CN109122311A

CN109122311A - 一种睡莲胎生块茎诱导无菌芽的培养基及其培养方法

Info

Publication number: CN109122311A
Application number: CN201810858776.5A
Authority: CN
Inventors: 王健; 郑华; 盛玉辉; 李雪青; 崔峥; 赵莹; 周扬
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2038-07-31
Also published as: CN109122311B

Abstract

本发明公开了一种睡莲胎生块茎诱导无菌芽的培养基：1/2MS+NAA 0.1～1mg/L+6‑BA 0.3～3mg/L+PVP 50～200mg/L+活性炭0～0.2%+蔗糖2～3%，PH5.8～6.5。使用该培养基培养无菌的睡莲幼嫩胎生块茎组织，22℃～25℃暗环境下液体培养15～25天，转速为20～50r/min，然后再转入到2000～5000lx光照条件下静置培养，获得健康无菌苗。本发明寻找到了最适合睡莲组织生长分化的配方，并提出了一种睡莲组织培养的新方式，有的效解决接种物褐化现象，给出了一种污染率低，死亡率低，褐化率低，发芽率高的睡莲胎生块茎诱导无菌芽的方法。

Description

一种睡莲胎生块茎诱导无菌芽的培养基及其培养方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，更具体地，涉及一种睡莲胎生块茎诱导无菌芽的培养基及其培养方法。

背景技术

睡莲，学名Nymphaea tetragona Georgi，睡莲科睡莲属，多年水生植物。

与荷花相类似，睡莲是一种名贵的水生花卉，广泛分布于东亚地区，特别是在我国，有着悠久的睡莲鉴赏和培育历史，曾因其在鉴赏、食用、药用和制茶等方面的贡献载入史册。睡莲品种非常多，按照其心皮的离生与聚合不同状态，可将睡莲分为2组5个亚组，或按照其对热量的要求与花朵直径大小分为热带大花睡莲品种群、耐寒小花睡莲品种群等6个品种群。其中人工培育的耐寒品种不仅打破了睡莲培育的地域限制，而且具有花径大，色彩丰富艳丽，花朵繁密，花期长，在北方6-9月下旬开花等特点。此外，这些睡莲中的‘人面桃花’，‘华清池’等几个品种有与众不同的挺水开放的特点，且多有香气，可作切花。同时，研究表明，在生态方面，睡莲能够吸附Pb²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺等重金属离子，同时能够抑制铜绿微囊藻的生长，对水质有净化作用。因此，睡莲经济价值很高，市场前景广阔。

但是，睡莲不少品种结实力和无性繁殖能力弱，繁殖率低；还有不少品种在其无性繁殖过程中，毒素的积累导致品种退化，花朵直径减小、品质下降，严重地制约了对于睡莲的利用。利用组织培养技术，可以有效地解决繁殖率低的问题，同时可以提供无毒的种苗，实现种苗复壮，提高种苗质量。目前成功的睡莲组培技术很少，已有的一些报道中，也有比较明显的褐化现象，不定芽再生率很低。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种睡莲胎生块茎诱导无菌芽的培养基及其培养方法，通过睡莲组织培养的方式，取不受污染的胎生块茎中心部分接种，使其生长发育，最终达到优化睡莲组培技术的效果，其中，睡莲胎生块茎是指在睡莲在叶片和叶柄的连接处，存在具有分化能力的细胞，在生长过程中，这些细胞再次分化长出的块茎。

本发明的第一个目的是提供一种睡莲胎生块茎诱导无菌芽的培养基。

本发明的第二个目的是提供一种睡莲胎生块茎诱导无菌芽的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明选用繁殖能力强的胎生块茎作为组培材料，通过采用不同配方培养基对睡莲胎生块茎进行培养，寻找到最适合睡莲组织生长的配方；同时探索到了有效的睡莲组织消毒方式及有效解决接种物褐化现象的方法：

一种睡莲胎生块茎诱导无菌芽的培养基，所述培养基为1/2MS+NAA 0.1～1 mg/L+6-BA0.3～3 mg/L+PVP 50～200 mg/L+活性炭0.05～0.2 g/L +蔗糖2～3 %，pH5.8。

优选地，所述培养基为1/2MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 3mg/L+PVP 50 mg/L+活性炭0.2g/L+蔗糖3%，PH 5.8。

