安全-稳定的缩醛磷脂和其制剂及认知症的未病状态的判断
方法
【技术领域】
本发明涉及来源于安全的生物系原料的、安全-稳定的缩醛磷脂和其制剂及以认知症发病前的成人(健康者)作为受试者的认知症的未病状态的判断方法。再具体而言,本发明涉及,作为必须的要件,使EPA(二十碳五烯酸:ω-3高度不饱和脂肪酸的一种)的混入缩醛磷脂(以下,有称为“PLs”的情况)的SN-2位最少化(不能检测的水平,实质上是0)而使DHA(二十二碳六烯酸:代表性的ω-3高度不饱和脂肪酸)的结合比例增加而成的安全-稳定的缩醛磷脂的制造,及将所述PLs使用安全的表面活性物质简便地纳米乳化(或者可溶化)而成的安全-稳定的水性制剂(乳液-果冻-粒体-粉体)的制造及通过以这些作为辅助物或食品经口摄取的认知症的未病状态的判断方法、由此的辅助认知症的经长期的抑制-缓和-预防等的新技术-新制品。
【背景技术】
最近,为了通过从患阿尔茨海默病(以下,称为“AD”)之前的状态长期追踪具有家族性阿尔茨海默病的成因基因的可能性高的家族来观察(1)可检测到向AD的变化与否,(2)从呈现症状的多久前,脑部呈现变化,实施了以美国华盛顿大学为中心的DIAN*研究(John·Morris教授统括)。
*Dominantly Inherited Alzheimer Network(基因阿尔茨海默病网络)
根据Morris教授,研究的主要的靶是脑的图像解析和脑脊髓液的成分动态的解明这两个。具体而言,是使用PET(正电子放射断层摄影)进行的作为AD的原因之一的淀粉样β(以下,称为“Aβ”)的脑内蓄积的检查及脑脊髓液中的τ蛋白(以下,称为“τ”)和Aβ的变动的检验。
基于研究对象者的年龄和其亲人患AD的年龄而预测对象者的至发病的年数而开始研究。捕捉以Aβ为首的与发病相关的各种物质、例如τ至其预测年数之间如何改变,将得到的数据与携带者和非携带者比较。结果,明确地确认到自发病大约25年前起携带者的脑中Aβ开始蓄积。但是,发病后描绘曲线而转为减少。τ的情况,得知从发病的15年前起,携带者的τ在脑脊髓液内开始增加。这表示脑内的神经细胞开始死亡。再者,司职记忆的海马从患AD的15年前左右前开始缓慢地变小。如果到发病的10年前,则如记忆力等的衰退慢慢显现。但是,如果忘事变得严重,或忘记亲人的名字,或忘记与人的约会,则日常生活开始出问题是在AD的发病后。
此划时代的DIAN研究的成果是促进以往的关于认知症的医科学的对应战略的拔本的变更,强烈要求真正“范式变动”。即表示,用以往的诊断得知认知症发病时,几乎达到末期症,其根治是令人绝望的。这,相反,可在认知症的压制中早期预防正在成为必须的要件的同时,Aβ和τ的脑内蓄积改之成为关于含阿尔茨海默病的认知症的病状发展的直接的指标,进而,证实在它们的检验中不欠缺低侵袭性并且能可视化的PET的活用。
近年,作为用于神经变性疾病及精神疾病的治疗及/或发病抑制以及预防的有效成分,PLs聚集了关注(例如,[专利文献1])。PLs是生物体内常见型的特殊的磷脂,在SN-1位具有乙烯基醚键,从而,有显示还原性的特异性。此PLs有特异性的同时,占人生物体内全磷脂的18质量%、尤其是,脑内全磷脂的20质量%。从其高的含量即便称为通用性磷脂的1种也不过言。
此PLs在功能上,在生物体内发挥重要的还原作用的点特殊的同时,其存在位置在生物体内定位在重要的膜上,直接防御各种膜的氧化损耗。还得知,PLs,特别,在脑内表达多面的功能,更加聚集关注。然而,PLs如从其分子结构明了,还原性表里相反而容易被氧化(自由基捕获感受性高)并且在酸性下由水和的水解性高(分解为磷脂的溶血体和脂肪族醛)。这被认为阻碍PLs的实用的有机合成的原因之一。
迄今为止、PLs依赖于专门从生物体组织的提取纯化(例如,[专利文献2]、[专利文献3]、[专利文献4]等)。在生物体内,依据其重要性,与由合目的各种结构谋求稳定化一同,由生物合成系、即,来自小泡体的过氧化物酶体的产生时常补给。
上述范式变动往后,PLs所要求的课题是以下的二个。
(I)用于在生物体内PLs的恒定性维持的各种保护修饰作用活动自动地稳定化,但由于在生物体外欠缺这些保护作用,意图的人工的处方乃至制剂化是必须的。使其具现化的PLs的安全且廉价的稳定化技术的开发。
(2)随着年龄的增加而减少的生物体内、尤其是,将脑内的PLs量补至平常并且使其维持的技术的开发。
[安全且廉价的稳定化技术]
鉴于生物体内常见性结构作为细胞膜的最重要的构成成分,其强力的抗氧化作用发生的针对各种细胞膜攻击防御而对于生命的恒定性维持发挥重要的作用,判断为作为细胞膜的疑似化的脂质双膜(脂质体)的平常的形成、换言之,活化其自身乳化性的乳化分散、尤其是,微乳化乃至可溶化型的处方制剂化是适宜的。再者,后文详述在其分子结构中,向与强的抗氧化活性的表达根据的乙烯基醚键邻接的SN-2位导入何的分子种是要紧的,可发挥作为物理的保护作用的“体效应”的分子种、例如可例示DHA。DHA的其他化学效果以其抗氧化性,相辅以该物理的-化学作用而DHA结合型PLs被改性为多重的自身稳定型。
[将脑内的PLs量补至平常并且使其维持的技术]
生物体内PLs的恒定性维持的中核是其生物合成系的过氧化物酶体,此合目的活化是要紧的。形成其多阶段生物合成系的中核的高级醇的合成,如后所述,作为其生物合成限速酶鉴定出Far1(脂肪酰基-CoA还原酶1)。如后所述被报告,DHA磷脂、尤其是,DHA类型PLs使该限速酶表达亢进,由此促进在过氧化物酶体中的Pls产生。
PLs的提取用原料是,家禽、特别产卵(也称为采卵)成鸡是主流(例如,[专利文献1],[专利文献2],[专利文献3],[专利文献4]等)。再者,近年,作为提取用原料,使用水产类来源的海鞘的内脏([专利文献5]等)或养殖扇贝的内脏类(例如,[专利文献6])开始。对于养殖二枚贝而言,无法消去从环境中蓄积的其贝毒、特别镉的隐患(担心安全性)。另一方面,海产性PLs的特征是使DNA和EPA一并结合于SN-2位。EPA结合型PLs由于被血脑屏障阻断而不被摄入到脑内,仅DHA结合型被关注其脑内功能性。对于后述的本发明涉及的[用DHA饲料饲养鸡的方式]而言,由于仅产生选择性高的DHA结合型PLs而高效且安全。
在生物体内的DHA的存在形态(结合分子)是甘油磷脂,特别多为乙醇胺型。DHA几乎全部结合于SN-2位(甘油磷脂中唯一的光学活性碳)。在生物体来源的脂肪酸之中,DHA的结构的特异性最高。DHA的链长长,因此,双键的数是6个而极其多,并且存在多个双烯丙基型结构((-CH=CHCH2-)2CH2-)。所述亚甲基碳的氧化感受性高,成为DHA受易氧化的主要原因。然而,如果使其O/W乳化(水包油型乳化),则如下所述,氧化稳定性的顺列一变为正相反(括弧内的数字表示双键的数)(例如,[非专利文献1])。
*通常的稳定性顺列:
亚油酸(2)>亚麻酸(3)>花生四烯酸(4)>EPA(二十碳五烯酸)(5)>DHA(6)
*O/W乳化型(水包油型)的稳定性顺列:
DHA(6)>EPA(5)>花生四烯酸(4)>亚麻酸(3)>亚油酸(2)
生物体内基本是水系,强烈提示DHA与甘油磷脂(两亲媒性而固有表面活性能)结合,在自身乳化状态下稳定化。再者被认为,在生物体内、特别脑内,DHA被报告为结合于选择性高的PLs的SN-2位(例如,[许文献2]),通过PLs的SN-1位的乙烯基醚键在SN-2位结合了DHA而如以下的1)~2)被双稳定化。即,
(1)DHA的空间立体结构表达立体位阻效果而阻碍活性氧向SN-1位乙烯基醚键的接近。
(2)由DHA结合型PLs的自身乳化功能,分子保持乳化状态的结果,由于在微团的微细胶囊内保持状态下存在,更加抵御氧化及水和。
水产类中的DHA等的多元不饱和脂肪酸(PUFA)在能成为食物链的产业中,吃海中的多含α-亚麻酸的植物性浮游生物的动物浮游生物将其转化到EPA和DHA,小鱼摄取其而开始食物链(例如,非专利文献3)。
得到安全-稳定的PLs的方法被判断为经生物体代谢是最合理的。例如,作为生物体,例示已经有DHA鸡蛋的实用化成效的产卵成鸡、尤其是,产卵鸡的废鸡(因产卵效率的降低而弃杀的产卵鸡)更优选为由强制换羽(用短期断食再生脱落羽毛而提升产卵效率的养鸡法)的产卵废鸡。再者,产卵鸡,顾名思义,是以产卵为目的家禽,与采肉目的肉鸡相同的鸡或不同的家禽。从其鸡蛋的流通的情况,产卵鸡与肉鸡(饲养规模1千万羽~数千万羽)比大致1/10左右的规模一同,消费地的附近周边部而饲养。
通常,此产卵鸡的一羽的年间产卵量是300个以上。日龄在700天左右作为废鸡弃杀,位于养鸡场的附近的半官半民的专用的废鸡处理中心(在全国存在40个位置左右,数百万羽~1千数百万羽的处理能力),处死解体采肉处理。处理制品供于食用,但除一部分,则大部分以肉糜等的形态而作为加工用廉价鸡肉原料流通。产卵鸡处于与批量进口冷冻鸡肉的价格竞争,变得别无他法地进行廉价销售。这支援近年的消费者的安全性志向,作为日产鸡肉附带附加价值,价格处于升高倾向。但是,产卵鸡在经济上无法与采肉由专用种的数千万羽的垂直统合化养鸡较量,并且品质上也无法与仅50日龄的幼鸟(若鸡)的食感食味对抗,产卵养鸡业的事业核算持续低迷状态。
在上述的状况中,需要特别说明的是,产卵废鸡的年间发生平均羽数在9千万羽以上,其养鸡场交货价格,大致,例如,0圆评价而格外价廉。再者,其发生的蓄积度高,并且由于作为活鸡被搬入至废鸡处理中心而可举出得到了与肉鸡同等的高鲜度处理制品。
作为一般论,鸡是人工育种产物,但在基因水平上属于鸟类。再者,具备作为独特的呼吸系统的“气囊式呼吸器官”([非专利文献4]),继承作为在6千5百万年前的巨大陨石的撞击中几乎灭绝的有“气囊式呼吸器官”的恐龙的末裔的性状([非专利文献5])。其特异性,作为气囊式的特长的吸气和排气分别进行的结果,与哺乳类对比氧的提取远远更多,代谢速度显著地提升。这如实呈现的在获得可食部1kg所要求的饲料量上,相对于典型的家畜的猪是9.1kg、肉牛是25.0kg,仅约4.5kg即足。能超过其的欠缺嗜好性和通用性,仅为养殖蟋蟀的2.1kg(FAO 2013公表)。
在鸡的组织或部位及器官中,与哺乳类的家畜不同的独特之处多。例示沙肝、金冠(未成熟卵黄)、皮肤、羽毛、肠、肝脏、鸡骨头(生骨)、鸡冠等(大致,废弃处理)或胸肉(“心肌”样,作为食用肉糜流通)、去腿带骨胸肉(俗称“兜”)、卵黄、骨髓(生鸡骨头中含有)等。向产卵鸡施用加有DHA的饲料数周,则可向上述的组织或部位及器官等转移DHA。作为加到供试饲料的DHA供给源和形态,例示鱼油和将其微细乳化(优选可溶化)而添加到饲料中的。
含有所述DHA转移型PLs等的组织等不使其特异性减耗,留意到在得到目的物的独特的加工工序中处理是重要的。作为其处理生成物,例如,例示保持上述列举的原料特异性构成比的、含有DHA结合型PLs的复合脂质、向其加水溶性低分子量级分(参照下述*)的复合脂质组合物、再者,向这些返回特异性蛋白质级分(参照下述**)的蛋白-脂质的复合化组合物、将这些微细乳化(可溶化)的各种水性制剂。
*---游离氨基酸、鹅肌肽或肌肽(提示认知功能降低抑制效果,例如,[非专利文献19]等的还原性二肽、辅酶Q10(与电子的授受相关)、肉毒碱(有脂质代谢亢进功能性,对于认知症发病的危险因子活性高[高脂血-高血糖]的抑制改善有效,可成为缩醛磷脂的佐剂)。
**---例如,[心肌]样的“胸肉”或骨髓的胶原蛋白、皮肤的胶原蛋白等。
对于上述的各种组合物及水性制剂,对于向含作为世界的通用型难病,作为甚至召开旨在对其根治的峰会([非专利文献6])的世界的紧迫的难题的AD的认知症的攻克投一石的可能性而进行报道。到了最近得知,AD、帕金森病、肌委缩性侧索固化症(以下,有称为“ALS”的情况)、多发性固化症等的慢性神经变性疾病的大部分、或者在脑卒中或头部外伤等的急性脑损伤中也伴随中枢神经(脑、脊髓等)的慢性炎症。
进而,也考虑这些疾病是否由中枢炎症引起而发展的可能性([非专利文献7])。例如,报告了中枢神经系炎症有使患AD等的神经变性疾病,使疾病发展的可能性(例如,[非专利文献7])。另外,报告了对由作为引起炎症的物质的LPS(脂多糖)的腹腔内施用制出的记忆障碍模型大鼠进行解析的结果,在脑部见到Aβ肽的蓄积,由作为抗炎症剂的sulindacsulfide恢复症状,([非专利文献8])。再者得知,中枢神经系炎症在抑郁病或自闭症等的精神疾病或发达障碍、再者在正常的老化过程中也高率确认。
从以上期待,通过预防或治疗中枢神经系炎症及关联的神经细胞死亡([非专利文献9])、神经细胞新生抑制([专利文献7])及Aβ脑内蓄积,可防止由因感染的炎症损伤神经细胞而发生的神经障碍,或进行AD、帕金森病等的神经变性疾病的治疗、或者统合失调症、抑郁病、自闭症等的精神疾病或发达障碍的治疗([非专利文献8])。基于这样的现况、越发越期望可有效并且无副作用地治疗中枢神经系炎症等的方法。
处于这样的状况下,本发明人成功立证由革新的临床试验方法使用鸡胸肉来源的独自的缩醛磷脂组合物,可改善认知症发病前的成人(健康者)的认知功能,从而完成本发明。临床试验的结果披露在以INPROVEMENT IN COGNITIVE FUNCTION BY SUPPLEMENTCONTAINED PLASMALOGEN FOR HEALTHY JAPANESE-A RAMDOMIZED,DOUBLE-BLIDED,PLASEBO-CONTROLED STUDY-的标题,查读附带的“诊疗和新药”第53卷12月号(非专利文献25)。由于此革新的成果,今后变得可解决中枢神经系炎症等的预防及/或缓和用的打开策,结果认为,能辅助中枢神经系炎症等的有效的抑制而益处多多。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:专利第5847086号公报
专利文献2:专利第5062873号公报
专利文献3:专利第5774816号公报
专利文献4:专利第5430566号公报
专利文献5:特开2007-262024号公报
专利文献6:特开2006-121957号公报
专利文献7:专利第6016363号公报
专利文献8:专利第5540209号公报
专利文献9:专利第5360454号公报
专利文献10:专利第5704493号公报
专利文献11:专利第5784486号公报
专利文献12:特开昭60-51104号公报
专利文献13:特开昭57-59629号公报
专利文献14:特开昭60-64919号公报
专利文献15:专利第6025568号公报
专利文献16:专利第4047354号公报[二十二碳六烯酸的生产性高的新颖网粘菌(Labyrinthula)类微生物及其利用](北海道大学等)
专利文献17:特愿2007-148398号公报[由微生物发酵的含有DHA的磷脂的制造方法](北海道大学)
【非专利文献】
非专利文献1:オレオ科学、第6卷、第12号、3-9(2006)
非专利文献2:“脑功能和营养”幸书房(2004)
非专利文献3:“水产食品营养学-基础から人へ-”技报堂出版(2004)
非专利文献4:科学80、No.11、1091-1097(2010)
非专利文献5:读卖新闻2011年2月11日
非专利文献6:“G8认知症峰会”2013年12月11日伦敦;http://dementiachallenge.dh.gov.uk/2013/12/12g8denetia-summit-agreements/)
非专利文献7:J.Neuroinflammation,9:197,2012
非专利文献8:Ann.N.Y.Acad.Sci.,(2012)1262:85-92
非专利文献9:PLoSONE.8:e83508.doi:10.1371(2013)
非专利文献10:J.Mol.Neurosci.,16,263-272(2001))
非专利文献11:BrainRes.,698(1995)223-226
非专利文献12:J.NeuropatholExperi Neurol-Jul 1,1999
非专利文献13:J.LipidRes.,48(2007)
