CN105815217A - 热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法 - Google Patents

Abstract

热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法，包括如下步骤：选择抗生素，过滤灭菌后加入到增殖培养基中配制培养基；在培养基中培养热带木本植物的增殖苗，植株生长状态相对良好，挑选可见细菌菌落相对较少的增殖苗进行试验；在超净工作台中，使用消毒好的尖头镊子夹取1‑2cm的植株茎尖，然后转移到添加抗生素的增殖培养基中；按周期对热带木本植物的增殖苗进行多次继代培养。本发明解决工厂化育苗中难以避免的由于人工操作引起的细菌污染，短期内解除植物细菌污染的干扰，重新获得无菌的优良苗木，满足市场需求，为植物组织培养特别是热带木本植物的工厂化育苗提供技术支持，为珍贵材料的保存方法和方式提供新的途径和技术方法。

Description

热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法

技术领域

本发明涉及组织培养技术领域，特别适用于热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法。

背景技术

在植物组织培养工厂化生产育苗过程中，需要大量的接种工人，而接种工人技术和操作水平参差不齐，增殖过程中操作不当引起的细菌污染主要来源于接种工人自身携带的细菌，在增殖和生根过程中会出现大量的细菌污染。影响组培苗的正常生长和繁殖，需要经常更换外植体，严重时需要每年重新采集外植体。由于从外植体消毒到正常生产需要较长的周期，增加时间和人工成本，同时可能会引起出苗日期延迟，错过造林季节，严重影响组培室的正常运转。而对于珍贵苗木和试验材料，由于消毒难度和繁育难度的增加，珍贵材料的细菌污染如不能去除会造成难以估量的损失。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过一种简单的方法解决木本植物组织培养工厂化育苗过程中由于人工转接引起的常见的细菌污染问题的在热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法，包括如下步骤：

S1、培养基的配制

选择具有广谱抗菌效果的头孢噻肟钠（Cef）、特美汀(Tmt)作为抑菌的抗生素，过滤灭菌后加入到增殖培养基中；

S2、增殖苗的选取

在增殖培养基中培养不超过20天或30天的热带木本植物的增殖苗，植株生长状态相对良好，挑选肉眼可见细菌菌落相对较少的增殖苗进行试验；

S3、增殖苗的转接与培养

在超净工作台中，挑选细菌污染较少即肉眼看到存在较少菌落的增殖苗，使用消毒好的尖头镊子夹取1-2cm的植株茎尖，然后转移到添加抗生素的增殖培养基中，夹取茎尖时镊子勿接触到培养基或瓶壁；

S4、增殖苗的抑菌处理

将带菌苗转移到带有抗生素的培养基中，按周期对热带木本植物的增殖苗进行S3中的操作，即进行多次继代培养，在无肉眼可见细菌污染时，继续在添加抗生素的培养基中进行2-3次的连续转接，控制培养条件为温度25±1℃,光照时间12-14h,光照强度为2500-3000lx，处理3-6次；

S5、除菌效果的检测

对多次抑菌处理后在抗生素培养基中培养的芽苗进行观察，将无细菌菌落出现的增殖苗转移到增殖或生根培养基中进行培养，20天或30天后检测是否有细菌长出以及细菌污染的比例。

进一步地，增殖培养基为mWPM培养基+6BA1.0mg.L^-1+IBA0.5mg.L^-1或增殖培养基为MS培养基+6BA2.0mg.L^-1。

进一步地，S1中，培养基的配制方法为：选择具有广谱抗菌效果的头孢噻肟钠（Cef）、特美汀(Tmt)作为抑菌的抗生素，配制成100mg/L的母液，过滤灭菌后放置在-20℃冰箱中备用。将配好的桉树、柚木和相思增殖培养基装在三角瓶中，使用高压灭菌锅灭菌，完成后取出待培养基冷却到50-60℃时加入不同浓度的抗生素。

进一步地，所述热带木本植物的增殖苗为增殖时间不超过20天桉树或增殖时间不超过30天柚木或黒木相思。

优选地，S2中，桉树选择在增殖培养基中培养15-20天；柚木或黒木相思在增殖培养基中培养25-30天。

进一步地，S4中，桉树选择抗生素为cef或tmt，浓度为50-100mg.L^-1，转接次数为3次，每20天为一个周期进行抑菌处理。

进一步地，S4中，柚木或黒木相思选择cef，浓度为50-100mg.L^-1，柚木的转接次数为3次；黒木相思的转接次数为5次，每30天为一个周期进行抑菌处理。

优选地，S4中，黒木相思中cef浓度为50mg.L^-1。

进一步地，在无肉眼可见细菌后，继续转接到带有相同浓度的抗生素培养基上继代3次以上。

优选地，在无肉眼可见细菌后，继续转接到带有相同浓度的抗生素培养基上继代3次。

本发明有如下的有益效果：

1、本发明通过在增殖过程中通过取植物顶部（包括茎尖分生组织）处理以及结合增殖培养基中添加广谱抑菌剂的方法来抑制组织培养中细菌生长，获得无细菌污染的植物组织培养苗木，解决工厂化育苗中难以避免的由于人工操作引起的细菌污染。

