CN109082439A - 一种利用CRISPR/Cas9提高猪产肉量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9提高猪产肉量的方法，包括通过CRISPR/Cas9技术构建含有靶向猪IGF2基因的sgRNA的打靶载体，转染猪细胞，制备含有编辑型IGF2基因的细胞，进行体细胞核移植和胚胎移植，其中，构建所述打靶载体所用的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明能够解除ZBED6对IGF2基因表达的抑制作用，上调IGF2的表达，提高猪瘦肉率和产肉量。

Description

一种利用CRISPR/Cas9提高猪产肉量的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9提高猪产肉量的方法。
背景技术
在中国地方猪遗传育种领域，通常采用传统瘦肉率选育方法，该技术的实施步骤为个体瘦肉率测定、BLUP估计育种值、综合排名选留个体。
然而，传统瘦肉率选育需要大量的生长和屠宰性能测定，测定周期长，测定费用高，瘦肉率提高较为缓慢。这主要是因为传统育种主要考虑综合性状选育，不会以瘦肉率性状为单一性状进行选育；猪瘦肉率性状数据只能通过屠宰测定获得，而通常猪活体的瘦肉率只能通过背膘厚和眼肌面积数据估测；中国地方猪种本身就不具备高瘦肉率的种质遗传特性等原因所导致。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效提高猪(特别是两广小花猪)产肉量的方法。
为了实现以上目的，本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9提高猪产肉量的方法，包括通过CRISPR/Cas9技术构建含有靶向猪IGF2基因的sgRNA的打靶载体，转染猪细胞(优选成纤维细胞)，制备含有编辑型IGF2基因的细胞，进行体细胞核移植和胚胎移植，其中，构建所述打靶载体所用的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了用于猪IGF2基因打靶的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
此外，本发明还提供了靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体，其包括pX330载体以及连接在所述pX330载体上的靶向猪IGF2基因的sgRNA，所述靶向猪IGF2基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述猪包括但不限于两广小花猪。
本发明还提供了一种宿主细胞，其包括上述靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体。
本发明还提供了靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体的构建方法，其包括以下步骤：
(1)设计并合成靶向猪IGF2基因的2条sgRNA，所述靶向猪IGF2基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)对所述靶向猪IGF2基因的sgRNA的正负两条寡核苷酸链进行磷酸化和程序性退火处理，使之形成具有BbsⅠ相应的黏性末端的双链DNA短片段；
(3)使用BbsⅠ酶切pX330载体，线性化的质粒经电泳后，通过胶回试剂盒进行回收；
(4)使用T4连接酶将步骤(2)得到的双链DNA短片段与步骤(3)得到线性化的pX330载体进行连接，得到靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体。
在该构建方法中，优选地，所述猪包括但不限于两广小花猪。
本发明还提供了上述猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体用于提高猪产肉量的应用。
本发明还提供了上述猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体在制备用于提高猪产肉量的试剂方面的应用。
本发明利用CRISPR/Cas9技术对两广小花猪的IGF2基因内含子3的ZBED6结合基序进行基因编辑，成功删除了IGF2基因内含子3的ZBED6结合基序GCTCG，证明破坏结合基序后，能够解除ZBED6对IGF2基因表达的抑制作用，上调IGF2的表达，结果表明，IGF2的上调表达能促进细胞的成肌分化潜能，并在一定程度上促进细胞的增殖，进一步将上述方法制备的含有编辑型IGF2基因的中靶细胞群通过体细胞核移植技术可获得高产肉量两广小花猪。