非专利文献14:DementGeriat Cogn Disord Extra 2,298-303(2012)
非专利文献15:Lipid inHealth and Disease,2012.11:161
非专利文献16:缩醛磷脂研究会主催“缩醛磷脂的基础和临床”~对于阿尔茨海默病的有效性~座谈会配布资料;2014/02/04九州大学医学部百年讲堂
非专利文献17:NeuroscienceLetters,556(2013)104-108)
非专利文献18:日本统合医疗学会九州支部大会ヨーガ部会设立记念发表会;於九州大学医院(2010/12/4)
非专利文献19:JAlzheimer’s Disease,33,983-998(2013)
非专利文献20:NHKSpecial取材班著“治疗阿尔茨海默病!”~“认知症800万人”时代的处方箋~(2014)p35~51、p76~77、p79~83(主妇和生活公司)
非专利文献21:由UMINR000028474缩醛磷脂的摄取的脑功能改善的评价
非专利文献22:Wechsler记忆力检查;第1次国际缩醛磷脂座谈会;2016年11月7~8天九州大学、讲演要点集P26
非专利文献23:第1次国际缩醛磷脂座谈会;2016年11月7~8天九州大学、讲演要点集P49
非专利文献24:DementGeriatr Disord Extra,2.298-303(2012)阿尔茨海默型认知症患者的红细胞缩醛磷脂降低
非专利文献25:“诊疗和新药”第53卷12月号39-62(2016)
非专利文献26:Abe,Y.etal.Biochim.Biophys.Acta-Mol.Cell.Biol.Lipids2014
非专利文献27:Honsho,M.et.al.J.Biol.Chem.2010;Honsho,M.et.al.J.Biol.Chem.2013
非专利文献28:Newton,37(No3)24-57(2017)
非专利文献29:JST新技术说明会080627发表资料“有高附加价值的含有DHA的磷脂的制造方法”奥山英登志
非专利文献30:Morris,JC.et,al.Clinicaland biomarker changes indominantly InheritedAlzheimer’s disease.N Engl J Med.2012 Aug30;367(9)795-804
非专利文献31:Klunk,W.E.,et.al.,Imagingbrain amyloid in Alzheimer’sdisease with Pittsbergh Compoud-B.Ann Neurol,55,306-319(2004)
非专利文献32:Maruyama,M.,et.al.,Imagingof tau pathology in atauopathyMouse model and inAlzheimer patients compared to normalcontrols.Neuron,79、1094-1108(2013)
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
本发明旨在提供安全-稳定的PLs和其制剂、作为含有它们的食品、化妆品、药品或饲料的用途及认知症的未病状态的判断方法。
用于解决课题的手段
本发明人令人惊讶地发现,通过向PLs分子中的SN-2位导入DHA,再通过将PLs简便地纳米乳化(可溶化)而形状变换,不仅可使PLs安全地稳定化,还确认呈现神经变性疾病及精神疾病的缓和和预防、及改善效果的同时,显著地改善其统合的费用对效果,进一步重复研究开发,从而完成本发明。
即,本发明由以下的项中记载的技术手段构成。
[1]由从生物体组织来源的特定的部位或器官提取分离、纯化除去该提取分离的工序中副生的蛋白质级分及/或水溶性低分子级分的总脂质的纯化物构成的、有生物体组织特异性的构成比的含有缩醛磷脂的磷脂(以下,称为“复合脂质”),其特征在于
(1)上述生物体组织来源的特定的部位或器官由选自鸡的生物体组织来源的带头屠体、含骨髓的生鸡骨头、鸡蛋黄、肠、沙肝、含卵巢和卵管的金冠、胸肉、皮的组的至少1种以上的特定的部位或器官构成,
(2)上述含有缩醛磷脂的磷脂是从向用含有含二十二碳六烯酸(DHA)的ω-3高度不饱和脂肪酸(以下,称为“ω-3HUFA”)衍生物(以下,总称为“ω-3HUFA衍生物”)的饲料饲养的鸡的生物体组织转移所述ω-3HUFA衍生物的生物体组织来源的特定的部位或器官提取分离的、转移了上述ω-3HUFA衍生物的有生物体组织特异性的ω-3HUFA结合型的构成比的含有缩醛磷脂的磷脂。
[2]上述[1]记载的复合脂质,其中ω-3HUFA衍生物为选自下述的1)~9)的任1种:
(1)结合于甘油磷脂酰磷脂的SN-2的ω-3HUFA衍生物
(2)结合于1-烷基甘油磷脂酰磷脂的SN-2的ω-3HUFA衍生物
(3)结合于1-烯基甘油磷脂酰磷脂的SN-2的ω-3HUFA衍生物
(4)结合于1-酰基甘油磷脂酰磷脂的SN-2的ω-3HUFA衍生物
(5)磷虾的脱壳内肉及/或干燥物中含有的前项(1)~(4)之任一项记载的结合于甘油磷脂酰磷脂的SN-2的ω-3HUFA衍生物
(6)全扇贝及/或其加工残、或者其粗粉(干燥物)中所含有的、前项1)~4)之任一项所述的结合于甘油磷脂酰磷脂的SN-2的ω-3HUFA衍生物
(7)全海鞘(海鞘)及/或其加工残、或者其粗粉(干燥物)中所含有的、前项1)~4)之任一项所述的结合于甘油磷脂酰磷脂的SN-2的ω-3HUFA衍生物
(8)有机合成的、前项1)~4)之任一项所述的结合于甘油磷脂酰磷脂的SN-2的ω-3HUFA衍生物
(9)由发酵法调制的、前项1)~4)之任一项所述的结合于甘油磷脂酰磷脂的SN-2的ω-3HUFA衍生物。
[3]上述特定的部位或器官是鸡蛋黄,由从含有在上述鸡的生物体中生物合成的DHA-PLs的鸡蛋黄提取分离的总脂质的纯化物构成的、上述[1]记载的复合脂质。
[4]由从用含有有机合成的1-烷基甘油磷脂酰磷脂的饲料饲养的鸡的生物体的特定的部位或器官提取分离的总脂质的纯化物构成的上述[1]记载的复合脂质。
[5]复合脂质组合物,其特征在于,上述[1]记载的复合脂质含有上述[1]记载的提取分离中副生的水溶性低分子级分的、有ω-3HUFA结合型的构成比。
[6]复合脂质或有ω-3HUFA结合型的构成比的复合脂质组合物的水性制剂,其特征在于,在皂苷类的存在下,上述[1]~[5]之任一项所述的有ω-3HUFA结合型的构成比的复合脂质或复合脂质组合物在水相纳米乳化或增溶。
[7]纯度30~70%的粗制缩醛磷脂或有其以上的纯度的高纯度缩醛磷脂的制造方法,其特征在于,将上述[1]~[4]之任一项所述的复合脂质用磷脂酶A1(PLA1)酶处理而除去含溶血体的甘油磷脂类,并且提取分离除去鞘磷脂。
[8]粗制缩醛磷脂或高纯度缩醛磷脂的水性制剂的制造方法,其特征在于,在皂苷类的存在下,以上述[7]记载的粗制缩醛磷脂或高纯度缩醛磷脂各作为底物而在水相纳米乳化或增溶。
[9]食品、化妆品、药品或饲料,其特征在于,含有选自上述[1]~[8]之任一项所述的复合脂质、复合脂质组合物、各缩醛磷脂、以及它们的水性制剂的任1种以上作为有效成分。
[10]神经变性疾病的缓和及预防用辅助物,其特征在于,含有选自上述[1]~[8]之任一项所述的复合脂质、复合脂质组合物、各缩醛磷脂、以及它们的各水性制剂之中的至少1种作为有效成分,有选自神经变性疾病的认知症、阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁病、以及统合失调症的组的至少1种神经变性疾病的缓和和预防作用。
[11]神经变性疾病的缓和和预防或治疗用的抗中枢神经系炎症制剂,其特征在于,含有选自上述[1]~[8]之任一项所述的复合脂质、复合脂质组合物、各缩醛磷脂、以及它们的各水性制剂之中的至少1种作为有效成分,有选自神经变性疾病的认知症、阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁病、以及统合失调症的组的至少1种神经变性疾病的缓和和预防或治疗作用。
[12]神经细胞新生剂,其特征在于,含有选自上述[1]~[8]之任一项所述的复合脂质、复合脂质组合物、各缩醛磷脂、以及它们的各水性制剂之中的至少1种作为有效成分。
[13]神经细胞的凋亡抑制剂,其特征在于,含有选自上述[1]~[8]之任一项所述的复合脂质、复合脂质组合物、各缩醛磷脂、以及它们的各水性制剂之中的至少1种作为有效成分。
[14]Aβ及/或τ的脑内蓄积抑制剂,其特征在于,含有选自上述[1]~[8]之任一项所述的复合脂质、复合脂质组合物、各缩醛磷脂、以及它们的各水性制剂之中的至少1种作为有效成分。
[15]作为神经变性疾病及/或精神疾病改善用药品或食品的加工品,其特征在于,含有选自上述[1]~[8]之任一项所述的复合脂质、复合脂质组合物、各缩醛磷脂、以及它们的各水性制剂之中的至少1种作为有效成分,有选自神经变性疾病及/或精神疾病的改善作用的抗中枢神经系炎症、神经细胞新生、神经细胞死亡的抑制以及Aβ脑内蓄积抑制之中的至少1种作用。
[16]蛋白质-脂质的复合组合物,其特征在于,由上述[1]~[4]之任一项所述的提取分离中副生的蛋白质级分和含有由上述[5]中记载的提取分离副生的水溶性低分子级分的有生物体组织特异性的构成比的复合脂质组合物的混合物构成。
[17]由前项记载的蛋白质级分和复合脂质组合物的混合物构成的蛋白质-脂质的复合组合物是鸡蛋黄来源的、上述[16]所述的蛋白质-脂质的复合组合物。
[18]作为神经变性疾病及/或精神疾病改善用药品或食品的加工品,其特征在于,含有上述[16]或[17]记载的蛋白质-脂质的复合组合物作为有效成分,有选自神经变性疾病及精神疾病的改善作用的抗中枢神经系炎症、神经细胞新生、神经细胞死亡的抑制、以及Aβ脑内蓄积抑制之中的至少1种作用。
[19]受试者的认知症未病状态的判断方法,其特征在于,使用选自上述[1]~[8]之任一项所述的含有缩醛磷脂的复合脂质、复合脂质组合物、粗制缩醛磷脂或高纯度缩醛磷脂、以及它们的各水性制剂之中的1种,以处于确认到生理性地无害的量的Aβ及τ的脑内蓄积的状态(以下,称为“认知症未病状态”)的认知症发病前的成人(健康者)作为受试者,
(a)为了使用PET而检查Aβ及τ的脑内蓄积状态来判断受试者的认知症未病状态,基于PET图像的SUVR值(评分)而如下述实施Aβ及τ的脑内蓄积状态的排序别的区分的工序、
(1)蓄积初期I期:1.0±0,2
(2)蓄积中间期II期:1.2±0.2
(3)蓄积后期III期:1.4±0.2
(b)与上述排序不同地,将对于缩醛磷脂的受试者的剂量应答经3~10个月的长期而以适宜的频度进行试验,如下述设定适合的日用量的范围或大体范围的工序:
(1)I期的受试者:“渐增”范围:1.0±0.15
(2)II期的受试者:“零增”大体范围:1.2±0.15
(3)III期的受试者:“渐减”大体范围:1.4±0.15
(c)向上述认知症发病前的成人(健康者)的受试者从认知症发病前的阶段经长期继续施用作为含有所述设定日用量的缩醛磷脂作为有效成分的辅助物或食品的加工品的工序、
(d)在该长期施用之间以适宜的频度将Aβ及τ的上述指定的脑内蓄积状态的定期的检验用PET诊断实施的工序、
(e)并行于定期的PET诊断而在该长期施用期间中以适宜的频度将海马的减容状态的检验用MRI诊断实施的工序、
(f)通过执行上述(a)~(d)的工序或上述(a)~(e)的工序判断受试者的认知症未病状态。
再者,本发明作为上述各发明涉及的发明特定事项,可含以下的实施方式。
(1)作为提取分离方法,预处理物的由过量的含水乙醇的缓慢提取而分离成的3相(“蛋白无机质等的不溶固体成分”(沉淀)、“中性脂质分”(上层)和“含水乙醇分(水溶性低分子类、极性脂质类)”)(区分)。
(2)在上述含水乙醇分的脱醇后加己烷而将水溶性低分子类区分-分离,蒸发干燥己烷而得到极性脂质分(复合脂质)。
(3)作为酶处理工序,对蒸发干燥分离的含水乙醇相而得到的磷脂级分进行PLA1酶处理而纯化缩醛磷脂。
(4)在各缩醛磷脂中含有乙醇胺缩醛磷脂及胆碱缩醛磷脂。
(5)各缩醛磷脂中所含有的乙醇胺缩醛磷脂和胆碱缩醛磷脂的质量比是[1:5]~[5:0.01]。
(6)含有DHA的缩醛磷脂的经口的日用量是0.01mg~10mg、例如,优选为0.25mg(内服药以下)。
(7)在Aβ和τ的脑内蓄积诊断用中使用的PET是头部专用的头盔型PET。
(8)缩醛磷脂的施用时期是从30多岁,更优选为从40多岁。
其中,对于本发明进行说明,则作为生物体内常见型磷脂的PLs,含有该PLs的生物体组织一直以来被食用。从而,从本发明涉及的生物体组织提取的PLs几乎无副作用等的担心,被认为安全性极其高。但是,PLs一旦从生物体组织提取分离了,则恰时失去稳定性,乙烯基醚键变得暴露于分解的危机。即,这表示,[强还原性]乙烯基醚键是强[易氧化性](=“易”氧化分解性),为了将其有效地活用,实施某些应当的防御措施变得必须。
本发明人在锐意研究该“二律背反”性的合理的打破的策略的结果,发现三个方法有效。一个是将PLs合理地纳米乳化,第二是向PLs的分子内、即,SN-2合理地导入DHA。使此二个统合化,即,使DHA结合型PLs纳米乳化成为最强的合理的防御。此处所说“合理的”是指通过统合的费用对效果比显著地高而实现“安全且实用的稳定化”。
再者,第三用名实一同“一石数鸟”的方法,使鸡作为饲料摄取有[烷基磷酸酯]的分子结构的“醚磷脂”。这是依据,向大鼠经口施用1质量%称为[原效果]的原等的研究成果(非专利文献23)的磷虾来源的烷基磷酸酯浓缩物8天而使其血清中的烷基磷酸酯和PLs显著地增加的同时,使它们的SN-2结合脂质类中的DHA和EPA比率增加。即,本发明人如以下一样活用该[原效果]而成功将本发明更加合理化-高品质化。
以适宜的含有烷基磷酸酯的原料、例如,磷虾脱壳肉、优选为其干燥物作为饲料施用给成鸡、优选为产卵鸡时、在其产卵的卵黄中,令人惊讶地确认到选择性高地,即,几乎不含EPA结合体而生成1-烯基-2-二十二碳六烯酰基-甘油磷酸酯及1-烷基-2-二十二碳六烯酰基-甘油磷酸酯。再者确认到,向大鼠施用该卵黄的浓缩卵黄油的结果,血清中的1-烯基-2-二十二碳六烯酰基-2-二十二碳六烯酰基-甘油磷酸酯显著地增加。
在生物体内PLs实量增加的[统合的费用对效果比]提升中的所述方法的显著性-显著性在于:
(1)是DHA-PLs和其前体的[DHA-醚磷脂]的选择性并且安全性高的生物合成法,
(2)能略完全地拂拭合理性高的有机合成体、例如,醚磷脂、烷基甘油磷脂或其DHA结合型[DHA-醚磷脂]等的[安全性担保风险],向所谓[生物体来源型]的变换可以高的[费用体效果比]实用化,
(3)在[向生物体来源型的变换]中,鸡,如前所述,是超人工饲育动物,其代谢旋转的速度不允许其他追随,即,[合理性高,但安全性低的[人工合成]]×[安全性高,生产性低的[生物合成]]而可实现安全-廉价的制品化。
发明的效果
本发明通过采用上述构成,发挥如下所述的特别的效果。
(1)本发明以处于确认到生理性地无害的量的Aβ及τ的脑内蓄积的状态(认知症未病状态)的认知症发病前的成人(健康者)作为受试者,作为判断该受试者的认知症未病状态的方法有用。
(2)本发明作为提供作为认知症等的缓和和预防用辅助物或食品的加工品有用。
(3)通过作为含有本发明的安全且稳定化的PLs作为有效成分的、神经变性疾病(认知症、AD、帕金森病、抑郁病、及统合失调症)的缓和和预防用的辅助物([非专利文献16])、抗中枢神经系炎症制剂([非专利文献8]及[专利文献1])、神经细胞新生制剂([专利文献7])、神经细胞的凋亡抑制制剂([非专利文献9])及Aβ和τ的脑内蓄积抑制制剂([非专利文献8]),可提供用于预防-缓和-改善,治疗认知功能障碍-不全整体的症状的辅助物或制剂。
