CN109071670A - 用于位点特异性缀合之抗体和抗体片段 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含用于位点特异性缀合的取代的半胱氨酸的多肽、抗体和其抗原结合片段。

Description

用于位点特异性缀合之抗体和抗体片段
技术领域
本发明关于经工程化以导入用于位点特异性缀合之氨基酸的抗体及其抗原结合片段。
先前技术
抗体已被缀合至多种细胞毒性药物，包括烷化DNA(例如双联霉素(duocarmycin)及卡利奇霉素(calicheamicin))、扰乱微管(例如类美坦素(maytansinoid)及耳抑素(auristatin))或结合DNA(例如蒽环(anthracycline))之小分子。一种包含缀合卡利奇霉素的人化抗CD33抗体的这类抗体-药物缀合物(antibody-drug conjugate,ADC)-MylotargTM(吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin))，已经获准用于治疗急性骨髓性白血病。AdcetrisTM(布吐西单抗维多汀(brentuximab vedotin))是一种包含缀合耳抑素单甲基耳抑素E(monomethyl auristatin E,MMAE)之抗CD30嵌合抗体的ADC，其已经核准用于治疗霍奇金氏淋巴瘤及退行性大细胞淋巴瘤。
尽管ADC用于癌症治疗的前景看好，细胞毒性药物通常经由赖氨酸侧链来缀合抗体，或者通过将存在于抗体中之链间双硫键还原，以提供经活化之半胱氨酸氢硫基来缀合抗体。然而，此非特异性缀合之方式具有许多缺点。举例来说，药物缀合抗体赖氨酸残基受到抗体中有许多个可供缀合之赖氨酸残基(约30个)的事实影响而复杂化。由于药物对抗体比例(DAR)的理想数目远远较低(例如约4:1)，因此赖氨酸缀合通常产生非常异质的缀合特性。另外，许多赖氨酸位于CDR区的关键抗原结合位点，药物缀合可能导致抗体亲和性降低。另一方面，虽然硫醇媒介之缀合主要是以八个与绞链双硫键有关的半胱氨酸为目标，但仍难以预测及识别八个半胱氨酸中的哪四个能在不同制剂中一致地缀合。
最近，游离半胱氨酸残基之基因工程已经使得位点特异性缀合能够利用基于硫醇之化学来进行。位点特异性ADC具有同质特性及定义良好的缀合位点，且显示有效的体外(in vitro)细胞毒性及高度体内内(in vivo)抗肿瘤活性。
WO 2013/093809揭示在特定位点包含氨基酸取代以导入用于缀合之半胱氨酸残基的工程化的抗体恒定区(Fc、Cγ、Cλ、Cκ)或其片段。数个在IgG重链及λ/κ轻链恒定区之Cys突变位点系经揭示。
成功使用经导入之Cys残基于位点特异性缀合，有赖于选择适当位点的能力，其中Cys取代不改变蛋白结构或功能。另外，使用不同缀合位点导致不同特征，诸如ADC的生物稳定性或可缀合性。因此，利用位点特异性缀合策略来制备具有经定义之缀合位点及所欲之ADC特征的ADC将是高度有用的。
发明内容
本发明关于包含用于位点特异性缀合之经取代的半胱氨酸之多肽、抗体及彼之抗原结合片段。
所属技术领域中具有通常知识者将认可或使用不多于例行实验可确定本文所述之本发明的特定实施例之许多均等物。该等均等物意欲由下列实施例(E)涵盖。
E1.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，该恒定结构域在根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的位置290上包含工程化的半胱氨酸残基。
E2.如E1之多肽，其中该恒定结构域包含IgG重链CH2结构域。
E3.如E2之多肽，其中该IgG系IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
E4.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，当该恒定结构域与SEQ ID NO:61比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:61之残基60的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E5.如E4之多肽，其中该工程化的半胱氨酸残基系位于IgG CH2结构域之根据卡巴之EU指数编号的位置290上。
E6.如E5之多肽，其中该IgG系IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
E7.如E1或E4之多肽，其中该恒定结构域包含IgA(例如IgA1或IgA2)重链CH2结构域。
E8.如E1或E4之多肽，其中该恒定结构域包含IgD重链CH2结构域。
E9.如E1或E4之多肽，其中该恒定结构域包含IgE重链CH2结构域。
E10.如E1或E4之多肽，其中该恒定结构域包含IgM重链CH2结构域。
E11.如E1至E10中任一项之多肽，其中该恒定结构域系人抗体恒定结构域。
E12.如E1至E11中任一项之多肽，其中该恒定结构域在选自由根据卡巴之EU指数编号的118、246、249、265、267、270、276、278、283、292、293、294、300、302、303、314、315、318、320、332、333、334、336、345、347、354、355、358、360、362、370、373、375、376、378、380、382、386、388、390、392、393、401、404、411、413、414、416、418、419、421、428、431、432、437、438、439、443、444及其任何组合所组成之群组的位置上进一步包含工程化的半胱氨酸残基。
E13.如E1至E12中任一项之多肽，其中该恒定结构域在选自由根据卡巴之EU指数编号的118、334、347、373、375、380、388、392、421、443及其任何组合所组成之群组的位置上进一步包含工程化的半胱氨酸残基。
E14.如E1至E13中任一项之多肽，其中该恒定结构域在根据卡巴之EU指数编号的位置334上进一步包含工程化的半胱氨酸残基。
E15.一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含如E1至E14中任一项之多肽。
E16.一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
(a)如E1至E14中任一项之多肽，及
(b)抗体轻链恒定区，其包含(i)在根据卡巴编号的位置183上之工程化的半胱氨酸残基；或(ii)当该恒定结构域与SEQ ID NO:63比对时，在对应SEQ ID NO:63之残基76的位置上之工程化的半胱氨酸残基。
E17.一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
(a)如E1至E14中任一项之多肽，及
(b)抗体轻链恒定区，其包含(i)在根据卡巴编号的110、111、125、149、155、158、161、185、188、189、191、197、205、206、207、208、210或其任何组合的位置上之工程化的半胱氨酸残基；(ii)当该恒定结构域与SEQ ID NO:63(κ轻链)比对时，在对应SEQ ID NO:63之残基4、42、81、100、103或其任何组合的位置上之工程化的半胱氨酸残基；或(iii)当该恒定结构域与SEQ ID NO:64(λ轻链)比对时，在对应SEQ ID NO:64之残基4、5、19、43、49、52、55、78、81、82、84、90、96、97、98、99、101或其任何组合的位置上之工程化的半胱氨酸残基。
E18.如E16或E17之抗体或其抗原结合片段，其中该轻链恒定区包含κ轻链恒定结构域(CLκ)。
E19.如E16或E17之抗体或其抗原结合片段，其中该轻链恒定区包含λ轻链恒定结构域(CLλ)。
E20.一种化合物，其包含如E1至E14中任一项之多肽，或如E15至E19中任一项之抗体或其抗原结合片段，其中该多肽或抗体系经由该工程化的半胱氨酸位点缀合一或多种治疗剂。
E21.如E20之化合物，其中该治疗剂系经由连接子缀合该多肽或该抗体或其抗原结合片段。
E22.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，该恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的334、375、392及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E23.如E22之多肽，其中恒定结构域包含IgG重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E24.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，当该恒定结构域与SEQ ID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基104、145、162或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E25.如E24之多肽，其中该工程化的半胱氨酸残基系位于IgG CH2结构域、CH3结构域、或二者之根据卡巴之EU指数编号的位置334、375、392或其任何组合上。
E26.如E22或E24之多肽，其中该恒定结构域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E27.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，该恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的347、388、421、443及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E28.如E27之多肽，其中恒定结构域包含IgG CH3结构域。
E29.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，当该恒定结构域与SEQ ID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之117、158、191、213或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E30.如E29之多肽，其中该工程化的半胱氨酸残基系位于IgG CH3结构域之根据卡巴之EU指数编号的位置347、388、421、443或其任何组合上。
E31.如E27或E29之多肽，其中该恒定结构域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重链CH3结构域。
E32.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，该恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的347、388、421及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E33.如E32之多肽，其中恒定结构域包含IgG重链CH3结构域。
E34.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，当该恒定结构域与SEQ ID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基117、158、191或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E35.如E34之多肽，其中该工程化的半胱氨酸残基系位于IgG CH3结构域之根据卡巴之EU指数编号的位置347、388、421或其任何组合上。
E36.如E32或E34之多肽，其中该恒定结构域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重链CH3结构域。
E37.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，该恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的290、334、392、443及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E38.如E37之多肽，其中恒定结构域包含IgG重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E39.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，当该恒定结构域与SEQ ID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基60、104、162、213或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E40.如E39之多肽，其中该工程化的半胱氨酸残基系位于IgG CH2结构域、CH3结构域、或二者之根据卡巴之EU指数编号的位置290、334、392、443或其任何组合上。
E41.如E37或E39之多肽，其中该恒定结构域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E42.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，该恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的334、388、421、443及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E43.如E42之多肽，其中恒定结构域包含IgG重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E44.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，当该恒定结构域与SEQ ID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之104、158、191、213或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E45.如E44之多肽，其中该工程化的半胱氨酸残基系位于IgG CH2结构域、CH3结构域、或二者之根据卡巴之EU指数编号的位置334、388、421、443或其任何组合上。
E46.如E42或E44之多肽，其中该恒定结构域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E47.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，该恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的334、392、421及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E48.如E47之多肽，其中恒定结构域包含IgG重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E49.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，当该恒定结构域与SEQ ID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之104、162、191或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E50.如E49之多肽，其中该工程化的半胱氨酸残基系位于IgG CH2结构域、CH3结构域、或二者之根据卡巴之EU指数编号的位置334、392、421或其任何组合上。
E51.如E47或E49之多肽，其中该恒定结构域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E52.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，该恒定结构域在根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的位置392上包含工程化的半胱氨酸残基。
E53.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，该恒定结构域在根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的位置290、443或二者上包含工程化的半胱氨酸残基。
E54.如E52或E53之多肽，其中该恒定结构域包含IgG重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E55.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，当该恒定结构域与SEQ ID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基162的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E56.如E55之多肽，其中该工程化的半胱氨酸残基系位于IgG CH3结构域之根据卡巴之EU指数编号的位置392上。
E57.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，当该恒定结构域与SEQ ID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基60、213或二者的位置上包含工程化的残基。
E58.如E57之多肽，其中该工程化的半胱氨酸残基系位于IgG CH2结构域、CH3结构域、或二者之根据卡巴之EU指数编号的位置290、443或二者上。
E59.如E52、E53、E55、及E57中之任一项之多肽，其中该恒定结构域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E60.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，该恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的290、388、443及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E61.如E60之多肽，其中恒定结构域包含IgG重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E62.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，当该恒定结构域与SEQ ID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基60、158、213或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E63.如E62之多肽，其中该工程化的半胱氨酸残基系位于IgG CH2结构域、CH3结构域、或二者之根据卡巴之EU指数编号的残基290、388、443或其任何组合上。
E64.如E60或E62之多肽，其中该恒定结构域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E65.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，该恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的334、375、392及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E66.如E65之多肽，其中恒定结构域包含IgG重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E67.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，当该恒定结构域与SEQ ID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基104、145、162或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E68.如E67之多肽，其中该工程化的半胱氨酸残基系位于IgG CH2结构域、CH3结构域、或二者之根据卡巴之EU指数编号的位置334、375、392或其任何组合上。
E69.如E65或E67之多肽，其中该恒定结构域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E70.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，该恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的334、347、375、380、388、392及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E71.如E70之多肽，其中该恒定结构域包含IgG重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E72.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，当该恒定结构域与SEQ ID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基104、117、145、150、158、162或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
E73.如E72之多肽，其中该工程化的半胱氨酸残基系位于IgG CH2结构域、CH3结构域、或二者之根据卡巴之EU指数编号的位置334、347、375、380、388、392或其任何组合上。
E74.如E70或E72之多肽，其中该恒定结构域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重链CH2结构域、CH3结构域、或二者。
E75.如E23、E25、E28、E30、E33、E35、E38、E40、E43、E45、E48、E50、E54、E56、E58、E61、E63、E66、D68、E71、及E73中任一例之多肽，其中该IgG系IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
E76.一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含选自E21至E75中任一项之多肽。
E77.一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
(a)如E21至E75中任一项之多肽，及
(b)抗体轻链恒定区，其包含(i)在根据卡巴编号的位置183上之工程化的半胱氨酸残基；或(ii)当该恒定结构域与SEQ ID NO:63比对时，在对应SEQ ID NO:63之残基76的位置上之工程化的半胱氨酸残基。
E78.一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
(a)如E21至E75中任一项之多肽，及
(b)抗体轻链恒定区，其包含(i)在根据卡巴编号的110、111、125、149、155、158、161、185、188、189、191、197、205、206、207、208、210或其任何组合的位置上之工程化的半胱氨酸残基；(ii)当该恒定结构域与SEQ ID NO:63(κ轻链)比对时，在对应SEQ ID NO:63之残基4、42、81、100、103或其任何组合的位置上之工程化的半胱氨酸残基；或(iii)当该恒定结构域与SEQ ID NO:64(λ轻链)比对时，在对应SEQ ID NO:64之残基4、5、19、43、49、52、55、78、81、82、84、90、96、97、98、99、101或其任何组合的位置上之工程化的半胱氨酸残基。
E79.一种化合物，其包含如E21至E75中任一项之多肽，或如E76至E78之抗体或其抗原结合片段，其中该多肽或抗体系经由该工程化的半胱氨酸位点缀合治疗剂。
E80如E79之化合物，其中该治疗剂系经由连接子缀合该多肽或该抗体或其抗原结合片段。
E81.如E79或E80之化合物，其中：
(a)该重链恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的334、375、392及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；或当该恒定结构域与SEQ IDNO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基104、145、162或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；且
(b)该化合物相对于该多肽或未缀合抗体之疏水性变化，以HIC相对滞留时间测量时系介于约1.0至约1.5、介于约1.0至约1.4、介于约1.0至约1.3或介于约1.0至约1.2。
E82.如E79或E80之化合物，其中：
(a)该重链恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的347、388、421、443及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；或当该恒定结构域与SEQID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基117、158、191、213或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；且
(b)该化合物相对于该多肽或未缀合抗体之疏水性变化，以HIC相对滞留时间测量时系约1.5或更大、约1.6或更大、约1.7或更大、约1.8或更大、约1.9或更大或约2.0或更大。
E83.如E80之化合物，其中：