本发明模拟自然突变，在基因组中不引入任何其他的外源DNA序列，可以有效避免转基因技术的生物安全风险，使本地猪种保持基因组的“纯度”，在最大限度地保留中国地方种猪优质肉质等优良性状的基础上，又能克服其产肉量低的劣势，特异性地提高其瘦肉率，大幅度提高优质猪肉生产和产量，对于改良和利用本地猪种资源具有重要的育种意义。
附图说明
图1是RGS报告载体构建示意图。
图2是流式细胞分选红绿双荧光细胞过程示意图。
图3是IGF2-sgRNA1打靶活性的验证结果。
图4是编辑IGF2后的定量PCR结果。
图5是IGF2基因编辑猪的鉴定结果。
图6是IGF2基因编辑猪与同日龄野生型两广小花猪体型比较结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。如未特别指出，实施例中涉及但未详细描述细节参数的操作为本领域技术人员所熟知的。
实施例
1、IGF2基因靶位点选择
根据IGF2基因序列以及sgRNA基本设计原则(序列符合5＇-GN19NGG-3＇)，并借助软件分析(http://crispr.mit.edu/)，设计1条靶向猪IGF2基因的sgRNA。具体序列见表1。
表1靶向IGF2基因gRNA序列信息
注：PAM(protospacer-adjacent motif)指sgRNA结合基序
2、猪IGF2基因sgRNA/Cas9打靶载体构建
pX330载体可同时表达sg RNA和密码子经人源性优化的Cas9蛋白。
根据以上设计的2条sgRNA，合成相应的寡核苷酸正负单链，每条单链上添加有相应的BbsI黏性末端。用BbsI酶切1μg pX330载体，线性化的质粒经电泳后，通过胶回试剂盒回收酶切载体。同时，对正负两条寡核苷酸链进行退火和磷酸化处理，使之形成具有黏性末端的双链DNA短片段。将上述短片段和线性化的pX330载体通过T4连接酶进行连接反应，接着转化至DH5α感受态细胞中。最后挑选细菌单克隆，通过测序鉴定sgRNA表达载体是否构建成功。
3、两广小花猪胎儿成纤维细胞培养与转染
两广小花猪胎儿成纤维细胞从广东小耳花猪胎儿中分离建立。胎儿成纤维细胞在含有20％胎牛血清的DMEM培养基中生长。胎儿成纤维细胞生长至80％左右的汇合度时，先用PBS洗涤两遍，然后用胰酶消化2min，随后加入血清终止消化，将消化后的细胞收集至15mL的离心管进行离心，弃上清后再用PBS洗涤一遍进行第二次离心。离心后弃上清，然后用适量Buffer R溶液重悬细胞，使细胞密度达到1.0×107cells/mL，使用NeonTM转染系统对胎儿成纤维细胞进行电击转染。转染条件为：voltage：1600V，width：10s，pulse number:3。细胞转染后24h更换培养基，在5％的CO2、37℃条件下进行培养。2d后进行流式分析、分选或者收取细胞提取DNA进行后续实验。
4、T7E1实验
T7E1酶(T7核酸内切酶I)可以用来检测CRISPR/Cas9介导的基因突变，通过PCR扩增出包含CRISPR/Cas9识别位点的IGF2基因片段，采用PCR清洁试剂盒纯化PCR产物。纯化后的PCR产物先在高温下变性，然后经逐步降温退火形成异源双链DNA，使用T7EI对上述产物进行酶切，设计合适的T7E1酶切引物(见表2)，使突变检测位点位于PCR片段的不对称点上，酶切后根据条带大小不同可以在聚丙烯酰胺胶中分辨出来，通过Image J软件计算CRISPR/Cas9的切割效率，估算其活性。
使用T7E1进行酶切，设计合适的引物如表2所示。
表2 T7E1酶切引物
引物 序列
IGF2-F CTTTAAGGAACCAGGTTTTCGCAGC
IGF2-R GTGCTTTGAGGTCTCTGGAAGTTAG
5、测序分析
利用LA Taq酶扩增出包含sgRNA所识别位点的IGF2基因片段，利用琼脂糖凝胶电泳分离该片段，然后用胶回试剂盒回收片段，将回收的片段克隆到pMD 18-T载体中，转化后挑选若干个单菌落，送测序分析。
6、RGS双荧光替代性报告载体的构建
通过在绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表达质粒的CMV启动子后的多克隆位点((multiple cloning site，MCS)插入mRFP片段以及CRISPR/Cas9结合位点序列，使GFP的开放阅读框(Open reading frame，ORF)发生移码，从而不表达GFP；在CRISPR/Cas9的存在下，CRISPR/Cas9与该质粒上相应的结合位点结合并切割产生双链切口(DSB)，质粒通过NHEJ(非同源末端连接)方式进行修复，使GFP的ORF重新回到正确的位置，从而能够表达GFP，使中靶细胞既发红光又发绿光。因此，将该质粒与CRISPR/Cas9以合适的条件共转染进细胞，通过流式细胞仪(flow cytometry，FCM)可以将既表达红色荧光又表达绿色荧光的细胞分选出来，可富集到基因中靶细胞。