一种睡莲胎生块茎诱导无菌芽的方法，使用以上述培养基进行培养。

优选地，包括以下步骤：

S1. 将睡莲胎生块茎清洗干净后，转移入无菌环境中，进行消毒；

S2. 切取消毒后的睡莲胎生块茎组织中间部分，接种于权利要求1或2所述培养基中，置于22℃～25℃培养，转速为20～50r/min；

S3. 培养15～25天，等其萌芽后再转入到2000～5000lx光照条件下静置培养，获得健康无菌苗。

优选地，步骤S1中，睡莲胎生块茎为直径为0.3～1cm 的幼嫩胎生块茎。

优选地，步骤S1中，睡莲胎生块茎消毒的方法为洗涤剂中浸洗10min～15min，用自来水冲洗15min～20min。

优选地，步骤S1中，洗涤剂为洗衣粉的水溶液。

优选地，步骤S1中，睡莲胎生块茎清洗干净后，去除叶片和茎，浸泡在无菌水中封口，转移入无菌环境。

优选地，步骤S1中，对睡莲胎生块茎进行消毒的方法为无菌水中浸泡4～7min，再经70%酒精消毒30～40s后，放入无菌水中清洗5～7min，再由0.1%升汞溶液消毒4～5min，无菌水清洗3～4次，每次5～6min。

更优选地，步骤S1中，对睡莲胎生块茎进行再次消毒的方法为无菌水中浸泡6min，再经70%酒精消毒30s后，放入无菌水中清洗6min。再由0.1%升汞溶液消毒5min，无菌水清洗3次，每次6min。

优选地，步骤S2中，转速为20r/min。

优选地，所述睡莲胎生块茎为睡莲幼嫩胎生块茎。

最优选地，包括以下步骤：

S1. 直径为0.3～1cm 的睡莲幼嫩胎生块茎用洗衣粉水中浸洗10min～15min，用自来水冲洗15min～20min，沥干，去除叶片和茎，浸泡在无菌水中封口，转移入超净工作台，对睡莲胎生块茎进行消毒：先在无菌水中浸泡6min，再经70%酒精消毒30s后，放入无菌水中清洗6min。再由0.1%升汞溶液消毒5min，无菌水清洗3次，每次6min；

S2. 切取消毒后的睡莲胎生块直径2～5mm的茎尖组织，接种于以上所述培养基中，置于22℃～25℃培养，转速为20r/min；

S3. 培养15 天，等其萌芽后再转入到3000lx光照条件下静置培养，获得健康无菌苗。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过采用不同的配方培养基对睡莲胎生块茎进行培养，寻找到了最适合睡莲组织生长分化的配方，并提出了一种睡莲组织培养的新方式，有的效解决接种物褐化现象，给出了一种污染率低，死亡率低，褐化率低，发芽率高的睡莲胎生块茎诱导无菌芽的方法。

具体实施方式

下面结合说明书和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

以下实施例以由海南省海口市荣丰睡莲基地所培育的品质良好的‘蓝鸟’睡莲为例，利用其胎生块茎作为实验材料研究本发明的诱导无菌芽的培养基及方法。

实施例1睡莲胎生块茎发芽培养基

一种睡莲胎生块茎发芽培养基，包括如下组分：1/2MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 3mg/L+PVP50 mg/L+活性炭0.2 g/L+蔗糖3%，pH 5.8。

实施例2睡莲胎生块茎发芽培养基

一种睡莲胎生块茎发芽培养基，包括如下组分：1/2MS+NAA 1 mg/L+6-BA 0.6 mg/L+PVP 200 mg/L+活性炭0.05 g/L+蔗糖2.5%，pH 5.8。

实施例3睡莲胎生块茎发芽培养基

一种睡莲胎生块茎发芽培养基，包括如下组分：1/2MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.3mg/L+PVP 100 mg/L+活性炭0.1 g/L+蔗糖2%，pH 5.8。

实施例4睡莲胎生块茎发芽组织培养的方法

一、组培材料

睡莲胎生块茎

二、组培方法

将直径0.3～1cm的幼嫩胎生块茎在洗衣粉水中浸洗10min～15min，用自来水冲洗15min～20min，沥干，去除叶片和茎，浸泡在无菌水中封口，转移入超净工作台。先在无菌水中浸泡6min，再经70%酒精消毒30s后，放入无菌水中清洗6min。再由0.1%升汞溶液消毒5min，无菌水清洗3次，每次6min。切取消毒后的睡莲胎生块中间直径2～5mm的茎尖组织，接种于培养基上。

