CN109182608A - 用于检测和/或辅助检测致手足口病毒cva16的引物组、试剂、试剂盒和检测方法 - Google Patents

用于检测和/或辅助检测致手足口病毒cva16的引物组、试剂、试剂盒和检测方法 Download PDF

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CN109182608A CN201811337478.8A CN201811337478A CN109182608A CN 109182608 A CN109182608 A CN 109182608A CN 201811337478 A CN201811337478 A CN 201811337478A CN 109182608 A CN109182608 A CN 109182608A
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姚雪春
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张学峰
张天宇
姚文清
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组、试剂、试剂盒和检测方法。本发明提供一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组，包括如SEQ ID NO.1所示单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示单链DNA分子。通过试验证明：本发明的引物组特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器，实验时间成本，操作的简便度和检测成本明显降低。含有该引物组的试剂或试剂盒可以特异性的检测、鉴定CVA16，且基于该引物组建立的致手足口病毒CVA16的RPA检测方法灵敏、准确、简便和快速，可以实现对致手足口病毒CVA16的筛选及快速诊断。

Description

用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组、试剂、 试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组、试剂、试剂盒和检测方法。
背景技术
手足口病属于全球范围内流行的儿童疾病，主要临床表现为发热，手、足、口腔等主要部位出现疱疹和皮疹，少部分患儿可能会伴随脑水肿、脑炎、急性或者迟缓性麻痹等严重并发症，该病进展迅速，具有较高的病死率。该病的致病原因主要是肠道病毒和其他病原菌的感染。该病由于其传播速度快，易于在小学、幼儿园等人流密集的地方迅速传播。手足口病患儿的预后一般较好，但是中枢神经受损的患儿可能会留下不同程度的后遗症，如果伴随肺出血以及脑水肿等严重并发症是可能会造成患儿的死亡。
柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16，CVA16)与肠道病毒71型(enterovirustype 71，EV71)均为手足口病的主要致病原，EV71所致的手足口病通常症状更典型、并发症的发生率和致死率均较高。然而CVA16是手足口病和疱疹性咽峡炎更主要的致病原，两者交替流行或共同流行时，其感染所致疾病在临床表现往往难以鉴别，这对病例处理及流行防控措施的及时性极为不利。由于不同型病毒所导致的手足口病的治疗方式不同，及时准确区分不同型致病病毒对患儿的治疗尤为重要。
目前对于致手足口病毒的检测有各种不同的方法，均有各自的优缺点，细胞病变效应检测法是最容易、简便的方法，但是实验周期太长且灵敏度低。免疫荧光法和Westernblot法所需时间和检测到的结果基本一致，对于病毒感染量有一定要求，较低的感染量无法检测病毒。随着生物医疗研究发展的不断深入，不同分子生物学方法在手足口的检测中应用越来越多，其特点在于：检测方法简便、耗时短、灵敏性高。在手足口病标本检测中，实时荧光聚合酶链反应(realtime polymerase chain reaction，Real-Time PCR)、一步法RT-PCR、巢式PCR法应用最为普遍，其中实时荧光定量PCR的操作简便，且在手足口病标本检测中的准确率较高，是目前手足口检测中最常用的一种检测方法。然而传统基于PCR的方法需要变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的温度不一样，需要专门的热循环仪来进行，限制了其使用范围。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组，本发明的第二目的在于提供一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的试剂，本发明的第三目的在于提供一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的试剂盒，本发明的第四目的在于提供上述引物组、试剂和试剂盒的应用，本发明的第五目的在于提供一种鉴定致手足口病毒CVA16的检测方法，以缓解现有技术中检测CVA16时，灵敏度低、耗时长、操作繁琐或成本高的技术问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组，所述引物组包括如SEQ ID NO.1所示单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示单链DNA分子。
一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的试剂，所述试剂包括上述引物组。
进一步地，所述试剂包括阳性对照样品；
优选地，所述阳性对照样品为含有SEQ ID NO.3所示序列的DNA质粒；
优选地，所述引物组中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述单链DNA分子的终浓度均独立地为0.38-0.58μmol/L；
优选地，所述阳性对照样品的终浓度为0.1-0.3ng/μL。
一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组或试剂。
进一步地，所述试剂盒包括冻干酶粉管、再水化缓冲液和醋酸镁溶液。