(4)作为引发中枢神经系的炎症的原因之一,考虑存在于中枢神经系的活化神经胶质细胞释放炎症性细胞因子,但本发明的抗中枢神经系炎症制剂有对于伴随中枢神经的炎症发生而增加及活化的神经胶质细胞而增加抑制作用,可由所述作用缓和-预防-改善中枢神经系炎症,实现治疗。
(5)为了被认为中枢神经的炎症的原因之一的疾病的、例如,认知症(特别是AD)、帕金森病、肌萎缩性侧索固化症(ALS)、多发性固化症等的慢性神经变性疾病、以及统合失调症、抑郁病、自闭症等的精神疾病的治疗可适宜地使用本发明的抗中枢神经系炎症性制剂。
(6)PLs是生物体组织中多含的成分,另外,因一直以来含PLs的生物体组织一直以来供于食用而证实了安全性,含从生物体组织提取的PLs的本发明的脑功能障碍的缓和和预防用的辅助物、抗中枢神经系炎症制剂、神经细胞新生制剂、神经细胞的凋亡抑制制剂及Aβ和τ的脑内蓄积抑制制剂几乎无副作用等的担心,安全性极其高。
附图的简单的说明
【图1】显示关于认知功能的受试者的挑选用3阶段的询问。
【图2】显示MMSE用片。
【图3】显示认知功能诊断用询问集。
【图4】显示MMSE的试验结果。
【图5】显示U-K测试的结果。
具体实施方式
接下来,对于本发明进一步详细地进行说明。
本发明涉及安全-稳定的PLs和其制剂、以及认知功能障碍的缓和及预防用的辅助物、抗中枢神经系炎症制剂、神经细胞新生制剂、神经细胞的凋亡抑制制剂及Aβ和τ的脑内蓄积抑制制剂、及经它们的经口摄取的辅助认知症的发病阻止的认知症未病状态的判断方法。
其中,对于PLs进一步进行说明,则PLs是醚磷脂的一种,是指在SN-1有经乙烯基醚键的长链烯基的甘油磷脂。而且,PLs是占人的生物体内磷脂的18质量%的通用型的同时,有强的还原性的特殊的磷脂的总称。此特殊性成为向PLs赋予显著的氧化分解性和水解性的原因。因此,在PLs的实用化时,直面典型的“二律背反”性的事件,要求其合理的打破。本发明人将所述“二律背反”性的事件,合理地,即,将PLs的原本的功能性最大限活的同时,成功以廉价且安全的手段达成其稳定化,从而确立本发明。
在本发明中使用的PLs适宜为从鸡的生物体组织提取分离的。生物体组织是指在生物中的含有PLs的组织。其中,作为一般论说明,则作为所述生物,例如可举出动物及微生物。作为微生物,厌氧性细菌是适宜的,例如,特别优选肠内细菌的Acidaminococaceae科的细菌等。细菌的情况,“生物体组织”是细菌本身。作为动物,鸟类、哺乳类、鱼类、磷虾、贝类等是适宜的。在哺乳类中,从其供给稳定性和安全性的两点来看,优选家畜,例如,可举出牛、猪、马、羊、山羊等。
作为原料用哺乳类的主要的组织,可举出皮肤、脑、肠、心脏、生殖器、肌肉、脊椎骨、乳等,可从这些组织(器官、部位)提取PLs。另外,作为鸟类,可举出鸡、家鸭、鹌鹑、鸭、雉、鸵鸟、火鸡等。从筹备性-成本-丰富的食体验性来看,鸡、尤其是,含种鸡的产卵鸡是特别适宜的。在使用的组织中,无特别限制,例如,使用胸肉、鸡皮、内脏(特别是,肠、卵巢卵管金冠、沙肝、肝脏)、卵、鸡骨头(肉糜调制副生物)、羽毛等是适宜的。
在本发明中,作为从生物体组织提取分离的PLs,使用从鸡组织提取分离的PLs。一直以来食用的鸡的安全性被确认,由于易稳定供给,从而适宜。作为从生物体组织提取分离PLs的方法,只要是可提取(及根据需要纯化)PLs,就不特别限制,但从简便性及成本等的方面来看,优选如接下来所述提取及纯化。另外,由所述提取及纯化方法,因为可将二酰基型甘油磷脂分解-除去,在可更进一步提高PLs的纯度的点优选。
作为PLs的提取及纯化的工序,具体而言,例如,可举出以下的1)~5)的工序。
(1)从生物体组织提取分离为总脂质级分(含、低分子量水溶性级分)和蛋白质级分及中性脂质级分的3相的工序。
具体而言,例示以下的工序。
(1)使生组织肉糜化而缓慢冷冻的工序
(2)将在冷冻肉糜强制解冻后压榨脱水后用“过加热水”(AquagasRTM;[专利文献8]、[专利文献9]、[专利文献10]、[专利文献11])高速调理杀菌而真空高速冷却(无氧气氛下的冷却脱水)的工序
(3)上述脱水处理后,加3倍(V/W)量的脱气(脱氧)乙醇,在密封无氧的气氛下缓慢搅拌12小时而进行提取的工序
(4)重复上述的工序
(5)将乙醇合并后,在无氧气氛中馏去乙醇分后,离心分离水层(水溶性低分子量级分)而得到总脂质级分的工序(水溶性低分子量级分另行冷冻干燥)
(2)从总脂质级分提取分离有组织特异性构成比的复合脂质的工序。
(3)从上述工序中分离水溶性低分子量级分,向复合脂质级分加其而得到复合脂质组合物的工序。
(4)从上述工序中分离蛋白质级分,向其加前项的复合脂质组合物,得到蛋白质-脂质复合组合物的工序。
(5)向复合脂质级分加酶而水解SN-1结合脂肪酸,将混在的二酰基甘油磷脂变换为溶血体的同时,与副生脂肪酸一同,用亲水系溶剂提取分离,纯化PLs的工序。
提取优选进行由有机溶剂(例如,有选自乙醇、丙酮、己烷等及这些中的至少2种以上的混合溶剂等的食品适性的)或含水有机溶剂的提取。另外,供于提取的鸡组织,优选为,例示在上述(1)及(2)的工序中处理的方法。即,为了使在后工序的由乙醇的3相区分中使用的乙醇量尽可能变少,要求从生组织在无氧气氛下低温-短时间进行尽可能的脱油和脱水。
附在提取处理条件,首要的是,为了使含有PLs的氧化分解和水解最少化,在密封下无氧的气氛中进行在低温的短时间搅拌处理。作为适宜的一例,例示向上述的预处理(1)及(2)中处理完了的产卵成鸡的去四肢的带头屠体肉糜肉加乙醇,在30℃以上50℃以下进行静置或缓慢搅拌180分钟以上的方法。对于所述胸肉1kg加预先脱气(脱氧)处理完了的乙醇2~4L而进行密封下静置或缓慢搅拌。
在区分为3相之内,含水乙醇相是蒸发浓缩乙醇而分离水层之后,加预先脱气处理完了己烷而提取磷脂级分。将分离的水层和己烷不溶层合起来而加脱气水,于4℃静置后,在低温下离心分离而除去不溶部,进行冷冻干燥,得到低分子水溶性级分18g。另一方面,将己烷溶液由常规方法蒸发干燥而得到了复合脂质级分7g。向所述磷脂级分加该低分子水溶性级分,得到了复合脂质组合物25g。
将所述磷脂级分供于酶水解处理工序,水解二酰基型磷脂而可优选浓缩PLs。作为这样的水解处理,例如,可举出由磷酸脂肪酶A1(以下,称为“PLA1”)的酶处理([专利文献4])。如果用PLA1处理,则混在的二酰基型甘油磷脂被分解为游离脂肪酸和溶血磷脂,如果将这些用丙酮及己烷提取分配,则可纯化缩醛磷脂。游离脂肪酸及溶血磷脂的除去,例如,可由使用丙酮及己烷的分配进行。
PLA1只要是得到了上述的效果的,其来源等就不特别限制,例如,可举出米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的PLA1。该PLA1例如,可从三菱化学食品(株)等商购。其使用量可对应于得到的复合脂质量而适宜设定。优选为,可使用0.2~200unit/复合脂质1mg,再优选为,可使用2~200unit/复合脂质1mg。再者,1unit是指每1分钟使1μmol的底物(复合脂质)改变的量,1μmol/min。
使用的缓冲液也可对应于PLA1而适宜选择。例如,可使1g复合脂质溶解于0.1M柠檬酸-盐酸缓冲液(pH4.5)至每1g复合脂质1~30ml、优选为5~15ml,加指定量的PLA1而使用。反应条件使用脱气完了的缓冲液,在氮气气氛中,尽可能短时间、优选为1小时、温度也尽可能在低温下、优选为以50℃作为上限,搅拌而进行酶反应。
避免由加温的酶失活处理,反应结束后,通过立即冷却至室温后,加反应液的2~3倍量的预先脱气处理完了的己烷而离心处理而回收上层的己烷层,除去酶缓冲液和酶蛋白质。通过向该己烷溶液适宜地加丙酮及水而进行分配,再由水或水溶液进行溶液分配,除去溶血磷脂而纯化缩醛磷脂。即,由丙酮除去磷脂以外的中性脂质,由水系溶液分配分离缩醛磷脂和溶血磷脂。这样得到的生物体组织来源的缩醛磷脂,优选为,可作为本发明的认知功能障碍的缓和及预防用的辅助物、抗中枢神经系炎症性制剂、神经细胞新生性制剂、神经细胞的凋亡抑制性制剂及/或Aβ脑内蓄积抑制性制剂的有效成分使用。
在生物体组织来源的复合脂质(含复合脂质组合物)及PLs的磷脂和其组成比中,存在由生物体组织的特有的特性。接下来,对于产卵成鸡的情况的组成比进行说明。
1.皮
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=[1~10]:1
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:[1.5~15]
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:[0.5~5]
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=[1.5~10]:1
2.带头屠体(剥皮)
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=[0.5~5]:1
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:[2~15]
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:[0.5~5]
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=[3~20]:1
3.卵黄
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:[0.1~1.5]
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:[2~20]
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:[10~50]
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=[40~350]:1
4.沙肝
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=[2~15]:1
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:[1~10]
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:[0.5~6]
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=[1~10]:1
5.肠
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=[2~15]:1
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:[2~20]
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:[1~12]
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=[1~10]:1
6.鸡骨头
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=[1~10]:1
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:[2~20]
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:[1~10]
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=[3~25]:1
7.金冠(含、卵巢)
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:[0.0001~0.1]
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:[1.5~15]
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:[15~130]
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=[20~200]:1
8.骨髓
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:[0.0001~0.1]
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:[1~10]
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:[0.5~6]
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=[30~3]:1
9.胸肉
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:[0.5~5]
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:[2~10]
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:[0.5~5]
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=[5~50]:1
特异性高的是以下的1)~4)。
(1)以胸肉([PL-PE]<[PL-PC])[心肌]样
(2)以金冠([PL-PE]>>>[PL-PC])[PL-PC]大致是0
(3)生鸡骨头(发生率高,价格也因为是废弃处理而是0以下并且组成接近于[胸肉],还含骨髓(内有脑的末梢组织),所以期待潜在附加价值(脑功能改善功能),被认为统合的价格对性能比显著高。
(4)以带头屠体([胸肉]+[骨髓])被认为与统合的[价格对性能比]高的[胸肉]相当。
从本发明中使用的生物体组织提取的复合脂质及PLs以干燥质量换算,乙醇胺PLs及胆碱PLs的含量如以下的1)~2)。
(1)在复合脂质中,上限是50质量%,优选10质量%以上,更优选20质量%以上,更优选30质量%以上,进一步优选40质量%以上。
(2)在PLs中,优选50质量%以上,更优选60质量%以上,更优选70质量%以上,再更优选80质量%以上,还优选90质量%以上,特别优选92质量%以上。
乙醇胺PLs及胆碱PLs的质量比以及含量可将从生物体组织提取的复合脂质或缩醛磷脂用高效液相层析(HPLC)解析而求出。具体而言,在HPLC中,通过由蒸发光散射检测(ELSD,Evaporating Light Scattering Detector)得到层析谱、求出在所述层析谱中的表示乙醇胺PLs及胆碱PLs的各自的峰面积比,可算出质量比。另外,算出显示乙醇胺PLs及胆碱PLs的峰面积相当于层析谱整体的峰面积的多少%就可求出含量。
在本发明中,合目的地改性使用的鸡的生物体是重要的。即,在本发明中,通过将鸡用含有ω-3HUFA衍生物的饲料饲养,向该组织或器官及部位等的脂质、尤其是,PLs转移选择性高的ω-3HUFA,由此,使PLs的SN-2结合脂肪酸和转移ω-3HUFA酯交换(非专利文献26)、生成含有ω-3HUFA结合型PLs的复合脂质及PLs。对于ω-3HUFA结合型的PLs,有提示有与认知功能障碍的关系的事例,例示以下所述的。
1.脑内DHA量和PLs量的相关关系
脑内的DHA已知作为甘油磷脂、尤其是,PLs结合型存在(非专利文献26)、与作为产生PLs的小泡体的过氧化物酶体的PLs的生物合成系统的限制性内切酶脂肪酰基-CoA还原酶1(Far1)(非专利文献27)的表达亢进相关(非专利文献10)。
2.脑内DHA及PLs浓度的减少和神经变性疾病及精神疾病的发病的相关关系(非专利文献10)。
