서의 표적물질의 신호 (Free NP_Signal)의 시간 별 그래프이다. 주입 직후부터 다양한 표적 효율을 보이는 다량의 세포를 시간에 따라 연속적으로 관찰할 수 있다. 도 8은 주입 직후부터 6분까지의 그래프로, 표적물질 주입 후 30초부터 순환 세포 외 표적물질의 신호(Free NP_Signal)가 급격하게 증가한 후에 감소하는 양상을 여러 번 반복하는 것을 볼 수 있고, 이러한 신호의 폭은 점차 감소하는 것을 관찰할 수 있다. 이는 표적물질이 순환 시스템 내에서 순환함과 동시에 점차적으로 분산되면서 고르게 퍼지는 현상에 의한 것으로, 이는 생체 내에서 약물이 혈액 순환에 의해서 분산되는 양상과 비슷하다.
<실험 예 2>
도 9 내지 도 11은 표적효율에 따른 단일 세포의 이미지와 시간에 따른 표적효율의 변화 분포 그래프를 나타낸 것이다. 도 9는 표적물질 (나노입자, 적색)에 낮게 표적된 세포이고 도 10은 표적물질에 높게 표적된 세포의 대표 이미지이다. 도 11은 주입 직후부터 5분 간격으로 5분 동안 관찰되는 순환세포의 표적 효율의 분포를 나타내는 그래프이다. 낮게 표적된 세포의 비율 (신호 값 = 20~40)은 시간에 따라서 감소하고, 높게 표적된 세포의 비율 (신호 값 > 40)은 시간에 따라서 증가하는 양상을 확인할 수 있다.
<실험 예 3>
도 3 내지 도 6은 비교 예 1 및 2에 따른 결과를 나타낸다. 도 3은 배양판에 배양된 암세포와 암세포에 표적된 나노 입자를 형광 세기로 시각화한 것이며, 적색신호는 형광 자성 나노 입자의 신호이며, 녹색신호는 암세포에서 발현되는 GFP 신호이다. 도 4 및 도 6을 참조하면, 분석 결과, 플레이트 조건과 쉐이킹 조건에서 동일하게 음성 대조군으로 사용된 시스테인이 부착된 형광 나노 입자(비표적 나노입자)는 표적 효율이 매우 낮았다. 또한 도 4 및 도 5를 참조하면, 플레이트 조건과 쉐이킹 조건에서 동일하게 H460-GFP 세포가 비교한 4가지 세포 중 가장 높은 표적 효율을 가지는 것을 확인하였으며, 시간이 지날수록 표적 효율이 증가하는 것을 볼 수 있다.
<비교 예 1> 플레이트 조건에서 배양 세포의 표적 성능 평가
여러 종류의 암세포들을 이용해 생체외(in vitro) 상황에서 암세포 표적용 형광 자성 나노 입자의 표적 효율을 평가하기 위해 다음과 같이 실험하였다.
단계 1 : 세포를 배양하는 단계
암세포에 형광단백질을 발현시킨 H460-GFP, PC9-GFP, B16F10-GFP, 226BR-GFP를 배양하였다. 실시 예 1과 달리 세포를 순환시키지 않고 24 웰 배양판에 암세포를 각각 10 만 마리 씩 배양하였다.
단계 2 : 배양 세포에 표적물질을 주입하는 단계
상기 실시 예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 표적물질을 합성하였다. 단게 1로부터 20 시간 후에 CGKRK 또는 시스테인(음성 대조군)이 부착된 형광 자성 나노입자를 50 μgFe/ml이 되도록 처리하고 30 분 후에 씻어냈다.
단계 3 : 표적물질을 검출하여 영상화 및 정량화하는 단계
상기 실시 예 1의 단계 3과 동일한 방법으로 표적 효율을 분석하였다.
<비교 예 2> 쉐이킹 조건에서 배양 세포의 표적 성능 평가
단계 1, 2 : 상기 비교 예 2의 단계 1, 2와 동일하게 반응을 수행하였다.
단계 3 : 세포 및 표적물질을 흔들어 혼합하는 단계
10만 마리의 세포 당 30 μgFe/ml 농도로 형광 자성 나노 입자를 처리하고 진탕 배양기(shaking incubator)를 이용하여 격렬히 흔들고, 5분마다 일부를 채집하였다.
단계 4 : 표적물질을 검출하여 영상화 및 정량화하는 단계
상기 비교 예 1의 단계 3과 동일하게 단계를 수행하였다.
100 : 영상화 장치
110 : 순환 펌프
120 : 순환관
130 : 유리관
140 : 영상화부
1 : 단일 프레임
2 : 특정 신호
3 : 단일 세포 내외의 제 1 신호
4 : 단일 세포 내외의 제 2 신호
5 : 제 1 신호 틀
6 : 제 2 신호 틀
7 : 단일 세포 내의 제 1 신호
8 : 단일 세포 내의 제 2 신호