培养基为：1/2MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 3 mg/L+PVP 50 mg/L+活性炭0.2 g/L+蔗糖3%，PH 5.8，不加琼脂，

培养培养条件为：温度22℃～25℃。液体培养，转速20r/min，暗培养。

培养15天后萌芽率达到30%，褐化率25%，芽形态正常，转入到3000lx光照条件下静置培养，均可以获得健康无菌苗。

实施例5 培养基的筛选

一、实验操作

睡莲胎生块茎经清洗后，去除叶片和茎，浸泡在无菌水中封口，转移入超净工作台。先在无菌水中浸泡6min，再经70%酒精消毒30s后，放入无菌水中清洗6min。再由0.1%升汞溶液消毒5min，无菌水清洗3次，每次6min。切取消毒后的睡莲胎生块茎组织中间部分，接种于1/2MS培养基上。培养基含琼脂与3%蔗糖，不含激素，PH值调至5.8左右。培养基配置完后放在121℃的高压灭菌锅内灭菌20min。拿出后放于室内，三天后不长菌则可用于接种。将接种好的睡莲组织放置于无菌室灯光下室温培养。后续观察统计其污染率、死亡率、褐化率与发芽率。

二．实验结果

发芽率为12%。污染率、死亡率、褐化率分别为27%、3%、97%。芽的萌发发生在接种后40天左右，发出的芽叶小且绿，干短，三个月后仍存活，但始终不能正常生长，4个月后死亡。

实验结果说明睡莲在不含任何激素的固体培养基萌发率低，污染率和褐化率较高，且萌发芽不能正常生长。

实施例6 PVP和活性炭用量的筛选优化

一、实验操作

在1/2MS培养基（配方同实施例5）中加入PVP和活性炭。将培养基在黑暗环境中培养。PVP与活性炭具体浓度与使用方法如表1。

表1 实验因子水平表：

处理	分类
		1	PVP 0 mg/L+活性炭0 g/L
2	PVP 0 mg/L+活性炭0.2 g/L
		3	PVP 0 mg/L+活性炭1 g/L
4	PVP 50 mg/L+活性炭0 g/L
		5	PVP 50 mg/L+活性炭0.2 g/L
6	PVP 50 mg/L+活性炭1 g/L
		7	PVP 200 mg/L+活性炭0 g/L
8	PVP 200 mg/L+活性炭0.2 g/L
		9	PVP 200 mg/L+活性炭1 g/L

二、实验结果

由结果（表2）可知，处理4、处理5及处理7有接种物发芽。发芽率分别为25%、50%及13%。处理4、5与处理1（空白）之间的显著性水平小于0.05，故处理4、5与处理1之间存在显著性差异。表明PVP 50 mg/L+活性炭0 g/L及PVP 50 mg/L+活性炭0.2 g/L均显著提升发芽率。处理4与处理5之间显著性水平小于0.01，即处理4与处理5之间存在极显著性差异。表明在50mg/L PVP的基础上，0.2 g/L活性炭能极显著提高发芽率。但是本实验所有萌发芽幼苗均为黄色，不能正常生长。

表2 发芽率显著性分析：

处理	发芽率均值	5%显著水平	1%极显著水平
				5	0.50±0.10	a	A
4	0.25±0.11	b	B
				7	0.13±0.11	bc	B
1	0.00±0.00	c	B
				2	0.00±0.00	c	B
3	0.00±0.00	c	B
				6	0.00±0.00	c	B
8	0.00±0.00	c	B
				9	0.00±0.00	c	B

实施例7 基础培养基、NAA和6-BA对睡莲胎生块茎发芽率的筛选

一、实验操作

为探究基础培养基种类及激素的种类与浓度对睡莲胎生块茎生长状况的影响。采用正交设计L9(3⁴)设计实验，共9个处理（表3）。所有培养基附加：PVP 50 mg/L，活性炭0.2 g/L，蔗糖3%。同时在所有培养基中加入0.7%琼脂配成固体培养基，pH均调至5.8。培养基暗培养。于第15天观察发芽率。各处理配方如表3：

表3 根据正交设计L9(3⁴)表的实验培养基配方：

处理组	培养基配方
		1	1/2MS培养基+0.3mg/L 6-BA+0mg/L NAA
2	1/2MS培养基+3mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA
		3	1/2MS培养基+6mg/L 6-BA+1mg/L NAA
4	N6培养基+0.3mg/L 6-BA+1mg/L NAA
		5	N6培养基+3mg/L 6-BA+0mg/L NAA
6	N6培养基+6mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA
		7	Nitsch培养基+0.3mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA
8	Nitsch培养基+3mg/L 6-BA+1mg/L NAA
		9	Nitsch培养基+6mg/L 6-BA+0mg/L NAA