进一步地，所述试剂盒包括反转录用品，用于将待测样品反转录成cDNA。
上述引物组或试剂或试剂盒在如下a)-c)中的应用：
a)制备检测和/或辅助检测是否感染致手足口病毒CVA16的产品；
b)鉴定待测样本中是否含有致手足口病毒CVA16；
c)制备鉴定待测样本中是否含有致手足口病毒CVA16的产品。
一种鉴定致手足口病毒CVA16的检测方法，包括以下步骤：用上述引物组对待测样品进行RPA扩增，检测RPA扩增产物的大小和序列。
进一步地，所述待测样品经过反转录处理。
进一步地，所述RPA扩增的条件包括：35-39℃扩增50-70min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组，包括如SEQ ID NO.1所示单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示单链DNA分子。本发明针对致手足口病毒CVA16的保守序列，设计特异性RPA扩增引物组，并基于该引物组建立了致手足口病毒CVA16的RPA检测方法，可对致手足口病毒CVA16进行定性检测。通过试验证明：本发明的RPA扩增引物组特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器，灵敏度与普通PCR方法相当，但是实验时间成本，操作的简便度和检测成本明显降低。含有该引物组的试剂或试剂盒可以特异性的检测、鉴定CVA16，且基于该引物组建立的致手足口病毒CVA16的RPA检测方法灵敏、准确、简便和快速，可以实现对致手足口病毒CVA16的筛选及快速诊断，不会受到场地和反应设备的限制，做到准确、快速的现场检测，便于在基层医疗检疫机构推广。
附图说明
图1为本发明实施例4中用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的试剂盒的验证结果；
图2为本发明实施例5中用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组特异性检测结果；
图3为本发明实施例6中用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组灵敏度检测结果；
图4为本发明实施例6中普通PCR灵敏度检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组，包括如SEQ ID NO.1所示单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示单链DNA分子。
本发明针对致手足口病毒CVA16的保守序列，设计特异性RPA扩增引物组，通过试验证明：本发明的RPA扩增引物组特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器，灵敏度与普通PCR方法相当，但是实验时间成本，操作的简便度和检测成本明显降低。
一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的试剂，包括上述引物组。该试剂利用该引物组作为鉴定物质，特异性快速检测出CVA16。
在本发明一个优选地实施方式中，试剂包括阳性对照样品。通过阳性对照样品的设置，可以提高检测的准确性，进而提高检测的可信度，有效地对引物组、试剂的质量进行质检。
在本发明一个优选地实施方式中，阳性对照样品为含有SEQ ID NO.3所示序列的DNA质粒。该阳性对照样品根据致手足口病毒CVA16保守序列设计，构建用于检测致手足口病毒CVA16的阳性对照质粒，该质粒包含上述引物组及引物组扩增得到的全部序列。
在本发明一个优选地实施方式中，引物组中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的单链DNA分子的终浓度均独立地为0.38-0.58μmol/L。在该范围内，引物组可以定性检测CVA16，特异性好，效率高，避免了试剂的浪费。引物组中的SEQ ID NO.1的单链DNA分子的终浓度例如可以为但不限于0.38μmol/L、0.43μmol/L、0.48μmol/L、0.53μmol/L或0.58μmol/L；引物组中的SEQ ID NO.2的单链DNA分子的终浓度例如可以为但不限于0.38μmol/L、0.43μmol/L、0.48μmol/L、0.53μmol/L或0.58μmol/L。
在本发明一个优选地实施方式中，阳性对照样品的终浓度为0.1-0.3ng/μL。阳性对照样品的终浓度典型但非限制性的为0.1ng/μL、0.15ng/μL、0.2ng/μL、0.25ng/μL或0.3ng/μL。该浓度下既可以保证阳性对照样品的检出率，又避免了试剂的浪费。
一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的试剂盒，包括上述引物组或试剂。该试剂盒以上述引物组为检测基础，可以快速特异性地检测出CVA16。
在本发明一个优选地实施方式中，试剂盒包括冻干酶粉管、再水化缓冲液和醋酸镁溶液。其中，醋酸镁溶液的浓度优选为280mmol/L，上述冻干酶粉管、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)和醋酸镁溶液均可为市面上的市售成品。
在本发明一个优选地实施方式中，试剂盒包括反转录用品，用于将待测样品反转录成cDNA。病毒的遗传物质为RNA，对待测样品进行检测时，需要将RNA反转录成cDNA，对cDNA进行检测，该试剂盒优选还包括可以将RNA反转录成cDNA的试剂和耗材。
本发明还提供上述引物组或试剂或试剂盒在如下a)-c)中的应用：
a)制备检测和/或辅助检测是否感染致手足口病毒CVA16的产品；
b)鉴定待测样本中是否含有致手足口病毒CVA16；
c)制备鉴定待测样本中是否含有致手足口病毒CVA16的产品。
一种鉴定致手足口病毒CVA16的检测方法，包括以下步骤：用上述引物组对待测样品进行RPA扩增，检测RPA扩增产物的大小和序列。
基于上述引物组建立了致手足口病毒CVA16的RPA检测方法，可对致手足口病毒CVA16进行定性检测。该检测方法灵敏、准确、简便和快速，可以实现对致手足口病毒CVA16的筛选及快速诊断，不会受到场地和反应设备的限制，做到准确、快速的现场检测，便于在基层医疗检疫机构推广。
在本发明的一些实施方式中，待测样品经过反转录处理。