(a)该重链恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的347、388、421及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；或当该恒定结构域与SEQ IDNO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基117、158、191或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；
(b)该连接子包含琥珀酰亚胺基团；且
(c)琥珀酰胺在血浆中在37℃下在5％CO2下在72小时之水解百分比系至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％。
E84.如E80之化合物，其中：
(a)该重链恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的347、388、421及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；或当该恒定结构域与SEQ IDNO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基117、158、191或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；
(b)该连接子包含琥珀酰亚胺基团；且
(c)琥珀酰胺在0.5mM谷胱甘肽(pH 7.4)中在37℃下在72小时之水解百分比系至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％。
E85.如E80之化合物，其中：
(a)该重链恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的290、334、392、443及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；或当该恒定结构域与SEQID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基60、104、162、213或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；
(b)该连接子包含琥珀酰亚胺基团；且
c)琥珀酰胺在血浆中在37℃下在5％CO2下在72小时之水解百分比系约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少或约30％或更少。
E86.如E80之化合物，其中：
(a)该重链恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的290、334、392、443及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；或当该恒定结构域与SEQID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基60、104、162、213或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；
(b)该连接子包含琥珀酰亚胺基团；且
(c)琥珀酰胺在0.5mM谷胱甘肽(pH 7.4)中在37℃下在72小时之水解百分比系约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少或约30％或更少。
E87.如E79或E80之化合物，其中：
(a)该重链恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的334、388、421、443及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；或当该恒定结构域与SEQID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基104、158、191、213或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；且
(b)药物对抗体比例(DAR)在血浆中在37℃下在5％CO2下在72小时之损失百分比系不大于约10％、不大于约9％、不大于约8％、不大于约7％、不大于约6％、不大于约5％、不大于约4％、不大于约3％、不大于约2％或不大于约1％。
E88.如E79或E80之化合物，其中：
(a)该重链恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的334、392、421及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；或当该恒定结构域与SEQ IDNO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基104、162、191或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；且
(b)DAR在0.5mM谷胱甘肽(pH 7.4)中在37℃下在72小时之损失百分比系不大于约10％、不大于约9％、不大于约8％、不大于约7％、
不大于约6％、不大于约5％、不大于约4％、不大于约3％、不大于约2％或不大于约1％。
E89.如E82之化合物，其中：
(a)该重链恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的290、388、443及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；或当该恒定结构域与SEQ IDNO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基60、158、213或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；且
(b)组织蛋白酶媒介性连接子切割(200至20000ng/mL组织蛋白酶)在37℃下在20分钟之百分比系至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％。
E90.如E80之化合物，其中：
(a)该重链恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的334、375、392及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；或当该恒定结构域与SEQ IDNO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基104、145、162或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；且
(b)组织蛋白酶媒介性(200至20000ng/mL组织蛋白酶)连接子切割在37℃下在4小时之百分比系约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少或约15％或更少。
E91.如E79或E80之化合物，其中：
(a)该重链恒定结构域在选自由根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的334、347、375、380、388、392及其任何组合所组成之群组的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；或当该恒定结构域与SEQ ID NO:62比对时，该恒定结构域在对应SEQ ID NO:62之残基104、117、145、150、158、162或其任何组合的位置上包含工程化的半胱氨酸残基；且
(b)呈单体形式化合物在5mg/mL浓度下在45℃下在第21天之百分比系约96.0％或更多、约96.5％或更多、约97.0％或更多、约97.5％或更多约98.0％或更多。
E92.如E21及E80至E91中任一项之化合物，其中该连接子系可切割。
E93.如E21及E80至E92中任一项之化合物，其中该连接子包含vc、mc、MalPeg6、m(H20)c、m(H20)cvc或其组合。
E94.如E21及E80至E93中任一项之化合物，其中该连接子包含vc。
E95.如E20至E21及E79至E94中任一项之化合物，其中该治疗剂系选自由下列所组成之群组：细胞毒性剂、细胞抑制剂、化学治疗剂、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、微小RNA、肽核酸、非天然氨基酸、肽、酶、荧光标签、生物素、微管溶素(tubulysin)及其任何组合。
E96.如E20至E21及E79至E95中任一项之化合物，其中该治疗剂系选自由下列所组成之群组：耳抑素(auristatin)、类美坦素(maytansinoid)、卡利奇霉素(calicheamicin)、微管溶素(tubulysin)及其任何组合。
E97.如E20至E21及E79至E96中任一项之化合物，其中该治疗剂系耳抑素(auristatin)。
E98.如E97之化合物，其中该耳抑素系选自由0101、8261、6121、8254、6780、0131、MMAD、MMAE、MMAF及其任何组合所组成之群组。
E99.如E20至E21及E79至E96中任一项之化合物，其中该治疗剂系微管溶素(tubulysin)。
E100.一种式Ab-(L-D)之抗体药物缀合物，其中(a)Ab系E76至E78中任一项之抗体；(b)L-D系连接子-药物部分，其中L系连接子，且D系药物。
E101.如E100之抗体药物缀合物，其中L-D包含琥珀酰亚胺基团、顺丁烯二酰亚胺基团、水解的琥珀酰亚胺基团或水解的顺丁烯二酰亚胺基团。
E102.如E100或E101之抗体药物缀合物，其中L-D包含顺丁烯二酰亚胺基团或水解的顺丁烯二酰亚胺基团。
E103.如E100至E102中任一项之抗体药物缀合物，其中L-D包含6-顺丁烯二酰亚胺基己酰基(MC)、顺丁烯二酰亚胺基丙酰基(MP)、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)、对氨酸苄氧羰基(PAB)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)或6-顺丁烯二酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨酸苄氧羰基(MC-vc-PAB)。
E104.如E100至E102中任一项之抗体药物缀合物，其包含式I之化合物：
或彼之医药上可接受之盐或溶剂合物，其中下列每次独立出现时，
W系
R1系氢或C1-C8烷基；
R2系氢或C1-C8烷基；
R3A及R3B系下列任一者：
(i)R3A系氢或C1-C8烷基；R3B系C1-C8烷基；
(ii)R3A及R3B一起系C2-C8亚烷基或C1-C8杂亚烷基；
R5系且
且R6系氢或-C1-C8烷基。
E105.如E100至E102中任一项之抗体药物缀合物，其包含式IIa之化合物：
或彼之医药上可接受之盐或溶剂合物，其中下列每次独立出现时，
W系
R1系
Y系选自下列之一或多个基团：-C2-C20亚烷基-、-C2-C20杂亚烷基-、-C3-C8碳环-、-亚芳基-、-C3-C8杂环-、-Cl-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-Cl-Cl0亚烷基-、-Cl-Cl0亚烷基-(C3-C8碳环)-、-(C3-C8碳环)-Cl-C10亚烷基-、-Cl-Cl0亚烷基-(C3-C8杂环)-或-(C3-C8杂环)-Cl-Cl0亚烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-10-、-(OCH2CH2)1-10-、-(OCH2CH2)1-10-C1-6烷基、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-及-C(O)-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6烷基-；
Z系
或-NH2；
G系卤素、-OH、-SH或-S-C1-C6烷基；R2系氢或C1-C8烷基；
R3A及R3B系下列任一者：
(i)R3A系氢或C1-C8烷基；且R3B系C1-C8烷基；或
(ii)R3A及R3B一起系C2-C8亚烷基或C1-C8杂亚烷基；
R5系
R6系氢或C1-C8烷基；
R10系氢、-Cl-Cl0烷基、-C3-C8碳环基、-芳基、
-Cl-C10杂烷基、-C3-C8杂环、-Cl-Cl0亚烷基-芳基、-亚芳基-Cl-Cl0烷基、-Cl-Cl0亚烷基-(C3-C8碳环)、-(C3-C8碳环)-Cl-Cl0烷基、-Cl-Cl0亚烷基-(C3-C8杂环)或-(C3-C8杂环)-Cl-Cl0烷基，其中R10上的芳基包含经[R7]h可选地取代之芳基；
R7每次出现时系独立选自由F、Cl、I、Br、NO2、CN及CF3所组成之群组；且h系1、2、3、4或5。
E106.如E100至E102中任一项之抗体药物缀合物，其包含式IIb之化合物：
或彼之医药上可接受之盐或溶剂合物，其中下列每次独立出现时，
W系
R1系
Y系-C2-C20亚烷基-、-C2-C20杂亚烷基-、-C3-C8碳环-、-亚芳基-、-C3-C8杂环-、-Cl-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-Cl-Cl0亚烷基、-Cl-Cl0亚烷基-(C3-C8碳环)-、-(C3-C8碳环)-Cl-C10亚烷基-、-Cl-Cl0亚烷基-(C3-C8杂环)-或-(C3-C8杂环)-Cl-Cl0亚烷基-；
Z系
或-NH-Ab；
Ab系抗体；
R2系氢、或C1-C8烷基；
R3A及R3B系下列任一者：
(i)R3A系氢或C1-C8烷基；R3B系C1-C8烷基；
(ii)R3A及R3B一起系C2-C8亚烷基或C1-C8杂亚烷基；
R5系且
R6系氢或-C1-C8烷基。
E107.一种医药组合物，其包含：如E20至E21及E79至E99中任一项之化合物，或如E100至E107中任一项之抗体药物缀合物；及医药上可接受之载剂。
E108.一种治疗癌症、自体免疫疾病、发炎性疾病、或感染性疾病之方法，该方法包含对有需要治疗之个体施用治疗有效量之如E20至E21及E79至E99中任一项之化合物、如E100至E107中任一项之抗体药物缀合物、或如E108之组合物。
E109.如E20至E21及E79至E99中任一项之化合物、如E100至E107中任一项之抗体药物缀合物、或如E108之组合物，其系用于治疗癌症、自体免疫疾病、发炎性疾病或感染性疾病。
E110.一种如E20至E21及E79至E99中任一项之化合物、如E100至E107中任一项之抗体药物缀合物、或如E108之组合物用于治疗癌症、自体免疫疾病、发炎性疾病或感染性疾病之用途。
E111.一种如E20至E21及E79至E99中任一项之化合物、如E100至E107中任一项之抗体药物缀合物、或如E108之组合物于制造用于治疗癌症、自体免疫疾病、发炎性疾病或感染性疾病的药物之用途。
E112.一种式Ab-(L-D)之抗体药物缀合物，其中：
(a)Ab系与HER2结合之抗体且包含
(1)重链可变区，其包括含SEQ ID NO:2、3及4之三个CDR；
(2)重链恒定区，其具有SEQ ID NO：17、5、13、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39中之任一者；
(3)轻链可变区，其包括含SEQ ID NO:8、9及10之三个CDR；
(4)轻链恒定区，其具有SEQ ID NO：41、11或43中之任一者；且
(b)L-D系连接子-药物部分，其中L系连接子，且D系药物，
唯当该重链恒定区系SEQ ID NO:5时，该轻链恒定区不是SEQ ID NO:11。
E113.如E112之抗体药物缀合物，其中
(a)该重链恒定区系SEQ ID NO:17且该轻链恒定区系SEQ ID NO:41；
(b)该重链恒定区系SEQ ID NO:5且该轻链恒定区系SEQ ID NO:41；
(c)该重链恒定区系SEQ ID NO:17且该轻链恒定区系SEQ ID NO:11；
(d)该重链恒定区系SEQ ID NO:21且该轻链恒定区系SEQ ID NO:11；
(e)该重链恒定区系SEQ ID NO:23且该轻链恒定区系SEQ ID NO:11；
(f)该重链恒定区系SEQ ID NO:25且该轻链恒定区系SEQ ID NO:11；
(g)该重链恒定区系SEQ ID NO:27且该轻链恒定区系SEQ ID NO:11；
(h)该重链恒定区系SEQ ID NO:23且该轻链恒定区系SEQ ID NO:41；
(i)该重链恒定区系SEQ ID NO:25且该轻链恒定区系SEQ ID NO:41；
(j)该重链恒定区系SEQ ID NO:27且该轻链恒定区系SEQ ID NO:41；
(k)该重链恒定区系SEQ ID NO:29且该轻链恒定区系SEQ ID NO:11；
(l)该重链恒定区系SEQ ID NO:31且该轻链恒定区系SEQ ID NO:11；
(m)该重链恒定区系SEQ ID NO:33且该轻链恒定区系SEQ ID NO:43；
(n)该重链恒定区系SEQ ID NO:35且该轻链恒定区系SEQ ID NO:11；
(o)该重链恒定区系SEQ ID NO:37且该轻链恒定区系SEQ ID NO:11；
(p)该重链恒定区系SEQ ID NO:39且该轻链恒定区系SEQ ID NO:11；或
(q)该重链恒定区系SEQ ID NO:13且该轻链恒定区系SEQ ID NO:43。
E114.如E112之抗体药物缀合物，其中
(a)该重链包含SEQ ID NO：18、6、14、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中之任一者；且
(b)该轻链包含SEQ ID NO：42、12、或44中之任一者，
唯当该重链系SEQ ID NO:6时，该轻链不是SEQ ID NO:12。
E115.如E114之抗体药物缀合物，其中
(a)该重链系SEQ ID NO:18且该轻链系SEQ ID NO:42；
(b)该重链系SEQ ID NO:6且该轻链系SEQ ID NO:42；
(c)该重链系SEQ ID NO:18且该轻链系SEQ ID NO:12；
(d)该重链系SEQ ID NO:22且该轻链系SEQ ID NO:12；
(e)该重链系SEQ ID NO:24且该轻链系SEQ ID NO:12；
(f)该重链系SEQ ID NO:26且该轻链系SEQ ID NO:12；
(g)该重链系SEQ ID NO:28且该轻链系SEQ ID NO:12；
(h)该重链系SEQ ID NO:24且该轻链系SEQ ID NO:42；
(i)该重链系SEQ ID NO:26且该轻链系SEQ ID NO:42；
(j)该重链系SEQ ID NO:28且该轻链系SEQ ID NO:42；
(k)该重链系SEQ ID NO:30且该轻链系SEQ ID NO:12；
(l)该重链系SEQ ID NO:32且该轻链系SEQ ID NO:12；
(m)该重链系SEQ ID NO:34且该轻链系SEQ ID NO:44；
(n)该重链系SEQ ID NO:36且该轻链系SEQ ID NO:12；
(o)该重链系SEQ ID NO:38且该轻链系SEQ ID NO:12；
(p)该重链系SEQ ID NO:40且该轻链系SEQ ID NO:12；或
(q)该重链系SEQ ID NO:14且该轻链系SEQ ID NO:44。
E116.如E112至E115中任一项之抗体药物缀合物，其中该连接子系选自由vc、mc、MalPeg6、m(H20)c及m(H20)cvc所组成之群组。
E117.如E116之抗体药物缀合物，其中该连接子系可切割。
E118.如E116或E117之抗体药物缀合物，其中该连接子系vc。
E119.如E112至E118中任一项之抗体药物缀合物，其中该药物具膜穿透性。
E120.如E112至E119中任一项之抗体药物缀合物，其中该药物系耳抑素(auristatin)。
E121.如E120之抗体药物缀合物，其中该耳抑素(auristatin)系选自由下列所组成之群组：
2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；
2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；
2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，三氟乙酸盐；
2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；
2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；
2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，三氟乙酸盐；
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；及
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，
或其医药上可接受之盐或溶剂合物。
E122.如E120之抗体药物缀合物，其中该耳抑素(auristatin)系2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺或彼之医药上可接受之盐或溶剂合物。
E123.一种式Ab-(L-D)之抗体药物缀合物，其中：
(a)Ab系与HER2结合之抗体且包含重链及轻链，该重链包含SEQ ID NO:18且该轻链包含SEQ ID NO:42；且
(b)L-D系连接子-药物部分，其中L系vc之连接子且D系2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺之耳抑素(auristatin)或彼之医药上可接受之盐或溶剂合物。
E124.一种医药组合物，其包含如E112至E123中任一项之抗体药物缀合物及医药上可接受之载剂。
E125.一种式Ab-(L-D)之抗体药物缀合物，其中Ab系与纤网蛋白(FN)之外结构域B(EDB)结合之抗体，且L-D系连接子-药物部分，其中L系连接子，且D系药物。
E126.如E125之抗体药物缀合物，其中该抗体包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含：
(a)VH互补决定区一(CDR-H1)，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:66或67，
(b)VH CDR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:68或69；及
(c)VH CDR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:70；及
(ii)轻链可变区(VL)，其包含：
(a)VL互补决定区一(CDR-L1)，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:73，
(b)VL CDR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:74；及
(c)VL CDR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。
E127.如E125或E126之抗体药物缀合物，其中该连接子系选自由vc、mc、MalPeg6、m(H20)c及m(H20)cvc所组成之群组。
E128.如E127之抗体药物缀合物，其中该连接子系可切割。
E129.如E127或E128之抗体药物缀合物，其中该连接子系vc。
E130.如E125至E129中任一项之抗体药物缀合物，其中该药物具膜穿透性。
E131.如E125至E130中任一项之抗体药物缀合物，其中该药物系耳抑素(auristatin)。
E132.如E131之抗体药物缀合物，其中该耳抑素(auristatin)系选自由下列所组成之群组：
2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；
2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；
2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，三氟乙酸盐；
2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；
2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；
2-甲基-L-脯氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，三氟乙酸盐；
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺；及
N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]氨基}1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺，
或其医药上可接受之盐或溶剂合物。
E133.如E132之抗体药物缀合物，其中该耳抑素(auristatin)系2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺或彼之医药上可接受之盐或溶剂合物。
E134.一种医药组合物，其包含如E125至E133中任一项之抗体药物缀合物及医药上可接受之载剂。
E135.一种核酸，其编码如E1至E14及E22至E75中任一项之多肽。
E136.一种核酸，其编码如E15至E19及E76至E78中任一项之抗体。
E137.一种核酸，其编码如E20、E21、及E79至E99中任一项之化合物的抗体部分。
E138.一种核酸，其编码如E100至E106、E112至E123、及E125至E133中任一项之抗体药物缀合物的抗体部分。
E139.一种核酸，其编码包含抗体重链恒定结构域之多肽，其中该重链恒定结构域在根据卡巴(Kabat)之EU指数编号的位置290上包含工程化的半胱氨酸残基。
E140.一种分离之核酸，其编码抗体或彼之抗原结合片段，其中该抗体或彼之抗原结合片段包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含：