(1)向脑内添加[3H]DHA,则DHA结合于存在于大部分脑内的膜间的PLs的SN-2。
(2)该结合DHA在阻断PLs产生系的细胞系中大幅地减少。
(3)向上述培养系添加sir1-十六烷基甘油酯,则PLs结合DHA量和PLs的产生量恢复。
(4)脑内DHA含量的降低和脑内PLs产生量的减少与下述1)~7)的神经变性疾病及精神疾病的发病有关系。
(1)过氧化物酶体失调症
(2)AD
(3)郁病
(4)ADHD(注意缺陷性多动性障碍症)
(5)脑卒中
(6)活动亢进症
(7)精神分裂症
(5)DHA强化食品的摄取提示与改善关于上述的(1)~(7)中特有的行动异常或学习能力的降低、以及精神状态的恶化的信息传递性的可能性相关。
再者,DHA,从其结构来看,通常容易受氧化分解,酸败而发恶臭,但意外不知可仅通过对其进行乳化(纳米乳化)而简便地解决。接下来,以其作为例示进行说明。
(1)使高度不饱和脂肪酸(HUFA)及其酯(含、甘油酯)分散到水溶液中(乳化),则与在空气中放置时完全相反地,越是不饱和度高的,越难以被氧化。在水中分散系中,DHA或EPA的氧化分解性极其变低([非专利文献1])。其理由被认为是乳化DHA等的立体结构成为活性氧接近的障碍,以所谓的“立体位阻”效果阻断向氧化靶位置(双烯丙基结合碳原子)的活性种的冲击而阻止氧化反应。此时,水分子的存在是重要的,被认为将氧化靶位置附近用覆盖(覆盖)的样式间接保护。
(2)在该乳化系的O/W乳液中,其微团粒径越细,DHA等的PUFA的氧化稳定性提升,由通常的微乳化进行纳米乳化(可溶化)是适宜的。再者,乳化有涉及大的负载的可能性,例如,避免高压匀浆机等的使用,优选简便且缓慢的搅拌。高装载乳化损害PUFA的氧化稳定性。
(3)向细胞培养系摄入亚油酸(LA)、花生四烯酸(AA)、DHA而进行氧化处理时、在LA和AA添加系中过氧化物生成量增大,但用DHA确认不到该增大。
(4)向培养细胞系加LA-PC(磷脂酰胆碱)、AA-PC及DHA-PC,氧化处理时,与上述同样地DHA特异性地过氧化物生成量,而成为比对照少的结果。如上所述,DHA的在培养细胞中的特征性的氧化稳定性是与空气中或溶剂系完全的不同的,表示DHA不是像以往考虑的那样在生物体内对于氧化不稳定。
(5)向大鼠施用鱼油时,鱼油的施用量只要是不极端多,就确认不到变化生物体内的脂质过氧化水平。
(6)由此,只要是摄取适合的量的鱼油,就提示几乎无生物体内的脂质过氧化的亢进和伴随其的不良影响。
(7)从以上,根据使DHA合理地结合于PLs的SN-2,期待在下述的1)~2)的PLs分子内的直接的稳定化效果的表达。
(1)在生物体外中,对于PLs的乙烯基醚键的邻接结合DHA的立体位阻在有效地阻断氧化活性物质的攻击的同时,DHA结合分子、即,PLs本身也被认为可经结合DHA特有的其乳化型特异性分子结构而获得氧化稳定性。
(2)在生物体内(株化细胞培养系)、特别,脑内(细胞内),DHA,磷脂和尤其是,结合于乙醇胺型PLs,定位在PLs生物合成小泡体“过氧化物酶体”的膜内,被认为使生物合成的键酶(限制性内切酶)的表达亢进而促进PLs产生。
除了以上之外,接下来综合例示PLs和脑功能障碍的相关。
1.与AD的相关
(1)AD患者的脑内PLs含量显著地减少(非专利文献11、非专利文献12)。
(2)AD患者的血清PLs含量显著地减少(非专利文献13)。
(3)AD患者的红细胞PLs含量显著地减少(非专利文献14)。
(4)在中枢神经系炎症模型小鼠(用LPS腹腔注射炎症引发的认知功能障碍)中脑内PLs减少(非专利文献8)。
2.PLs的生物体内动态
(1)经口施用大鼠的血中缩醛磷脂增加(非专利文献15)。
(2)LPS诱发中枢神经系炎症模型小鼠的脑内PLs含量增加(非专利文献8)。
(3)PLs经口施用AD患者的血中乙醇胺PLs增加(非专利文献16)。
3.认知功能障碍的预防和缓和及治疗效果
(1)促进老化模型大鼠(SAMP8)的神经新生(专利文献7)。
(2)抑制Aβ两侧注入大鼠的空间认知学习功能障碍(非专利文献16)。
(3)缓和LPS诱发的中枢神经系炎症小鼠的症状(非专利文献8)。
(1)抑制微神经胶质的活化。
(2)脑内细胞因子、TNFα-mRNA的增加和脑内IL-2β的表达抑制。
(3)Aβ的蓄积抑制。
(4)LPS(腹腔内注射)诱发的中枢神经系炎症小鼠的中枢神经系炎症和Aβ蓄积的抑制(非专利文献8)。
(1)神经胶质细胞的活化抑制。
(2)抑制向前额皮质及海马的Aβ蓄积。
抑制腹腔内注射LPS而诱发的炎症导致的PLs的减少(非专利文献8)。
(5)神经细胞死亡的in vitro抑制(非专利文献9)。
(6)此外的关联
(1)认知功能障碍发病危险因子的高血糖及高脂血的抑制(非专利文献18)。
(2)由肌肽食的认知功能降低的抑制(非专利文献19)。
在以上的PLs效能中,在上述的DHA结合型PLs中,也相辅以对于其分子内的直接的稳定化和认知功能障碍的改善-矫正的协同效果,被认为抗认知功能障碍效能显著地增大。
接下来例示将鸡用含有ω-3HUFA衍生物的饲料饲养而向该生物体组织有效率地转移ω-3HUFA的方法。
1.生物种的选择
鸡、特别,优选产卵鸡,更优选种鸡雌雄的废鸡,特别优选含“强制换羽”产卵鸡的产卵废鸡。接下来例示其根据。
(1)唯一继承“恐龙特异性呼吸系“气囊式””的动物是鸟类,与动物对比有下述的显著的特异性。
(1)氧的吸入量是2倍(由于吸气和排气是不同系统)。
(2)由上述,能关系代谢速度是2倍。
(3)由上述,可食部1kg制造中必要的饲料是,肉鸡是4.5kg、一方面,与家畜的猪的9.1kg和肉牛的25.0kg比效率大幅地提高,在食用动物中能超过其的,仅有通用性欠佳的蟋蟀的2.1kg(FAO 2013公表)。
(2)由于下述的要因而筹备性(统合的价格对性能比)显著地优良。
(1)养鸡是全球产业,品质均一且价格也廉价而集约度高:
*肉鸡是垂直统合型产业
*产卵成鸡(700日龄左右)的废鸡(年间7成左右被弃杀;750日龄左右)在专用的处死解体场“半官半民的废鸡处理中心(在全日本有30处左右,平均处理能力是年间3百万羽左右,也有超1千万羽时)”是高鲜度且廉价并且日产-安全是特长
*卵价稳定化国策的产物(日本特有)
(2)世界的年间累计饲育羽数是200亿羽;在中国显著增加中
(3)全球共同对应数品种;肉鸡(精肉)和产卵鸡(鸡蛋)
(4)现在也延伸中
(5)鲜度良好,废鸡也在在活的状态下处死
(6)在家畜中特别地生长快;肉鸡是50天、产卵鸡是年间以接近每日1个地产卵
(7)“强制换羽”用使产卵效率下降的产卵成鸡再生的人工手段,使700日龄左右的老鸡绝食10天左右,结果羽毛(羽)落下而成裸状态,从而再次饲育的养鸡模式。与动物虐待相差无几,但作为卵价低迷或销售数量停滞不前时的应急措施被默认。作为生物体功能性再生的特异性个体,例如,作为含DHA的ω-3HUFA衍生物转移用鸡,令人深感兴趣。可大规模实现此种的措施也是家禽的特异性之一。
(8)在产卵鸡来源的卵黄中,其前体的金冠特异性地其PLs组成率是PL-PC>>PL-PE(实质上是0),在通常饲育产卵鸡的卵黄中,有不含PLs的极其不可思议的现象。
然而,此番的含DHA的ω-3HUFA衍生物转移饲育的结果,在该产卵鸡的卵黄中,令人惊讶地,得知以下的*。
*检测到PLs
*其大部分是DHA-PLs
*而且,与前体的金冠正相反,组成率是PL-PE>>PL-PC
该结果如后所述,DHA使生物体内PLs新生小泡体“过氧化物酶体”的生物合成通路的限速酶Far1的表达亢进的结果,被认为在卵黄中PLs产生。再者,解释为该PLs特异性地补充卵黄中的DHA而使DHA-PLs发生。
2.适宜于PLs的提取用的组织等的选定
例示下述的。
(1)产卵鸡的卵黄(冷冻)
(2)生鸡骨头(肉糜冷冻)
(3)兜(肉糜冷冻)
(4)沙肝(肉糜冷冻)
(5)肠(肉糜冷冻)
(6)皮(肉糜冷冻)
(7)金冠(冷冻)
(8)胸肉(肉糜冷冻)
3.供试的ω-3HUFA衍生物的选定
例示水产类来源的粗粉、沙丁鱼-鲭·秋刀鱼-鲔·鲣-扇贝-海鞘-磷虾等及它们的2种以上的组合,同左的水产类来源的粗粉副生油脂、水产类的生殖组织来源的粗粉、同左的副生油、微生物的发酵培养基来源等。
含有4.ω-3HUFA的饲料和饲养条件
例示下述的。
(1)鸡种
Julia种、及/或Boris Brown种
(2)饲料
玉米62%、含有ω-3HUFA的饲料15%左右、植物油脂15%、动物基本饲料6%及其他谷类2%左右
(3)饲养条件
(1)饲养期间是1~5周、优选为1~3周
(2)鸡是40周龄左右
(3)饲养场所是九州的养鸡场
(4)饲育羽数是50羽左右而适宜地
(4)处死解体区分第一次处理储存
九州的废鸡处理中心
接下来示以生物体组织来源的复合脂质和其组合物及PLs作为底物的纳米乳化的详细。
1.基本处方
接下来例示适宜的处方。
通过将上述复合脂质在皂苷类的存在下纳米乳化,得到了以在水相复合脂质或PLs增溶作为特征的复合脂质或含有PLs的水性制剂。([专利文献12])
此时,以皂苷、优选为,Kiraya皂苷作为必须成分,适宜地使用选自脂肪酸单甘油酯、碳原子数6~12的脂肪酸的脂肪酸单甘油酯、聚甘油脂肪酸酯、聚羟基化合物、糖浆等的1种以上的辅助成分。
2.纳米乳化工序
一边将上述复合脂质在预先脱气的含有Kiraya皂苷的水溶液中用磁力搅拌器搅拌,一边在氮气气氛下添加,搅拌至浑浊变没,则得到了有透明性的可溶化溶液。
3.纳米乳化液的性状
将上述调制液稀释为10,100,1000倍,目测确认透明性。
4.稳定性试验([专利文献12])
在将上述调制液稀释为例如,500倍的有透明性的水溶液中,使用柠檬酸而调至pH4,目测确认变化的有无,在将其于95℃加热30分钟后返回室温,将变化的有无用目测确认。再者,将该加热液蒸发干燥后,用常规方法得到己烷提取液,以未加热可溶化液作为对照,用HPLC/ELSD图进行峰面积比较解析,检验残留缩醛磷脂。
5.平均粒径测定试验([专利文献12])
将上述调制可溶化液中的油相粒子的平均粒径用市售亚微米分析仪测定。
6.粉末制剂的调制试验和成分的残留性([专利文献14])
使赋形剂的淀粉水解物溶解于该可溶化液之后,使用台式小喷雾干燥器而进行喷雾干燥。此粉末制剂的,例如,通过水稀释100倍而将溶液的透明性用目测判断其透明性,确认可溶化。
另外,如上所述,以未加热可溶化液作为对照,用HPLC/ELSD图进行峰面积比较解析,确认PLs的残留量。
7.可溶化果冻的调制试验([专利文献13])
(1)使酪蛋白钠加温溶解于甘油,向其例如在搅拌下添加1%复合脂质δ生长酚溶液,得到有透明感的胶状的可溶化物。在蒸发干燥后用己烷提取,用HPLC/ELSD与前项同样地从峰面积比的对比解析确认PLs的残留。另外,调制所述果冻的,例如,100倍水稀释液,用市售亚微米分析仪测定平均粒径分布。
(2)例如,使干燥卵清2g溶解于水8g,使上等白糖适宜地溶解于其。在氮气气氛下搅拌下、例如,向此液适量添加PLs的0.5%δ生长酚溶液,则得到了有透明感的胶状的可溶化物。
以本发明涉及的复合脂质和其组合物及PLs以及这些的水性制剂、再者,蛋白质-脂质复合组合物、含有ω-3HUFA结合型PLs的复合脂质和其组合物及PLs以及这些的水性制剂、再者,蛋白质-脂质复合组合物(以下,有称为“各种PLs类”的情况)作为中枢神经系炎症、神经细胞新生失调症、神经细胞的凋亡症及Aβ和τ的脑内蓄积症(以下,称为“认知功能障碍”)的缓和-预防-改善、及治疗用的有效成分,可在食品、化妆品、药品或饲料中使用。
以本发明涉及的PLs制剂作为辅助物及/或一般食品(以下,有称为“各种食品”的情况)使用时,所述各种食品可为各种PLs制剂本身,也可为适宜配合这些和食品卫生学上容许的基材、载体、添加剂或此外,可作为食品利用的成分-材料。另外,作为这样的各种食品的形态,例如,可举出液状、粉末状、片状、颗粒状、糊状的食品,但不限于这些。
以本发明涉及的PLs制剂作为食品使用时,所述制剂适宜配合PLs、及食品卫生学上容许的基材、载体、添加剂或此外,可作为食品利用的成分-材料(即,含各种PLs的食品组合物)。例如,可例示含各种PLs制剂的加工食品、饮料、健康食品(营养功能食品、特定保健用食品等)、病者用食品(医院食、病人食或护理食等)等。
辅助物及食品的种类不特别限制,例如,例示配合各种PLs制剂的汉堡包、肉丸、Wiener、鸟肉松,鸡皮片等的加工食品、及含加工的肉食品等而成的健康食品(营养功能食品、特定保健用食品等)、辅助物、病者用食品等。另外例示,使各种PLs制剂,例如,成为粉末状等而含在饮料类(汁等)、点心类(例如,树胶、巧克力、糖果、饼干、糕饼、烤年糕片,煎饼、布丁、胶状点心、杏仁豆腐等)、面包类、汤类(含粉末汤)、加工食品等的各种食品中。
再者,当作为健康食品(营养功能食品、特定保健用食品等)、辅助物,调制本发明涉及的食品时,优选使继续摄取容易进行地,例如,以颗粒、胶囊、锭剂(含咀嚼型剂等)、饮料(饮料剂等)等的形态调制,就是在其中,从摄取的简便性的方面来看,更优选胶囊、片、锭剂、果冻等的形态。颗粒、胶囊、锭剂、果冻等的形态可使用药学上及/或食品卫生学容许的载体等,根据常规方法而适宜调制。
在本发明涉及的食品中的PLs的配合量优选为,0.00005~100质量%、更优选为,0.0005~75质量%、再优选为,0.005~50质量%。本发明涉及的食品可用于认知功能障碍的预防-缓和-改善。另外,摄取量、摄取对象、含有PLs量的测定等,例如,优选与后述的本发明涉及的药品同样。
再者,医院食是指供于医院住院的情况的就餐,病人食是病人用的就餐,护理食是指被护理者用的就餐。本发明涉及的食品可特别作为因上述例示的疾病而住院、自宅疗养等的患者、或者,受护理的患者用的医院食、病人食或护理食使用。另外,高龄者等、患上述例示的疾病的可能性高的人也可预防性地摄取。
在医药领域中使用本发明的抗认知功能障碍剂时,所述制剂可为仅由PLs构成的,也可为配合其他成分的(即,含PLs的药品)。例如,在本发明涉及的药品中,可向作为有效成分的各种PLs制剂根据需要配合药学上容许的基材、载体、添加剂(例如,赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、溶剂、甜味剂、着色剂、矫味剂、表面活性剂、保湿剂、保存剂、pH调整剂、粘调化剂等)等。另外,可由常规方法,例如,调制为锭剂、包被锭剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、胶囊剂、丸剂、液剂、悬浮剂、乳剂、凝胶剂、咀嚼型剂、软件锭剂等的制剂。特别是,可调制为液剂、悬浮剂、乳剂等,作为注射剂或点滴剂使用,另外,也可作为经口剂使用。
在本发明涉及的药品中的PLs的配合量只要是发挥抗认知功能障碍作用,就不特别限制,可对应于一天的优选的PLs的摄取量而适宜设定。其配合量优选为,0.0005~100质量%、更优选为,0.005~90质量%、再优选为,0.05~80质量%。作为施用本发明涉及的药品的对象,优选患认知功能障碍的对象。作为这样的疾病,可例示神经变性疾病及精神疾病等。作为神经变性疾病,具体而言,可例示AD、帕金森病、肌委缩性侧索固化症(ALS)、多发性固化症等。
另外,作为精神疾病,具体而言,可例示抑郁病、躁病、躁抑郁病、统合失调症、自闭症、接触障碍等。再者,也可对于将来患这样的疾病的可能性高的对象施用本发明涉及的药品。例如,可向遗传学地患上述例示疾病的可能性高的对象或高龄者(特别是60岁以上)等预防性地施用。另外,作为施用本发明涉及的药品的对象不仅是人,也可作为饲料用而是此外的哺乳类。在这样的哺乳类中,例如,可推定作为家畜或伴侣动物饲育的,例如,可例示狗、猫、牛、马、猪、绵羊、山羊、猴、兔、小鼠、大鼠、仓鼠等。