2、短期内解除植物细菌污染的干扰，重新获得无菌的优良苗木，满足市场需求，为植物组织培养特别是热带木本植物的工厂化育苗提供技术支持。

3、为珍贵材料的保存方法和方式提供新的途径和技术方法。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

申请人在2013年11月，在广东省广州市广汕一路682号热带林业研究所组培繁育中心对细菌污染的巨尾桉无性系SP7，至2014年2月获得无菌苗。在2015年3月对尾巨桉Gl9和3213增殖苗进行处理，至2015年6月获得无菌苗。

该热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法，具体步骤如下：

S1、培养基的配制

增殖培养基采用mWPM培养基+6BA1.0mg.L^-1+IBA0.5mg.L^-1，将抗生素配制成100mg/L的Cef母液，使用过滤灭菌消毒Cef或TMT。从灭菌锅中取出高温消毒过的增殖培养基，待培养基温度降低到40-50℃时加入抗生素，配制成50mg/L和100mg/L的Cef或TMT的增殖培养基，进行分装，每个处理10瓶。

S2、增殖苗的选取

在增殖培养基中培养15-20天的增殖苗，挑选肉眼可见细菌菌落相对较少的瓶进行下列试验，同时植株生长相对良好，大量的丛芽出现，单芽高度3-5cm。

S3、增殖苗的转接与培养

使用酒精擦洗带有少量细菌污染的增殖苗培养瓶，注意勿倒置或过度倾斜培养瓶，防止细菌随着培养基中的水分扩散。然后在超净工作台中，挑选细菌污染较少即肉眼看到存在较少菌落的增殖苗，使用消毒好的17cm长尖头镊子夹取1-2cm的上部芽苗，直接转移到带有cef或tmt的培养基中，不要接触瓶壁。每取1株更换新的镊子，每1或2株放置在一个新的培养瓶中。每个处理50瓶。控制培养条件为温度25±1℃，光照时间12-14h，光照强度为2500-3000lx。

S4、增殖苗的抑菌处理

15-20天转接到新的带有抗生素的培养基中，采取同样的捏取茎尖的处理方法，连续进行3-5个周期处理。最终获得了无细菌污染的增殖苗，且增殖苗的生长状态没有受到明显的影响。

经对比试验，抗生素的浓度和抑菌次数是抑菌处理的关键因子。经过0、25、50、75、100、125和150mg/L的cef和TMT浓度的对比试验，发现50-125mg/L的cef和TMT经过3次转接，明显的抑制了细菌的生长，获得了20%-70%的抑菌率，同时获得了无菌苗。但在125mg/L时抑制了苗的高度生长，在50mg/L需要增加2次转接。推荐使用75-100mg/L的cef或TMT。

本发明中芽苗的切取和处理是一个必不可少的环节。在快速繁殖过程中顶芽可能带较少的细菌甚至不带细菌，同时茎尖部位不接触培养基，细菌难以快速的繁殖，也减少了与细菌的接触。因此采用切取顶芽的方式进行抑菌处理，这是获得无菌苗的关键步骤。同时为了减少交叉污染，采用镊子直接夹取顶芽后放置在培养基中，需及时更换镊子，这样能进一步减少污染。

转接时间也是一个重要的因素，在转接时间改为30天时，同样浓度的抗生素的培养基处理，在进行同样的转接条件时无法达到抑制细菌生长的效果。主要是经过长时间培养后，抗生素会失效，细菌重新生长。因此需要及时的转接，以获得较好的除菌效果。

S5、除菌效果的检测

在经过3次转接后，将无肉眼可见的植株整块转移到无抗生素的生根和增殖培养基上，15-20天后调查污染率，除偶尔在生根培养基中看到有细菌，其他均无法看到有细菌生长。在增殖和生根培养基中无肉眼可见的细菌，在连续的增殖转接中无可见的细菌菌落。

实施例2

申请人在2015年4月，在广东省广州市广汕一路682号热带林业研究所组培繁育中心对细菌污染的柚木无性系7544增殖苗进行处理，至2015年7月细菌污染全部去除。具体步骤如下：

在增殖培养基中培养25天的增殖苗，挑选肉眼可见细菌菌落相对较少的瓶进行下列试验，同时植株生长相对良好，芽高8-10cm。增殖培养基采用MS培养基+6BA2.0mg.L^-1

增殖苗的转接与培养以及增殖苗的抑菌处理的操作同实施例1。其中尖头镊子夹取时是顶端1-2个节间，3-5cm长。在对比试验中，150mg/L的cef抑制了植株的生长，部分叶片发黄。50mg/L和75mg/L的cef经过3次转接，分别获得了50%和80%的抑菌率，同时获得了无菌苗。为了防止抗生素对植株生长的影响，因此推荐使用50-75mg/L的cef。