(a)VH互补决定区一(CDR-H1)，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:66或67，
(b)VH CDR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:68或69；及
(c)VH CDR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:70；及
(ii)轻链可变区(VL)，其包含：
(a)VL互补决定区一(CDR-L1)，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:73，
(b)VL CDR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:74；及
(c)VL CDR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。
E141.一种宿主细胞，其包含如E135至E140中任一项之核酸。
E142.一种制备多肽或抗体之方法，该方法包含在表达该多肽或抗体的适当条件下培养如E141之宿主细胞，以及分离该多肽或抗体。
附图说明
图1A至1B说明(A)T(κK183C+K290C)-vc0101及(B)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101ADC。各黑色圆点代表缀合单克隆抗体之连接子/载荷物。每个ADC显示一个此类连接子/载荷物之结构。画底线之实体系由抗体上之氨基酸残基供应，而缀合即经由该残基发生。
图2A至2E说明选定ADC之疏水性交互作用层析(HIC)图谱，其显示当曲妥单抗衍生抗体缀合不同连接子载荷物时滞留时间的变化。
图3A至3B说明ADC结合至HER2之曲线。(A)直接结合至HER2阳性BT474细胞及(B)与PE标示曲妥单抗竞争结合至BT474细胞。这些结果指出在这些ADC中之抗体的结合性质不受缀合方法之改变。
图4说明曲妥单抗衍生ADC之ADCC活性。
图5说明数个曲妥单抗衍生ADC对数个HER2表达水平不同的细胞系之体外细胞毒性数据(IC50)，报告单位为nM载荷物浓度。
图6说明数个曲妥单抗衍生ADC对数个HER2表达水平不同的细胞系之体外细胞毒性数据(IC50)，报告单位为ng/ml抗体浓度。
图7A至7I说明九种曲妥单抗衍生ADC在N87异种移植的抗肿瘤活性，以肿瘤体积对时间作图。(A)T(κK183C+K290C)-vc0101；(B)T(κK183C)-vc0101；(C)T(K290C)-vc0101；(D)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101；(E)T(K290C+K334C)-vc0101；(F)T(K334C+K392C)-vc0101；(G)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101；(H)T-vc0101；(I)T-DM1。N87胃癌细胞表达高水平的HER2。
图8A至8E说明六种曲妥单抗衍生ADC在HCC1954异种移植的抗肿瘤活性，以肿瘤体积对时间作图。(A)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101；(B)T(K290C+K334C)-vc0101；(C)T(K334C+K392C)-vc0101；(D)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101；(E)T-DM1。HCC1954乳癌细胞表达高水平的HER2。
图9A至9G说明七种曲妥单抗衍生ADC在JIMT-1异种移植的抗肿瘤活性，以肿瘤体积对时间作图。(A)T(κK183C+K290C)-vc0101；(B)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101；(C)T(K290C+K334C)-vc0101；(D)T(K334C+K392C)-vc0101；(E)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101；(F)T-vc0101；(G)T-DM1。JIMT-1乳癌细胞表达中/低水平的HER2。
图10A至10D说明五种曲妥单抗衍生ADC在MDA-MB-361(DYT2)异种移植的抗肿瘤活性，以肿瘤体积对时间作图。(A)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101；(B)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101；(C)T-vc0101；(D)T-DM1。MDA-MB-361(DYT2)乳癌细胞表达中/低水平的HER2。
图11A至11E说明五种曲妥单抗衍生ADC在PDX-144580病患衍生异种移植的抗肿瘤活性，以肿瘤体积对时间作图。(A)T(κK183C+K290C)-vc0101；(B)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101；(C)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101；(D)T-vc0101；(E)T-DM1。PDX-144580病患衍生细胞系TNBC PDX模型。
图12A至12D说明四种曲妥单抗衍生ADC在PDX-37622病患衍生异种移植的抗肿瘤活性，以肿瘤体积对时间作图。(A)T(κK183C+K290C)-vc0101；(B)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101；(C)T(K297C+K334C)-vc0101；(D)T-DM1。PDX-37622病患衍生细胞系表达中度水平之HER2之NSCLC PDX模型。
图13A至13B说明经(A)T-DM1或(B)T-vc0101处理且针对磷酸化组蛋白H3及IgG抗体染色之N87肿瘤异种移植之免疫组织化学结果。
T-vc0101观察到旁路(Bystander)活性。
图14说明数个曲妥单抗衍生ADC及游离载荷物对于在体外经处理使产生对T-DM1抗性之细胞((N87-TM1及N87-TM2)或对T-DM1敏感之亲代细胞(N87细胞)的体外细胞毒性数据(IC50)，报告单位为nM载荷物浓度及ng/ml抗体浓度。N87胃癌细胞表达高水平的HER2。
图15A至15G说明七种曲妥单抗衍生ADC对T-DM1敏感性(N87细胞)及抗性(N87-TM1及N87-TM2)胃癌细胞之抗肿瘤活性。(A)T-DM1；(B)T-mc8261；(C)T(297Q+K222R)-AcLysvc0101；(D)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101；(E)T(K290C+K334C)-vc0101；(F)T(K334C+K392C)-vc0101；(G)T(κK183C+K290C)-vc0101。
图16A至16B说明在T-DM1敏感性(N87细胞)及抗性(N87-TM1及N87-TM2)胃癌细胞上显示(A)MRP1药物流出泵及(B)MDR1药物流出泵之蛋白质表达的蛋白印迹分析。
图17A至17B说明T-DM1敏感性(N87细胞)及抗性(N87-TM1及N87-TM2)胃癌细胞之HER2表达及结合至曲妥单抗。(A)显示HER2蛋白质表达之蛋白印迹及(B)结合至细胞表面HER2之曲妥单抗。
图18A至18D说明T-DM1敏感性(N87细胞)及抗性(N87-TM1及N87-TM2)胃癌细胞中之蛋白质表达水平之表征。(A)523个蛋白质的蛋白质表达水平变化；(B)显示IGF2R、LAMP1及CTSB之蛋白质表达的蛋白印迹；(C)显示CAV1之蛋白质表达的蛋白印迹；(D)由N87及N87-TM2细胞植入而在体内制备之肿瘤中的CAV1蛋白质表达之IHC。
图19A至19C说明由(A)T-DM1敏感性N87亲代细胞；(B)T-DM1抗性N87-TM1细胞；(C)T-DM1抗性N87-TM2细胞植入而在体内制备之肿瘤对曲妥单抗及各种曲妥单抗衍生ADC的敏感性。
图20A至20F说明由T-DM1敏感性N87亲代细胞及T-DM1抗性N87-TM2或N87-TM1细胞植入而在体内制备之肿瘤对曲妥单抗及各种曲妥单抗衍生ADC的敏感性。(A)在曲妥单抗或二种曲妥单抗衍生ADC存在下，N87肿瘤大小对时间作图；(B)在曲妥单抗或二种曲妥单抗衍生ADC存在下，N87-TM2肿瘤大小对时间作图；(C)在曲妥单抗或二种曲妥单抗衍生ADC存在下，N87细胞肿瘤大小倍增的时间；(D)在曲妥单抗或二种曲妥单抗衍生ADC存在下，N87-TM2细胞肿瘤大小倍增的时间；(E)在七种不同曲妥单抗衍生ADC存在下，N87-TM2肿瘤大小对时间作图；(F)在第14天新增曲妥单抗衍生ADC下，N87-TM1肿瘤大小对时间作图。
图21A至21E说明在体内制备的T-DM1抗性细胞之制备及表征。(A)N87胃癌细胞最初植入体内时对T-DM1敏感。(B)经过一段时间后，经植入之N87细胞变得对T-DM1具有抗性，但维持对(C)T-vc0101、(D)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101及(E)T(κK183+K290C)-vc0101之敏感性。
图22A至22D说明四种曲妥单抗衍生ADC对于在体内制备之T-DM1抗性细胞(N87-TDM)相较于T-DM1敏感性亲代N87细胞之体外细胞毒性，以肿瘤体积对时间作图。(A)T-DM1；(B)T(κK183+K290C)-vc0101；(C)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101；(D)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101。
图23A至23B说明在体内制备的T-DM1抗性细胞(N87-TDM1，来自小鼠2、17及18)相较于T-DM1敏感性亲代N87细胞之HER2蛋白质表达水平。(A)FACS分析及(B)蛋白印迹分析。未观察到HER2蛋白质表达的显著差异。
图24A至24D说明在N87-TDM1(小鼠2、7及17)中之T-DM1抗性并不是由于药物流出泵所致。(A)显示MDR1蛋白质表达之蛋白印迹。T-DM1抗性细胞(N87-TDM1)及T-DM1敏感性N87亲代细胞在游离药物(B)0101；(C)多柔比星；(D)T-DM1存在下之体外细胞毒性。
图25A至25B说明(A)在对马来猴施用剂量后之总Ab及曲妥单抗ADC(T-vc0101)或T(κK183C+K290C)位点特异性ADC二者，以及(B)对马来猴施用剂量后之曲妥单抗(T-vc0101)或各种位点特异性ADC的ADC分析物的浓度对时间曲线及药物动力学/毒物动力学。
图26说明疏水性交互作用层析(HIC)之相对滞留值相较于大鼠中之暴露(AUC)。X轴代表HIV测得之相对滞留时间；而Y轴代表在大鼠中之药物动力学剂量-标准化暴露(自0至336小时之抗体“曲线下面积(AUC)”，除以10mg/kg之药物剂量)。
符号形状表示大致的药物装载(DAR)：菱形＝DAR 2；圆形＝DAR 4。箭头指示T(κK183C+K290C)-vc0101。
图27说明使用T-vc0101常规缀合物ADC及T(κK183C+K290C)-vc0101位点特异性ADC的毒性研究。T-vc0101在5mg/kg下诱导严重的嗜中性粒细胞减少症，然而T(κK183C+K290C)-vc0101在9mg/kg下造成最小的嗜中性粒细胞数下降。
图28A至28C说明(A)T(K290C+K334C)-vc0101；(B)T(K290C+K392C)-vc0101；及(C)T(K334C+K392C)-vc0101的结晶结构。如图28C所示，考虑载荷物几何形状，在K290、K334、K392中任一位点之缀合，可能潜在地扰乱聚醣之整体轨迹而远离CH2表面，使聚醣以及CH2结构本身去稳定化，因此导致CH2-CH3界面。
图29是以3mpk之各种vc0101位点突变体ADC投药下之肿瘤生长图(N87)。
图30显示原始SEC痕迹，其说明各种位点突变体与LP#2缀合时的行为。
图31显示实例22之ADC的血浆稳定性。含有乙酰化产物之重链或轻链(质量偏移＝993)被当作“经装载”，然而该些含有去乙酰化产物者(质量偏移＝951)被当作“未经装载”以进行DAR计算。
图32显示实例22之ADC的体内稳定性(以DAR测量)。
图33显示在WI38-VA13和HT-29细胞中以蛋白印迹分析EDB+FN的表达。
图34A至34F显示下列在PDX-NSX-11122(高度EDB+FN表达性NSCLC病患衍生性异种移植(PDX)人癌症模型)中之抗肿瘤疗效：(A)0.3、0.75、1.5及3mg/kg之EDB-L19-vc-0101；(B)3mg/kg之EDB-L19-vc-0101及10mg/kg之双硫键连接之EDB-L19-diS-DM1；(C)1及3mg/kg之EDB-L19-vc-0101与5mg/kg之双硫键连接之EDB-L19-diS-C2OCO-1569；(D)分别为剂量0.3、1及3mg/kg之位点特异性缀合之EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101与剂量1.5mg/kg之常规缀合之EDB-L19-vc-0101(ADC1)；(E)剂量为0.3、1及3mg/kg之位点特异性缀合之EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101；以及(F)以3mg/kg投药之EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101组中每只个别荷瘤小鼠之肿瘤生长抑制曲线。
图35A至35F显示下列在H-1975(中度至高度EDB+FN表达性NSCLC细胞系异种移植(CLX)人癌症模型)中之抗肿瘤疗效：(A)0.3、0.75、1.5及3mg/mg之EDB-L19-vc-0101；(B)0.3、1及3mg/kg之EDB-L19-vc-0101和EDB-L19-vc-1569；(C)分别为0.5、1.5及3mg/kg之EDB-L19-vc-0101和0.1、0.3及1mg/kg之EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI；(D)0.5、1.5及3mg/kg之位点特异性缀合EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101和常规缀合之EDB-L19-vc-0101；(E)1及3mg/kg之EDB-L19-vc-0101和EDB-(K94R)-vc-0101；以及(F)1及3mg/kg之EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101和EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101。
图36显示3mg/kg之EDB-L19-vc-0101和EDB-L19-vc-9411在HT29(中度EDB+FN表达性结肠CLX人癌症模型)中之抗肿瘤疗效。
图37A至37B显示0.3、1及3mg/kg之EDB-L19-vc-0101在下列中之抗肿瘤疗效：(A)PDX-PAX-13565(中度至高度EDB+FN表达性胰脏PDX)；以及(B)PDX-PAX-12534(低度至中度EDB+FN表达性胰脏PDX)。
图38显示1及3mg/kg之EDB-L19-vc-0101于Ramos(中度EDB+FN表达性淋巴瘤CLX人癌症模型)中之抗肿瘤疗效。
图39A至39B显示下列于EMT-6(小鼠同基因型乳癌模型)中之抗肿瘤疗效：(A)4.5mg/kg之EDB-mut1κK183C-K290C)-vc-0101；以及(B)以4.5mg/kg投药之EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101组中每只个别荷瘤小鼠之肿瘤生长抑制曲线。
图40显示5mg/kg之常规缀合之EDB-L19-vc-0101相较于6mg/kg之位点特异性缀合之EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)的绝对嗜中性粒细胞计数。
图41显示抗体X和cys突变体X(κK183C+K290C)与目标抗原之竞争结合。X和X(κK183C+K290C)系于竞争型ELISA中测试，其中目标抗原经固定在盘上，而抗体X和cys突变体X(κK183C+K290C)二者的连续稀释液在恒定浓度的生物素化亲代抗体存在下施加。维持与ELISA盘上之目标抗原结合之生物素化亲代抗体的量，系通过施加与辣根过氧化酶缀合之链霉抗生物素蛋白测定(见方法)。
图42显示Calu-6人NSCLC异种移植肿瘤于经ADC或载剂治疗之雌性无胸腺小鼠中的生长曲线。各治疗组中个别小鼠的平均肿瘤体积(mm3，平均值±SEM)系对开始投药后天数作图。
实施方式
本发明关于包含用于位点特异性缀合之经取代的半胱氨酸之多肽、抗体及彼之抗原结合片段。特别地，已发现抗体重链恒定区之位置290(依据卡巴之EU指数编号)可用于位点特异性缀合，以利用针对不同目标(包括但不限于HER2)之抗体制备抗体药物缀合物(ADC)。在本文中例示之数据证明，与其它缀合位点相比，缀合在位置290的ADC工程化体显示优越的体内性质。
举例来说，如实例所示，缀合不同缀合位点可导致不同的ADC特征，诸如生物物理性质(例如疏水性)、生物稳定性、可缀合性、以及ADC疗效(例如载荷物释放动力学以及ADC代谢)。
疏水性的连接子-载荷物，诸如实例中使用之vc-101，对ADC造成特别挑战。已有报导，血浆清除速率随连接子-载荷物的疏水性增加而增加，导致体内疗效降低。因此，已有提出降低整体疏水性可改善体内PK(Lyon et al,Nature Biotechnology 33,733-735(2015))。然而，本发明人经由一系列的实验观察到，降低疏水性并不一定与改善PK相关。实际上，在许多情况下，疏水性并不是良好PK特性的可靠预测指标。此外，基于Cys之位点特异性缀合物的PK特性与转谷氨酰胺酶缀合物之行为不同。因此，需要新的设计方案与准则来评估理想的缀合位点。
发明人的结构试验提供一些选择理想缀合位点的初步见解。例如，在特定位点的ADC缀合可能改变Fc结构域的结构，或可能因为此位点之载荷物的几何形状而干扰抗体的糖基化。另外，某些缀合位点可提供适当的表面暴露平衡：其暴露的表面足以允许药物之缀合，但不致于过度暴露致使该药物在体内代谢并且自血浆中过快清除。基于结构试验，许多候选位点被识别为有潜力的缀合位点(例如，重链290、392，轻链183)。
在结构试验之后，设计并进行额外的检定。值得注意的是，本发明人评估的几个缀合位点中，与其它缀合位点相比，位置290一开始没有显示出优越的性质。例如，基于小鼠模型之体内药物动力学(PK)数据无法提示位置290是特别理想的。然而，来自马来猴的体内PK数据令人惊讶地显示，在位置290缀合的ADC分子具有优越的PK特性，让该缀合位点在临床应用上更有利。位点290的优点不能根据连接子-载荷物的疏水性来预测。
其它也提供优越体内PK特性的缀合位点包括392(重链)与183(轻链)。
除了有利的体内PK，Cys-290缀合物亦显示非常低度的高分子量(HMW)聚集，以及有利的抗体依赖性细胞媒介性细胞毒性(ADCC)。特别地，已有报告指出缀合事件通常导致丧失ADCC功能。例如，抗CD70(SGN-70A ADC的抗体组分)已显示ADCC、抗体依赖性细胞性吞噬作用(ADCP)、和补体依赖性细胞毒性(CDC)等功能。尽管如此，抗CD70-MMAF缀合物缺乏FcγR结合(Kim et al,Biomol Ther(Seoul).2015Nov；23(6):493-509)。相反的，此处揭示之Cys-290ADC缀合物的ADCC功能并未受损。
另外，在本文中例示的血液学与显微数据显示，使用Cys-290之位点特异性缀合，与常规缀合物相比，亦改善ADC(例如，Ab-vc0101)诱导之毒性(诸如嗜中性粒细胞减少症以及骨髓毒性)。
最终，在本文中提供的实例亦显示，视ADC分子的特定应用而定，数个候选缀合位点可用来解决特定问题。例如，某些位点提供较佳的载荷物代谢，一些位点降低分子的整体疏水性，以及一些位点允许更快或更慢的连接子切割。这些首选的缀合位点可被用来优化ADC分子。见实施例21及22。
1.抗体-药物缀合物(ADC)
ADC包含通常经由使用连接子与载荷药物缀合的抗体组分。常规的ADC缀合策略倚赖经由在抗体重链及/或轻链上内源性发现的赖氨酸或半胱氨酸，将载荷药物随机缀合至抗体上。因此，如此得到的ADC为显示不同药物：抗体比(DAR)之物种的异质性混合物。相反地，此处揭示之ADC为位点特异性ADC，其在抗体重链及/或轻链上特定工程化的残基处，将载荷药物缀合至抗体。因此，位点特异性ADC是包含具有明确药物：抗体比(DAR)之物种的均质性ADC族群。因此，位点特异性ADC显示一致的化学计量，导致改善的缀合物药物动力学、生物分布与安全特性。本发明的ADC包括与连接子及/或载荷物缀合的本发明之抗体及多肽。
本发明提供式Ab-(L-D)之抗体药物缀合物，其中
(a)Ab系与抗原结合之抗体或其抗原结合片段，且(b)L-D系连接子-药物部分，其中L系连接子，且D系药物。
本发明亦包含式Ab-(L-D)p之抗体药物缀合物，其中(a)Ab系与HER2结合之抗体或其抗原结合片段，(b)L-D系连接子-药物部分，其中L系连接子，且D系药物，且(c)p系连接至抗体的连接子/药物部分之数目。对于位点特异性ADC，由于ADC的均质性，p系整数。在一些实施例中，p系4。在其它实施例中，p系3。在其它实施例中，p系2。在其它实施例中，p系1。在其它实施例中，p系大于4。
A.抗体及缀合位点
本发明的多肽及及抗体以位点特异性方式与载荷物缀合。为了顺应这种型态的缀合，恒定结构域系经修饰，以提供经工程化在一或多个特异性位点之反应性半胱氨酸残基(有时称为“Cys”突变体)。亦揭示可用于基于转谷氨酰胺酶缀合之抗体，其中含有酰基供体谷氨酰胺之标签或内源性谷氨酰胺系于转谷氨酰胺酶及胺存在下通过多肽工程化而成为反应性。
一般来说，抗体重链或轻链中的区域系基于各种类别成员之区域内之相对缺乏序列变异，而经定义为“恒定”(C)区“可变”(V)区。抗体之恒定区可指称不论是单独或组合的抗体轻链之恒定区或抗体重链之恒定区。恒定结构域并不直接涉及抗体与抗原之结合，但是其展现多种效应功能，诸如Fc受体(FcR)结合、抗体依赖性细胞性毒性(ADCC)中之抗体参与、调理作用、启动补体依赖性细胞毒性、以及肥胖细胞去颗粒化。
抗体重链与轻链的恒定区与可变区经折叠成结构域。免疫球蛋白轻链上的恒定区通常称为“CL结构域”。重链上的恒定结构域(例如绞链、CH1、CH2或CH3结构域)称为“CH结构域”。本发明的多肽或抗体(或其片段)的恒定区可能衍生自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、或其任一同型以及其亚型和突变版本中之任一者之恒定区。
CH1结构域包括免疫球蛋白重链之第一个(最氨基端)恒定区结构域，其例如根据卡巴之EU指数编号自约位置118延伸至215。CH1结构域邻近VH结构域以及免疫球蛋白重链分子之绞链区的氨基端，且并不形成免疫球蛋白重链之Fc区的一部份。
绞链区包括连接CH1结构域至CH2结构域的重链分子部分。此绞链区包含大约25个残基并且可弯折，因此允许两个N端抗原结合区可独立地移动。绞链区可以细分成三个不同的结构域：上、中、和下绞链接构域。
CH2结构域包括例如依据卡巴之EU指数编号自约位置231延伸至340之免疫球蛋白分子重链的部份。CH2结构域很特别，因为其不与另一结构域紧密配对。反而有两条N-连接分支碳水化合物链插入完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。在某些实施例中，本发明之多肽或抗体(或其片段)包含衍生自IgG分子(诸如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)之CH2结构域。在某些实施例中，IgG系人IgG。
CH3结构域包括自CH2结构域之N端延伸大约110个残基之免疫球蛋白分子重链的部份，例如依据卡巴之EU指数编号自约位置341至447。CH3结构域基本上形成抗体的C端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，可从CH3结构域延伸另外的结构域以形成分子的C端部分(例如，IgM的μ链以及IgE的ε链中的CH4结构域)。在某些实施例中，本发明之多肽或抗体(或其片段)包含衍生自IgG分子(诸如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)之CH3结构域。在某些实施例中，IgG系人IgG。
CL结构域包括例如根据卡巴之EU指数编号自约位置108延伸至214之免疫球蛋白轻链之恒定区结构域。CL结构域邻近VL结构域。在某些实施例中，本发明之多肽或抗体(或其片段)包含κ轻链恒定结构域(CLκ)。在某些实施例中，本发明之多肽或抗体(或其片段)包含λ轻链恒定结构域(CLλ)。CLκ具有已知多态性基因座CLκ-V/A45及CLκ-L/V83(使用卡巴编号)，因此允许多态性Km(1)：CLκ-V45/L83；Km(1,2)：CLκ-A45/L83；及Km(3):CLκ-A45/V83。本发明之多肽、抗体及ADC可具有含有任何这些轻链恒定区之抗体组分。
Fc区通常包含CH2结构域及CH3结构域。虽然免疫球蛋白重链之Fc区的边界可能不同，人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或Pro230位置(依据卡巴之EU指数编号)之氨基酸残基至彼之羧基端之片段。本发明之“Fc区”可能为天然序列Fc区或变异体Fc区。
在一实施方式中，本发明提供一种多肽，其包含依据卡巴之EU指数编号位置290上经取代的半胱氨酸残基之抗体重链恒定结构域。如本文所公开与举例，位置290的缀合提供令人惊奇地期望的体内PK特性。
可以引入另外的半胱氨酸取代，如位置118、246、249、265、267、270、276、278、283、292、293、294、300、302、303、314、315、318、320、332、333、334、336、345、347、354、355、358、360、362、370、373、375、376、378、380、382、386、388、390、392、393、401、404、411、413、414、416、418、419、421、428、431、432、437、438、439、443、444、或其任何组合(根据卡巴之EU指数编号)。特别是，可使用位置118、334、347、373、375、380、388、392、421、443或其任何组合。残基118在实例中亦称为A114、A114C、C114、或114C，因为此位点之最初发表系使用卡巴编号(114)而非EU指数(118)，且自当时起已通常被该领域称为114位点。