Claims (11)

  1. 검출대상 세포 및 상기 세포를 표적으로 하는 표적물질이 순환하는 혈류 모방 순환 시스템;
    상기 시스템을 순환하는 상기 표적물질을 검출하여 영상화하는 영상화부; 및
    상기 영상화를 기반으로 상기 검출대상 세포와, 상기 검출대상 세포에 대한 상기 표적물질의 결합친화도를 정량화하는 분석부;를 포함하는 순환 표적물질 영상화 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분석부에서 상기 검출대상 세포와, 상기 검출대상 세포에 대한 상기 표적물질의 결합친화도를 정량화하는 방법은 상기 영상화부로부터 얻은 영상을 단일 프레임의 이미지로 변경하여 상기 단일 프레임으로부터 특정신호를 분리하여 검출대상 세포 내외의 제 1 신호와 제 2 신호를 선별하는 것을 특징으로 하는 순환 표적물질 영상화 장치.
  3. 제2항에 있어서, 상기 분석부에서 상기 검출대상 세포와, 상기 검출대상 세포에 대한 상기 표적물질의 결합친화도를 정량화하는 방법은 상기 선별된 검출대상 세포 내외의 제 1 신호와 제 2 신호에 제 1 신호 틀과 제 2 신호 틀을 각각 적용하고 상기 제 1 신호 틀과 제 2 신호 틀을 사용하여 검출대상 세포 내의 제 1 신호와 제 2 신호를 각각 분석하는 것을 특징으로 하는 순환 표적물질 영상화 장치.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제 1 신호 틀은 검출대상 세포 내의 제 1 신호만을 선별하고 상기 제 2 신호 틀은 검출대상 세포 내의 제 2 신호만을 선별하는 것을 특징으로 하는 순환 표적물질 영상화 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 혈류 모방 시스템은 순환 펌프;
    상기 순환 펌프를 통과하는 순환관; 및
    상기 순환관의 일부 구간에 구비된 유리관을 포함하는 것을 특징으로 하는 순환 표적물질 영상화 장치.
  6. 제5항에 있어서, 상기 영상화부는 레이저 광원;
    상기 레이저 광원을 반사시켜 X-라인 스캐닝을 수행하는 회전다각거울;
    상기 레이저 광원을 반사시켜 Y-라인 스캐닝을 수행하는 갈바노 거울; 및
    상기 표적물질에서 방출된 형광신호를 이용하여 3차원 영상을 검출하는 검출부를 포함하는 공초점 현미경인 것을 특징으로 하는 순환 표적물질 영상화 장치.
  7. 혈류 모방 순환 시스템에 검출대상 세포를 순환시키는 단계 (단계 1);
    상기 단계 1의 검출대상 세포에, 상기 세포를 표적으로 하는 표적물질을 주입하는 단계 (단계 2);
    상기 단계 2의 표적물질을 검출하여 영상화하는 단계 (단계 3); 및
    상기 단계 3의 영상화를 기반으로 상기 검출대상 세포와, 상기 검출대상 세포에 대한 상기 표적물질의 결합친화도를 정량화하는 단계 (단계 4); 를 포함하는 순환 표적물질 영상 처리 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단계 4의 정량화는
    상기 단계3에서 영상화된 영상을 단일 프레임의 이미지로 변경하는 단계 (단계 a); 및
    상기 단일 프레임으로부터 특정신호를 분리하여 검출대상 세포 내외의 제 1 신호와 제 2 신호를 선별하는 단계(단계 b);를 포함하는 것을 특징으로 하는 순환 표적물질 영상 처리 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 단계 b의 선별된 검출대상 세포 내외의 제 1 신호 및 제 2 신호에 제 1 신호 틀과 제 2 신호 틀을 각각 적용하는 단계(단계 c); 및
    상기 제 1 신호 틀과 제 2 신호 틀을 사용하여 검출대상 세포 내의 제 1 신호와 제 2 신호를 각각 분석하는 단계(단계 d); 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 순환 표적물질 영상 처리 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 단계 3의 영상화는 현미경을 사용한 것을 특징으로 하는 순환 표적물질 영상 처리 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 단계 3의 표적물질은 검출대상 세포 내에서의 표적물질 또는 검출대상 세포 외에서의 표적물질인 것을 특징으로 하는 순환 표적물질 영상 처리 방법.

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