本发明涉及的抗认知功能障碍剂的施用时期要求从所述认知功能障碍发病的优选为5年前、更优选为10年前、再优选为15年前施用。在发病诊断时间点,得知迎末期症([非专利文献20])。适宜的施用形态是,鉴于其施用期间是经长期,优选经口施用。本发明涉及的抗认知功能障碍剂的施用量对应于患者的年龄、患者的症状的程度、此外的条件等而适宜选择。通常,所述剂中的PLs的量优选以优选为成人一天0.001~1000mg、更优选为,0.01~100mg的范围作为基准。再者,可1天1次或分多次(优选为2~3次)施用。
本发明也提供包括对于患认知功能障碍的对象施用有效量的本发明的抗认知功能障碍剂(特别是,经口施用或经血管施用)的工序的认知功能障碍的治疗方法。再者,本发明还提供包括对于患神经变性疾病或精神疾病的对象或患的可能性高的对象施用有效量的本发明的抗认知功能障碍剂(特别是,经口施用或经血管施用)的工序的这些疾病的预防或治疗方法。所述方法,具体而言,通过施用前述的本发明的抗认知功能障碍剂来实施。再者,在所述方法中的对照、摄取量等的各条件如前所述。
作为本发明涉及的PLs和其制剂等的指定的效能(神经变性疾病和精神疾病的预防及治疗)的独自的临床试验方法,可例示下述的1)~7)。
(1)对象者的特征在于,处于确认到生理性地无害的量的Aβ及τ的脑内蓄积的状态的认知症发病前的成人(健康者)、尤其是,处于“认知症未病状态”的受试者。
在近年的美国的研究成果([非专利文献20])中得知,Aβ和τ蛋白的脑内蓄积与以往的发病诊断时期比,至少10年、通常从15~20年前开始蓄积,引起一种“范式变动”。早期预防是发病抑制的决定手段,所以认知症发病前的成人(健康者)~在处于未病状态的受试者中的表达该效能的如何是要紧的。
(2)以使用安全-稳定的PLs及/或其制剂作为特征。
依据上述,在神经变性疾病和精神疾病的预防-缓和-改善及治疗用的成分中,由于要求与以往对比远长期的摄取,安全-稳定并且廉价的缩醛磷脂作为必须要件。
(3)更优选为,以使用安全-稳定的ω-3HUFA结合型PLs及/或其制剂作为特征。
(4)以上述安全-稳定的ω-3HUFA结合型PLs从用含安全的ω-3HUFA供给源的饲料安全地饲养的鸡安全地提取作为特征。
(5)以安全且简便的经口施用作为特征。
(6)以施用期间与通常的所述疾病对象的临床试验期间的1年以上比,长也是2年以下,优选为18个月间、更优选为12个月间、优选为6个月以下、短至1个月以上的可减轻对于对象者的负担的作为特征。
(7)主要必须测定效能以含选自以下的*标的组的3项目以上作为特征在的革新的神经变性疾病和精神疾病的预防及治疗效能的判断方法。
*内田·Kraepelin检查
*MMSE
*安静时功能性MRI(rs-fMRI)图像解析(非专利文献17)
*红细胞中的PLs含量测定(非专利文献24)
*PSOL“认知功能自身诊断测试”
*RBANS([非专利文献21])
*Cognitrax([非专利文献21])
*Wechsler记忆力检查([非专利文献22])
再者,rs-fMRI图像在脑的默认-模式-网络(DMN)的解析-评价中有用。即,以往认为,在不进行意识的活动之时、脑也又休息,但近年由脑功能成像研究得知惊人的事实,在安静时也进行重要的活动,在脑的基底状态中的活动中耗费的能达在意识的反应中使用的脑能的20倍([非专利文献17])。成为此脑活动的中心是由称为DMN的多个脑区域构成的网络,有与脑内的各种各样的神经活动同调的作用。要关注的是,因在AD患者中确认到显著的萎缩的脑区域与构成DMN的主要的脑区域几乎重叠,期待由安静时的fMRI图像解析成为新的神经疾病的理解的线索。
最近发表,得知安静时脑功能网络的小世界性及模块性伴随年龄的增加而降低,由于这些功能的变化在一般脑委缩等的解剖学变化之前发生,有在年龄的增加及认知症的研究中成为有用的标志物的可能性(非专利文献17)。
满足基于由本发明人的前述的基本概念的最新的PLs的认知功能改善效果判断的下述要件的临床试验:
*委托专门机关的JACTA(东京)实施,
*随机-双盲检-安慰剂组对照,
*使用革新的PLs组合物的认知功能改善性食品
*对于严选的健康受试者(机关注册者的书面考核135名认知功能3阶层问诊挑选81名试验责任者的接见挑选75名排除71名试验中发觉的不合格者),
*极其低日用量、0.25mg和0.5mg、
*极其短期间的12周内、
而且,仅在第6周,确认到认知功能的显著并且即效的改善效果(非专利文献25)、被评价为惊人的成果。
以往的关于认知症[II相临床试验]的实施方法也有对象是脑的情况,试验结果的合理的客观化是困难的。直接的图像解析方法也因装置过高额,或图像解析缺乏合理性而再现性有问题等而无得到了学术的认知的。
为了直接检验脑内Aβ和τ蛋白的动态,有进行“腰椎穿刺”的必要,但极其侵袭性高,无通用性。
由直近的报告,在量子科学技术研究开发机构-放射线医学综合研究所开发了使PET(Positoron Emission Tomography,正电子放射断层摄影)改良小型化而头部专用PET,与以往PET比装置的成本是原先的1/3,再者,也成功地使海马附近的灵敏度提升(非专利文献28)。
另外,在同所成功开发用于将[τ蛋白]用PET观察的检查药[PBB3],变得可用PET与Aβ一同还观察[τ蛋白]。
本发明人驱使所述[淀粉样PET-PIB]而进行在悬案的认知功能改善中的[DHA-PLs]对比[PLs]的效能评价[临床试验],得到极其令人深感兴趣的结果。
实施例
以下,基于验证例和调制例及实施例而具体性地说明本发明,但本发明不限定于下述的例。
含有调制例1[生物体组织提取用PLs的磷脂的制造]
含有[生物体组织提取PLs的磷脂的制造]
1.从废鸡的去四肢的带头屠体调制复合脂质
从作为鸡组织的产卵废鸡的新鲜的去四肢的带头屠体(从“去内脏屠体”拔去“腿”的屠体)调制复合脂质。
从废鸡处理中心筹备去四肢的带头屠体,调制约8mm的肉糜1kg。缓慢冷冻该肉糜而进行保存。使用时,在用温流水强制解冻后压榨而进行脱水-脱油。将其[过加热水](Aquagas;注册商标)在“无氧的气氛”(氧0.5容量%以下)下烹饪5分钟后,用真空冷却方式进行急冷脱水。将得到的脱水-脱油-调理-杀菌完了胸肉在低温粉碎后供于乙醇3相分离工序。
[3相分离工序]
向容器放入上述中得到的调理-杀菌完了的粉碎去四肢的带头屠体而进行脱气,向此容器加脱气完了的800ml的乙醇而在密封下、于35℃持续10小时缓慢搅拌之后在冰冷下静置而分离上层的鸡油分和固体沉淀蛋白分等而得到含水乙醇级分(密封冷藏储存)。向蛋白分等加脱气乙醇800ml,重复同样的提取操作,用离心分离对乙醇相进行分液,在密封下冰冷却,并且减压浓缩。将水溶性低分子级分的固体成分过滤分离后,减压蒸发干燥,得到含有PLs的磷脂(复合脂质)7g。
(1)总脂质的区分
用Folch法提取-分配-分离的总脂质是26.5质量%。
(2)磷脂的表征检验
用常规方法的名达等的HPLC/ELSD法测定。
(3)在上述结果的[mg/100g去四肢的带头屠体]中的一览表述
TL(总脂质):26.5质量%、TPL(总磷脂):0.6质量%
PL-PE(乙醇胺型PLs):104、PE(磷脂酰乙醇胺):43、PL-PC(胆碱型PLs):49、PC(磷脂酰胆碱):327、SM(鞘磷脂):74
(4)去四肢的带头屠体特异性磷脂的构成比
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=2.1:1
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:7.6
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:2.4
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=7:1
2.从废鸡的生鸡骨头调制复合脂质
仿兜处理。
(1)脂质的区分
用Folch法提取分分配离的总脂质是14质量%。
(2)磷脂的表征检验
用常规方法的名达等的HPLC/ELSD法测定。
(3)用上述结果的[mg/100g生鸡骨头]的一览表述
TL(总脂质):14质量%、TPL(总磷脂):0.73%
PL-PE(乙醇胺型PLs):149、PE(磷脂酰乙醇胺):119、PL-PC(胆碱型PLs):42、PC(磷脂酰胆碱):283、SM(鞘磷脂):60
(4)生鸡骨头特异性磷脂的构成比
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=3.5:1
(2)酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:2.4
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:2.1
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=10:1
3.从废鸡的肠调制复合脂质
仿兜处理。
(1)脂质的区分
用Folch法提取分分配离的总脂质是32质量%。
(2)磷脂的表征检验
用常规方法的名达等的HPLC/ELSD法测定。
(3)在上述结果的[mg/100g生鸡骨头]中的一览表述
TL(总脂质):32质量%、TPL(总磷脂):1质量%
PL-PE(乙醇胺型PLs):169、PE(磷脂酰乙醇胺):88、PL-PC(胆碱型PLs):14、PC(磷脂酰胆碱):379、SM(鞘磷脂):86
(4)肠特异性总脂质的构成比
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=12:1
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:4.3
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:2.6
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=7,6:1
4.从废鸡的沙肝调制复合脂质
仿兜处理。
(1)脂质的区分
用Folch法提取分分配离的总脂质是7.9质量%。
(2)磷脂的表征检验
用常规方法的名达等的HPLC/ELSD法测定。
(3)在上述结果的[mg/100g沙肝]中的一览表述
TL(总脂质):7.9质量%、TPL(总磷脂):0.88质量%
PL-PE(乙醇胺型PLs):111、PE(磷脂酰乙醇胺):91、PL-PC(胆碱型PLs):23、PC(磷脂酰胆碱):255、SM(鞘磷脂):118
(4)沙肝特异性构成比
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=4.8:1
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:2.8
(3)醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:2.6
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=4.1:1
5.从金冠调制复合脂质
(1)产卵废鸡的金冠
仿兜处理。
(1)脂质的区分
用Folch法提取分分配离的总脂质是31质量%。
(2)磷脂的表征检验
用常规方法的名达等的HPLC/ELSD法测定。
(3)在上述结果的[mg/100g金冠]中的一览表述
TL(总脂质):31质量%、TPL(总磷脂):9.5质量%
PL-PE(乙醇胺型PLs):200、PE(磷脂酰乙醇胺):1,574、PL-PC(胆碱型PLs):0、PC(磷脂酰胆碱):7,542、SM(鞘磷脂):145
(4)金冠特异性磷脂的构成比
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=200:0
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:4.8
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:45
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=64:1
(2)种鸡雌的金冠
(1)脂质的区分
用Folch法提取分分配离的总脂质是39.3质量%。
(2)磷脂的表征检验
用常规方法的名达等的HPLC/ELSD法测定。
(3)在上述结果的[mg/100g金冠]中的一览表述
TL(总脂质):39.3质量%、TPL(总磷脂):12.2质量%
PL-PE(乙醇胺型PLs):551、PE(磷脂酰乙醇胺):2、236、PL-PC(胆碱型PLs):0、PC(磷脂酰胆碱):10,592、SM(鞘磷脂):339
(4)金冠特异性磷脂的构成比
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=551:0
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:4.7
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:23.3
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=40:1
6.从废鸡的表皮调制复合脂质
仿兜处理。
(1)脂质的区分
用Folch法提取分分配离的总脂质是46质量%。
(2)磷脂的表征检验
用常规方法的名达等的HPLC/ELSD法测定。
(3)在上述结果的[mg/100g皮]中的一览表述
TL(总脂质):46质量%、TPL(总磷脂):0.72质量%
PL-PE(乙醇胺型PLs):58、PE(磷脂酰乙醇胺):21、PL-PC(胆碱型PLs):17、PC(磷脂酰胆碱):95、SM(鞘磷脂):55
(4)皮特异性磷脂的构成比
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=3.4:1
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:4.5
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:1.5
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=3.5:1
7.从废鸡的胸肉调制复合脂质
从废鸡处理中心筹备作为鸡组织的产卵废鸡的新鲜的剥皮胸肉,调制约8mm的肉糜1kg。缓慢冷冻该肉糜而进行保存。使用时,在用温流水强制解冻后压榨而进行脱水-脱油。将其[过加热水](Aquagas;RTM)在“无氧的气氛”(氧0.5容量%以下)下烹饪5分钟后,用真空冷却方式进行急冷脱水。将得到的脱水-脱油-调理-杀菌完了胸肉在低温粉碎后供于乙醇3相分离工序。
[3相分离工序]
向容器放入上述中得到的调理-杀菌完了的粉碎胸肉而进行脱气,向此容器加脱气完了的800ml的乙醇而在密封下、于35℃持续10小时缓慢搅拌之后在冰冷下静置,分离上层的鸡油分和固体沉淀蛋白分而得到含水乙醇级分(密封冷藏储存)。向蛋白分加脱气乙醇800ml,重复同样的提取操作,用离心分离对乙醇相进行分液,在密封下冰冷却,并且减压浓缩。将水溶性低分子级分的固体成分过滤分离后,减压蒸发干燥,得到含有PLs的磷脂(复合脂质)7g。
(1)总脂质的区分
用Folch法提取-分配-分离的总脂质是1.8质量%。
(2)磷脂的表征检验
用常规方法的名达等的HPLC/ELSD法测定[专利文献1]。
(3)在上述结果的[mg/100g胸肉]中的一览表述
TL(总脂质):1.8质量%、TPL(总磷脂):0.7质量%
PL-PE(乙醇胺型PLs):61、PE(磷脂酰乙醇胺):44、PL-PC(胆碱型PLs):124、PC(磷脂酰胆碱):276、SM(鞘磷脂):32
(4)胸肉特异性磷脂的构成比
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:2