在另一实施方式中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含(a)本文所揭示之多肽及(b)抗体轻链恒定区，其包含(i)在根据卡巴之EU指数编号的位置183上之工程化的半胱氨酸残基；或(ii)当该恒定结构域与SEQ ID NO:63比对时，在对应SEQ ID NO:63之残基76的位置上之工程化的半胱氨酸残基。
在另一实施方式中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含(a)本文所揭示之多肽及(b)抗体轻链恒定区，其包含(i)在根据卡巴编号的110、111、125、149、155、158、161、185、188、189、191、197、205、206、207、208、210或其任何组合的位置上之工程化的半胱氨酸残基；(ii)当该恒定结构域与SEQ ID NO:63(κ轻链)比对时，在对应SEQ ID NO:63之残基4、42、81、100、103或其任何组合的位置上之工程化的半胱氨酸残基；或(iii)当该恒定结构域与SEQ ID NO:64(λ轻链)比对时，在对应SEQ ID NO:64之残基4、5、19、43、49、52、55、78、81、82、84、90、96、97、98、99、101或其任何组合的位置上之工程化的半胱氨酸残基。
在另一实施方式中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含(a)本文所揭示之多肽及(b)抗体κ轻链恒定区，其包含(i)在根据卡巴编号的111、149、188、207、210或其任何组合(较佳为111或210)的位置上之工程化的半胱氨酸残基；或(ii)当该恒定结构域与SEQID NO:63比对时，在对应SEQ ID NO:63之残基4、42、81、100、103或其任何组合(较佳为残基4或103)的位置上之工程化的半胱氨酸残基。
在另一实施方式中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含(a)本文所揭示之多肽及(b)抗体λ轻链恒定区，其包含(i)在根据卡巴编号的110、111、125、149、155、158、161、185、188、189、191、197、205、206、207、208、210或其任何组合(较佳为110、111、125、149、或155)的位置上之工程化的半胱氨酸残基；或(ii)当该恒定结构域与SEQ ID NO:64对齐时，在对应SEQ ID NO:64之残基4、5、19、43、49、52、55、78、81、82、84、90、96、97、98、99、101或其任何组合(较佳为残基4、5、19、43、或49)的位置上之工程化的半胱氨酸残基。
氨基酸修饰可通过该领域已知之任何方法进行，许多该等方法为本领域技术人员所广为周知及例行。例如(但无限制之意)，氨基酸取代、删除及插入可利用任何广为周知之基于PCR之技术完成。氨基酸取代可通过定点突变形成进行(见例如Zoller and Smith,1982,Nucl.Acids Res.10:6487-6500；及Kunkel,1985,PNAS82:488)。
在需要维持抗原结合的应用中，此类修饰应该发生在不会扰乱抗体之抗原结合能力的位点。在首选的实施例中，该一或多个修饰系发生在重链和/或轻链之恒定区中。
通常，该抗体对目标之KD相较于对另一非目标分子诸如，但不限于，环境中之不相关物质或随附物质之KD将小于2倍、较佳地小于5倍、更佳地小于10倍。更佳地，该KD相较于对非目标分子之KD将小于50倍，诸如小于100倍，或小于200倍；甚至更佳地小于500倍，诸如小于1,000倍或小于10,000倍。
此解离常数之值可通过广为周知之方法直接测定，甚至可计算复杂混合物之解离常数，例如通过该些于Caceci et al.,1984,Byte 9:340-362中提出的方法。例如，KD可利用双过滤硝化纤维素膜结合检定建立，诸如由Wong and Lohman,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5428-5432所揭示者。其它用于评估配体诸如抗体对目标的结合能力的标准检定系该领域已知，包括例如ELISA、蛋白印迹分析、RIA、及流式细胞分析。抗体之结合动力学及结合亲和性亦可通过该领域已知之标准检定评估，诸如使用BiacoreTM系统之表面电浆共振(SPR)。
可进行竞争性结合检定，其中抗体与目标之结合系与该目标与该目标之另一配体(诸如另一抗体)之结合比较。发生百分之50结合抑制之浓度称为Ki。在理想条件下，Ki等于KD。Ki值绝不会小于KD，因此可方便地以Ki之测量值取代以提供KD之上限。
本发明之抗体可具有对其目标不大于约1×10-3M之KD，诸如不大于约1×10-3M、不大于约9×10-4M、不大于约8×10-4M、不大于约7×10-4M、不大于约6×10-4M、不大于约5×10-4M、不大于约4×10-4M、不大于约3×10-4M、不大于约2×10-4M、不大于约1×10-4M、不大于约9×10-5M、不大于约8×10-5M、不大于约7×10-5M、不大于约6×10-5M、不大于约5×10-5M、不大于约4×10-5M、不大于约3×10-5M、不大于约2×10-5M、不大于约1×10-5M、不大于约9×10-6M、不大于约8×10-6M、不大于约7×10-6M、不大于约6×10-6M、不大于约5×10-6M、不大于约4×10-6M、不大于约3×10-6M、不大于约2×10-6M、不大于约1×10-6M、不大于约9×10-7M、不大于约8×10-7M、不大于约7×10-7M、不大于约6×10-7M、不大于约5×10-7M、不大于约4×10-7M、不大于约3×10-7M、不大于约2×10-7M、不大于约1×10-7M、不大于约9×10-8M、不大于约8×10-8M、不大于约7×10-8M、不大于约6×10-8M、不大于约5×10-8M、不大于约4×10-8M、不大于约3×10-8M、不大于约2×10-8M、不大于约1×10-8M、不大于约9×10-9M、不大于约8×10-9M、不大于约7×10-9M、不大于约6×10-9M、不大于约5×10-9M、不大于约4×10-9M、不大于约3×10-9M、不大于约2×10-9M、不大于约1×10-9M、自约1×10-3M至约1×10-13M、1×10-4M至约1×10-13M、1×10-5M至约1×10-13M、自约1×10-6M至约1×10-13M、自约1×10-7M至约1×10- 13M、自约1×10-8M至约1×10-13M、自约1×10-9M至约1×10-13M、1×10-3M至约1×10-12M、1×10-4M至约1×10-12M、自约1×10-5M至约1×10-12M、自约1×10-6M至约1×10-12M、自约1×10-7M至约1×10-12M、自约1×10-8M至约1×10-12M、自约1×10-9M至约1×10-12M、1×10-3M至约1×10-11M、1×10-4M至约1×10-11M、自约1×10-5M至约1×10-11M、自约1×10-6M至约1×10-11M、自约1×10-7M至约1×10-11M、自约1×10-8M至约1×10-11M、自约1×10-9M至约1×10-11M、1×10- 3M至约1×10-10M、1×10-4M至约1×10-10M、自约1×10-5M至约1×10-10M、自约1×10-6M至约1×10-10M、自约1×10-7M至约1×10-10M、自约1×10-8M至约1×10-10M、或自约1×10-9M至约1×10-10M。
虽然一般来说，希望在纳摩尔范围的KD，在某些实施例中，低亲和性抗体可能较佳，例如为了标靶区室中之高度表达受体并避免非标靶之结合。另外，一些治疗应用可受益于具有较低结合亲和性的抗体以促进抗体再循环。
本揭露之抗体应维持对其天然对应物之抗原结合能力。在一实施例中，本揭露之抗体与Cys取代前之抗体相比展现基本上相同的亲和性。在另一实施例中，本揭露之抗体与Cys取代前之抗体相比展现减少的亲和性。在另一实施例中，本揭露之抗体与Cys取代前之抗体相比展现增加的亲和性。
在一实施例中，本揭露之抗体可能具有与Cys取代前之抗体的解离常数(KD)大约相等之KD。在一实施例中，本揭露之抗体对其同源抗原可能具有与Cys取代前之抗体的解离常数(KD)相比，高出约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约150倍、约200倍、约250倍、约300倍、约400倍、约500倍、约600倍、约700倍、约800倍、约900倍、或约1000倍的KD。
在又另一实施例中，本揭露之抗体对其同源抗原可能具有与Cys取代前之抗体的KD相比，较低约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约150倍、约200倍、约250倍、约300倍、约400倍、约500倍、约600倍、约700倍、约800倍、约900倍、或约1000倍的KD。
编码用于制备本发明之ADC之抗体重链与轻链的核酸可被克隆到载体中以供表达或增殖。编码该感兴趣之抗体的序列可被维持于宿主细胞中之载体，接着该宿主细胞可被扩增及冷冻以供将来使用。
表1提供用于工程化本发明之位点特异性ADC的人化HER2抗体的氨基酸(蛋白质)序列。所示之CDR系经卡巴编号定义。
表1中所示之抗体重链与轻链具有曲妥单抗重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。重链恒定区与轻链恒定区系衍生自曲妥单抗并含有一或多个修饰以于制备本发明之ADC时允许位点特异性缀合。
为允许位点特异性缀合而对抗体恒定区中之氨基酸序列进行之修饰系经画底线及粗体标记。对于衍生自曲妥单抗之抗体的命名法系T(代表trastuzumab)，然后接修饰氨基酸的位置，该位置前后分别为代表野生型残基的单字母氨基酸代码以及现在位于衍生抗体的该位置中之残基的单字母氨基酸代码。此命名法的两个例外是“κK183C”和“LCQ05”，前者表示在轻(κ)链上之位置183已从赖氨酸修饰为半胱氨酸，而后者表示含有谷氨酰胺之八个氨基酸标签已被连接至轻链恒定区之C端。
表1中所示之一个修饰不用于缀合。重链位置222(使用卡巴之EU指数)上的残基可经改变，以导致更均质的抗体与载荷物缀合物、抗体与载荷物之间更好的分子间交联、及/或显著减少链间交联。
表1：人源化HER2抗体的序列
ADC可利用针对任何抗原的抗体组份，使用位点特异性缀合，经由单独在位置290(根据卡巴之EU指数)上或与其它位置组合之工程化的半胱氨酸制造。
在一些实施例中，抗原结合结构域(即具有所有6个CDR的可变区，或与抗体可变区具有至少百分之90同一性的相等区)，由以下组成之群组：阿巴伏单抗(abagovomab)、阿巴西普(abatacept)阿昔单抗(abciximab)(c7E3Fab)、阿达木单抗(Adalimumab)阿德木单抗(adecatumumab)、阿来组单抗(alemtuzumab)(MabCampath或Campath-1H)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿非莫单抗(afelimomab)、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)、阿尼图莫单抗(anetumumab)、安庐金珠单抗(anrukizumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿利珠单抗(atlizumab)、阿托木单抗(atorolimumab)、巴品珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)贝利丹抗(belimumab)柏替木单抗(bertilimumab)、贝西索单抗(besilesomab)、βcept贝伐珠单抗(bevacizumab)比西单抗-溴烯比妥(biciromabbrallobarbital)、比佛珠单抗-美登素(bivatuzumab mertansine)、贝伦妥单抗-维多汀(brentuximab vedotin)卡那单抗(canakinumab)(ACZ885)、美坎珠单抗(cantuzumab mertansine)、卡罗单抗(capromab)卡妥索单抗(catumaxomab)(REMOV)、西利珠单抗(cedelizumab)赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)克立昔单抗(clenoliximab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达昔单抗(dacliximab)、达利珠单抗(daclizumab)(ZENAP地诺单抗(denosumab)(AMG 162)、地莫单抗(detumomab)、阿托度单抗(dorlimomab aritox)、多利昔单抗(dorlixizumab)、丹图木单抗(duntumumab)、杜利木单抗(durimulumab)、杜木路单抗(durmulumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依库珠单抗(eculizumab)埃巴单抗(edobacomab)、依决洛单抗(edrecolomab)(Mab17-1A、)、依法利珠单抗(efalizumab)依芬古单抗(efungumab)艾西莫单抗(elsilimomab)、培戈赖莫单抗(enlimomab pegol)、西艾匹莫单抗(epitumomabcituxetan)、依法利珠单抗(efalizumab)、依匹莫单抗(epitumomab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)埃达珠单抗(etaracizumab)(etaratuzumab、ABEGRINTM)、艾伟单抗(exbivirumab)、法索单抗(fanolesomab)法拉莫单抗(faralimomab)、非维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)加利昔单抗(galiximab)、罗氏单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(gavilimomab)(ABX-CBL(R))、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)戈利木单抗(golimumab)(CNTO 148)、鲁昔单抗(gomiliximab)、伊巴珠单抗(ibalizumab)(TNX-355)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)伊戈伏单抗(igovomab)、英西单抗(imciromab)、英利昔单抗(infliximab)(REMICAD)、伊诺莫单抗(inolimomab)、伊珠单抗奥加米星(inotuzumabozogamicin)、伊匹单抗(ipilimumab)(MDX-010)、伊妥木单抗(iratumumab)、凯利昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、来马索单抗(lemalesomab)、来布珠单抗(lebrilizumab)、乐德木单抗(lerdelimumab)、来沙木单抗(lexatumumab)(HGS-ETR2、ETR2-ST01)、来昔木单抗(lexitumumab)、利伟单抗(libivirumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗(mapatumumab)(HGS-ETR1、TRM-I)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥珠单抗(matuzumab)(EMD72000)、美泊利单抗(mepolizumab)美替木单抗(metelimumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫罗木单抗(morolimumab)、莫维珠单抗(motavizumab)(NUMAXTM)、莫罗单抗(muromonab)(OKT3)、他那可单抗(nacolomab tafenatox)、他那莫单抗(naptumomabestafenatox)、那他珠单抗(natalizumab)奈巴库单抗(nebacumab)、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)(THERACIM )、巯诺莫单抗(nofetumomab merpentan)奥克利丹抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗(odulimomab)、欧福杜单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)奥戈伏单抗(oregovomab)奥昔珠单抗(otelixizumab)、帕吉昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗(palivizumab)帕尼单抗(panitumumab)(ABX-EGF、)、帕考珠单抗(pascolizumab)、潘图莫单抗(pemtumomab)帕妥珠单抗(pertuzumab)(2C4、)、培克珠单抗(pexelizumab)、平妥单抗(pintumomab)、彭尼珠单抗(ponezumab)、普利昔单抗(priliximab)、普托木单抗(pritumumab)、来尼珠单抗(ranibizumab)拉巴库单抗(raxibacumab)、瑞加伟单抗(regavirumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利妥昔单抗(rituximab)罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、沙妥莫单抗(satumomab)、司伟单抗(sevirumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)(MEDI-507)、索土珠单抗(sontuzumab)、司他芦单抗(stamulumab)(Myo-029)、硫索单抗(sulesomab)他珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、帕他普莫单抗(taplitumomab paptox)、特非珠单抗(tefibazumab)阿替莫单抗(telimomab aritox)、替奈昔单抗(teneliximab)、替利珠单抗(teplizumab)、替西莫单抗(ticilimumab)、托珠单抗(tocilizumab)托利珠单抗(toralizumab)、妥司莫单抗(tositumomab)、曲妥单抗(trastuzumab)、曲美木单抗(tremelimumab)(CP-675,206)、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)、妥伟单抗(tuvirumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)、优特克单抗(ustekinumab)(CNTO1275)、伐利昔单抗(vapaliximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、维西珠单抗(visilizumab)伏洛昔单抗(volociximab)(M200)、伏妥莫单抗(votumumab)扎鲁木单抗(zalutumumab)、扎木单抗(zanolimumab)(HuMAX-CD4)、齐拉木单抗(ziralimumab)、或阿佐莫单抗(zolimomab aritox)。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含具有六个CDR之重链及轻链可变结构域，且/或与选自前述清单之抗体竞争结合。在一些实施例中，抗原结合结构域结合至与前述清单之抗体相同之表位。在一些实施例中，抗原结合结构域包含总共具有六个CDR之重链及轻链可变结构域，且结合至与前述清单之抗体相同之抗原。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含总共具有六个(6)CDR之重链及轻链可变结构域，且与选自由以下所组成之群组的抗原特异性结合：PDGFRα、PDGFRβ、PDGF、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGF、FGF2、HGF、KDR、FLT-1、FLK-1、Ang-2、Ang-1、PLGF、CEA、CXCL13、BAFF、IL-21、CCL21、TNF-α、CXCL12、SDF-I、bFGF、MAC-I、IL23p19、FPR、IGFBP4、CXCR3、TLR4、CXCR2、EphA2、EphA4、EphrinB2、EGFR(ErbBl)、HER2(ErbB2或pl85neu)、HER3(ErbB3)、HER4ErbB4或tyro2)、SCl、LRP5、LRP6、RAGE、s100A8、s100A9、Navl.7、GLPl、RSV、RSV F蛋白质、流感HA蛋白质、流感NA蛋白质、HMGBl、CD16、CD19、CD20、CD21、CD28、CD32、CD32b、CD64、CD79、CD22、ICAM-I、FGFRl、FGFR2、HDGF、EphB4、GITR、β-类淀粉蛋白、hMPV、PIV-I、PIV-2、OX40L、IGFBP3、cMet、PD-I、PLGF、Neprolysin、CTD、IL-18、IL-6、CXCL-13、IL-IRI、IL-15、IL-4R、IgE、PAI-I、NGF、EphA2、uPARt、DLL-4、αvβ5、αvβ6、α5β1、α3β1、干扰素受体I型及II型、CD19、ICOS、IL-17、因子II、Hsp90、IGF、IGF-I、IGF-II、CD19、GM-CSFR、PIV-3、CMV、IL-13、IL-9、及EBV。
在一些实施例中，抗原结合结构域与TNF超家族之成员(受体或配体)特异性结合。TNF超家族成员可选自包括但不限于下列之群组：肿瘤坏死因子-α(“TNF-α”)、肿瘤坏死因子-β(“TNF-β”)、淋巴毒素-α(“LT-α”)、CD30配体、CD27配体、CD40配体、4-1BB配体、Apo-1配体(也称为Fas配体或CD95配体)、Apo-2配体(也称为TRAIL)、Apo-3配体(也称为TWEAK)、骨保护因子(OPG)、APRIL、RANK配体(也称为TRANCE)、TALL-I(也称为BIyS、BAFF或THANK)、DR4、DR5(也称为Apo-2、TRAIL-R2、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2、或KILLER)、DR6、DcRl、DcR2、DcR3(也称为TR6或M68)、CARl、HVEM(也称为ATAR或TR2)、GITR、ZTNFR-5、NTR-I、TNFLl、CD30、LTBr、4-1BB受体和TR9。