在本发明一个优选地实施方式中，RPA扩增的条件包括：35-39℃扩增50-70min。扩增温度典型但非限制性的为35℃、36℃、37℃、38℃或39℃；扩增时间典型但非限制性的为50min、55min、60min、65min或70min。RPA检测仅需要一对引物即可完成扩增，避免了复杂的引物设计过程，反应温度恒定，在较低的温度下进行，不需要特殊的热循环设备，同时反应时间短，快速出结果。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的致手足口病毒CVA16、致手足口病毒EV71为辽宁省疾病预防控制中心提供，A/B/C型轮状病毒、副溶血弧菌为盘锦市疾病预防控制中心提供。
实施例1引物组、阳性对照样品的设计
针对致手足口病毒CVA16的保守序列，设计检测致手足口病毒CVA16的RPA引物组，产物大小为160bp，针对引物组和扩增片段设计阳性对照样品为含有阳性对照的DNA质粒。具体引物组和阳性对照样品中含有的阳性对照的序列如下：
表1引物组和阳性对照的序列
实施例2用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的试剂盒
该试剂盒包括实施例1中的上游引物RPA-CVA16-F、下游引物RPA-CVA16-R、致手足口病毒CVA16阳性对照样品(0.2ng/μL)、含冻干酶粉管、再水化缓冲液(RehydrationBuffer)、醋酸镁溶液(280mmol/L)。上述含冻干酶粉管、再水化缓冲液(RehydrationBuffer)和醋酸镁溶液(280mmol/L)均来源于RPA扩增试剂盒TwistAmp Basic kits。
实施例3鉴定致手足口病毒CVA16的检测方法
(a)RPA扩增
以待测样品的cDNA为模板，采用实施例2中的试剂盒，利用RPA-CVA16-F和RPA-CVA16-R引物组进行RPA扩增，得到RPA扩增产物。同时设置空白对照(DNA模板为无核酸酶水)。
RPA扩增体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、去离子水12.5μL、上、下游引物各2.4μL(引物的终浓度均为0.48μmol/L)，模板DNA或阳性对照样品1μL，最后再加入醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)。
RPA扩增反应条件：将上述RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴或水浴锅上反应60min，得到RPA扩增产物。
(b)RPA扩增产物的电泳检测
RPA反应结束后，分别向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀，12000rpm离心2min，取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳，采用3％琼脂糖凝胶，120V，50min，凝胶成像系统观察结果。
(c)对RPA扩增产物进行测序。委托Thermo生物公司进行序列测定。
实施例4用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的试剂盒的验证
RNA的提取及cDNA的合成：参照试剂盒操作(RNeasy Mini Kit，货号为74104，QIAGEN)提取致手足口病毒CVA16的RNA。并参照试剂盒(GoScript Reverse TranscriptionSystem，货号为A5001，Promega)的操作，以获得的RNA为模板，反转录获得cDNA。将获得的cDNA保存于-20℃备用。
RPA扩增：以上述获得的cDNA为模板，采用RPA-CVA16-F和RPA-CVA16-R引物进行RPA扩增，得到RPA扩增产物。同时设置空白对照(DNA模板为无核酸酶水)。
RPA扩增体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、去离子水12.5μL、上、下游引物各2.4μL(引物的终浓度均为0.48μmol/L)，模板DNA或阳性对照样品1μL，最后再加入醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)。
RPA扩增反应条件：将上述RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴或水浴锅上反应60min，得到RPA扩增产物。
RPA扩增产物的电泳检测：RPA反应结束后，分别向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀，12000rpm离心2min，取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳，采用3％琼脂糖凝胶，120V，50min，凝胶成像系统观察结果。
结果如图1(M:maker；1：阳性对照样品；2：致手足口病毒CVA16；3：阴性对照)所示：致手足口病毒CVA16的RPA扩增产物含有1个条带，大小为160bp，而阴性对照无条带。
说明本发明提供的用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组、试剂及试剂盒可以有效检测致手足口病毒CVA16。
实施例5用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组特异性检测
采用实施例4中的反转录方法，得到致手足口病毒CVA16、致手足口病毒EV71和A/B/C型轮状病毒的cDNA，采用实施例3中的检测方法RPA扩增检测致手足口病毒CVA16、致手足口病毒EV71、A/B/C型轮状病毒和副溶血弧菌。
结果如图2(M：maker；1：致手足口病毒CVA16；2：致手足口病毒EV71样本；3：A型轮状病毒；4：B型轮状病毒；5：C型轮状病毒；6：副溶血弧菌；7：阴性对照)所示：从图中可以看出，只有致手足口病毒CVA16的扩增产物含有1个大小为160bp的条带，致手足口病毒EV71、A/B/C型轮状病毒、副溶血弧菌均无条带。说明本发明的RPA引物特异性高。
实施例6用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组的灵敏度及与普通PCR灵敏度的对比