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:6.3
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:1.7
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=16:1
调制例2
[从复合脂质调制纯化PLs]
1.从废鸡去四肢的带头屠体的复合脂质调制纯化PLs
使上述的含有PLs的磷脂(复合脂质)20g分散到磷酸脂肪酶A1(三菱化学食品)溶液400ml(10mg/ml 0.1M柠檬酸-盐酸缓冲液)中,氮气填充下于50℃搅拌2小时。冰冷下、加2倍容量的己烷而搅拌2次、分配,回收上层而浓缩干燥。再者,将向干燥物加60ml丙酮而进行搅拌、离心,回收沉淀的操作重复2次。
再者,向该沉淀加己烷/丙酮(7:3)60ml而搅拌、离心,回收液层。浓缩干燥此液层之后,加己烷/丙酮(1:1)240ml而移到分液漏斗,添加水36ml而进行搅拌、分配。舍去下层,向上层加丙酮/水(5:3)96ml而搅拌-分配。回收上层,快速减压干燥而得到鸡去四肢的带头屠体来源的纯化PLs。
[废鸡去四肢的带头屠体来源的纯化PLs的纯度的检验]
基于名达等的方法([专利文献1])而进行纯度检验。纯度是93.6质量%。
2.从废鸡生鸡骨头的复合脂质调制纯化PLs
使上述的含有缩醛磷脂的磷脂20g分散到磷酸脂肪酶A1(三菱化学食品)溶液400ml(10mg/ml 0.1M柠檬酸-盐酸缓冲液)中,氮气填充下于50℃搅拌2小时。冰冷下、加2倍容量的己烷而搅拌2次、分配,回收上层而浓缩干燥。再者,将向干燥物加60ml丙酮而搅拌、离心,回收沉淀的操作重复2次。再者,向该沉淀加己烷/丙酮(7:3)60ml而搅拌、离心,回收液层。
浓缩干燥此液层之后,加己烷/丙酮(1:1)240ml而移到分液漏斗,添加水36ml而进行搅拌、分配。舍去下层,向上层加丙酮/水(5:3)96ml而搅拌-分配。回收上层,快速减压干燥而得到废鸡生鸡骨头来源的纯化PLs。
[废鸡生鸡骨头来源的纯化PLs的纯度的检验]
基于名达等的方法而进行纯度检验。纯度是94.3质量%。
3.从废鸡肠的复合脂质调制纯化PLs
使上述的含有PLs的磷脂20g分散到磷酸脂肪酶A1(三菱化学食品)溶液400ml(10mg/ml 0.1M柠檬酸-盐酸缓冲液)中,氮气填充下于50℃搅拌2小时。冰冷下、加2倍容量的己烷而搅拌2次、分配,回收上层而浓缩干燥。再者,将向干燥物加60ml丙酮而搅拌、离心,回收沉淀的操作重复2次。再者,向该沉淀加己烷/丙酮(7:3)60ml而搅拌、离心,回收液层。
浓缩干燥此液层之后,加己烷/丙酮(1:1)240ml而移到分液漏斗,添加水36ml而进行搅拌、分配。舍去下层,向上层加丙酮/水(5:3)96ml而搅拌-分配。回收上层,快速减压干燥而得到废鸡肠来源的纯化PLs。
[废鸡的肠来源的纯化缩醛磷脂的纯度的检验]
基于名达等的方法而进行纯度检验。纯度是91质量%。
4.从废鸡沙肝的复合脂质调制纯化缩醛磷脂
使上述的含有PLs的磷脂20g分散到磷酸脂肪酶A1(三菱化学食品)溶液400ml(10mg/ml 0.1M柠檬酸-盐酸缓冲液)中,氮气填充下于50℃搅拌2小时。冰冷下、加2倍容量的己烷而搅拌2次、分配,回收上层而浓缩干燥。再者,将向干燥物加60ml丙酮而搅拌、离心,回收沉淀的操作重复2次。再者,向该沉淀加60ml己烷/丙酮(7:3)而搅拌、离心,回收液层。
浓缩干燥此液层之后,加己烷/丙酮(1:1)240ml而移到分液漏斗,添加水36ml而进行搅拌、分配。舍去下层,向上层加丙酮/水(5:3)96ml而搅拌-分配。回收上层,快速减压干燥而得到废鸡沙肝来源的纯化缩醛磷脂3g。
[鸡沙肝来源的纯化PLs的纯度的检验]
基于名达等的方法而进行纯度检验。纯度是95.4质量%。
5.从鸡金冠的复合脂质调制纯化PLs
(1)废鸡来源金冠
使上述的含有PLs的磷脂20g分散到磷酸脂肪酶A1(三菱化学食品)溶液400ml(10mg/ml 0.1M柠檬酸-盐酸缓冲液)中,氮气填充下于50℃搅拌2小时。冰冷下、加2倍容量的己烷而搅拌2次、分配,回收上层而浓缩干燥。再者,将向干燥物加60ml丙酮而搅拌、离心,回收沉淀的操作重复2次。再者,向该沉淀加60ml己烷/丙酮(7:3)而搅拌、离心,回收液层。
浓缩干燥此液层之后,加己烷/丙酮(1:1)240ml而移到分液漏斗,添加水36ml而进行搅拌、分配。舍去下层,向上层加96ml丙酮/水(5:3)而搅拌-分配。回收上层,快速减压干燥而得到废鸡金冠来源的纯化PLs。
[废鸡金冠来源的纯化缩醛磷脂的纯度的检验]
基于名达等的方法而进行纯度检验。纯度是95.6质量%。
(2)种鸡雌的金冠
根据上述调制种鸡雌金冠来源的纯化PLs。
[废鸡金冠来源的纯化PLs的纯度的检验]
基于名达等的方法而进行纯度检验。纯度是96.7质量%。
6.从废鸡皮的复合脂质调制纯化PLs
使上述的含有PLs的磷脂20g分散到磷酸脂肪酶A1(三菱化学食品)溶液400ml(10mg/ml 0.1M柠檬酸-盐酸缓冲液)中,氮气填充下于50℃搅拌2小时。冰冷下、加2倍容量的己烷而搅拌2次、分配,回收上层而浓缩干燥。再者,将向干燥物加60ml丙酮而搅拌、离心,回收沉淀的操作重复2次。再者,向该沉淀加60ml己烷/丙酮(7:3)而搅拌、离心,回收液层。
浓缩干燥此液层之后,加己烷/丙酮(1:1)240ml而移到分液漏斗,添加水36ml而进行搅拌、分配。舍去下层,向上层加96ml丙酮/水(5:3)而搅拌-分配。回收上层,快速减压干燥而得到废鸡皮来源的纯化PLs。
[废鸡皮来源的纯化PLs的纯度的检验]
基于名达等的方法而进行纯度检验。纯度是96.7质量%。
7.从废鸡胸肉的复合脂质调制纯化PLs
使上述的含有PLs的磷脂(复合脂质)20g分散到磷酸脂肪酶A1(三菱化学食品)溶液400ml(10mg/ml 0.1M柠檬酸-盐酸缓冲液)中,氮气填充下于50℃搅拌2小时。冰冷下、加2倍容量的己烷而搅拌2次、分配,回收上层而浓缩干燥。再者,将向干燥物加60ml丙酮而搅拌、离心,回收沉淀的操作重复2次。
再者,向该沉淀加60ml己烷/丙酮(7:3)而搅拌、离心,回收液层。浓缩干燥此液层之后,加己烷/丙酮(1:1)240ml而移到分液漏斗,添加水36ml而进行搅拌、分配。舍去下层,向上层加96ml丙酮/水(5:3)而搅拌-分配。回收上层,快速减压干燥而得到鸡胸肉来源的纯化PLs。
[废鸡胸肉来源的纯化缩醛磷脂的纯度的检验]
基于名达等的方法([专利文献1])而进行纯度检验。纯度是94质量%。
调制例3
[含有ω-3HUFA衍生物的饲料而饲养的产卵成鸡的制出和有其位点特异性的构成比并且含有ω-3HUFA结合型的PLs的磷脂(复合脂质)的调制]
~饲养条件~
a.产卵鸡种和饲养羽数:Julia30羽
b.同上的日龄:700日龄
c.同上的平均体重:1.8kg
含有d.ω-3HUFA衍生物的饲料:含有DHA-TG25%(EPA-TG6%)的鲣油5%添加的市售产卵鸡用饲料(玉米62%,植物油20%,动物基本饲料6%,此外12%)
e.同上施用期间:4周
f.饲育环境:笼饲育
g.处死日龄:735日龄
h.饲养结束后的结果:
[ω-3HUFA转移组织-部位的复合脂质的磷脂的表征解析和其纯化PLs结合DHA比率的检验]
1.去四肢的带头屠体
(1)各脂质的区分:总脂质:26.5质量%总磷脂:0.6质量%
(2)磷脂的表征
(1)依据HPLC/ELSD法。
(2)将表征设为mg/100g(兜)而记载如下。
PL-PE:114、PE:43、PL-PC:54、PC:276、SM:74
(3)去四肢的带头屠体的PLs的结合DHA的检验
(1)PLs的调制
仿名达等的方法调制,得到的PLs的纯度是94.6质量%(明细、PL-PC:30.4%、PL-PE:64.2%)。
(2)PLs的脂肪酸组成解析
将上述PLs用常规方法甲基酯化,实施脂肪酸组成分析。PLs的SN-2结合脂肪酸中的DHA的构成比是64%。
2.生鸡骨头
(1)各脂质的区分:总脂质:14质量%总磷脂:0.73质量%
(2)磷脂的表征
(1)依据HPLC/ELSD法。
(2)将表征设为mg/100g(生鸡骨头)而记载如下。
PL-PE:164、PE:119、PL-PC:46、PC:283、SM:60
(3)生鸡骨头的PLs的结合DHA的检验
(1)缩醛磷脂的调制
仿名达等的方法调制,得到的PLs的纯度是94.4质量%(明细、PL-PC:20.8%、PL-PE:73.6%)。
(2)PLs的脂肪酸组成解析
将上述PLs用常规方法甲基酯化,实施脂肪酸组成分析。PLs的SN-2结合脂肪酸中的DHA的构成比是69%。
3.肠
(1)各脂质的区分:TL:32%TPL:1%
(2)磷脂的表征
(1)依据HPLC/ELSD法。
(2)将表征设为mg/100g(肠)而记载如下。
PL-PE:186、PE:88、PL-PC:16、PC:379、SM:86
(3)肠的PLs的结合DHA的检验
(1)PLs的调制
仿名达等的方法调制,得到的PLs的纯度是92.4质量%(明细、PL-PC:7.3%、PL-PE:85.1%)。
(2)PLs的脂肪酸组成解析
将上述PLs用常规方法甲基酯化,实施脂肪酸组成分析。PLs的SN-2结合脂肪酸中的DHA的构成比是70%。
4.沙肝
(1)各脂质的区分:总脂质:7.9质量%总磷脂:0.9质量%
(2)磷脂的表征
(1)依据HPLC/ELSD法。
(2)将表征设为mg/100g(沙肝)而记载如下。
PL-PE:122、PE:91、PL-PC:25、PC:255、SM:118
(3)沙肝的PLs的结合DHA的检验
(1)缩醛磷脂的调制
仿名达等的方法调制,得到的PLs的纯度是95质量%(明细、PL-PC:16.2%、PL-PE:78.8%)。
(2)PLs的脂肪酸组成解析
将上述PLs用常规方法甲基酯化,实施脂肪酸组成分析。PLs的SN-2结合脂肪酸中的DHA的构成比是69%。
5.金冠
[产卵成鸡]
(1)各脂质的区分:总脂质:31质量%总磷脂:9.5质量%
(2)磷脂的表征
(1)依据HPLC/ELSD法。
(2)将表征设为mg/100g(金冠)而记载如下。
PL-PE:220、PE:1574、PL-PC:0、PC:7,542、SM:145
(3)金冠的PLs的结合DHA的检验
(1)PLs的调制
仿名达等的方法调制,得到的PLs的纯度是96质量%(明细、PL-PC:0%、PL-PE:96%)。
(2)PLs的脂肪酸组成解析
将上述PLs用常规方法甲基酯化,实施脂肪酸组成分析。PLs的SN-2结合脂肪酸中的DHA的构成比是69%。
[种鸡雌]
(1)各脂质的区分:总脂质:39质量%总磷脂:12.2质量%
(2)磷脂的表征
(1)依据HPLC/ELSD法。
(2)将表征设为mg/100g(金冠)而记载如下。
PL-PE:551、PE:2、238、PL-PC:0、PC:10,592、SM:339
(3)金冠的PLs的结合DHA的检验
(1)PLs的调制
仿名达等的方法调制,得到的PLs的纯度是97质量%(明细、PL-PC:0%、PL-PE:97%)。
(2)PLs的脂肪酸组成解析
将上述PLs用常规方法甲基酯化,实施脂肪酸组成分析。PLs的SN-2结合脂肪酸中的DHA的构成比是70%。
6.皮(表皮)
(1)各脂质的区分:总脂质:31质量%总磷脂:9.5质量%
(2)磷脂的表征
(1)依据HPLC/ELSD法。
(2)将表征设为mg/100g(皮)而记载如下。
PL-PE:58、PE:21、PL-PC:17、PC:95、SM:55
(3)皮的PLs的结合DHA的检验
(1)PLs的调制
仿名达等的方法调制,得到的PLs的纯度是96质量%(明细、PL-PC:21.8%、PL-PE:74.2%)。
(2)PLs的脂肪酸组成解析
将上述PLs用常规方法甲基酯化,实施脂肪酸组成分析。PLs的SN-2结合脂肪酸中的DHA的构成比是67%。
7.胸肉
(1)各脂质的区分:TL:1.9%、TPL:0.8%
(2)磷脂的表征
(1)依据HPLC/ELSD法。
(2)将表征设为mg/100g(胸肉)而记载如下。
PL-PE:67、PE:44、PL-PC:136、PC:276、SM:32
(3)胸肉的PLs的结合DHA的检验
(1)纯化PLs的调制
仿名达等的方法调制,得到的PLs的纯度是95.4质量%(明细、PL-PC:36.8%、PL-PE:58.6%)。
(2)PLs的脂肪酸组成解析
将上述PLs用常规方法甲基酯化,实施脂肪酸组成分析。PLs的SN-2结合脂肪酸中的DHA的构成比是65%。
8.鸡蛋的卵黄
(1)各脂质的区分:总脂质:32.1质量%总磷脂:9.8质量%
(2)磷脂的表征
(1)依据HPLC/ELSD法。
(2)将表征设为mg/100g(金冠)而记载如下。
PL-PE:100、PE:1,624、PL-PC:5、PC:7,942、SM:133
(3)金冠的PLs的结合DHA的检验
(1)PLs的调制
仿名达等的方法调制,得到的PLs的纯度是97质量%(明细、PL-PC:5%、PL-PE:92%)。
(2)PLs的脂肪酸组成解析
将上述PLs用常规方法甲基酯化,实施脂肪酸组成分析。PLs的SN-2结合脂肪酸中的DHA的构成比是75%。
调制例4
[卵黄来源的含有PLs的磷脂(复合脂质)的提取分离]
向生卵黄100g混合乙醇20g而在室温放置10分钟后,再者,加20%含水乙醇120g而搅拌。将其以2000rpm离心分离5分钟,则分离为自上层起黄色透明的卵黄油相、黄白色的复合脂质乳化相、几乎白色的卵黄蛋白沉淀的3相。分开卵黄油相和乳化相,将沉淀相用20%含水乙醇50g提取,同样地离心分离而将上清和上述乳化相合起来在减压下浓缩,则得到了黄色的卵黄复合脂质11.5g(丙酮不溶部80%)。
(1)脂质的区分
用Folch法提取分分配离的总脂质是33.5质量%。
(2)磷脂的表征检验
用常规方法的名达等的方法的HPLC/ELSD法进行测定。
(3)在上述结果的[mg/100g卵黄]中的一览表述
TL(总脂质):33.5%
TPL(总磷脂):9.5%
PLs([PL-PE]+[PL-PC](乙醇胺型PLs+胆碱型PLs)):0
PE(磷脂酰乙醇胺):1,574
PC(磷脂酰胆碱):7,542
SM(鞘磷脂):145
(4)对卵黄的复合脂质具有特异性的磷脂的构成比
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=-
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:4.8
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=-
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=62.9:1
[种鸡雌的金冠来源的含有PLs的磷脂(复合脂质)的提取分离]
向金冠100g混合乙醇20g而在室温放置10分钟后,再者,加20%含水乙醇120g而搅拌。将其以2000rpm离心分离5分钟,则分离为自上层起黄色透明成金冠油相、黄白色的复合脂质乳化相、几乎白色的卵黄蛋白沉淀的3相。分开金冠油相和乳化相,将沉淀相用20%含水乙醇50g提取,同样地离心分离而将上清和上述乳化相合起来在减压下浓缩,则得到了黄色的金冠复合脂质12.2g(丙酮不溶部80%)。
(1)脂质的区分
用Folch法提取分分配离的总脂质是39.3质量%。
(2)磷脂的表征检验
用常规方法的名达等的方法的HPLC/ELSD法进行测定。
(3)在上述结果的[mg/100g卵黄]中的一览表述
TL(总脂质):39.3%
TPL(总磷脂):12.2%
PLs([PL-PE]+[PL-PC](乙醇胺型PLs+胆碱型PLs)):551
PE(磷脂酰乙醇胺):2、233
PC(磷脂酰胆碱):10,592