在一些实施例中，抗原结合结构域能与选自包括但不限于下列之群组的一或多个目标结合：5T4、ABL、ABCB5、ABCFl、ACVRl、ACVRlB、ACVR2、ACVR2B、ACVRLl、AD0RA2A、聚集蛋白聚醣(Aggrecan)、AGR2、AICDA、AIFI、AIGl、AKAPl、AKAP2、AMH、AMHR2、血管生成素(ANG)、ANGPTl、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、膜联蛋白A2(Annexin A2)、ANPEP、APC、APOCl、AR、芳香酶、ATX、AXl、AZGPl(锌-a-糖蛋白)、B7.1、B7.2、B7-H1、BAD、BAFF、BAG1、BAIl、BCR、BCL2、BCL6、BDNF、BLNK、BLRl(MDR15)、BIyS、BMP1、BMP2、BMP3B(GDFlO)、BMP4、BMP6、BMP7、BMP8、BMP9、BMP11、BMP12、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BPAGl(网蛋白)、BRCAl、C19orflO(IL27w)、C3、C4A、C5、C5R1、CANTl、CASPl、CASP4、CAVl、CCBP2(D6/JAB61)、CCLl(1-309)、CCLI 1(嗜酸性球趋化因子(eotaxin))、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-Id)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MEP-2)、SLC、迁离蛋白(exodus)-2、CCL22(MDC/STC-I)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CCL3(MIP-Ia)、CCL4(MIP-Ib)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCNAl、CCNA2、CCNDl、CCNEl、CCNE2、CCRl(CKRl/HM145)、CCR2(mcp-IRB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TERl/CKR-Ll)、CCR9(GPR-9-6)、CCRLl(VSHKl)、CCRL2(L-CCR)、CD164、CD19、CDlC、CD20、CD200、CD-22、CD24、CD28、CD3、CD33、CD35、CD37、CD38、CD3E、CD3G,CD3Z、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45RB、CD46、CD52、CD69、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CD8、CD80、CD81、CD83、CD86、CD105、CD137、CDHl(E-钙黏素)、CDCP1CDH10、CDH12、CDH13、CDH18,CDH19、CDH20、CDH5、CDH7、CDH8、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、CDKNlA(p21Wapl/Cipl)、CDKNlB(p27Kipl)、CDKNlC、CDKN2A(pl6INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CERl、CHGA、CHGB、几丁酵素(Chitinase)、CHSTlO、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、CLDN3、CLDN7(紧密连接蛋白-7)、CLN3、CLU(簇蛋白(clusterin))、CMKLRl、CMKORl(RDCl)、CNRl、COLl8Al、COL1A1.COL4A3、COL6A1、CR2、Cripto、CRP、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA4、CTL8、CTNNBl(b-连环蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、CX3CL1(SCYDl)、CX3CR1(V28)、CXCLl(GROl)、CXCLlO(IP-IO)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDFl)、CXCL13、CXCL14,CXCL16、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR4、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYB5、CYCl、Cyr61、CYSLTRl、c-Met、DAB2IP、DES、DKFZp451J0118、DNCLl、DPP4、E2F1、ECGFl5EDGl、EFNAl、EFNA3、EFNB2、EGF、ELAC2、ENG、内皮糖蛋白、ENOl、EN02、EN03、EPHAl、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHAlO、EPHBl、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、EPHRIN-Al、EPHRIN-A2、EPHRIN-A3、EPHRIN-A4、EPHRIN-A5、EPHRIN-A6、EPHRIN-Bl、EPHRIN-B2、EPHRTN-B3、EPHB4,EPG、ERBB2(Her-2)、EREG、ERK8、雌激素受体、ESRl、ESR2、F3(TF)、FADD、法呢基转移酶、FasL、FASNf、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21(诸如mimAb1)、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF8、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FILl(EPSILON)、FBLl(ZETA)、FLJ12584、FLJ25530、FLRTl(纤网蛋白(fibronectin))、FLTl、FLT-3、FOS、FOSLl(FRA-I)、FY(DARC)、GABRP(GABAa)、GAGEBl、GAGECl、GALNAC4S-6ST、GATA3、GD2、GD3、GDF5、GDF8、GFIl、GGTl、GM-CSF、GNASl、GNRHl、GPR2(CCRlO)、GPR31、GPR44、GPR81(FKSG80)、GRCClO(ClO)、骨形态蛋白(gremlin)、GRP、GSN(胶溶素(Gelsolin))、GSTPl、HAVCR2、HDAC、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、刺猬(Hedgehog)、HGF、HIFlA、HIPl、组织胺和组织胺受体、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOXl、HSP90、HUMCYT2A、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNAl、IFNA2、IFNA4、IFNA5、EFNA6、BFNA7、IFNB1、IFNγ、IFNWl、IGBPl、IGF1、IGF1R、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、DL-I、ILlO、ILlORA、ILlORB、IL-1、ILlRl(CD121a)、ILlR2(CD121b)、IL-IRA、IL-2、IL2RA(CD25)、IL2RB(CD122)、IL2RG(CD132)、IL-4、IL-4R(CD123)、IL-5、IL5RA(CD125)、IL3RB(CD131)、IL-6、IL6RA(CD126)、IR6RB(CD130)、IL-7、IL7RA(CD127)、IL-8、CXCRl(IL8RA)、CXCR2(IL8RB/CD128)、IL-9、IL9R(CD129)、IL-10、IL10RA(CD210)、IL10RB(CDW210B)、IL-11、ILlIRA、IL-12、IL-12A、IL-12B、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-13、IL13RA1、IL13RA2、IL14、IL15、IL15RA、1L16、IL17、IL17A、IL17B、IL17C、IL17R、IL18、IL18BP、IL18R1、IL18RAP、IL19、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、DL1F9、IL1HYl、IL1R1、IL1R2、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RL1、IL1RL2、IL1RN、IL2、IL20、IL20RA、IL21R、IL22、IL22R、IL22RA2、IL23,DL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL30、IL3RA、IL4,IL4R、IL6ST(醣蛋白130)、ILK、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAKI、IRAK2、ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA6(α6整合素)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(β4整合素)、JAK1、JAK3、JTB、JUN、K6HF、KAIl、KDR、KIM-1、KITLG、KLF5(GC Box BP)、KLF6、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(头发特异性II型角蛋白)、LAMA5、LEP(瘦体素)、Lingo-p75、Lingo-Troy、LPS、LRP5、LRP6、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或Omgp、MAP2K7(c-Jun)、MCP-I、MDK、MIBl、中期因子蛋白(midkine)、MIF、MISRII、MJP-2、MK、MKI67(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金属硫蛋白-Ui)、mTOR、MTSSl、MUCl(黏蛋白)、MYC、MYD88、NCK2、神经蛋白聚醣(neurocan)、神经调节蛋白-1(neuregulin-1)、神经毡蛋白-1(neuropilin-1)、NFKBl、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-p75、NgR-Troy、NMEl(NM23A)、NOTCH、NOTCH1、N0X5、NPPB、NROBl、NR0B2、NRlDl、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRPl、NRP2、NT5E、NTN4、OCT-1、ODZ1、OPN1、OPN2、OPRDl、P2RX7、PAP、PARTl、PATE、PAWR、PCA3、PCDGF、PCNA、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAMl、peg-天冬酰胺酶、PF4(CXCL4)、神经丛蛋白B2(PLXNB2)、PGF、PGR、磷酸黏蛋白、PIAS2、PI3激酶、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG5PLXDCl、PKC、PKC-β、PPBP(CXCL7)、PPID、PRl、PRKCQ、PRKDl、PRL、PROC、PROK2、pro-NGF、鞘脂激活蛋白原、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、RAC2(P21Rac2)、RANK、RANK配体、RARB、RGSl、RGS13、RGS3、RNFI10(ZNF144)、Ron、R0B02、RXR、选滞蛋白(selectin)、S100A2、S100A8、S100A9、SCGB1D2(亲脂素B(lipophilin B))、SCGB2A1(乳腺球蛋白2(mammaglobin2))、SCGB2A2(乳腺球蛋白1(mammaglobin 1))、SCYEl(内皮单核细胞活化细胞因子)、SDF2、SERPENA1、SERPINA3、SERPINB5(乳腺丝胺酸蛋白酶抑制剂(maspin))、SERPINEl(PAI-I)、SERPINFl、SHIP-I、SHIP-2、SHBl、SHB2、SHBG、SfcAZ、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPPl、SPRRlB(Sprl)、ST6GAL1、STABl、STAT6、STEAP、STEAP2、SULF-1、Sulf-2、TB4R2、TBX21、TCPlO、TDGFl、TEK、TGFA、TGFB1、TGFBlIl、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBRl、TGFBR2、TGFBR3、THlL、THBSl(血小板反应蛋白-1)、THBS2/THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TIMP3、组织因子、TIKI2、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6JLR7、TLR8、TLR9、TM4SF1、TNF、TNF-a、TNFAIP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSFIlA、TNFRSFlA、TNFRSFlB、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSFlO(TRAIL)、TNFSFl 1(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B,TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF 18、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TOLLIP、Toll样受体、TLR2、TLR4、TLR9、T0P2A(拓朴异构酶Iia)、TP53、TPMl、TPM2、TRADD、TRAFl、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRKA、TREMl、TREM2、TRPC6、TROY、TSLP、TWEAK、酪氨酸酶、uPAR、VEGF、VEGFB、VEGFC、多功能蛋白聚糖(versican)、VHL C5、VLA-4、Wnt-1、XCLl(淋巴细胞趋化因子(lymphotactin))、XCL2(SCM-Ib)、XCRl(GPR5/CCXCRl)、YYl、和ZFPM2。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段与纤网蛋白(FN)之外结构域B(EDB)结合。FN-EDB系91个氨基酸的小型结构域，可经由替代剪接的机制插入纤网蛋白分子中。FN-EDB的氨基酸序列在人、马来侯、大鼠和小鼠之间是100％保守的。FN-EDB在胚胎发育过程中过度表达并且广泛表达在人类癌中，但几乎无法在正常成人组织(女性生殖组织除外)中检测出。
在某些实施例中，在本文中所述之抗体或其抗原结合片段包含以下重链CDR序列：(i)VH互补决定区1(CDR-H1)，其与SEQ ID NO:66或67享有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％之同一性；CDR-H2，其与SEQ ID NO:68或69享有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％之同一性；以及CDR-H3，其与SEQ IDNO:70享有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％之同一性；和/或(ii)以下轻链CDR序列：VL互补决定区1(CDR-L1)，其与SEQ ID NO:73享有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％之同一性；CDR-L2，其与SEQ ID NO:74享有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％之同一性；以及CDR-L3，其与SEQ ID NO:75享有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％之同一性。
在某些实施例中，在本文中所述之抗体或其抗原结合片段包含(i)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:65具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的氨基酸序列，及/或(ii)轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:72具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的氨基酸序列。这些VL和VH序列的任何组合也包含在本发明中。
在某些实施例中，本文中所述之抗体或其抗原结合片段包含Fc结构域。Fc结构域可衍生自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG、IgE、或IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)。
在某些实施例中，本文中所述之抗体或其抗原结合片段包含(i)重链，其包含与SEQ ID NO:71或77具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的氨基酸序列；及/或(ii)轻链，其包含与SEQ ID NO:76或78具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的氨基酸序列。这些重链和轻链序列的任何组合也包含在本发明中。
本发明亦提供与本文中所述之任一抗EDB抗体或其抗原结合片段(诸如表33中所列任一抗体或其抗原结合片段)竞争结合EDB的抗体或其抗原结合片段。
本发明提供编码本文中所述之经工程化的多肽的核酸。本发明亦提供编码包含本文中所述之经工程化的多肽的抗体的核酸。
本发明亦提供包含编码本文中所述之经工程化的多肽的核酸之宿主细胞。本发明亦提供包含编码包含本文中所述之经工程化的多肽的抗体的核酸之宿主细胞。
本发明提供编码此处揭示之任一种HER2抗体之抗体或彼之抗原结合片段的核酸，以及包含该核酸的宿主细胞。
本发明提供编码此处揭示之任一种抗EDB抗体之抗体或彼之抗原结合片段的核酸，以及包含该核酸的宿主细胞。
本发明提供制备本文中所述之经工程化的多肽，或包含该经工程化的多肽之抗体或其抗原结合部分的方法。该方法包含在表达该多肽、该抗体、或其抗原结合部分的适当条件下培养宿主细胞，以及分离该多肽、或该抗体或抗原结合片段。
B.药物
可用于制备本发明之位点特异性ADC的药物包括可用于治疗癌的任何治疗剂，其包括但不限于细胞毒性剂、细胞抑制剂、免疫调节剂和化学治疗剂。细胞毒性效应系指除尽、消除及/或杀死目标细胞(即肿瘤细胞)。细胞毒性剂系指对细胞具有细胞毒性效应之剂。细胞静止效应系指抑制细胞增生。细胞抑制剂系指对细胞具有细胞静止效应之剂，藉以抑制特定细胞亚群(即肿瘤细胞)之生长及/或扩张。免疫调节剂系指经由产生细胞因子及/或抗体及/或调节T细胞功能来刺激免疫反应，藉以直接抑制或减少细胞亚群的生长(即肿瘤细胞)或间接地通过允许另一剂更有疗效以抑制或减少细胞亚群的生长(即肿瘤细胞)之剂。化学治疗剂系指可用于治疗癌之化学化合物之剂。药物也可能为药物衍生物，其中药物已经被官能化以能够与本发明的抗体缀合。
在一些实施例中，药物系膜穿透性药物。在此类实施例中，载荷物可以诱发旁路效应，其中原本内化ADC之细胞周围的细胞被载荷物杀灭。这发生在当载荷物自抗体释放(即通过切割可切割之连接子)并穿过细胞膜时，通过扩散诱导杀灭周围的细胞。
根据经揭示的方法，药物系用于制备式Ab-(L-D)之抗体药物缀合物，其中(a)Ab系与特定目标结合之抗体；且(b)L-D系连接子-药物部分，其中L系连接子，且D系药物。
药物对抗体比(DAR)或药物装载指示每个抗体缀合的药物(D)分子的数目。本发明的抗体药物缀合物使用位点特异性缀合致使在ADC组合物中基本上为具有一个DAR的均质ADC族群。在一些实施例中，该DAR系1。在一些实施例中，该DAR系2。在其它实施例中，该DAR系3。在其它实施例中，该DAR系4。在其它实施例中，该DAR大于4。
使用常规缀合(而不是位点特异性缀合)导致不同ADC物种之异质族群，其各自具有不同的个别DAR。以这种方式制备的ADC组合物包括多个抗体，每个抗体缀合到特定数目的药物分子。因此，该组合物具有平均DAR。T-DM1使用常规缀合至赖氨酸残基上并且具有大约4的平均DAR，其分布宽广包括装载0、1、2、3、4、5、6、7、或8个药物分子的ADC(Kim et al.,2014,Bioconj Chem 25(7):1223-32)。
可以经由各种常规方法测定DAR，诸如UV光谱、质谱、ELISA检定、辐射测量法、疏水性交互作用层析法(HIC)、电泳和HPLC。
在一实施例中，本发明的ADC之药物组份系抗有丝分裂药物。在某些实施例中，抗有丝分裂药物可能是耳抑素(例如0101、8261、6121、8254、6780和0131；参见下表2)。在更具体的实施例中，耳抑素药物为2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(也称为0101)。
耳抑素于有丝分裂期间经由抑制微管蛋白聚合而抑制微管的形成，从而抑制细胞增生。PCT国际专利公开号WO 2013/072813(全文以引用方式并入本文中)揭示了可用于制造本发明之ADC的耳抑素并且提供生产这些耳抑素的方法。
表2:药物
在本发明的一些实施方式中，细胞毒性剂可使用脂质体或生物兼容性聚合物制造。此处所述之抗体可与生物兼容性聚合物缀合，以增加血清半衰期及生物活性及/或延长体内半衰期。生物兼容性聚合物之实例包括水溶性聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)或彼之衍生物及含有两性离子之生物兼容性聚合物(例如含有磷酰胆碱之聚合物)。
C.连接子
本发明之位点特异性ADC使用连接子将药物连接或缀合抗体来制备。连接子系可被用于连接药物及抗体以形成抗体药物缀合物(ADC)之双官能性化合物。该等缀合物允许选择性递送药物至肿瘤细胞。适当之连接子包括例如可切割及不可切割之连接子。可切割之连接子通常可在细胞内之条件下被切割。自抗体切割经缀合药物的主要机制包括于溶酶体的酸性pH下水解(腙、缩醛、和顺乌头酸样酰胺(cis-aconitate-like amides))、溶酶体酶的肽切割(组织蛋白酶和其它溶酶体酶)以及还原二硫化物。由于这些不同的切割机制，将药物连接至抗体的机制也有很大的不同，而且可以使用任何适当的连接子。
适当的可切割连接子包括但不限于可经由细胞内蛋白酶如溶酶体蛋白酶或胞内体蛋白酶切割的肽连接子，如vc和m(H20)c-vc(下表3)。在特定的实施例中，连接子系可切割的连接子，以使得该连接子一经切割后，载荷物可诱导旁路效应。旁路效应系当膜穿透性药物自抗体释放(即通过切割可切割之连接子)并穿过细胞膜时，通过扩散诱导杀灭原本内化ADC之细胞周围的细胞。
适当的不可切割连接子包括但不限于mc、MalPeg6、Mal-PEG2C2、Mal-PEG3C2和m(H20)c(下表3)。
其它适当之连接子包括可在特定pH或pH范围内被水解之连接子，诸如腙连接子。其它适当之可切割连接子包括二硫化物连接子。连接子可与抗体共价连接，该共价连接之程度使得抗体必须在细胞内被降解才能让药物被释放，例如mc连接子及类似物。
在本发明的特定实施方式中，本发明之位点特异性ADC中的连接子是可切割的，并且可为vc。
许多与抗体缀合的治疗剂在水中的溶解度很小(如果可溶的话)，而这可能限制药物在缀合物上的装载，因为缀合物会产生聚集。克服这点的一个方式系添加溶解(solublizing)基团至连接子。可以使用由PEG和二肽组成的连接子制造缀合物，包括连接至抗体之那些具有PEG二酸、硫羟酸、或顺丁烯二酰亚胺酸的连接子、二肽间隔子、以及键结至蒽环或双联霉素类似物之胺的酰胺键。另一实例是用含PEG的连接子制备缀合物，其以双硫键与细胞毒性剂连接并且以酰胺键与抗体连接。并入PEG基团的方式可能有利于克服聚集与药物装载的限制。
表3：连接子
连接子经由如表3所示之分子的左侧连接至单克隆抗体，而药物经由分子的右侧连接。
在某些实施例中，本发明的抗体系缀合硫醇反应剂，其中反应基团系例如顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物、或其它硫醇反应缀合配偶体(Haugland,2003,Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,Molecular Probes,Inc.；Brinkley,1992,Bioconjugate Chem.3:2；Garman,1997,Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach,Academic Press,London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2；Hermanson,G.in Bioconjugate Techniques(1996)AcademicPress,San Diego,pp.40-55,643-671)。
在某些实施例中，本发明提供式Ab-(L-D)之抗体药物缀合物，其中(a)Ab系与特定目标结合之抗体；且(b)L-D系连接子-药物部分，其中L系连接子，且D系药物。
在某些实施例中，Ab-(L-D)包含琥珀酰亚胺基团、顺丁烯二酰亚胺基团、水解的琥珀酰亚胺基团、或水解的顺丁烯二酰亚胺基团。
在某些实施例中，Ab-(L-D)包含顺丁烯二酰亚胺基团或水解的顺丁烯二酰亚胺基团。顺丁烯二酰亚胺诸如N-乙基顺丁烯二酰亚胺被视为对氢硫基有特异性，特别是在其它基团被质子化之低于7的pH值下。
在某些实施例中，Ab-(L-D)包含6-顺丁烯二酰亚胺基己酰基(MC)、顺丁烯二酰亚胺基丙酰基(MP)、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)、对氨酸苄氧羰基(PAB)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、或6-顺丁烯二酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨酸苄氧羰基(MC-vc-PAB)。
在某些实施例中，Ab-(L-D)包含式I之化合物：
或彼之医药上可接受之盐或溶剂合物，其中下列每次独立出现时，
W系
R1系氢或C1-C8烷基；
R2系氢或C1-C8烷基；
R3A及R3B系下列任一者：
(iii)R3A系氢或C1-C8烷基；
R3B系C1-C8烷基；
(iv)R3A及R3B一起系C2-C8亚烷基或C1-C8杂亚烷基；
R5系且
R6系氢或-C1-C8烷基。
在某些实施例中，Ab-(L-D)包含式IIa之化合物：
或彼之医药上可接受之盐或溶剂合物，其中下列每次独立出现时，
W系
R1系
Y系选自下列一或多个基团：-C2-C20亚烷基-、-C2-C20杂亚烷基-、-C3-C8碳环-、-亚芳基-、-C3-C8杂环-、-Cl-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-Cl-Cl0亚烷基-、-Cl-Cl0亚烷基-(C3-C8碳环)-、-(C3-C8碳环)-Cl-C10亚烷基-、-Cl-Cl0亚烷基-(C3-C8杂环)-或-(C3-C8杂环)-Cl-Cl0亚烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-10-、-(OCH2CH2)1-10-、-(OCH2CH2)1-10-C1-6烷基、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-、及-C(O)-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6烷基-；
Z系
G系卤素、-OH、-SH、或-S-C1-C6烷基；R2系氢或C1-C8烷基；
R3A及R3B系下列任一者：
(iii)R3A系氢或C1-C8烷基；
且R3B系C1-C8烷基；或
(iv)R3A及R3B一起系C2-C8亚烷基或C1-C8杂亚烷基；
R5系
或R6系氢或-C1-C8烷基；
R10系氢、-Cl-Cl0烷基、-C3-C8碳环基、-芳基、-Cl-C10杂烷基、-C3-C8杂环、-Cl-Cl0亚烷基-芳基、-亚芳基-Cl-Cl0烷基、-Cl-Cl0亚烷基-(C3-C8碳环)、-(C3-C8碳环)-Cl-Cl0烷基、-Cl-Cl0亚烷基-(C3-C8杂环)、或-(C3-C8杂环)-Cl-Cl0烷基，其中R10上的芳基包含经[R7]h可选地取代之芳基；
R7每次出现时系独立选自由F、Cl、I、Br、NO2、CN及CF3所组成之群组；且
h系1、2、3、4或5。
较佳地，Y系选自下列一或多个基团：