RGS实验原理如图1所示。RGS双荧光替代性报告载体同时包含了能够在细胞中表达的红色荧光蛋白RFP和绿色荧光蛋白GFP，同时在RFP基因后，GFP基因前插入了一段和已有的CRISPR敲除系统靶位点的同源位点，并加上终止密码子。正常情况下双荧光报告载体进入细胞后只表达RFP，使细胞发红光。但在报告质粒和配套CRISPR敲除质粒同时被转入细胞后，预计报告载体上的敲除靶位点就有极大可能与基因组上的靶位点同时被Cas9蛋白切割，敲除靶位点后使终止密码子失效。这样报告质粒就能在细胞内同时表达红色荧光和绿色荧光。通过流式分选出同时表达红色荧光和绿色荧光的细胞，以起到富集中靶细胞的作用。
7、流式细胞分析与分选
流式分选红绿双荧光细胞的过程如图2所示。胰蛋白酶消化贴壁的胎儿成纤维细胞，然后用PBS重悬成单个细胞，经50μm尼龙膜过滤到流式管中，在流式细胞分析仪上分析细胞的荧光比例与强度。应用流式细胞分选仪器分选出EGFP和RFP双阳性细胞，接种至12孔板中继续培养。
流式分选不同荧光强度比例细胞，提取细胞基因组，通过T7E1实验验证IGF2-sgRNA1打靶活性。
酶切结果表明，sgRNA1(15％荧光比例)和sgRNA1(5％荧光比例)打靶活性分别估算为25％和38％。通过T-A克隆技术获得20个PCR克隆中，IGF2-sgRNA1(15％)打靶效率为60％，ZBED6结合基序破坏效率为5％；IGF2-sgRNA1(5％)打靶效率为80％，ZBED6结合基序破坏效率为20％(如图3所示)。
8、RNA提取与qPCR
收集胎儿成纤维细胞提取RNA，需用到的试剂有TRIzol、氯仿、异丙醇、用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水配制的75％v/v的乙醇。提取RNA后用反转录试剂盒将RNA反转成cDNA用于后续qPCR实验。
所用qPCR扩增引物如以下表3所示。
表3 qPCR扩增引物
编辑IGF2后，IGF2及成肌分化相关因子、细胞增殖相关水平的变化：如图4所示，定量PCR结果表明，编辑IGF2后，IGF2的表达水平有显著的提高，同时在蛋白水平也检测到这一趋势，表明CRISPR/Cas9系统对IGF2内含子3的3072位点进行了正确的编辑(图4A)。同时检测了MyoD1基因表达水平的变化，MyoD1基因对成肌发生其重要的调控作用，野生型胎儿成纤维细胞中检测不到MyoD1基因的表达，编辑IGF2后，MyoD1基因的mRNA和蛋白水平均表明其表达有显著上调(图4B)。同时EdU细胞增殖检测实验表明，编辑IGF2后，细胞增殖明显加快，表明IGF2的上调表达能够起到促进成肌分化，促进细胞增殖的作用(图4C)。
9、蛋白提取与western blot
收集胎儿成纤维细胞提取蛋白，用终浓度为1nm PMSF的RIPA裂解液裂解细胞，经过SDS-PAGE分离蛋白质样品，转移到硝酸纤维素薄膜上。用western blot成像系统检测相关蛋白的表达情况。
体细胞核移植：从健康两广小花猪体内挑选发育阶段适宜的卵巢，用注射器抽取卵巢表面直径在3-5mm的卵泡中的内含物，将内含物在TL-PVA中稀释并重悬形成悬浊液。将悬浊液在37℃环境下静置至卵母细胞沉淀完全，将沉淀吸出置于体视镜下，用移液器或口吸管挑选卵周细胞完整的卵母细胞。将挑选的健康卵母细胞放入含有10％卵泡液、FSH(卵泡刺激素)、LH(黄体生成素)、EGF(表皮细胞生长因子)的TCM-199中培养22h。再用移液器或口吸管将卵母细胞移到含有10％卵泡液、EGF的TCM-199中继续培养22h。经过44h培养成熟后挑选已经排出第二极体的健康成熟卵母细胞作克隆胚胎用。将上述制备的两广小花猪的含有编辑型IGF2基因的细胞，于5％CO2、37℃饱和湿度的细胞培养箱培养，待细胞长至对数生长期时，即可用于核移植操作。待卵母细胞体外培养成熟后，用采用电融合法将含有编辑型IGF2基因的细胞群进行体细胞核移植，并在24h之内进行胚胎移植，制备IGF2基因编辑猪，IGF2基因编辑猪体细胞核移植及生产统计如表4所示。
表4通过SCNT的IGF2编辑猪传代统计
实验编号 移植胚胎 受试数 怀孕数 产仔数 存活数 健康仔猪数
1 1005 5 2(40％) 9 6 0
2 1199 5 1(20％) 3 3 0
3 1363 5 2(40％) 16 11 8
4 948 5 1(20％) 6 4 3
总计 4515 20 6(30％) 34 24 11
10、IGF2基因编辑猪的鉴定
采取少量IGF2基因编辑猪的耳组织提取基因组作为鉴定模板，用IGF2-F与IGF2-R组成的引物对进行PCR扩增，并克隆测序，鉴定克隆猪的基因型。部分IGF2基因编辑猪的鉴定结果如图5所示，其中，#1、#2、#3分别代表IGF2未编辑型、IGF2双等位基因编辑型和IGF2单等位基因编辑型三种类型。其中#2IGF2基因编辑猪所挑选的6个克隆测序结果均一致，表明其为IGF2双等位基因编辑，且IGF2基因内含子3的ZBED6结合基序GCTCG被成功删除。#2IGF2基因编辑猪与同日龄野生型两广小花猪相比，可见背部及臀部肌肉明显发达，具有较明显的体型差异(图6)。