SM(鞘磷脂):339
(4)对于金冠的复合脂质特异性的磷脂的构成比
(1)PLs:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:[~0.1]
(2)二酰基甘油磷脂:[乙醇胺型]:[胆碱型]=1:4.7
(3)[醚甘油磷脂]:[二酰基甘油磷脂]=1:23
(4)[总甘油磷脂]:[总鞘磷脂]=40:1
调制例5
[以废鸡胸肉作为原料的2种生成物的组成]
1.复合脂质组合物:mg/g
PLs类6~60、非缩醛磷脂磷脂9.6~84.3、鹅肌肽0.4~3.6、肌肽0.07~0.6、游离氨基酸0.24~2.4、维生素E0.12~1.2、肉毒碱0.3~3、辅酶Q10
0.12~1.2
2.蛋白-脂质复合化组合物
蛋白分87.1、复合脂质分1.4、低分子水溶性级分3.2
验证例1
1.对于认知功能及关联事件的鸡来源PLs的及的效果等的测定(检验)例
所述测定试验用PLs如下所述调制。
[鸡种和其部位]
从废鸡处理中心筹备产卵废鸡的剥皮胸肉肉糜。
[总脂质的调制]
外订冷冻干燥上述肉糜,将其用乙醇通过常规方法缓慢提取而调制胸肉来源总脂质。
[复合脂质的调制]
向上述总脂质的乙醇溶液适宜加水而脱树胶(脱中性脂质)而调制复合资质。
[甘油磷脂的调制]
将该复合脂质通过常规方法用己烷/丙酮(7:3)处理而调制脱鞘磷脂、纯化甘油磷脂。
[高纯度PLs的调制]
常规方法通过,用PLA1酶将二酰基甘油磷脂变换为溶血体而调制纯度90质量%左右的PLs。
2.经口施用的废鸡胸肉PLs的消化吸收性的验证例
(1)依据大鼠的血中PLs增加,确认到经口施用的有效性(非专利文献15)。
(2)依据使LPS诱发性中枢神经系炎症模型小鼠的脑内PLs浓度增加,确认到来自经口施用PLs的血脑屏障的脑内吸收(非专利文献8)。
(3)通过AD患者的血中PLs浓度增加,验证对于人、尤其是AD患者的经口施用的有效性(非专利文献16)。
3.废鸡胸肉PLs认知功能障碍的发病抑制(预防)和缓和及治疗效果的验证例
(1)根据老化模型大鼠(SAMP8)的神经细胞新生,验证由废鸡胸肉PLs的认知功能障碍的缓和和其治疗效果的可能性(专利文献7)。
(2)对Aβ的两侧注入模型大鼠的由废鸡胸肉缩醛磷脂的空间认知学习功能障碍的抑制作用表达立证废鸡胸肉PLs的认知功能障碍的治疗效果的可能性(非专利文献16)。
4.LPS诱发性中枢神经系炎症模型小鼠的炎症症状的缓和作用的验证例(非专利文献8)
(1)由废鸡胸肉PLs的微神经胶质的活化抑制立证经其中枢神经系炎症的认知功能障碍的缓和-治疗的可能性。
(2)由废鸡胸肉PLs的脑内细胞因子的TNFα的m-RNA的增加和脑内IL-2β的表达抑制作用立证经由废鸡胸肉PLs的中枢神经系炎症的认知功能障碍的缓和和治疗的可能性。
(3)由废鸡胸肉PLs的脑内Aβ的蓄积抑制作用立证经其中枢神经系炎症的认知功能障碍的缓和-治疗的可能性。
5.腹腔内注射LPS诱发性的中枢神经系炎症模型小鼠的中枢神经系炎症和Aβ蓄积的抑制作用的检验([非专利文献8])
(1)经由废鸡胸肉PLs的中枢神经系神经胶质细胞的活化抑制的中枢神经系炎症的消炎立证废鸡胸肉PLs的认知功能障碍的预防和缓和作用的可能性。
(2)由废鸡胸肉PLs的向前额皮质及海马的Aβ蓄积的抑制作用立证经废鸡胸肉PLs的Aβ蓄积的抑制作用的认知功能障碍的抑制效果的可能性。
(3)立证废鸡胸肉PLs经由腹腔内注射LPS而诱发的炎症引发的PLs的减少的抑制的认知功能障碍的抑制效果的可能性。
(4)立证废鸡胸肉PLs经在神经细胞培养系中的神经细胞死亡的抑制而发挥直接治疗伴随神经细胞死亡的认知功能障碍的作用的可能性。(非专利文献9)
(5)此外
(1)立证废鸡胸肉来源复合脂质级分经其认知功能障碍发病危险因子的高血糖及高脂血的抑制而使认知功能障碍的发病延迟的作用表达的可能性。([非专利文献18])
(2)立证废鸡胸肉来源复合脂质组合物经由肌肽食的认知功能降低的抑制而将认知功能障碍预防及或缓和作用表达的可能性。(非专利文献19)
验证例2
1.对应于废鸡胸肉PLs的认知功能障碍抑制效能的鸡来源DHA结合型PLs的认知功能障碍的抑制效能显著地增大与否的验证例
(1)与PLs的DHA的结合适性的验证
储藏PLs是DHA的主要的磷脂([非专利文献26])。
(2)DHA-PLs的生物化学-生理学特异性的验证
(1)在单分子(游离)中,水系(乳浊)的方更稳定([非专利文献1])。
(2)在复合系(脂质双层)中,由于是主要的膜构成成分,比单分子系远远更稳定化。
(3)被认为DHA-PLs由作为与不稳定的乙烯基醚键邻接结合的大块头的脂肪酸的DHA,自由基或活性酸性水等向乙烯基醚键位置的接近被立体位阻地阻断的结果而被稳定化([非专利文献1])。
(4)结合于甘油磷脂的SN-2位的脂肪酸残基最难以被水解,消化吸收系统也不被分解而顺利通过而吸收,并且相辅以PLs也摄入到血中,判断为DHA-PLs有效地向血中转移。
(5)对于自血脑屏障的脑内转移性,DHA以甘油酯结构体无法向脑内转移,必须考虑磷脂结构,并且PLs的DHA的结合选择性大(上述)、DHA-PLs结构即使称为血脑屏障通过的最敌分子种形态也不过言。
(6)向脑内转移后,DHA通过接近PLs产生系的神经细胞内小泡体过氧化物酶体而促进PLs生物合成系的限速酶Far1(脂肪酰基-CoA还原酶1)的表达来使PLs产生亢进([非专利文献10])。
(7)脑内PLs的浓度增加经主要中枢神经系炎症的抑制,促进认知功能障碍的表达抑制和其缓和及治疗(非专利文献7、非专利文献8、非专利文献10、及专利文献1)。
以上、相辅以对于其分子内的直接的稳定化和认知功能障碍的改善-矫正的协同效果而DHA-PLs可被称为对于认知功能的改善-维持-提升最适的分子种。
验证例3
(1)从成年期起预防是必要的
(1)作为美国华盛顿大学的Morris教授统括的DIAN*研究项目的划时代的成果,得知了从40多岁发生Aβ及τ蛋白的脑内蓄积的结果,由于处于认知症发病诊断时导致“末期状态”,得知几乎没有对于该认知症患者的治疗法。
*Dominantly Inherited Alzheimer Network(遗传性阿尔茨海默病网络):由于通过从AD发病前的状态长期追踪具有家族性AD的成因基因的可能性高的家族(100名强),旨在发现可检测到向AD的变化与否,进而从出现症状的多久前,脑部呈现变化,在2005年起始7年后的2012年得到了上述的划时代的成果(非专利文献30Morris,JC.et,al.Clinicaland biomarker changes in dominantly Inherited Alzheimer’s disease.N Engl JMed.2012 Aug 30;367(9)795-804、[非专利文献20][治疗阿尔茨海默病!]
NHKSpecial取材班著(主妇和生活公司2014))
(2)要求首先抑制作为AD发病的先驱的症状的Aβ的蓄积,再抑制与该[Aβ的蓄积]连动而发生的τ蛋白的神经元内凝集([τ的纠缠];诱发神经元死)。
(3)以上的症状发病将微神经胶质细胞活化为“战斗模式”,因释放的强氧化性因子或细胞因子的攻击而结果导致神经元死亡,因此,要求抑制“微神经胶质活化”。
(2)贡献于上述脑内异常的矫正的产卵成鸡胸肉PLs(以下,称为“胸肉PLs”)的各种作用
(1)胸肉PLs抑制[脑内Aβ的蓄积](专利文献第1)。
(2)胸肉PLs抑制脑内微神经胶质的活化(非专利文献8)。
(3)胸肉PLs抑制神经元凋亡(非专利文献9)。
(4)依据胸肉PLs抑制脑内细胞因子的TNFα-mRNA亢进及IL-2β的表达而抑制神经元的损耗(非专利文献8)。
(5)胸肉PLs促进神经元新生(专利文献7)。
胸肉PLs的上述诸々的作用经由[Aβ的蓄积]抑制及神经元内凝集[τ蛋白]诱发性细胞死亡的神经元新生的补强各,自40多岁的长期PPLs摄取可成为有效的预防方法。
(3)附在胸肉PLs的“四安*”:*安心-安全-稳定-廉价
(1)安心
(i)胸肉的由人类的食经验是一直以来的并且其消费量也是巨量。
(ii)在飞翔时要求长时间的活动的胸肉被认为相当于哺乳类的心肌。
故而,由于是能多消费器官,副生高氧化性物质也多,适合地防御其的抗氧化系的构建是必然的。形成此中核是细胞膜构成成分的强还原性PLs,因此被认为含量多。
(iii)依据上述,PLs是生物体内细胞膜构成的重要成分,是实占人全磷脂的18%的“通用性”磷脂。
(iv)PLs通常在细胞内小泡体[过氧化物酶体]中产生,但由于随着年龄的增加而其生物合成能力降低,要求其补给。
(2)安全
(i)在胸肉PLs的制造中,排除一切的化学处理,以将安全且温和的提取处理和其纯化时所含的同类的磷脂组用天然来源的酶分解的方式蓄积。
(ii)原料胸肉从新鲜的产卵成鸡去内脏屠体分割,实施剥皮而制造的食用精肉而检验记录鸡种-鸡舍-摄取饲料-日龄的记录及残留农药和抗生物质-重金属。
(iii)产卵成鸡是日产品。
(3)稳定
(i)溶解于食用等级的生长酚中而谋求稳定化-抗氧化,
(ii)使其肠溶性软胶囊化而外贩、乃至
(iii)将其仅用天然食用成分温和地纳米乳化、
(iv)将纳米乳化液,
(i)软胶囊化、
(ii)向既有食品等添加指定量、
(iii)加赋形剂而喷雾干燥而粒剂-粉剂化,
(iv)将其锭剂化、或者
(v)与固体食品等的干混。
(4)廉价
(i)由于日用量0.5mg的极少量而完了,可以妥当的原价提供
(ii)上述的稳定化且保存稳定性良好,不需要原单位的水增
(iii)原料产卵成鸡(日产)在家禽中最廉价
(iv)胸肉在鸡精肉中最廉价,通常作为加工用的肉糜块流通
(v)胸肉在鸡精肉用部位中以最大的比率筹备性优良
验证例4
[网粘菌(Labyrinthula)类微生物的DHA磷脂的生产性]
(1)从在冲绳的红树汽水域采集的微细藻类分离的网粘菌(Labyrinthula)类微生物12B株所含有的DHA量均为21g(全DHA)/100g而数值错位高(参照下述的鱼类数据)、在其全脂肪酸中,实含有超50%的DHA,由北海道大学的奥山准教授等解明(专利文献16、许文献17)。
(1)鱼类的含有DHA(g/可食部100g)(非专利文献29)
(1)黑鲔:3.2
(2)鲭(大西洋产):2.3
(3)白鲑:2.0
(4)鰤:1.6
(5)秋刀鱼:1.6
(2)由新技术“葡萄糖饥饿发酵法”飞跃性提升磷脂、DHA含量进一步增加
网粘菌(Labyrinthula)类微生物12B株在葡萄糖存在下发酵,则蓄积大量的脂肪。接下来,通过实施葡萄糖饥饿而蓄积脂肪变换为磷脂的结果,DHA含量也增大。
(2)DHA磷脂的实用化目标
(1)现状(水准点高程)DHA磷脂:培养液(1g/L)的干燥重量中11%
(2)目标DHA磷脂:培养液(5-10g/L)的干燥重量中20%
(3)上述发酵培养液及或其干燥物作为ω-3HUFA衍生物非常地适宜
(1)生物体内缩醛磷脂产生系的过氧化物酶体的活化
(2)从血脑屏障容易地转移到脑内
(3)脑内DHA的常见型结构
接下来,基于实施例而具体性地说明本发明。
实施例1
[产卵废鸡的卵黄来源的纯化缩醛磷脂的调制]
根据名达等的方法([专利文献4])而调制95.6质量%纯度的缩醛磷脂(PLs)。
[种鸡雌的卵黄来源的纯化PLs的调制]
根据名达等的方法([专利文献4])而调制96.7质量%纯度的PLs。
实施例2
[卵黄来源的纯化PLs的纳米乳化和其稳定性的检验]
一边将95.6质量%PLs的10质量%δ生长酚溶液5g在含Kiraya皂苷15g的水溶液95g中用磁力搅拌器搅拌,一边滴下,持续搅拌至浑浊变没,则得到了纳米乳化液。用亚微米分析仪测定所述纳米乳化液中的油相粒子的平均粒径的结果,是58nm。将该纳米乳化液用水稀释为500倍,透明,使用柠檬酸调至pH4也完全无变化,即使于95℃加热30分钟后返回室温,无浑浊的发生,透明性无变化。使该纳米乳化稀释液在低温下蒸发干燥,用上述专利的方法(HPLC/ELSD)进行PLs的纯度检验的结果,确认到是94质量%。
实施例3
[卵黄来源的纯化PLs的纳米乳化液的形状变换和其稳定性]
(1)使淀粉水解物(例如,日淀科学(株)制的Amycol6H)30g溶解于在实施例1中调制的92质量%PLs的0.5质量%纳米乳化液的喷雾干燥该纳米乳化液100g之后,使用台式小喷雾干燥器(例如,大和科学(株)制)而进行入口热风温度110℃、出口温度于60℃喷雾干燥,得到了含有1质量%的92质量%PL-PE的粉末状制剂。此粉末状制剂的水稀释100倍液多少呈青色,透明。对此水稀释液中的油相粒子的粒度进行测定的结果,平均粒径是61nm。再者,该水稀释液使用柠檬酸调至pH4也完全无变化,另外,于95℃加热30分钟后,返回室温也无混浊等的变化。使此纳米乳化稀释液在低温下蒸发干燥,用上述专利的方法(HPLC/ELSD)进行PLs的纯度检验的结果,确认到是90质量%。
(2)卵黄来源的含有PL-PE的果冻的调制和其性状
向水8g溶解干燥卵清,向其加上等白糖14g而使溶解。向此液在搅拌下添加95%PLs的10质量%δ生长酚溶液120g而均一化,则得到了半透明的胶状的可溶化物。将其放进水中则得到略透明的水溶液。
实施例4
[从在调制例3中调制的产卵成鸡产生的鸡蛋得到的DHA转移卵黄提取-纯化PLs的DHA结合型PLs]
与调制例3同样地调制DHA转移卵黄复合脂质。
实施例5
[转移了DHA的卵黄来源的纯化PLs的调制]
根据名达等的方法的HPLC/ELSD法([专利文献4])而调制含有96%纯度的DHA结合PLs的PLs。
实施例6
[前项的PLs的DHA结合比例的测定]
根据常规方法而甲基酯化该PLs,对脂肪酸组成进行测定。结果,PLs的SN-2结合脂肪酸中的DHA结合比例(mol%)确证是75%。
实施例7
[96%纯度的DHA结合(75%)类型PLs的纳米乳化和其稳定性的检验]
与实施例2同样地进行而得到了纳米乳化液。用亚微米分析仪测定所述纳米乳化液中的油相粒子的平均粒径的结果,是37nm。
将该纳米乳化液用水稀释为500倍,则透明,使用柠檬酸调至pH4也完全无变化,即使于95℃加热30分钟后返回室温,无浑浊的发生,透明性无变化。使该纳米乳化稀释液在低温下蒸发干燥,用上述专利的方法(HPLC/ELSD)进行PLs的纯度检验的结果,确认到是95质量%。
实施例8
[纳米乳化液的形状变换和其稳定性]
仿实施例3,如下所述实施。
(1)在实施例1中调制的96质量%PLs的0.5质量%纳米乳化液的喷雾干燥
使淀粉水解物(例如,日淀科学(株)制的Amycol6H)30g溶解于该纳米乳化液100g之后,使用台式小喷雾干燥器(例如,大和科学(株)制)而进行入口热风温度110℃、出口温度于60℃喷雾干燥,得到了含有1质量%的96质量%PLs的粉末状制剂。此粉末状制剂的水稀释100倍液多少呈青色,透明。对此水稀释液中的油相粒子的粒度进行测定的结果,平均粒径是40nm。再者,该水稀释液使用柠檬酸调至pH4也完全无变化,另外,于95℃加热30分钟后,返回室温也无混浊等的变化。使此纳米乳化稀释液在低温下蒸发干燥,用上述专利的方法(HPLC/ELSD)进行PLs的纯度检验的结果,确认到是94质量%。
含有(2)DHA结合型PLs的果冻的调制和其性状
向水8g溶解干燥卵清,向其加上等白糖14g而使溶解。向此液在搅拌下添加96%PLs的10质量%δ生长酚溶液120g而均一化,则得到了半透明的胶状的可溶化物。其水稀释100倍液略透明,使用柠檬酸调至pH4也完全无变化,另外,于95℃加热30分钟后,返回室温也无混浊等的变化。使此纳米乳化稀释液在低温下蒸发干燥,用上述专利的方法(HPLC/ELSD)进行PLs的纯度检验的结果,确认到是95质量%。
实施例9
[92质量%PLs和DHA结合比例75mol%的96质量%PLs的稳定性比较试验]
(1)10质量%δ生长酚溶液的遮光下密封的50℃放置试验
通过含量的半衰期比较,92质量%PLs平均经1周就减半,与此相比DHA结合的96质量%PLs经4周也无减耗。