-C2-C20亚烷基-、-C2-C20杂亚烷基-、-C3-C8碳环-、-亚芳基-、-C3-C8杂环-、-Cl-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-Cl-Cl0亚烷基-、-Cl-Cl0亚烷基-(C3-C8碳环)-、-(C3-C8碳环)-Cl-C10亚烷基-、-Cl-Cl0亚烷基-(C3-C8杂环)-或-(C3-C8杂环)-Cl-Cl0亚烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-10-、-(OCH2CH2)1-10-、-(OCH2CH2)1-10-C1-6烷基、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、及-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-；
较佳地，Z系
在某些实施例中，Ab-(L-D)包含式IIb之化合物：
或彼之医药上可接受之盐或溶剂合物，其中下列每次独立出现时，
W系
R1系
Y系-C2-C20亚烷基-、-C2-C20杂亚烷基-、-C3-C8碳环-、-亚芳基-、-C3-C8杂环-、-Cl-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-Cl-Cl0亚烷基、-Cl-Cl0亚烷基-(C3-C8碳环)-、-(C3-C8碳环)-Cl-C10亚烷基-、-Cl-Cl0亚烷基-(C3-C8杂环)-、或-(C3-C8杂环)-Cl-Cl0亚烷基-；
Z系
或-NH-Ab；
Ab系抗体；
R2系氢或C1-C8烷基；
R3A及R3B系下列任一者：
(iii)R3A系氢或C1-C8烷基；
R3B系C1-C8烷基；
(iv)R3A及R3B一起系C2-C8亚烷基或C1-C8杂亚烷基；
R5系且
R6系氢或-C1-C8烷基。
较佳地，Z系
在某些实施例中，Ab-(L-D)包含
mcValCitPABC_MMAE(“vcMMAE”)：
在某些实施例中，Ab-(L-D)包含
mcValCitPABC_MMAD(“vcMMAD”)：
在某些实施例中，Ab-(L-D)包含
mcMMAD(“顺丁烯二酰亚胺-己酰基MMAD”)：
在某些实施例中，Ab-(L-D)包含
mcMMAF(“顺丁烯二酰亚胺-己酰基MMAF”)：
式I、IIa和IIb中使用的一般用语例如烷基、烯基、卤烷基、杂环基的定义，应根据该等用语的寻常和惯用含义来理解。特别是，这些用语在WO 2013/072813(全文以引用方式并入本文)中从第15页21行至第18页14行定义。
D.制备位点特异性ADC的方法
亦提供制备本发明之抗体药物缀合物的方法。例如，生产此处揭示之位点特异性ADC的方法可包括(a)将连接子与药物连接；(b)将连接子药物部分与抗体缀合；及(c)纯化抗体缀合物。
本发明之ADC使用位点特异性方法将抗体与载荷药物缀合。
在一个实施例中，位点特异性缀合经由经工程化至抗体恒定区中之一或多个半胱氨酸残基发生。制备用于经由半胱氨酸残基进行位点特异性缀合的抗体之方法，可如PCT公开号WO2013/093809(全文以引用方式并入本文)所述实施。以下一或多个位置可以改变成半胱氨酸，并因此用作缀合的位点：a)重链恒定区上之残基246、249、265、267、270、276、278、283、290、292、293、294、300、302、303、314、315、318、320、327、332、333、334、336、345、347、354、355、358、360、362、370、373、376、378、380、382、386、388、390、392、393、401、404、411、413、414、416、418、419、421、428、431、432、437、438、439、443、及444(依据重链的卡巴EU指数)，及/或b)轻链恒定区上之残基111、149、183、188、207、及210(依据轻链的卡巴编号)。
在某些实施例中，一或多个可改变为半胱氨酸之位置为：
a)重链恒定区上之290、334、392及/或443(依据重链的卡巴EU指数)，及/或b)轻链恒定区上之183(依据轻链的卡巴编号)。
在更多特定的实施例中，依据卡巴之EU指数，在重链恒定区上之位置290与在轻链恒定区上之位置183(依据卡巴编号)被改变为用于缀合的半胱氨酸。
在另一实施例中，位点特异性缀合经由一或多个已经工程化在抗体恒定区中的酰基供体谷氨酰胺残基发生。制备用于经由谷氨酰胺残基进行位点特异性缀合的抗体之方法，可如PCT公开号WO2012/059882(全文以引用方式并入本文)所述实施。可使用三种不同方式工程化抗体以表达用于位点特异性缀合之谷氨酰胺残基。
含有谷氨酰胺残基的短肽标签可经并入轻链及/或重链之数个不同位置(即N端、C端、内部)。在第一个实施例中，含有谷氨酰胺残基的短肽标签可经连接至重链及/或轻链的C端。一或多个下列含有谷氨酰胺之标签可经连接以作为用于药物缀合之酰基供体：GGLLQGPP(SEQ ID NO:45)、GGLLQGG(SEQ ID NO:46)、LLQGA(SEQ ID NO:47)、GGLLQGA(SEQID NO:48)、LLQ、LLQGPGK(SEQ ID NO:49)、LLQGPG(SEQ ID NO:50)、LLQGPA(SEQ ID NO:51)、LLQGP(SEQ ID NO:52)、LLQP(SEQ ID NO:53)、LLQPGK(SEQ ID NO:54)、LLQGAPGK(SEQID NO:55)、LLQGAPG(SEQ ID NO:56)、LLQGAP(SEQ ID NO:57)、LLQX1X2X3X4X5(其中X1系G或P，其中X2系A、G、P、或不存在，其中X3系A、G、K、P、或不存在，其中X4系G、K或不存在，且其中X5系K或不存在)(SEQ ID NO:58)、或LLQX1X2X3X4X5(其中X1系任何天然发生之氨基酸且其中X2、X3、X4、及X5系任何天然发生之氨基酸或不存在)(SEQ ID NO:59)。
在某些实施例中，GGLLQGPP(SEQ ID NO:60)可能连接到轻链的C端。
在某些实施例中，重链和/或轻链上的残基可能经由定点突变改变成谷氨酰胺残基。在某些实施例中，重链上位置297(使用卡巴之EU指数)的残基可能经改变成谷氨酰胺(Q)并且因此用作缀合的位点。
在某些实施例中，重链或轻链上的残基可能经改变导致该位置之去糖基化，使得一或多个内源性谷氨酰胺变成可接近/可反应而用于缀合。在某些实施例中，重链上位置297(使用卡巴之EU指数)的残基可能经改变成丙氨酸(A)。在这种情况下，在重链位置295上的谷氨酰胺(Q)便能够用于缀合。
形成缀合物的最佳反应条件可凭经验通过改变反应变量如温度、pH、连接子-载荷物部分输入、及添加物浓度来判定。缀合其它药物的适当条件可以由本领域技术人员于无需过度实验的情况下判定。经由工程化的半胱氨酸残基进行位点特异性缀合系于以下实例5A中例示。经由工程化的谷氨酰胺残基进行位点特异性缀合系于以下实例5B中例示。
为了进一步增加每个抗体药物缀合物的药物分子数目，可将药物与聚乙二醇(PEG)(包括直链或分支的聚乙二醇聚合物及单体)缀合。PEG单体具有式：-(CH2CH2O)-。药物和/或肽类似物可直接或间接(即经由适当的间隔子基团，如糖)与PEG结合。PEG-抗体药物组合物也可包括另外的亲脂性及/或亲水性部分，以促进药物稳定性及在体内递送至目标位点。制备含PEG组合物的代表性方法可见例如美国专利第6,461,603；6,309,633；及5,648,095号。
缀合后，可使用常规方法，将缀合物自未缀合的反应物及/或聚集形式的缀合物中分离与纯化出来。此可包括如粒径排阻层析法(SEC)、超过滤/渗滤法、离子交换层析法(IEC)、层析聚焦(CF)HPLC、FPLC、或Sephacryl S-200层析法之方法。分离程序也可经由疏水性交互作用层析法(HIC)完成。合适的HIC介质包括Phenyl Sepharose 6 Fast Flow层析介质、Butyl Sepharose 4 Fast Flow层析介质、Octyl Sepharose 4 Fast Flow层析介质、Toyopearl Ether-650M层析介质、Macro-Prep甲基HIC介质或Macro-Prep三级丁基HIC介质。
表4显示在实例部分中用于产生数据的HER2ADC。表4中显示的位点特异性HER2ADC(第1至17列)为本发明之位点特异性ADC的实例。
为了制备本发明之位点特异性ADC，此处揭示之任何抗体可经由此处揭示之任何连接子，使用位点特异性技术缀合此处揭示之任何药物。在某些实施例中，连接子系可切割的(例如vc)。在某些实施例中，药物系耳抑素(例如0101)。
本发明之多肽、抗体及ADC可经由在位置290(根据卡巴之EU指数编号)之工程化的半胱氨酸进行位点特异性缀合。IgG1抗体重链CH2结构域系显示于SEQ ID NO:61或SEQ IDNO:62(使用卡巴之EU指数编号之K290系以粗体和底线标记)。
(SEQ ID NO:61,CH2结构域)
(SEQ ID NO:62,CH2和CH3结构域)
工程化的半胱氨酸可单独存在位置290上，或与下列位置上之一或多个工程化的半胱氨酸残基组合：a)在重链恒定区上之残基246、249、265、267、270、276、278、283、292、293、294、300、302、303、314、315、318、320、327、332、333、334、336、345、347、354、355、358、360、362、370、373、376、378、380、382、386、388、390、392、393、401、404、411、413、414、416、418、419、421、428、431、432、437、438、439、443、和444(根据卡巴之EU指数编号)，及/或b)在轻链恒定区上之残基111、149、183、188、207、和210(根据卡巴编号)。
在某些实施例中，本发明之多肽、抗体及ADC可进一步包含抗体κ轻链恒定区，其包含(i)在根据卡巴编号的位置183上之工程化的半胱氨酸残基；或(ii)当该恒定结构域与SEQ ID NO:63比对时，在对应SEQ ID NO:63之残基76的位置上之工程化的半胱氨酸残基。此工程化的半胱氨酸也称为“K183C”(使用卡巴编号)，并在下面以粗体及底线显示。本发明之肽、抗体和ADC可包含λ轻链恒定区，其在对应人κ轻链恒定区之氨基酸残基183的氨基酸位置上包含经工程化的半胱氨酸残基，称为如下显示之“K183C”残基。
(SEQ ID NO:63,Cκ恒定结构域)
在另一实施方式中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含(a)本文所揭示之多肽及(b)抗体κ轻链恒定区，其包含(i)在根据卡巴编号的111、149、188、207、210或其任何组合(较佳为111或210)的位置上之工程化的半胱氨酸残基；或(ii)当该恒定结构域与SEQID NO:63比对时，在对应SEQ ID NO:63之残基4、42、81、100、103或其任何组合(较佳为残基4或103)的位置上之工程化的半胱氨酸残基。
在另一实施方式中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含(a)本文所揭示之多肽及(b)抗体λ轻链恒定区，其包含(i)在根据卡巴编号的110、111、125、149、155、158、161、185、188、189、191、197、205、206、207、208、210或其任何组合(较佳为110、111、125、149、或155)的位置上之工程化的半胱氨酸残基；或(ii)当该恒定结构域与SEQ ID NO:64比对时，在对应SEQ ID NO:64之残基4、5、19、43、49、52、55、78、81、82、84、90、96、97、98、99、101或其任何组合(较佳为残基4、5、19、43、或49)的位置上之工程化的半胱氨酸残基。
(SEQ ID NO:64,Cλ恒定结构域)
表4：HER2 ADC(1C＝可切割；N＝不可切割)
2.调制剂与用途
在本文中所述之多肽、抗体、和ADC可调制成药品调制剂。该药品调制剂可进一步包含医药上可接受的载体、赋型剂或稳定剂。另外，组合物可包括超过一种此处揭示之ADC。
本发明所使用之组合物可另包括医药上可接受之载剂、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science and practice of Pharmacy 21st Ed.,2005,LippincottWilliams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)以呈冷冻干燥调制剂或水溶液之形式。可接受之载剂、赋形剂或稳定剂在所采用之剂量及浓度下对接受者不具毒性，且可能包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸及甲硫氨酸；保存剂(诸如十八基二甲基苄基氯化铵、六甲氯胺、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、酚醇、丁醇、苄醇、烷基对羟苯甲酸酯类诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单醣、双醣及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成反离子诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；及/或非离子性界面活性剂诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。如本文中所使用之“医药上可接受之盐”系指分子或巨分子之医药上可接受之有机或无机盐。医药上可接受之赋形剂另于此处说明。
本发明之一或多种ADC之各种调制剂可被用于施用，包括但不限于包含一或多种医药上可接受之赋形剂的调制剂。医药上可接受之赋形剂系为该领域所知，且系有助于施用药理有效物质之相对惰性物质。举例来说，赋形剂可提供外形或稠度，或作为稀释剂。适当之赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于改变渗透性之盐类、包封剂、缓冲剂及皮肤穿透增进剂。用于非经肠及经肠药物递送之赋形剂以及调制剂系阐述于Remington,The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.,Mack Publishing,2000。
在本发明之一些实施方式中，该等剂系经调制为供注射施用(例如腹膜内、静脉、皮下、肌肉内等)。因此，这些剂可与医药上可接受之媒剂诸如盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液及类似物组合。特定给药方案(即剂量、时间及重复性)将依特定个体及该个体之医学病史而定。
本发明之ADC治疗调制剂系经由混合具所欲纯度的ADC与可选地医药上可接受的载剂、赋型剂或稳定剂(Remington,The Science and Practice of Pharmacy 21stEd.Mack Publishing,2005)，制备成供储存之冷冻干燥调制剂或水溶液之形式。可接受之载剂、赋形剂或稳定剂在所采用之剂量及浓度下对接受者不具毒性，可能包括例如缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；盐诸如氯化钠；抗氧化剂包括抗坏血酸及甲硫氨酸；保存剂(诸如十八基二甲基苄基氯化铵、六甲氯胺、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、酚醇、丁醇、苄醇、烷基对羟苯甲酸酯类诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单醣、双醣及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成反离子诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白质络合物)；及/或非离子性界面活性剂诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
含有本发明之ADC的脂质体可经由该领域已知之方法制备，诸如Eppstein,etal.,1985,PNAS82:3688-92；Hwang,et al.,1908,PNAS 77:4030-4；和美国专利第4,485,045号和第4,544,545号所述。循环时间延长之脂质体系揭露于美国专利第5,013,556号。特别有用之脂质体可利用逆相蒸发方法以包括磷脂酰胆碱、胆固醇及PEG-衍生性磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)之脂质组合物制备。脂质体被挤压通过定义孔径大小之滤网以产生具有所欲直径之脂质体。
活性成分亦可被包封于通过例如凝聚技术或通过界面聚合化所制备之微胶囊中，例如分别于羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中、于胶体药物递送系统中(例如脂质体、白蛋白微球、微乳化液、纳米微粒及纳米微囊)或于巨乳化液中。该等技术系揭示于Remington,The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,MackPublishing,2005。
持续释放性制品可被制备。持续释放制剂之适当实例包括含有抗体之固相疏水性聚合物之半透性基质，该基质系呈形状对象之形式(例如膜或微胶囊)。持续释放基质之实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸及7乙基-L-谷氨酸盐之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolide acetate)所组成之注射型微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯及聚-D-(-)-3-羟丁酸。
欲用于体内施用之调制剂必须为无菌。此可轻易地通过例如无菌过滤膜之过滤达成。治疗性ADC组合物通常被置放于具有无菌接口之容器中，例如具有可被皮下注射针穿刺之塞子的静脉溶液袋或小瓶。
适当之表面活性剂包括特别是非离子性剂，诸如聚氧乙烯去水山梨醇(例如TWEENTM 20、40、60、80或85)及其它去水山梨醇(例如SpanTM20、40、60、80或85)。具有表面活性剂之组合物将方便地包括0.05至5％之间、且可在0.1至2.5％之间的表面活性剂。将了解若需要的话其它成分可被添加，例如甘露醇或其它医药上可接受之媒剂。
适当之乳液可利用自商业途径获得之脂质乳液制备，如INTRALIPIDTM、LIPOSYNTM、INFONUTROLTM、LIPOFUNDINTM和LIPIPHYSANTM。活性成分可被溶解于预先混合之乳液组合物中，或者可被溶解于油中(例如大豆油、红花籽油、棉花籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)再与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合以形成乳液。将了解的是可添加其它成分例如甘油或葡萄糖以调整乳液之张力。适当之乳液通常将含有最高20％例如介于5至20％之油。脂质乳液可包括0.1至1.0μm之间，特别是0.1至0.5μm之间的脂质微滴，并且具有5.5至8.0范围内之pH。乳液组合物可为该些通过混合本发明之ADC与INTRALIPIDTM或彼之成份(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所制备者。
本发明亦提供用于本方法之试剂盒。本发明之试剂盒包括一或多个包括本发明之一或多个ADC之容器及根据此处所述之本发明之任何方法之使用说明。通常，这些说明包括施用ADC以供治疗性治疗之描述。
有关使用本发明之ADC之说明通常包括该意图治疗之剂量、投药计划及施用途径之信息。该等容器可为单位剂量、大量包装(例如多剂量包装)或次单位剂量。本发明之试剂盒所提供之说明通常为在标签或包装插页上之书面说明(例如包含在试剂盒中之纸张)，但机器读取之说明(例如磁性或光学储存磁盘上携有之说明)亦可被接受。
本发明之试剂盒系经适当包装。适当包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐、可弯折之包装(例如密封之美拉(Mylar)或塑料袋)、及类似物。亦考虑的是与特殊装置组合使用之包装，诸如输注装置诸如小型泵。试剂盒可能具有无菌接口(例如该容器可能为具有可被皮下注射针穿刺之塞子的静注溶液袋或小瓶)。该容器也可能具有无菌接口(例如该容器可能为具有可被皮下注射针穿刺之塞子的静注溶液袋或小瓶)。该组合物中之至少一种活性剂系本发明之ADC。该容器可能另包括第二医药活性剂。
试剂盒可能可选地提供额外成份诸如缓冲剂及解说信息。通常，试剂盒包括容器及在容器上或与容器相关之标签或包装插页。
本发明之ADC可用于治疗性、诊断性、或非治疗性目的。例如，抗体或其抗原结合片段可以当做亲和性纯化剂(例如用于体外纯化)、当做诊断剂(例如用于检测关注抗原在特定细胞、组织、或血清中的表达)使用。
对于治疗性应用，本发明之ADC可经由常规的技术施用至哺乳类动物(特别是人)，诸如静脉内(作为推注或经由连续输注一段时间)、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入。抗体或抗原结合片段也适当地经由肿瘤内、肿瘤周围、病灶内、或病灶周围之途径施用。本发明之ADC可以用于预防性治疗或治疗性治疗。
3.定义
除非本文另外加以定义，关于本发明所使用之科学性及技术性用语应具有本领域技术人员所通常了解之意义。另外，除非内文另外要求，单数用语应包括复数意义且复数用语应包括单数意义。一般来说，与此处所描述之细胞培养、组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因学以及蛋白质及核酸化学和杂交有关所使用之命名法及技术系该领域所广为周知且经常使用者。
用语“L-D”是指由药物(D)与连接子(L)连接所导致之连接子-药物部分。用语“药物(D)”是指可用于治疗疾病的任何治疗剂。药物具有生物或可检测的活性，例如细胞毒剂、化学治疗剂、细胞抑制剂、或免疫调节剂。在癌症治疗的背景下，治疗剂对肿瘤具有细胞毒性效应，包括除尽、消除及/或杀灭肿瘤细胞。用语药物、载荷物及载荷药物可互相交换使用。在某些实施例中，治疗剂对肿瘤具有细胞毒性效应，包括除尽、消除及/或杀灭肿瘤细胞。在某些实施例中，药物系抗有丝分裂剂。在某些实施例中，药物系耳抑素。在某些实施例中，药物系2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(也称为0101)。在某些实施例中，药物较佳地具有膜穿透性。
用语“连接子(L)”描述抗体与载荷药物间之直接或间接键结。将连接子连接至抗体可利用多种方式达成，诸如经由表面赖氨酸、还原偶合至经氧化之碳水化合物、通过还原链间双硫键释放半胱氨酸残基、工程化于特定位点之反应性半胱氨酸残基、及于转谷氨酰胺酶及胺存在下通过多肽工程化而成为反应性之含有酰基供体谷氨酰胺之标签或内源性谷氨酰胺。本发明使用之位点特异性方法连接抗体与载荷药物。在一个实施例中，缀合经由经工程化至抗体恒定区中之半胱氨酸残基发生。在另一实施例中，缀合经由已经a)经由肽标签添加至抗体恒定区、b)经工程化至抗体恒定区中、或c)通过工程化周围残基而变成可接近/可反应之酰基供体谷氨酰胺残基发生。连接子可为可切割(即在细胞内之条件下易受切割)或不可切割的。在一些实施实施方式中，连接子系可切割连接子。
抗体之“抗原结合片段”是指维持对抗原之特异性结合能力的全长抗体之片段(较佳具有实质上相同的结合亲和性)。抗原结合片段之实例包括：Fab片段；F(ab')2片段；Fd片段；Fv片段；dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546)；分离之互补决定区(CDR)；经双硫键连接之Fv(dsFv)；抗遗传型(抗Id)抗体；细胞内抗体；单链Fv(scFv，见例如Bird et al.Science 242:423-426(1988)及Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988))；及双价抗体(见例如Holliger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Poljak et al.,1994,Structure 2:1121-1123)。本发明之抗原结合片段包含本文所述之工程化的抗体恒定结构域，但不需要包含天然抗体之全长Fc区。例如，本发明之抗原结合片段可为“微抗体(minibody)”(VL-VH-CH3或(scFv-CH3)2；参见Hu etal.,Cancer Res.1996；56(13):3055-61,及Olafsen et al.,Protein Eng Des Sel.2004；17(4):315-23)。
抗体可变结构域中的残基是根据卡巴来编号，卡巴系用于汇总抗体之重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。见Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))。使此编号系统，实际的线性氨基酸序列可含有对应于缩短或插入可变结构域之FR或CDR的较少或额外氨基酸。例如，重链可变结构域可在H2之残基52之后包括单一氨基酸插入(根据卡巴的残基52a)以及在重链FR残基82之后包括插入残基(例如根据卡巴的残基82a、82b、和82c)。经由抗体序列与“标准”卡巴编号序列同源区之比对可判定给定抗体的残基之卡巴编号。各种用于分配卡巴编号的算法可供使用。除非另外说明，在本文中使用Abysis(www.abysis.org)于2012年所发布实施的算法分配卡巴编号至可变区。
除非另外说明，抗体之IgG重链恒定结构域中的氨基酸残基系根据Edelman etal.,1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1):78-85中之EU指数来编号，如Kabat et al.,1991中所述，在本文中称为“卡巴之EU指数”。通常，Fc结构域包含人IgG1恒定结构域中之从约氨基酸残基236至约447。C编号之间的对应关系可在例如IGMT数据库中找到。轻链恒定结构域的氨基酸残基系根据Kabat et al.,1991编号。抗体恒定结构域氨基酸残基的编号也显示在国际专利公开号WO 2013/093809中。
在IgG重链恒定结构域中，卡巴之EU指数的使用之唯一例外是实例中所述的残基A114。A114系指卡巴编号，而对应的EU指数编号为118。这是因为在最初发表此位点之位点特异性缀合使用卡巴编号，并称此位点为A114C，并且自当时起已在本领域中广泛使用为“114”位点。见Junutula et al.,Nature Biotechnology 26,925-932(2008)。为了与本领域此位点的常见用法一致，故在实例中使用“A114”、“A114C”、“C114”或“114C”。