将实施例5中的致手足口病毒CVA16的cDNA。并将致手足口病毒CVA16的cDNA进行梯度稀释，分别得到稀释1、10、102、103、104、105倍的致手足口病毒CVA16的cDNA。
RPA扩增：分别以上述得到的稀释1、10、102、103、104、105倍的致手足口病毒CVA16的cDNA为模板，采用RPA-CVA16-F和RPA-CVA16-R引物组按照实施例3中的检测方法进行RPA扩增。
PCR扩增：分别以上述得到的稀释1、10、102、103、104、105倍的致手足口病毒CVA16的cDNA为模板，采用CVA16-F和CVA16-R引物进行PCR扩增。参照2×PrimeSTAR HS(Premix)产品说明书(Takara，R040A)，每个PCR体系50μL，包括2×PrimeSTAR HS(Premix)25μL，上、下游引物各1μL(10μmol/L)，cDNA 2μL，补充水至50μL，PCR扩增条件见表2，PCR扩增引物序列见表3。
表2.PCR扩增条件
表3.PCR扩增引物序列
名称 序列(5’-3’) 序列号
CVA16-F CCACGCAAGAGACAGCTATTG SEQ ID NO.4
CVA16-R CGCATTTCCGCCGCAGCTGAG SEQ ID NO.5
RPA反应结束后，分别向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀，12000rpm离心2min，取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳，采用3％琼脂糖凝胶，120V，50min，凝胶成像系统观察结果。RPA电泳结果如图3所示(M：maker；1-6泳道依次为：模板cDNA分别稀释1、10、102、103、104、105倍)。
PCR反应结束后，取5μL的PCR扩增产物于3％琼脂糖凝胶电泳，120V，50min，在凝胶成像系统上观察结果。PCR电泳结果如图4所示(M：maker；1-6泳道依次为：模板cDNA分别稀释1、10、102、103、104、105倍)。
从图3和图4中可以看出，本发明的RPA方法与普通PCR的灵敏度相当。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 辽宁佰昊生物科技有限公司
<120> 用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组、试剂、试剂盒和检测
方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aattctaata cgactcacta tagggacgca agagacagct attgggaatt tctttagccg 60
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cacctgagca tatcccatca aatcaatgtc ccaat 35
<210> 3
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccacgcaaga gacagctatt gggaatttct ttagccgtgc tggtcttgtc agcatcatca 60
caatgcccac cacgggtaca cagaatacag atggttatgt taattgggac attgatttga 120
tgggatatgc tcagctgcgg cggaaatgcg 150
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccacgcaaga gacagctatt g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgcatttccg ccgcagctga g 21

Claims (10)

1.一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的引物组，其特征在于，所述引物组包括如SEQ ID NO.1所示单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示单链DNA分子。
2.一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括阳性对照样品；
优选地，所述阳性对照样品为含有SEQ ID NO.3所示序列的DNA质粒；
优选地，所述引物组中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述单链DNA分子的终浓度均独立地为0.38-0.58μmol/L；
优选地，所述阳性对照样品的终浓度为0.1-0.3ng/μL。
4.一种用于检测和/或辅助检测致手足口病毒CVA16的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括冻干酶粉管、再水化缓冲液和醋酸镁溶液。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反转录用品，用于将待测样品反转录成cDNA。
7.权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4-6任一项所述的试剂盒在如下a)-c)中的应用：
a)制备检测和/或辅助检测是否感染致手足口病毒CVA16的产品；
b)鉴定待测样本中是否含有致手足口病毒CVA16；
c)制备鉴定待测样本中是否含有致手足口病毒CVA16的产品。
8.一种鉴定致手足口病毒CVA16的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：用权利要求1所述的引物组对待测样品进行RPA扩增，检测RPA扩增产物的大小和序列。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品经过反转录处理。
10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于，所述RPA扩增的条件包括：35-39℃扩增50-70min。
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