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种利用CRISPR/Cas9提高猪产肉量的方法
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
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<211> 25
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<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccagggttca agaggtcc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tccaagccag acctcacc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caggaagcac ctccaaact 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagatcatcc gcaaacacg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgggagacag cagcagagt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccctggtgg acaacatc 18
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<212> DNA
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gcagcccaga ctcacatt 18
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agcgtatcag agctttgagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatacctgca tctccttgtc t 21

Claims (9)

1.一种利用CRISPR/Cas9提高猪产肉量的方法，包括通过CRISPR/Cas9技术构建含有靶向猪IGF2基因的sgRNA的打靶载体，转染猪细胞(优选成纤维细胞)，制备含有编辑型IGF2基因的细胞，进行体细胞核移植和胚胎移植，其特征在于，构建所述打靶载体所用的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述猪为两广小花猪。
3.用于猪IGF2基因打靶的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体，其包括pX330载体以及连接在所述pX330载体上的靶向猪IGF2基因的sgRNA，所述靶向猪IGF2基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
5.一种宿主细胞，其包括权利要求4所述的靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体。
6.一种靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体的构建方法，其包括以下步骤：
(1)设计并合成靶向猪IGF2基因的2条sgRNA，所述靶向猪IGF2基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)对所述靶向猪IGF2基因的sgRNA的正负两条寡核苷酸链进行磷酸化和程序性退火处理，使之形成具有BbsⅠ相应的黏性末端的双链DNA短片段；
(3)使用BbsⅠ酶切pX330载体，线性化的质粒经电泳后，通过胶回试剂盒进行回收；
(4)使用T4连接酶将步骤(2)得到的双链DNA短片段与步骤(3)得到线性化的pX330载体进行连接，得到靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述猪为两广小花猪。
8.根据权利要求4所述的靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体用于提高猪产肉量的应用。
9.根据权利要求4所述的靶向猪IGF2基因的Cas9/sgRNA共表达载体在制备用于提高猪产肉量的试剂方面的应用。
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