除非另外说明，抗体之轻链恒定结构域的氨基酸残基系根据Kabat et al.,1991编号。
当经由比对查询氨基酸序列与参考序列而残基的位置与指定位置匹配时，查询序列的氨基酸残基“对应于”参考序列的指定位置(例如，SEQ ID NO:61或62的位置60，或SEQID No:63的位置76)。这种比对可经由手工比对或使用广为周知的序列比对程序如ClustalW2或“BLAST 2 Sequences”，以预设参数进行。
“Fc融合”蛋白系其中一或多个多肽可操作地连接到Fc多肽之蛋白质。Fc融合将免疫球蛋白之Fc区与融合配偶体结合起来。
本文中所使用的用语“约”是指数值的+/-10％。
本文中所使用的用语“经工程化”(如工程化的半胱氨酸)与“经取代”(如经取代之半胱氨酸)可互换使用，并且系指将氨基酸突变成半胱氨酸，以产生用于将另一部分与多肽或抗体连接的缀合位点。
生物保藏
本发明之代表性材料系于2015年11月17日保藏于美国菌种保存中心(10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209,USA)。载体T(K290C)-HC具有ATCC编号PTA-122672，其包含编码SEQ ID NO:18之重链序列的DNA插入物；且载体T(κK183C)-LC具有ATCC编号PTA-122673，其包含编码SEQ ID NO:42之轻链序列的DNA插入物。该等保藏系根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约之规定进行。此确保自保藏日开始30年内维持存活的保藏物培养物。保藏物将依照布达佩斯条约之规定由ATCC提供，且将受限于辉瑞(Pfizer,Inc.)与ATCC之合约，该合约确保当颁发相关美国专利或公开任何美国或外国专利申请案时(以先到者为主)，该保藏物之培养子代可永久且不受限制地供公众使用，且确保由美国专利商标局局长依据35U.S.C.122及该局长所依据之法则(包括37C.F.R.1.14，特别参照886OG 638)判定有权获得该子代者之可得性。
本申请案之受让人同意，若该保藏中之材料的培养物在适当条件培养下死亡或遗失或毁损，一经通知应立即以另一相同材料取代该材料。不得将该保藏材料之可得性视为可藉以实施本发明而侵犯由任何政府主管机关依据该国专利法所授予之权利之许可。
实例
本发明进一步详细描述于下列实验实例。这些实例仅提供作为说明之目的，除非另外说明，否则并无限制之意图。因此，本发明不应被视为受到下列实例之限制，反而应视为包含任何及所有因此处所提供之教示而变得明显之变异。
实例1：制备用于缀合之曲妥单抗(trastuzumab)衍生抗体
A.经由半胱氨酸缀合
制备用于经由半胱氨酸残基进行位点特异性缀合的曲妥单抗衍生物之方法，大致系如PCT公开案WO2013/093809(其系以其整体纳入此处)所述实施。在轻链(使用卡巴编号方案之183)或重链(使用卡巴之EU指数之290、334、392及/或443)上的一或多个残基系通过位点定点突变形成，改变成半胱氨酸(C)残基。
B.经由转谷氨酰胺酶缀合
制备用于经由谷氨酰胺残基进行位点特异性缀合的曲妥单抗衍生物之方法，大致系如PCT公开案WO2012/059882(其系以其整体纳入此处)所述实施。曲妥单抗系经工程化以表达以三种不同方法用于缀合之谷氨酰胺残基。
在第一种方法中，含有谷氨酰胺残基之8个氨基酸残基标签(LCQ05)系连接至轻链之C端。
在第二种方法中，在重链上的残基(使用卡巴之EU指数之位置297)系通过位点定点突变形成，从天冬酰胺(N)改变成谷氨酰胺(Q)残基。
在第三种方法中，在重链上的残基(使用卡巴之EU指数之位置297)系从天冬酰胺(N)改变成丙氨酸(A)。此导致在位置297之无糖基化及在位置295之可接近/反应性内源性谷氨酰胺。
此外，一些曲妥单抗衍生物具有非用于缀合之改变。在重链上之位置222的残基(使用卡巴之EU指数之位置297)系从赖氨酸(K)改变成精氨酸(R)残基。发现K222R取代导致更同质之抗体与载荷物(payload)缀合体、抗体与载荷物之间更佳之分子间交联，及/或显著减少与抗体轻链C端上之谷氨酰胺标签的链间交联。
实例2：生产表达曲妥单抗衍生抗体之稳定转染细胞
为了决定该工程化的单一及双半胱氨酸曲妥单抗衍生抗体变异体可于细胞中稳定表达及大规模生产，CHO细胞系经编码九种曲妥单抗衍生抗体变异体(T(KK183C)、T(K290C)、T(K334C)、T(K392C)、T(KK183C+K290C)、T(KK183C+K392C)、T(K290C+K334C)、T(K334C+K392C)及T(K290C+K392C))之DNA转染，且使用该领域广为周知之标准程序分离稳定高生产池(pool)。为了生产用于缀合试验之T(KK183C+K334C)，使用标准方法，将HEK-293细胞(ATCC保藏编号CRL-1573)以编码此经双半胱氨酸工程化之抗体变异体的重链及轻链DNA进行瞬时共转染。使用二管柱方法(即蛋白质A亲和性捕捉，然后TMAE管柱)或三管柱方法(即蛋白质A亲和性捕捉，然后TMAE管柱及接着CHA-TI管柱)，自该浓缩CHO池起始材料分离这些曲妥单抗变异体。使用这些纯化方法，所有工程化的半胱氨酸曲妥单抗衍生抗体变异体制剂含有如分析性粒径排阻层析所测得之>97％关注峰(POI)(表5)。这些表5所示之结果证明，所有十种曲妥单抗衍生半胱氨酸变异体在自蛋白质A树脂溶析后检测到可接受水平之高分子量(HMW)聚集物种，且此非所欲之HMW物种可利用粒径排阻层析移除。此外，该数据证明人IgG1恒定区中之蛋白质A结合位点，并未受到该等工程化的半胱氨酸残基的存在而改变。
表5:曲妥单抗衍生的半胱氨酸抗体变体的制备
ND＝未测定
实例3：曲妥单抗衍生抗体之完整性
工程化的半胱氨酸及转谷氨酰胺酶变异体之分子评估系经实施，以评估相对于曲妥单抗野生型抗体之重要生物物理性质，以确保该等变异体可适用于标准抗体制造平台方法。
为了测定经由稳定CHO表达所生产工程化的半胱氨酸抗体变异体之纯化制剂的完整性，使用非还原性毛细管胶体电泳计算尖峰之纯度百分比(Caliper LabChip GXII:Perkin Elmer Waltham,MA)。结果显示该工程化的半胱氨酸抗体变异体T(KK183C+K290C)及T(K290C+KS334C)含有低水平之类似曲妥单抗野生型抗体的片段及高分子质量物种(HMMS)。相对地，T(K334C+K392C)相对于其它经评估之双工程化半胱氨酸变异体，含有高水平之断裂抗体尖峰(表6)。这些结果提示，工程化的半胱氨酸的特定组合可影响意图用于位点特异性缀合之抗体的完整性。
表6:从非还原的电泳图计算的峰的纯度百分数
抗体 主峰(％) 片段(％) HMMS(％)
曲妥单抗WT 95 5 0
T(<sub>K</sub>K183C+K290C) 95.78 4.18 0.04
T(K290C+K334C) 94.6 5.2 0.2
T(K334C+K392C) 80.7 19.3 0
实例4：载荷药物化合物的制备
耳抑素药物化合物0101、0131、8261、6121、8254及6780系根据PCT公开案WO2013/072813(其系以其整体纳入此处)所述之方法制造。在公开申请案中，耳抑素化合物系以表7所示之编号系统表示。
表7
耳抑素药物化合物 指定在WO2013/072813
0101 #54
0131 #118
8261 #69
6121 #117
8254 #70
6780 #112
根据PCT公开案WO2013/072813，药物化合物0101系根据下列程序制造。
步骤1.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#53)。根据一般程序D，自#32(2.05g,2.83mmol,1eq.)于二氯甲烷(20mL,0.1M)及N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中、胺#19(2.5g,3.4mmol,1.2eq.)、HATU(1.29g,3.38mmol,1.2eq.)及三乙胺(1.57mL,11.3mmol,4eq.)合成粗制所欲材料，该粗制所欲材料通过硅胶层析纯化(梯度：0％至55％丙酮于庚烷中)，生产呈固体之#53(2.42g,74％)。LC-MS:m/z 965.7[M+H+],987.6[M+Na+],滞留时间＝1.04分钟；HPLC(规程A):m/z 965.4[M+H+],滞留时间＝11.344分钟(纯度&gt;97％)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)假设为旋转异构体之混合物的特征信号：δ7.86-7.91(m,2H),[7.77(d,J＝3.3Hz)及7.79(d,J＝3.2Hz),总1H],7.67-7.74(m,2H),[7.63(d,J＝3.2Hz)及7.65(d,J＝3.2Hz),总1H],7.38-7.44(m,2H),7.30-7.36(m,2H),7.11-7.30(m,5H),[5.39(ddd,J＝11.4,8.4,4.1Hz)及5.52(ddd,J＝11.7,8.8,4.2Hz),总1H],[4.49(dd,J＝8.6,7.6Hz)及4.59(dd,J＝8.6,6.8Hz),总1H],3.13,3.17,3.18及3.24(4s,总6H),2.90及3.00(2br s,总3H),1.31及1.36(2br s,总6H),[1.05(d,J＝6.7Hz)及1.09(d,J＝6.7Hz),总3H]。
步骤2.合成2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺(#54或0101)。根据一般程序A，自#53(701mg,0.726mmol)于二氯甲烷中(10mL,0.07M)合成粗制所欲材料，该粗制所欲材料通过硅胶层析纯化(梯度：0％至10％甲醇于二氯甲烷中)。残余物系经二乙基醚及庚烷稀释，并于真空中浓缩以得到呈白色固体之#54(或0101)(406mg,75％)。LC-MS:m/z743.6[M+H+],滞留时间＝0.70分钟；HPLC(规程A):m/z743.4[M+H+],滞留时间＝6.903分钟(纯度&gt;97％)；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)假设为旋转异构体之混合物的特征信号：δ[8.64(br d,J＝8.5Hz)及8.86(br d,J＝8.7Hz),总1H],[8.04(br d,J＝9.3Hz)及8.08(br d,J＝9.3Hz),总1H],[7.77(d,J＝3.3Hz)及7.80(d,J＝3.2Hz),总1H],[7.63(d,J＝3.3Hz)及7.66(d,J＝3.2Hz),总1H],7.13-7.31(m,5H),[5.39(ddd,J＝11,8.5,4Hz)及5.53(ddd,J＝12,9,4Hz),总1H],[4.49(dd,J＝9,8Hz)及4.60(dd,J＝9,7Hz),总1H],3.16,3.20,3.21及3.25(4s,总6H),2.93及3.02(2br s,总3H),1.21(s,3H),1.13及1.13(2s,总3H),[1.05(d,J＝6.7Hz)及1.10(d,J＝6.7Hz),总3H],0.73-0.80(m,3H)。
药物化合物MMAD、MMAE及MMAF系根据PCT公开案WO 2013/072813所揭示之方法在实验室内部制造。
药物化合物DM1系经由美国专利第5,208,020号概述之程序自购买之美坦素醇(maytansinol)在实验室内部制造。
实例5：曲妥单抗衍生抗体之生物缀合
本发明之曲妥单抗衍生抗体系经由连接子缀合载荷物以制备ADC。所使用之缀合方法系位点特异性(即经由特定半胱氨酸残基或特定谷氨酰胺残基)或常规缀合。
A.半胱氨酸位点特异性
表8之ADC系经由下述之半胱氨酸位点特异性方法缀合。
表8
将500mM三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)溶液(50至100摩尔当量)加至抗体(5mg)，使得最终抗体浓度系5至15mg/mL于含有20mM EDTA之PBS中。让反应在37℃持续进行2.5小时后，使用凝胶过滤管柱(PD-10除盐管柱，GE Healthcare)将抗体缓冲交换至含有5mM EDTA之PBS中。将所得之在含有5mM EDTA之PBS中之抗体(5至10mg/mL)以新鲜制备之50mM DHA溶液于1:1PBS/EtOH中处理(最终DHA浓度＝1mM至4mM)，且允许在4℃下静置整夜。
抗体/DHA混合物系经缓冲交换至含有5mM EDTA之PBS中(该平衡缓冲液之pH系使用磷酸调整至～7.0)，且使用50KDa MW临界旋转浓缩装置浓缩。将所得之在含有5mM EDTA之PBS中之抗体(抗体浓度约5至10mg/ml)以5至7摩尔当量之在DMA中之10mM顺丁烯二酰亚胺载荷物处理。在静置1.5至2.5小时后，将材料进行缓冲交换(PD-10)。实施SEC纯化(若需要)以去除任何聚集材料及残留之游离载荷物。
B.转谷氨酰胺酶位点特异性
表9之ADC系经由下述之转谷氨酰胺酶位点特异性方法缀合。
表9
在转酰胺反应中，抗体上之谷氨酰胺系作为酰基供体，且含胺化合物系作为酰基受体(胺供体)。将浓度33μM之经纯化之HER2抗体与10至25M过量之酰基受体(范围介于33至83.3μM之AcLysvc-0101)在2％(w/v)茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)转谷氨酰胺酶(ACTIVATM,Ajinomoto,Japan)存在下，培养于150mM氯化钠及Tris HCl缓冲液pH范围7.5至8中，且除非说明否则含有0.31mM之还原谷胱甘肽。反应条件系根据个别酰基供体调整，其中T(LCQ05+K222R)于pH 8.0下使用10M过量之酰基供体且不含还原谷胱甘肽，T(N297Q+K222R)及T(N297Q)在pH 7.5下使用20M过量之酰基供体，且T(N297A+K222R+LCQ05)在pH 7.5下使用25M过量之酰基供体。在37℃下培养16至20小时后，抗体系利用所属技术领域中具有通常知识者已知之标准层析方法，诸如GE Healthcare之商用亲和性层析及疏水性交互作用层析，于MabSelect树脂或丁基琼脂糖高性能(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上纯化。
C.常规缀合
表10及11之ADC系经由下述之常规缀合方法缀合。
表10
表11
抗体系经透析至达尔柏克(Dulbecco)氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Lonza)。该透析抗体系以pH 7之含有5mM 2,2',2",2"'-(乙烷-1,2-二基二氮基)四乙酸(EDTA)之PBS稀释至15mg/mL。所得抗体系以2至3当量之三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP，5mM于蒸馏水中)处理且允许于37℃下静置1至2小时。待冷却至室温后，添加二甲基乙酰胺(DMA)以达到10％(v/v)总有机物。该混合物系经8至10当量之适当连接子-载荷物处理为10mM于DMA中之原液。允许该反应在室温下进行1至2小时，再根据制造商的指示使用GE Healthcare Sephadex G-25 M缓冲交换管柱缓冲交换至DPBS(pH 7.4)中。
欲维持环闭合之材料(表10之ADC)系通过粒径排阻层析(SEC)使用GE AKTAExplorer系统与GE Superdex200管柱及PBS(pH 7.4)溶析液纯化。最终样本系浓缩至约5mg/mL蛋白质、经滤器灭菌，且使用如下概述之质谱条件检查装载状况。
用于琥珀酰亚胺环水解之材料(表11之ADC)系使用超过滤装置(50Kda MW临界值)立即缓冲交换至50mM硼酸盐缓冲液(pH 9.2)中。将所得溶液加热至45℃达48h。所得溶液系经冷却、经缓冲交换至PBS中，且通过SEC纯化(如下所述)以移除任何聚集材料。最终样本系浓缩至约5mg/mL蛋白质并经滤器灭菌，且使用如下概述之质谱条件检查装载状况。
D.T-DM1缀合
曲妥单抗-类美坦素缀合物(T-DM1)的结构类似曲妥单抗恩他新(trastuzumabemtansine)T-DM1包含经由双官能性连接子磺酸基琥珀酰亚胺基4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺酸基-SMCC)共价连接至DM1类美坦素之曲妥单抗抗体。磺酸基-SMCC首先在25℃下于50mM磷酸钾、2mM EDTA、pH6.8中，以10:1反应化学计量缀合抗体上的游离胺一小时，且未结合连接子接着自该经缀合之抗体除盐。此抗体-MCC中间物接着在25℃下于50mM磷酸钾、50mM NaCl、2mM EDTA、pH 6.8中，以10:1反应化学计量由MCC连接子抗体上之游离顺丁烯二酰亚氨基端缀合DM1硫化物整夜。剩余未反应之顺丁烯二酰亚胺接着系经L-半胱氨酸加帽，且该ADC系经Superdex200管柱分馏以移除非单体物种(Chari et al.,1992,Cancer Res 52:127-31)。
实例6：ADC之纯化
ADC大致上系使用如下所述之粒径排阻层析(SEC)纯化及表征。药物装载至所欲缀合位点上之状况系使用多种方法测定，包括如下更完整描述之质谱术(MS)、逆相HPLC、及疏水性交互作用层析(HIC)。这三种分析方法的组合提供多种验证及定量载荷物在抗体上之装载状况之方式，藉以提供各缀合物之DAR的正确测定值。
A.制备型SEC
ADC大致上使用SEC层析来纯化，即使用Akta Explorer FPLC系统上之WatersSuperdex20010/300GL管柱，以移除蛋白质聚集体并移除留在反应混合物中之少量载荷物-连接子。偶而情况下，ADC在SEC纯化之前不含聚集体及小分子，因此不经制备型SEC处理。所使用之溶析液系1mL/min流速之PBS。在这些条件下，聚集材料(在室温下溶析约10分钟)可轻易地与非聚集材料分离(在室温下溶析约15分钟)。疏水性载荷物-连接子组合常导致SEC尖峰之“向右偏移”。在不希望受到任何特定理论局限下，此SEC尖峰位移可能是因连接子-载荷物与静相间之疏水性交互作用所致。在某些情况下，此向右位移允许经缀合之蛋白质得以自非缀合蛋白质部分解出。
B.分析型SEC
分析型SEC系于Agilent 1100 HPLC上使用PBS作为溶析液进行，以评估ADC之纯度及单体状态。溶析液系于220及280nM下监测。当管柱系TSKGel G3000SW管柱(7.8×300mm，目录编号R874803P)时，所使用之移动相系以流动速率0.9mL/min流动30分钟之PBS。当管柱系BiosepSEC3000管柱(7.8×300mm)时，所使用之移动相系以流动速率1.0mL/min流动25分钟之PBS。
实例7：ADC之表征
A.质谱术(MS)
制备用于LCMS分析之样本，其系将大约20μl之样本(大约1mg/ml ADC于PBS中)与20μl之20mM二硫苏糖醇(DTT)组合。在允许该混合物在室温下静置5分钟之后，将样本注射至安装Agilent Poroshell 300SB-C8(2.1×75mm)管柱之Agilent 110 HPLC系统中。系统温度设定为60℃。利用从20％至45％乙腈在水中(含0.1％甲酸修饰剂)之5分钟梯度。溶析液系通过UV(220nM)及Waters Micromass ZQ质谱仪(ESI离子化；锥孔电压：20V；源极温度：120℃；去溶剂化温度：350℃)监测。含有多重带电物种之原始图谱系使用MassLynx 4.1软件试剂盒中之MaxEnt1，根据厂商说明去卷积(deconvoluted)。
B.MS测定每个抗体之装载状况
载荷物对抗体以制造ADC之总装载状况被称为药物抗体比或DAR。计算所制造之各ADC的DAR(表12)。
整个溶析窗(通常为5分钟)之图谱系经组合成单一总和图谱(即代表整个样本之MS的质谱)。ADC样本之MS结果系与完全相同之非装载对照抗体之对应MS直接比较。此允许鉴别装载/非装载重链(HC)尖峰及装载/非装载轻链(LC)尖峰。不同尖峰之比可基于下述方程式(方程式1)用于建立装载状况。计算系基于装载链及非装载链离子化相等的假设，此假设已经被决定为大致有效之假设。
下列计算是为了建立DAR而实施：
方程式1：
装载＝2*[LC1/(LC1+LC0)]+2*[HC1/(HC0+HC1+HC2)]+4*[HC2/(HC0+HC1+HC2)]
其中所示变量系下列者之相对丰度：LC0＝未装载轻链，LC1＝单一装载轻链，HC0＝未装载重链，HC1＝单一装载重链，及HC2＝双装载重链。所属技术领域中具有通常知识者将理解本发明涵盖此计算之扩充，以涵盖更高装载物种诸如LC2、LC3、HC3、HC4、HC5、及类似者。
下面的方程式2系用于估计在非经工程化半胱氨酸残基上之装载的量。就经工程化Fc突变体而言，在轻链(LC)上之装载在定义上被认为是非特异性装载。再者，仅装载LC被假设是因为意外还原HC-LC双硫键(即该抗体系经“过度还原”)所致。由于大幅过量之顺丁烯二酰亚胺亲电子剂系用于缀合反应(单一突变体大致约5当量且双突变体10当量)，在轻链上之任何非特异性装载被假设伴随着对应量之在重链上之非特异性装载发生(即该断裂HC-LC双硫键之另“一半”)。有了这些假设，下列方程式(方程式2)系用于估计在蛋白质上之非特异性装载的量：
方程式2：
非特异性装载＝4*[LC1/(LC1+LC0)]
其中所示变量系下列者之相对丰度：LC0＝未装载轻链，LC1＝单一装载轻链。
表12：ADC的药物抗体比例(DAR)
ADC DAR
T(κK183C)-vc0101 2
T(K290C)-vc0101 2
T(K334C)-vc0101 2
T(K392C)-vc0101 2
T(κK183C+K290C)-vc0101 4
T(κK183C+K334C)-vc0101 4
T(κK183C+K392C)-vc0101 4
T(K290C+K334C)-vc0101 4
T(K290C+K392C)-vc0101 4
T(K334C+K392C)-vc0101 4
T(N297Q)-AcLysvc0101 4
T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 4
T(N297A+K222R+LCQ05)-AcLysvc0101 4
T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101 2
T-mc8261 4.2
T-m(H20)c8261 3.6
T-MalPeg8261 3.1
T-vc8261 4.3
T-mc6121 3.5
T-MalPeg6121 3.6
T-mc0101 4.8
T-vc0101 4.2
T-vc8254 4
T-vc6780 4.2
T-vc0131 4.5
T-MalPegMMAD 4.4
T-vcMMAE 3.8
T-DM1 4.2
C.利用进行蛋白水解以建立装载位点
就半胱氨酸突变ADC而言，任何非特异性装载亲电子载荷物至抗体上系假设发生在“链间”亦称为“内部”半胱氨酸残基(即，一般而言系HC-HC或HC-LC双硫键之一部分的该些残基)。为了要分辨装载亲电子剂至Fc结构域中之工程化的半胱氨酸上与装载至内部半胱氨酸残基上(否则一般而言形成在HC-HC或HC-LC之间的S-S键结)，缀合物系经已知可切割抗体之Fab结构域与Fc结构域之间之蛋白酶处理。一种此类蛋白酶系半胱氨酸蛋白酶IdeS，由Genovis以之名称销售，并描述于von Pawel-Rammingenet al.,2002,EMBO J.21:1607。
简言之，遵照制造商之建议条件，将ADC以蛋白酶处理且样本系于37℃下培养30分钟。制备用于LCMS分析之样本，其系将大约20μl之样本(大约1mg/mL于PBS中)与20μl之20mM二硫苏糖醇(DTT)组合，且允许该混合物在室温下静置5分钟。此人IgG1之处理导致三种大小范围皆在约23至26KDa的范围内之抗体片段：包含内部半胱氨酸之LC片段，该内部半胱氨酸一般而言形成LC-HC链间双硫键；包含三个内部半胱氨酸之N端HC片段(其中一个一般而言形成LC-HC双硫键且另外二个在抗体绞链区发现之半胱氨酸一般而言形成抗体之二个重链之间的HC-HC双硫键)；及不包含反应性半胱氨酸之C端HC片段，但该些通过突变导入此处揭示之工程化体中之反应性半胱氨酸除外。样本如上述通过MS分析。装载计算系以如前所述(如上)之相同方式实施，以定量LC、N端HC及C端HC之装载。在C端HC上之装载被认为是“特异性”装载，而在LC及N端HC上之装载被认为是“非特异性”装载。
为了交叉检查装载计算，一个ADC亚群亦使用替代方法(基于逆相高效液相层析[rpHPLC]及基于疏水性交互作用层析[HIC]之方法)进行装载检测，在下面章节中有更完整的描述。
D.逆相HPLC分析
制备用于逆相HPLC分析之样本，其系将大约20ul之样本(大约1mg/mL于PBS中)与20ul之20mM二硫苏糖醇(DTT)组合。在允许该混合物在室温下静置5分钟之后，将样本注射至安装Agilent Poroshell300SB-C8(2.1×75mm)管柱之Agilent 1100 HPLC系统中。系统温度设定为60℃，且溶析液系通过UV(220nM及280nM)监测。利用从20％至45％乙腈在水中(含0.1％TFA修饰剂)之20分钟梯度：T＝0min:25％乙腈；T＝2min:25％乙腈；T＝19min:45％乙腈；及T＝20min:25％乙腈。使用这些条件，抗体之HC及LC系经基准分离。此分析之结果指示LC大多维持未经修饰(但含有T(κK183C)及T(LCQ05)之抗体除外)，而HC系经修饰(数据未显示)。
E.疏水性交互作用层析(HIC)
制备用于HIC分析之化合物，其系将样本用PBS稀释至大约1mg/ml。通过将15μl之样本自动注射至具有TSK-GEL丁基NPR管柱(4.6×3.5mm，2.5μm孔径大小；TosohBiosciences部件#14947)之Agilent 1200HPLC上来进行分析。该系统包括具有恒温器之自动取样器、管柱加热器及UV检测器。
梯度方法的使用如下：移动相A：1.5M硫酸铵、50mM磷酸氢二钾(pH7)；移动相B：20％异丙基醇、50mM磷酸氢二钾(pH7)；T＝0min.100％A；T＝12min.,0％A。
滞留时间显示于表13。选定图谱显示于图2A至2E。使用位点特异性缀合之ADC(T(κK183C+K290C)-vc0101、T(K334C+K392C)-vc0101及T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101)(图1A至1C)主要显示一个尖峰，然而使用常规缀合之ADC(T-vc0101及T-DM1)(图2D至2E)显示差异化装载之缀合物的混合物。
表13:疏水性相互作用层析(HIC)的ADC滞留时间
ADC RT(min) RRT