(2)10质量%δ生长酚溶液的0.1质量%纳米乳化液的遮光下密封而在60℃放置试验
通过含量的半衰期比较,92质量%PLs平均经5天减半,与此相比DHA结合的96质量%PLs经4周也几乎无减耗。
实施例10
[脱壳磷虾粗粉的卵黄改性效果的探讨]
~试验条件~
·产卵鸡种:Boris Brown42周龄56羽、28羽/区
·试验区:对照区-试验区
·饲料:市售饲料(2,850kcal/kg,CP17.0%)
试验区市售饲料85质量%+脱壳磷虾粗粉15质量%
·饲养期间:1周
~受试体处理和检验~
产生-的鸡蛋的处理:割卵后,对卵黄进行分离,将其冷冻干燥。用乙醇提取而分取脂质级分。
·脂质级分的脂质检验:气相层析及HPLC/ELSD
检验项目:EPA、DHA、PLs
~检验结果~
表1示探讨结果。
【表1】主要脂质的表征:质量%
区 |
饲料 |
EPA |
DHA |
PLs |
对照 |
市售饲料100% |
0 |
4.8 |
5.4 |
试验 |
市售85%+磷虾粗粉15% |
0 |
15.7 |
13.5 |
(数值是平均值)
~脱壳磷虾粗粉的添加效果:对照对比~
(1)EPA:0
(2)DHA:3.3倍提高
(3)PLs:2.5倍提高
以上确认到,依据脱壳磷虾粗粉的卵黄的显著的改性效果。
实施例11
[废鸡胸肉来源PLs的关于认知功能改善效果的临床试验]
[从废鸡剥皮胸肉提取的含有PLs的磷脂的制造]
1.从废鸡剥皮胸肉调制复合脂质
仿调制例1-7调制胸肉来源的食用[复合脂质]。
[从复合脂质调制纯化PLs]
2.从废鸡剥皮胸肉的食用[复合脂质]调制纯化PLs
仿调制例2-7调制纯化PLs。
[临床试验用的食用[PLs受试体]的调制]
适宜地混合上述调制的[复合脂质]和[纯化PLs]而调制供试用的食用[PLs受试体]。
[临床试验]
由以严选的健康日本人作为受试者的添加食用PLs受试体而成的辅助物的施用的认知功能改善-随机-双盲检-安慰剂组对照试验-(详细内容参照非专利文献21)的效果探讨临床试验的实施。
本试验委托作为所述临床试验领域的专门机关的一般财团法人日本临床试验协会(JACTA;Japan ClicalTrial Association东京)实施。实施期间是2016年4月5日~6月29日的12周,遵守基于赫尔辛基宣言的伦理的原则而实施。以年龄40~79岁的健康男性及健康女性135名作为候选从全例取得对于本试验的同意书。
I.供试试样的调制
(1)供试食用[PLs受试体]的调制
如上所述。
(2)依据食用[PLs受试体]的添加的含有PLs0.25mg的软胶囊(以下,称为“缩醛磷脂EX”)及含有PLs0.50mg的软胶囊(以下,称为“缩醛磷脂ES”)用原液的调制
基于表1记载的处方制成缩醛磷脂EX及缩醛磷脂ES的软胶囊用原液。
(3)安慰剂组的软胶囊用原液的调制
基于表1记载的处方而从缩醛磷脂EX原液提取食用[PLs受试体],加淀粉而调整重量,制成安慰剂组软胶囊用原液。
(4)各原液的软胶囊化
试验用2种和安慰剂组用的软胶囊将以各外观无法区别的焦糖着色的食品用标准明胶作为被膜的椭圆球型软胶囊委托外部专门厂商制造制成。表2示供试胶囊的规格。
【表2】供试软胶囊用原液的处方(mg/胶囊)
II.受试者的选定
将总数135名由书面考核从MOTORBANK的CROee Inc.(东京)的2016年3月~4月的自发的注册者之中筛选。
(1)挑选基准:
(1)年龄40~79岁的一般健康日本人男女
(2)由图1的认知功能问诊得知认知功能上、虽然无法说完全地正常,但过去无应当的药的服用经验的者
(2)除外基准:除54名
(1)认知功能疾病的治疗中的者
(2)服用含中药的药中的者
(3)妊产妇及在本试验期间中成为妊产妇的担忧的有的女性
(4)作为本试验的受试者不合格,则本试验执行责任者是判断的者
由上述从135名除外54名的结果,受试者成为81名。
结果,随机地分配为组A(n=26)、组B(n=28)、组C(n=27)的3组。此时、考虑为性别或年龄无偏差。
*组A是安慰剂组区
*组B是测试-1(0.25mg)区
*组C是测试-2(0.5mg)区
区分如上述,受试者是一边控制暴饮暴食而过通常经历的生活,一边将每日2粒(朝夕餐后各1粒)的软胶囊摄取12周,向本试验的监督者提出记载身体的及忘事的状态的日记。
III.试验概要
(1)试验的进度
表3示试验的进度。
【表3】试验进度
·:实施
←→:试验期间中的日课
(2)MMSE
参照图2。最高评分是30。
(3)内田·Kraepelin试验(以下,称为“U-K测试”)
将简单的一位数的加法连续进行一定时间,由该计算量所表示的曲线判断“人计算时的能力”、“发挥其计算力之时的特征”的计算力的检查。通常,以1分钟×15次的2组进行。
(4)PSOL认知功能自身诊断测试
以答复关于独自考察的认知功能性的完整性高的设问的样式,参照图3。在0~4的4阶段评价中2是基准点(基线)。超2则评价为良。
(5)供试试样(3种软胶囊)的安全性评价
来自
记载在受试者的日报告书中而进行评价。
(6)数据解析法
在本试验中,不具备标本的数而使用全部解析结果实施。
统计处理值全部以mean±SD表述。
在配对t检验中使用0、6及12周的测定值的差异进行统计处理。相同组内的MMSE,U-K测试、及PSOL认知功能自身诊断测试的测定值的比较评价使用配对t检验进行。
使用Student T检验而进行自0、6及12周的测定值和基线(Δ0-6周和Δ0-12周)的偏离值的组间比较。组内受试者的背景比较使用单因素方差解析进行。
对于附在伴随实施时期的变动,不对其进行调整。误记载的受试者从统计处理完全地除外。统计处理使用Statcel4和EXCEL(Excel)统计进行。2标本间的检验统计处理结果是<5%而判断为显著。
IV.试验结果
(1)受试者的统计信息
将81名分为3区而起始摄取试验,6名脱落。其理由明细是
身体状况不良2、突发的仕事情况3、家事情况1,结局75名完成试验。其明细是测试-1:27名、测试-2:23名、安慰剂组:25名,在年龄和性别及U-K测试上无显著差异(表3)。
表4示关于受试者的统计处理的内容。
【表4】关于受试者的统计处理
项目 |
单位 |
测试-1(0.5mg) |
测试-2(0.25mg) |
安慰剂组 |
p-值 |
受试者 |
人数 |
27 |
23 |
25 |
- |
男性:女性* |
人数 |
9:18 |
10:13 |
9:16 |
0.758 |
年龄* |
岁 |
57.0±10.7 |
58.8±10.5 |
57.2±9.5 |
0.795 |
U-K测试* |
评价值 |
4.4±1.6 |
4.0±1.8 |
4.0±1.5 |
0.575 |
数值以mean±SD表述
*:无显著差异
(2)MMSE
结果示于图1及表4。用在第12周的测试-1和测试-2的组内比较确认到显著差异。再者,在第6周,安慰剂组区的组内比较中确认到显著差异。但是组间比较的测试-1对安慰剂组、和测试-2对安慰剂组、在任何中均确认不到显著差异。
(3)U-K测试
结果示于图2及表4。在3组内均确认不到显著差异。但是,在组间对比中,在第6周的测试-1和安慰剂组间确认到显著差异倾向。
(4)认知功能自身诊断
结果示于表5。
【表5】测试的解析结果
数值以[mean±SD]表述。
(1)*:p<0.05、**:p<0.01、相对于各基线有显著差异
(2)p<0.1,在测试-1和安慰剂组之间有显著差异
在表5中,通过组间的变化量对比解析,在测试-1和安慰剂组或测试-2和安慰剂组中
在以下的项目间确认到显著差异:
在第6周的#1(测试-1,测试-2),#5(测试-1),
#7(测试-1,测试-2),#8(测试-1),#12(测试-1),#13(测试-1),#17(测试-1,测试-2),#18
(测试-1),#25(测试-1),#26(测试-2),及#27(测试-1,测试-2),
另一方面,在第12周各在#1(测试-1),#2(测试-1,测试-2),
#4(测试-1,测试-2),#5(测试-1,测试-2),#8(测试-1,测试-2),#12(测试-1),#15(测试-2),#16(测试-2),#17(测试-2),#20(测试-2),#21(测试-2),#23(测试-2),#24(测试-1,测试-2),#26(测试-2)及#27(测试-1,测试-2)确认到显著差异。
在测试-1对安慰剂组中,第6周的显著差异项目数10在第12周减少到6项目,
在测试-2对安慰剂组中,第6周的显著差异项目数4显著增加到第12周的显著差异项目数14。
(5)认知功能自身诊断结果和其解析
结果示于表6~9。
[0199]~[0202]
【表6】~【表9】认知功能自身诊断结果和其解析
数值以[mean±SD]表述。
(1)p<0.1、*:p<0.05、**:p<0.01、相对于各基线有显著差异
(2)a:p<0.1、b:p<0.05、c:p<0.01、在测试-1和安慰剂组之间有显著差异
(3)d:p<0.1、e:p<0.05、f:p<0.01、在测试-2和安慰剂组之间有显著差异
(6)安全性评价
只要是在日报见到,就皆无向供试试样的安全性提示疑义,安全性无问题。
V.试验结果的评价
(1)总论
确认到对于与摄取12周含有缩醛磷脂的辅助物的健康受试者的语言和状况关联的认知功能的改善有效。再者,供试软胶囊在12周的试验期间未在安全面引发障碍。
U-K测试的结果,确认不到显著差异,但在第6周的高用量摄取组和安慰剂组间确认到显著差异倾向。
得到了在高用量组和低用量组间在用量依赖性上呈现显著倾向,进而在它们和安慰剂组间呈现显著倾向的结果。
得到了以作为食品、尤其是辅助物用量极其低的还被认为内服药以下的“微米”量级,而还加上每1粒中0.5mg以下,在健康者对象中并且施用期间短至3个月并且在第6周呈现计算力的即效的提升的结果,这是惊人的发现。
(2)各论
(1)MMSE
0.5mg组和0.25mg组各在第12周确认到组内显著差异。但是发现了,即使是安慰剂组也在第6周组内有显著差异。
(2)U-K测试
在即效的第6周的高用量组和安慰剂组间确认到显著差异倾向,并且,在高用量组和低用量组间确认到用量依赖性倾向值得关注。
(3)PSOL认知功能自身诊断测试
第12周和即效地从第6周起,在高-低两用量组内及组间以及安慰剂组间确认到显著差异。在高-低两用量组间,尽管确认到混乱的显著差异,是缺少用量依赖性地的结果。
(3)总括评价
*随机-双盲检-安慰剂组对照试验,
*使用革新的食用缩醛磷脂组合物,
*对于严选的健康受试者(机关注册者的书面考核135名认知功能3阶层问诊挑选81名试验责任者的接见挑选75名排除71名试验中发觉的不合格者),
*极其低日用量、0.25mg和0,5mg、并且,
*在极其短期间的12周内,
仅在第6周确认到认知功能的显著并且即效的改善效果,被评价为惊人的成果。
实施例12
[ω-3HUFA衍生物转移种鸡雌的金冠来源的-PLs和产卵废鸡的胸肉来源PLs及安慰剂组区设定的对比「Aβ及τ的脑内蓄积推移解明]的单盲检开放试验临床试验]
(1)受试体
(1)DHA-PLs:以96.7%纯度,DHA结合率是75mol%
在[DHA转移种鸡雌的金冠]中根据调制例2 5.2)
(2)PLs:92质量%[废鸡胸肉来源]
(2)对象和n数
15名5区(DHA-PLs3名×[0.25mg区和0.5mg区]、PLs3名×[0.25mg区和0.5mg区]及安慰剂组区3名)的男女的认知症未病者,在60±5岁中挑选。男女的构成是男性5名和女性10名。
(3)条件
(1)日用量:0.25mg(朝)和0.5mg(0.25mg×朝夕2次)
(2)剂型:软胶囊
(3)期间:40周
(4)检查间隔:0、20周、40周
(4)评价法
依据Aβ蛋白的PET图像解析。再者,在AβPET的检查药中使用PIB(非专利文献31)。
蓄积量是响应认知功能障碍的进行度的PET图像的SUVR(Standardized UptakeValue Ratio)。表10~11显示PET图像的SUVR的评分。
(5)结果
<0.25mg区>
(1)开始时的PET图像的见解概要
[Aβ图像]
由于受试者是认知症未病者,确认不到青一色,确认到以“青”为背景的略微含“红”的“黄色+绿”的展开。
(4)总括评价
(1)[DHA-PLs]及[PLs]均提示低日量的经口摄取而对于认知症未病状态的受试者的Aβ的蓄积抑制作用。附在对于蓄积Aβ的降低化均在第40周呈现降低作用。
(2)[PLs]对比[DHA-PLs]在上述中显示同等的倾向。
【表10】“在0.25mg区”中的PET图像的SUVR:将开始时设为100
<0.5mg区>
(1)开始时的PET图像的见解概要
[Aβ图像]
由于受试者是MCI,确认到青一色,确认不到以“青”为背景的略微含“红”的“黄色+绿”的展开。
(2)评价
(1)[PLs]及[DHA-PLs]以低日量的经口摄取而提示认知症未病者的Aβ的蓄积抑制及蓄积降低效果。
(2)[PLs]对比[DHA-PLs]在上述中呈现效能高的倾向。
(3)总括评价
依据以上,[PLs]及[DHA-PLs]、尤其是提示,[DHA-PLs]以0.25mg的经口极低日用量也有认知症未病者的Aβ的蓄积抑制及蓄积降低效果。
【表11】在“0.5mg区”中的PET图像的SUVR:将开始时设为100
实施例13
[ω-3HUFA衍生物转移种鸡雌的金冠来源的-PLs和产卵废鸡的胸肉来源PLs及安慰剂组区设定的对比的“海马的减容状态推移的解明”单盲检开放试验临床试验]
(1)受试体
(1)DHA-PLs:96.7%纯度,DHA结合率是75mol%
在[DHA转移种鸡雌的金冠]中根据调制例2 5.2)
(2)PLs:92质量%[废鸡胸肉来源]
(2)对象和n数
15名5区(DHA-PLs3名×[0.25mg区、0.5mg区]、PLs3名×[0.25mg区、0.5mg区]及安慰剂组区3名)的男女的认知症未病者,在60±5岁中挑选。男女的构成是男性5名和女性10名。
(3)条件
(1)日用量:0.25mg(朝)及0.5mg(0.25mg×朝夕2次)
(2)剂型:软胶囊
(3)期间:40周
(4)检查间隔:0、20周、40周
(4)评价法
检查在受试者的脑MRI图像中的“海马”的减容状态。
(5)结果
结果示于表12~13。
(1)0.25mg区
(1)[PLs]及[DHA-PLs]一同,提示以低日量的经口摄取对于认知症未病状态的受试者的海马的减容的抑制作用低。
【表12】在0.25mg区中的“海马的减容状态的推移”:将开始时设为100
(2)0.5mg区的评价结果
(1)[PLs]及[DHA-PLs]均提示以低日用量的40周的经口摄取抑制在认知症未病状态的受试者的脑MRI中的海马的减容的倾向。
(3)总括评价
[PLs]及[DHA-PLs]均提示以低日用量的40周的经口摄取抑制在认知症未病状态的受试者的脑MRI中的海马的减容的倾向。
【表13】0.5mg区的“海马减容”的推移:将开始时设为100
产业上的利用可能性
如以上详述,本发明涉及,安全-稳定的缩醛磷脂和其制剂及用途,根据本发明,在得到了(1)提供安全的生物系原料来源的、安全-稳定的缩醛磷脂、更具体而言,作为必须的要件向缩醛磷脂的SN-2结合DHA(二十二碳六烯酸)而成的安全-稳定的含有缩醛磷脂的复合脂质,(2)提供将所述缩醛磷脂复合脂质使用安全的表面活性物质简便地纳米乳化(或者可溶化)而成的安全-稳定的水性制剂(乳液-果冻-粒体-粉体),(3)提供在皂苷类的存在下,有生物体组织特异性构成比的复合脂质及ω-3HUFA结合型复合脂质以及它们的复合脂质组合物在水相纳米乳化乃至增溶的复合脂质及ω-3HUFA结合型复合脂质以及它们的复合脂质组合物的水性制剂,(4)提供它们的用途,(5)提供以ω-3HUFA结合型的粗制或高纯度缩醛磷脂等作为有效成分的神经变性疾病及/或精神疾病的预防或治疗用的各种加工品、辅助物、预防或治疗用剂等,(6)提供认知症未病状态的判断方法等的特别的效果的方面,本发明有产业上的利用可能性。