二、实验结果

表4 发芽率显著性分析：

处理组	发芽率均值	5%显著水平	1%极显著水平
				2	0.30±0.15	a	A
3	0.20±0.10	ab	AB
				1	0.10±0.08	ab	AB
4	0.00±0.00	b	B
				5	0.00±0.00	b	B
6	0.00±0.00	b	B
				7	0.00±0.00	b	B
8	0.00±0.00	b	B
				9	0.00±0.00	b	B

根据结果（表4）可知，只有处理1、2、3，即1/2MS培养基中有胎生块茎发芽，发芽率分别为10%、30%及20%。由差异显著性分析可知，三个处理中，处理2与其他六个处理的显著性水平小于0.05，即处理2与处理4、5、6、7、8、9之间存在显著性差异。说明在1/2MS培养基中加入3mg/L6-BA和0.1mg/LNAA能够显著提高发芽率。而据表4可知，处理1、2、3之间差异性均不显著，说明实验中所涉及的6-BA与NAA浓度的差异导致的发芽率差别并不明显。同样的，本试验中萌发芽呈现黄色，不能正常生长。

实施例8 液体培养基对睡莲褐化的影响

一、实验操作

为降低接种物褐化率，配置液体培养基。仅使用1/2MS基础培养基。培养基配方即在前面实施例7处理1、处理2、处理3组的培养基基础上去掉琼脂成分，即，处理1、处理2、处理3同实施例7的处理1、处理2、处理3；处理4、处理5、处理6分别为上述处理培养基去掉琼脂成分。

为保证胎生块茎正常生长所需氧气，将培养基放在震荡摇床中培养，转速为20r/min。除此之外，其余培养条件均与实施例7相同。

二、实验结果

表5 褐化率显著性分析：

处理	褐化率均值	5%显著水平	1%极显著水平
				1	0.92±0.08	a	A
3	0.92±0.08	a	A
				2	0.81±0.10	a	A
4	0.25±0.00	b	B
				5	0.25±0.14	b	B
6	0.17±0.14	b	B

根据实验（表5）结果，处理1、2、3之间（固体培养基）不存在显著性差异，处理4、5、6之间（液体培养基+震荡培养）也不存在显著性差异。而处理1、2、3与处理4、5、6之间显著性水平均小于等于0.01，即存在极显著性差异。同时，培养15～25天后液体培养基内的组织萌发芽，培养基呈绿色，将培养基转入到3000lx光照条件下静置培养，可获得健康无菌苗。

说明液体培养基相较于固体培养基，能够极有效的降低褐化率，且能改善萌发芽的生长状态。

Claims

1.一种睡莲胎生块茎诱导无菌芽的培养基，其特征在于，所述培养基为1/2MS+NAA 0.1～1 mg/L+6-BA 0.3～3 mg/L+PVP 50～200 mg/L+活性炭0.05～0.2 g/L+蔗糖2～3 %，PH5.6～6.5。

2. 根据权利要求所述的培养基，其特征在于，所述培养基为1/2MS+NAA 0.1mg/L+6-BA3mg/L+PVP 50 mg/L+活性炭0.2 g/L+蔗糖3%，PH 5.8。

3.一种睡莲叶柄处自然再生的胎生块茎诱导无菌芽的方法，其特征在于，使用权利要求1或2所述培养基诱导培养睡莲胎生块茎得到无菌芽。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2. 切取消毒后的睡莲胎生块茎中间直径2～5mm的茎尖组织，接种于权利要求1或2所述培养基中，置于22℃～25℃培养，转速为20～50 r/min；

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S1中，清洗的方法为洗涤剂中浸洗10min～15min，再用自来水冲洗15min～20min。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S1中，睡莲胎生块茎清洗干净后后，去除叶片和茎，浸泡在无菌水中封口，转移入无菌环境。

7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S1中，对睡莲胎生块茎进行消毒的方法为无菌水中浸泡4～7min，再经70%酒精消毒30～40s后，放入无菌水中清洗5～7min，再由0.1%升汞溶液消毒4～5min，无菌水清洗3～4次，每次5～6min。

8. 根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S2中，转速为20 r/min。

9.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述睡莲胎生块茎为睡莲幼嫩胎生块茎。