至2015年7月，已获得无细菌污染的柚木增殖苗。

实施例3

申请人在2015年4月，在广东省广州市广汕一路682号热带林业研究所组培繁育中心对细菌污染的黒木相思增殖苗进行处理，至2015年7月细菌污染全部去除。

具体步骤如下：

在增殖培养基中培养25天的增殖苗，挑选肉眼可见细菌菌落相对较少的瓶进行下列试验，同时植株生长相对良好，较多丛芽，选择芽高3-5cm的植株。增殖培养基采用MS培养基+6BA1.0mg.L^-1+IBA0.1mg.L^-1。

增殖苗的转接与培养以及增殖苗的抑菌处理的操作同实施例1。其中尖头镊子夹取时是顶端1-2个节间，2-3cm长。在对比试验中，黒木相思对cef较敏感，75mg/L的cef抑制了黒木相思的繁殖效率，植株变矮，尽管在75-150mg/L时细菌生长得到很好的抑制，在3次转接后获得了50%以上的抑菌率。在50mg/L的cef经过5次转接，分别获得了20%的抑菌率，同时获得了无菌苗。为了防止抗生素对植株生长的影响，因此推荐使用50mg/L的cef，转接5次以上。

至2015年7月，已获得无细菌污染的黒木相思增殖苗。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案所作的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围之内。

Claims (10)

1.热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、培养基的配制

选择具有广谱抗菌效果的头孢噻肟钠、特美汀作为抑菌的抗生素，过滤灭菌后加入到增殖培养基中；

S2、增殖苗的选取

在增殖培养基中培养不超过20天或30天的热带木本植物的增殖苗，植株生长状态相对良好，挑选肉眼可见细菌菌落相对较少的增殖苗进行试验；

S3、增殖苗的转接与培养

在超净工作台中，挑选细菌污染较少即肉眼看到存在较少菌落的增殖苗，使用消毒好的尖头镊子夹取1-2cm的植株茎尖，然后转移到添加抗生素的增殖培养基中，夹取茎尖时镊子勿接触到培养基或瓶壁；

S4、增殖苗的抑菌处理

将带菌苗转移到带有抗生素的培养基中，按周期对热带木本植物的增殖苗进行S3中的操作，即进行多次继代培养，在无肉眼可见细菌污染时，继续在添加抗生素的培养基中进行2-3次的连续转接，控制培养条件为温度25±1℃,光照时间12-14h,光照强度为2500-3000lx，处理3-6次；

S5、除菌效果的检测

对多次抑菌处理后在抗生素培养基中培养的芽苗进行观察，将无细菌菌落出现的增殖苗转移到增殖或生根培养基中进行培养，20天或30天后检测是否有细菌长出以及细菌污染的比例。

2.根据权利要求1所述的热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法，其特征在于，增殖培养基为mWPM培养基+6BA1.0mg.L^-1+IBA0.5mg.L^-1或增殖培养基为MS培养基+6BA2.0mg.L^-1。

3.根据权利要求2所述的热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法，其特征在于，S1中，培养基的配制方法为：选择具有广谱抗菌效果的头孢噻肟钠、特美汀作为抑菌的抗生素，配制成100mg/L的母液，过滤灭菌后放置在-20℃冰箱中备用，将配好的桉树、柚木和相思增殖培养基装在三角瓶中，使用高压灭菌锅灭菌，完成后取出待培养基冷却到50-60℃时加入不同浓度的抗生素。

4.根据权利要求3所述的热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法，其特征在于，所述热带木本植物的增殖苗为增殖时间不超过20天桉树或增殖时间不超过30天柚木或黒木相思。

5.根据权利要求4所述的热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法，其特征在于，S2中，桉树选择在增殖培养基中培养15-20天；柚木或黒木相思在增殖培养基中培养25-30天。

6.根据权利要求5所述的热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法，其特征在于，S4中，桉树选择抗生素为头孢噻肟钠或特美汀，浓度为50-100mg.L^-1，转接次数为3次，每20天为一个周期进行抑菌处理。

7.根据权利要求5所述的热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法，其特征在于，S4中，柚木或黒木相思选择头孢噻肟钠，浓度为50-100mg.L^-1，柚木的转接次数为3次；黒木相思的转接次数为5次，每30天为一个周期进行抑菌处理。

8.根据权利要求7所述的热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法，其特征在于，S4中，黒木相思中头孢噻肟钠浓度为50mg.L^-1。

9.根据权利要求1所述的热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法，其特征在于，在无肉眼可见细菌后，继续转接到带有相同浓度的抗生素培养基上继代3次以上。

10.根据权利要求9所述的热带木本植物组织培养工厂化育苗中细菌污染的处理方法，其特征在于，在无肉眼可见细菌后，继续转接到带有相同浓度的抗生素培养基上继代3次。