T-vc0101 8.8±0.1 1.68
T(κK183C)-vc0101 7.2±0.1 1.40
T(K334C)-vc0101 ND
T(K392C)-vc0101 6.7±0.1 1.29
T(L443C)-vc0101 10.1±0.1 1.98
T(κK183C+K290C)-vc0101 9.0±0.0 1.77
T(κK183C+K334C)-vc0101 ND
T(κK183C+K392C)-vc0101 7.7±0.1 1.54
T(κK183C+L443C)-vc0101 10.6 2.04
T(K290C+K334C)-vc0101 6.3±0.0 1.21
T(K290C+K392C)-vc0101 7.8±0.0 1.54
T(K334C+K392C)-vc0101 6.0±0.3 1.18
T(K392C+L443C)-vc0101 10.8±0.0 2.08
T(LCQ05+K222R)-AcLys-vc0101 6.5 1.27
T(N297A+K222R+LCQ05)-AcLys-vc0101 6.3±0.1 1.24
ND＝未测定
RT＝HIC上的滞留时间(min)
RRT＝平均相对滞留时间，计算方式为将ADC的RT除以基准未缀合的野生型曲妥单抗的RT(具有5.0-5.2分钟的典型滞留时间)
F.热稳定性
示差扫描量热仪(DCS)系用于测定工程化的半胱氨酸及转谷氨酰胺酶抗体变异体及对应Aur-06380101位点特异性缀合物之热稳定性。在此分析中，以PBS-CMF pH 7.2调制之样本系经分配至具有自动取样器之Micr℃al VP毛细管DSC的试样盘(GE HealthcareBio-Sciences,Piscataway,NJ)中，在10℃下平衡5分钟，接着以每小时100℃的速率扫描至最高110℃。选择16秒之过滤期。原始数据系经基准校正，该蛋白质浓度系经标准化。Origin软件7.0(OriginLab Corporation,Northampton,MA)被用于适配该数据至具有适当数量之转换(transition)之MN2-State模型。
所有经单一及双半胱氨酸工程化之抗体变异体以及工程化的含有酰基供体谷氨酰胺之标签之LCQ05抗体皆展现优异的热稳定性，如由第一融化转换(Tm1)&gt;65℃所决定(表14)。
使用位点特异性缀合方法缀合0101之曲妥单抗衍生单克隆抗体亦经评估且亦显示具有绝佳之热稳定性(表15)。然而，T(K392C+L443C)-vc0101ADC之Tm1最受载荷物缀合之影响，因为相对于未缀合之抗体，其减少4.35℃。
一并考虑这些结果证明，工程化的半胱氨酸抗体变异体及含有酰基供体谷氨酰胺之标签之抗体变异体皆为热稳定的，且经由vc连接子位点特异性缀合0101产生具有优异热稳定性之缀合物。另外，在T(K392C+L443C)-vc0101所观察到之相对于未缀合抗体之较低热稳定性，显示经由vc连接子缀合0101至某些工程化的半胱氨酸残基的组合可影响ADC之稳定性。
表14:工程化曲妥单抗衍生的变体的热稳定性
抗体 Tm1(℃) Tm2(℃) Tm3(℃)
T(<sub>K</sub>K183C) 72.17±0.029 80.78±0.37 82.81±0.055
T(L443C) 72.02±0.06 80.98±1.10 82.96±0.11
T(LCQ05) 72.22±0.027 81.16±0.19 82.88±0.033
T(<sub>K</sub>K183C+K290C) 75.4 81.1 82.9
T(<sub>K</sub>K183C+K392C) 75 81 83
T(<sub>K</sub>K183C+L443C) 72.24±0.05 80.89±0.89 82.87±0.16
T(K290C+K334C) 75.0±0.14 83.0±0.1 81.1±0.4
T(K334C+K392C) 75.3±0.25 82.7±0.53 81.0±2.9
T(K290C+K392C) 77 81 83
T(K392C+L443C) 73.95±0.29 80.54±0.70 82.81±0.17
表15:位点特异性构建体缀合至耳抑素0101的热稳定性
位点特异性缀合物 Tm1(℃) Tm2(℃) Tm3(℃) Tm1<sub>SSC</sub>–Tm1<sub>Ab</sub>
T(<sub>K</sub>K183C)-vc0101 70.16±0.03 80.45±0.12 82.04±0.03 -2.01
T(L443C)-vc0101 72.34±0.10 80.20±0.59 82.44±0.10 0.32
T(<sub>K</sub>K183C+L443C)-vc0101 70.11±0.02 78.89±0.59 81.38±0.10 -2.13
T(K392C+L443C)-vc0101 69.60±0.35 79.21±0.43 82.10±0.05 -4.35
实例8：ADC结合至HER2
A.直接结合
BT474细胞(HTB-20)系经胰蛋白酶消化、离心及重悬于新鲜培养基中。该等细胞接着与一系列ADC或未缀合曲妥单抗之稀释液以1μg/ml之起始浓度于4℃下一起培养一小时。该等细胞接着以冰冷PBS清洗二次且用抗人Alexafluor488二级抗体(Cat#A-11013,Lifetechnologies)培养30min。该等细胞接着以PBS清洗二次且接着重悬于PBS中。使用Accuri流式细胞仪(BD Biosciences San Jose,CA)读取平均荧光强度。
表16:ADC结合至HER2
ADC/Ab EC<sub>50</sub>
曲妥单抗 0.37
T(κK183C+K392C)-vc0101 0.56
T(κK183C+K290C)-vc0101 0.47
T(K290C+K392C)-vc0101 0.32
T-DM1(Kadcyla) 0.40
T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101 0.37
T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 0.36
EC50＝给出半最大结合的抗体或ADC的浓度
如图3A及表16所示，ADC T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101、T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101、T(κK183C+K290C)-vc0101、T(κK183C+K392C)-vc0101、T(K290C+K392C)-vc0101与T-DM1及曲妥单抗在直接结合上具有类似之结合亲和力。这表示对本发明之ADC中之抗体的修饰以及添加连接子-载荷物不显著影响结合。
B.竞争结合(FACS)
BT474细胞系经胰蛋白酶消化、离心及重悬于新鲜培养基中。该等细胞接着与ADC或未缀合曲妥单抗之系列稀释液加上1μg/mL之曲妥单抗-PE(由eBiosciences(San Diego,CA)委托合成1:1PE标示之曲妥单抗)于4℃下培养一小时。该等细胞接着以PBS清洗二次且接着重悬于PBS中。使用Accuri流式细胞仪(BD Biosciences San Jose,CA)读取平均荧光强度。
如图3B所示，ADC T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101、T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101、T(κK183C+K290C)-vc0101、T(κK183C+K392C)-vc0101、T(K290C+K392C)-vc0101与T-DM1及曲妥单抗在与PE标示之曲妥单抗的竞争结合上具有类似之结合亲和力。这表示对本发明之ADC中之抗体的修饰以及添加连接子-载荷物不显著影响结合。
实例9：ADC结合至人FcRn
本技术领域相信，FcRn以pH依赖性方式与不论何种亚型之IgG交互作用，且通过防止抗体进入溶酶体区室来防止抗体之降解(抗体系在溶酶体区室中降解)。因此，在选择导入反应性半胱氨酸至野生型IgG1-Fc区中的位置时之一个考虑，即为避免改变FcRn之结合性质以及包含该工程化的半胱氨酸的抗体之半衰期。
分析系经实施，以决定曲妥单抗衍生单克隆抗体及其个别ADC与人FcRn结合之稳定状态亲和性(KD)。技术利用传感器之表面层的折射率变化，此等变化发生在曲妥单抗衍生单克隆抗体或其个别ADC与固定在该层上之人FcRn蛋白质结合时。结合系通过表面电浆共振(SPR)检测自表面折射之雷射光。人FcRn系使用BirA试剂(目录编号BIRA500,Avidity,LLC,Aurora,Colorado)特别经由工程化的Avi标签生物素化，且经固定至链霉抗生物素蛋白(SA)传感器芯片上以使FcRn蛋白质能一致定向于传感器上。接着，各种浓度的曲妥单抗衍生单克隆抗体或其个别ADC于20mM MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸pH 6.0中，与150mM NaCl、3mM EDTA(乙二胺四乙酸)、0.5％表面活性剂P20(MES-EP)被注射至芯片表面。在注射周期之间，使用HBS-EP+0.05％表面活性剂P20(GE Healthcare,Piscataway,NJ)pH7.4进行表面再生。稳定状态结合亲和性系针对曲妥单抗衍生单克隆抗体或其个别ADC测定，且与野生型曲妥单抗抗体(在IgG1 Fc区不包含半胱氨酸突变、无TGase工程化标签或载荷物之位点特异性缀合)比较。
这些数据证明在本发明指示之IgG-Fc区的位置上纳入工程化的半胱氨酸残基不会改变对FcRn之亲和性(表17)。
表17:位点特异性缀合物结合人FcRn的稳定状态亲和力
ND＝未测定
实例10：ADC结合至Fcγ受体
使用位点特异性缀合之ADC与人Fc-γ受体之结合系经评估，以了解缀合载荷物是否改变结合进而可影响抗体相关官能性性质诸如抗体依赖性细胞媒介性细胞毒性(ADCC)。FcγIIIa(CD16)系表达于NK细胞及巨噬细胞上，且经由抗体结合使此受体与目标表达性细胞共啮合(co-engagement)诱导ADCC。分析系用于检测曲妥单抗衍生单克隆抗体及其个别ADC与Fc-γ受体IIa(CD32a)、IIb(CD32b)、IIIa(CD16)及FcγRI(CD64)之结合。
在此表面电浆共振(SPR)检定中，重组人表皮生长因子受体2(Her2/neu)胞外结构域蛋白质(Sino Biological Inc.,Beijing,P.R.China)系经固定于CM5芯片(GEHealthcare,Piscataway,NJ)上，且约300至400反应单位(RU)之曲妥单抗衍生单克隆抗体或彼之个别ADC系经捕捉。T-DM1系包括于此评估以作为阳性对照，因为其显示保留与未缀合曲妥单抗抗体可相比之与Fcγ受体之缀合后结合性质。接下来，各种浓度的Fcγ受体FcγIIa(CD32a)、FcγIIb(CD32b)、FcγIIIa(CD16a)及FcγRI(CD64)系经注射至表面且进行结合测定。
FcγR IIa、IIb及IIIa展现快速结合/解离速率，因此感测曲线图系经拟合至稳定状态模型以获得KD数值。FcγRI展现较慢的结合/解离速率，因此数据系经拟合至动力学模型以获得KD数值。
在工程化的半胱氨酸位置290及334上缀合载荷物相较于其未缀合对应抗体及T-DM1显示中度丧失对FcγR的亲和性，特别是对CD16a、CD32a及CD64的亲和性(表18)。然而，同时缀合在位点290、334及392上导致对CD16a、CD32a及CD32b而不是对CD64显著亲和性丧失，如用T(K290C+K334C)-vc0101及T(K334C+K392C)-vc0101所观察到(表18)。有趣的是，T(KK183C+K290C)-vc0101虽然在K290C位置上获得载荷药物，但仍展现可相比的与此研究所评估之所有FcγR的结合(表18)。如预期的，转谷氨酰胺酶媒介缀合之T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101不与任何评估的Fcγ受体结合，因为含有酰基供体谷氨酰胺之卷标的位置移除N-连接糖基化。相反地，T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101保留与Fcγ受体之完整结合，因为该含有谷氨酰胺之标签系经工程化于人κ轻链恒定区之内。
综合所述，这些结果提示缀合载荷物之位置可影响ADC对FcγR之结合，且可能影响该缀合物之抗体官能性。
表18:位点特异性缀合物对Fcγ受体结合至CD16a、CD32a、CD32b和CD64的结合亲和性
ND＝未测定,NB＝未结合
实例11：ADCC活性
在ADCC检定中，Her2表达性细胞系BT474及SKBR3系用来作为目标细胞，而NK-92细胞(衍生自一名50岁高加索男性外周血液单核细胞之介白素2依赖性自然杀手细胞细胞系，由Conkwest提供)或自健康捐赠者(编号179)新鲜抽取之血液所分离之人外周血液单核细胞(PBMC)系用来作为效应细胞。
将目标细胞(BT474或SKBR3)以1×104细胞/100μl/孔放置在96孔盘中，并于37℃/5％CO2下于RPMI1640培养基中培养整夜。隔天，移除培养基，并更换为60μl检定缓冲液(含有10mM HEPES之RPMI1640培养基)、20μl之1μg/ml抗体或ADC，接着在各孔中加入20μl之1×105(用于SKBR3)或5×105(用于BT474)之PBMC悬浮液，或在二种细胞系中皆加入2.5×105NK92细胞，以达到效应细胞对目标细胞比率为：PBMC对BT474为50:1，或对SKBR3为25:1，NK92对二种细胞系皆为10:1。所有样本皆运行三次(triplicate)。
检定盘系于37℃/5％CO2下培养6小时，接着平衡至室温。使用Cyto Tox-OneTM试剂在激发波长560nm及发射波长590nm下测量自细胞溶解释放之LDH。作为阳性对照，在对照孔中添加8μL之Triton以产生最大LDH释放。使用下式计算图4所示之比细胞毒性(specificcytotoxicity)：
“实验”对应于在上述任一条件下测定的信号
“效应自发性”对应于在仅PBMC存在下测定的信号
“目标自发性”对应于在仅目标细胞存在下测定的信号
“目标最大值”对应于在仅去污剂溶解目标细胞存在下测定的信号
图4显示曲妥单抗、T-DM1及vc0101 ADC缀合物之测试ADCC活性。数据符合所报告之曲妥单抗及T-DM1之ADCC活性。由于N297Q突变系位于糖基化位点，因此预期T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101不具有ADCC活性，此预期亦在检定中获得证实。单突变(K183C、K290C、K334C、K392C包括LCQ05)ADC则维持ADCC活性。意外的是，在双突变(K183C+K290C、K183C+K392C、K183C+K334C、K290C+K392C、K290C+K334C、K334C+K392C)ADC中，除了二个与K334C位点有关的双突变ADC(K290C+K334C及K334C+K392C)以外，所有皆维持ADCC活性。
实例12：体外细胞毒性检定
抗体-药物缀合物系如实例3所示制备。将细胞以低密度接种于96孔盘，接着在隔天用ADC及未缀合载荷物之10个浓度的3倍连续稀释液处理二次(duplicate)。将细胞在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中培养4天。盘系通过与96 AQueous One MTS溶液(Promega,Madison,WI)一起培养1.5小时加以收集，并在波长490nm下在Victor孔盘读取仪(Perkin-Elmer,Waltham,MA)上测量吸光度。IC50数值使用采用XLfit(IDBS,Bridgewater,NJ)之四参数对数模型计算，且在图5中报告为nM载荷物浓度，在图6中报告为ng/ml抗体浓度。IC50系显示为+/-标准差，独立测定次数显示于括号中。
相较于基准ADCT-DM1(Kadcyla)，含有vc-0101或AcLysv-0101连接子载荷物之ADC对于Her2阳性细胞模型高度有效，且对Her2阴性细胞具有选择性。
利用位点特异性缀合曲妥单抗所合成之ADC显示对Her2细胞模型之高度有效性及选择性。值得注意的是，数种曲妥单抗-vc0101 ADC在中度或低度Her2表达性细胞模型中比T-DM1更为有效。例如，T(κK183C+K290C)-vc0101在MDA-MB-175-VII细胞(具有1+Her2表达)中的体外细胞毒性IC50为351ng/ml，相较之下T-DM1为3626ng/ml(约低10倍)。对于具有2++Her2表达水平之细胞诸如MDA-MB-361-DYT2及MDA-MB-453细胞，T(κK183C+K290C)-vc0101之IC50系12至20ng/ml，相较之下T-DM1系38至40ng/ml。
实例13：异种移植模型
本发明之曲妥单抗衍生ADC系于N87胃癌异种移植模型、37622肺癌异种移植模型及数个乳癌异种移植模型(即，HCC 1954、JIMT-1、MDA-MB-361(DYT2)及144580(PDX)模型)中测试。下述之各模型中，第一剂皆于第1天给予。每周至少测量一次肿瘤，其体积系以下式计算：肿瘤体积(mm3)＝0.5×(肿瘤宽度2)(肿瘤长度)。各治疗组之平均肿瘤体积(±S.E.M.)系由包括最多8至10只动物，最少6至8只动物加以计算。
A.N87胃癌异种移植
曲妥单抗衍生ADC对于人肿瘤异种移植体内生长的效应系于免疫缺陷小鼠检测，该等异种移植系自具有高水平HER2表达之N87细胞系(ATCC CRL-5822)建立。为了制备异种移植物，母裸鼠(Nu/Nu,Charles River Lab,Wilmington,MA)系经皮下植入于50％基质胶(BD Biosciences)中之7.5×106个N87细胞。当肿瘤到达250至450mm3之体积时，该肿瘤被分期以确保在不同处理组之间的肿瘤大小之一致性。N87胃癌模型系以PBS载剂、曲妥单抗ADC(0.3、1及3mg/kg)或T-DM1(1、3及10mg/kg)静脉内投药4次，每次相隔4天(Q4dx4)(图7)。
数据证明曲妥单抗衍生ADC以剂量依赖性方式抑制N87胃癌异种移植之生长(图7A至7H)。
如图7I所示，T-DM1在1及3mg/kg下延缓肿瘤生长，且在10mg/kg下完全缓解肿瘤。然而，T(κK183C+K290C)-vc0101在1及3mg/kg下提供完全缓解且在0.3mg/kg下提供部分缓解(图7A)。数据显示在此模型中，T(κK183C+K290C)-vc0101相较于T-DM1显著更为有效(约10倍)。
自具有DAR4之ADC(图6E、6F及6G)获得与183+290(图7A)相比类似的体内疗效。此外，评估其系DAR2 ADC之单突变体(图7B、7C及7D)。一般来说，这些ADC比起DAR4 ADC较为无效，但是比起T-DM1则较为有效。在DAR2 ADC中，根据体内疗效数据LCQ05似乎是最有效的ADC。
B.HCC1954乳癌异种移植
HCC1954(ATCC# CRL-2338)系高度HER2表达乳癌细胞系。为了制备异种移植物，SHO母小鼠(Charles River,Wilmington,MA)系经皮下植入于50％基质胶(BDBiosciences)中之5×106个HCC1954细胞。当肿瘤到达200至250mm3之体积时，该肿瘤被分期以确保在不同处理组之间的肿瘤大小之一致性。HCC1954乳癌模型系以PBS载剂、曲妥单抗衍生ADC及阴性对照ADC静脉内投药Q4dx4(图8A至8E)。
数据证明曲妥单抗ADC以剂量依赖性方式抑制HCC1954乳癌异种移植之生长。比较1mg/kg的剂量，vc0101缀合物比起T-DM1更为有效。比较0.3mg/kg的剂量，DAR4装载ADC(图8B、8C及8D)比起DAR2装载ADC更为有效(图8A)。另外，相较于载剂对照(图8D)，阴性对照ADC在1mg/kg下对于肿瘤生长具有非常小的影响。然而，T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101完全缓解肿瘤表示目标特异性。
C.JIMT-1乳癌异种移植
JIMT-1系表达中度/低度Her2的乳癌细胞系，且固有地对曲妥单抗具有抗性。为了制备异种移植物，母裸鼠(Nu/Nu)系经皮下植入于50％基质胶(BD Biosciences)中之5×106个JIMT-1细胞(DSMZ# ACC-589)。当肿瘤到达200至250mm3之体积时，该肿瘤被分期以确保在不同处理组之间的肿瘤大小之一致性。JIMT-1乳癌模型系以PBS载剂、T-DM1(图9G)、使用位点特异性缀合之曲妥单抗衍生ADC(图9A至9E)、使用常规缀合之曲妥单抗衍生ADC(图9F)及阴性对照huNeg-8.8ADC静脉内投药Q4dx4。
数据证明所有测试之vc0101缀合物皆以剂量依赖性方式造成肿瘤减小。这些ADC在1mg/kg下可造成肿瘤缓解。然而，T-DM1在此中度/低度Her2表达性模型中不具活性，即使在6mg/kg下。
D.MDA-MB-361(DYT2)乳癌异种移植
MDA-MB-361(DYT2)系表达中度/低度Her2的乳癌细胞系。为了制备异种移植物，母裸鼠(Nu/Nu)系以100cGy/min照射4分钟，三天之后经皮下植入于50％基质胶(BDBiosciences)中之1.0×107个MDA-MB-361(DYT2)细胞(ATCC# HTB-27)。当肿瘤到达300至400mm3之体积时，该肿瘤被分期以确保在不同处理组之间的肿瘤大小之一致性。DYT2乳癌模型系以PBS载剂、使用位点特异性及常规缀合之曲妥单抗衍生ADC、T-DM1及阴性对照ADC静脉投药Q4dx4(图10A至10D)。
数据证明曲妥单抗ADC以剂量依赖性方式抑制DYT2乳癌异种移植之生长。虽然DYT2系中度/低度Her2表达细胞系，其对于微管抑制剂比其它Her2低度/中度表达性细胞系更敏感。
E.144580病患衍生乳癌异种移植
曲妥单抗衍生ADC对于人肿瘤异种移植体内生长的效应系于免疫缺陷小鼠检测，该等异种移植系自根据适当知情程序获得之新鲜切除的144580乳房肿瘤之片段建立。当采集新鲜活体组织检查时144580之肿瘤表征系三阴性(ER-、PR-、及HER2-)乳癌肿瘤。144580乳癌病患衍生异种移植系于体内皮下继代，即在母裸鼠(Nu/Nu)中从动物至动物以片段继代。当肿瘤到达150至300mm3之体积时，它们被分期以确保在不同处理组之间的肿瘤大小之一致性。144580乳癌模型系以PBS载剂、使用位点特异性缀合之曲妥单抗ADC、使用常规缀合之曲妥单抗衍生ADC及阴性对照ADC(图11A至11E)每四天静脉投药共四次(Q4dx4)。
在此HER2-(依据临床定义)之PDX模型中，T-DM1在所有测试剂量下皆无效(1.5、3及6mg/kg)(图10E)。DAR4 vc0101 ADC(图11A、11C及11D)的3mg/kg能够造成肿瘤缓解(图11C中即使在1mg/kg下亦可)。DAR2 vc0101 ADC(图11B)在3mg/kg下比DAR4 ADC无效。然而，不像T-DM1，DAR 2 vc0101 ADC在6mg/kg下系有效。
F.37622病患衍生非小细胞肺癌异种移植
数种ADC系于根据适当知情程序获得之37622的病患衍生非小细胞肺癌异种移植模型中测试。37622病患衍生异种移植系于体内皮下继代，即在母裸鼠(Nu/Nu)中从动物至动物以片段继代。当肿瘤到达150至300mm3之体积时，它们被分期以确保在不同处理组之间的肿瘤大小之一致性。37622 PDX模型系以PBS载剂、使用位点特异性缀合之曲妥单抗衍生ADC、T-DM1及阴性对照ADC(图12A至12D)每四天静脉投药共四次(Q4dx4)。
Her2之表达系由改良式Hercept测试进行分析，且系分类为2+，比细胞系中所见具有更高异质性。与连接子-载荷物vc0101缀合之ADC(图12A至12C)在1及3mg/kg下有效地造成肿瘤缓解。然而，T-DM1仅在10mg/kg下提供一些治疗好处(图12D)。比较10mg/kg之T-DM1与1mg/kg之vc0101 ADC的结果，vc0101 ADC似乎比T-DM1有效10倍。旁路效应对异质性肿瘤的疗效来说有可能是重要的。
T-DM1 ADC之释放代谢物经显示系经赖氨酸加盖之mcc-DM1连接子载荷物(即Lys-mcc-DM1)，其系膜不可穿透性化合物(Kovtun et al.,2006,Cancer Res66:3214-21；Xieet al.,2004,J Pharmacol Exp Ther310:844)。然而，自T-vc0101 ADC释放之代谢物系耳抑素0101，其系膜穿透性高于Lys-mcc-DM1之化合物。经释放之ADC载荷物杀死邻近细胞之能力称为旁路效应(bystander effect)。由于膜穿透性载荷物之释放，因此T-vc0101能够诱发强烈旁路效应，而T-DM1则否。图13显示N87细胞系异种移植肿瘤的免疫组织化学分析，该等肿瘤接收单剂量T-DM1 6mg/kg(图XA)或T-vc0101 3mg/kg(图XB)，接着在96小时之后收集并以福尔马林固定处理。肿瘤切片系针对人IgG染色以检测结合至肿瘤细胞之ADC，以及针对磷酸化组蛋白H3(pHH3)染色以检测有丝分裂细胞，以读取二种ADC之载荷物的假定作用机制。
在二例中，ADC皆在肿瘤周围检测到。在T-DM1处理肿瘤中(图13A)，大部分的pHH3阳性肿瘤细胞位于ADC附近。然而，在T-vc0101处理肿瘤中(图13B)，大部分的pHH3阳性肿瘤细胞位于超过ADC的位置(黑色箭头指出少数实例)且系在肿瘤内部。此提示具有可切割连接子及膜穿透性载荷物之ADC可在体内诱发强烈的旁路效应。
实例14：体外(in vitro)T-DM1抗性模型
A.制备体外T-DM1抗性细胞
N87细胞系继代至二个不同的角瓶，且各角瓶系经完全相同的抗性制备规程处理，以能够获得生物双重物(duplicate)。将细胞暴露至大约IC80浓度(10nM载荷物浓度)的T-DM1缀合物五个周期3天，之后为大约4至11天的无处理恢复期。在五个周期的10nM之T-DM1缀合物之后，将细胞以类似方式暴露至六个额外的100nM T-DM1周期。该程序意图仿真在诊间通常使用细胞毒性治疗剂以最大耐受剂量慢性、多周期(投药/停药)投药，然后是恢复期。自N87衍生之亲代细胞称为N87，经过慢性暴露T-DM1之细胞称为N87-TM。N87-TM细胞在4个月内发展出中至高水平之药物抗性。在周期处理大约3至4个月、持续药物暴露不再增加抗性水平之后，移除药物选择压力。之后使培养细胞系中之反应及表型维持稳定大约3至6个月。之后，偶而观察到以细胞毒性检定测量之抗性表型强度减少，在这种情形下，将早期继代之冷冻保存T-DM1抗性细胞解冻以进行额外试验。所有报告之表征在移除T-DM1选择压力之后进行至少2至8周，以确保细胞稳定。在模型发展之后大约1至2年间，收集衍生自单一选择的各种解冻的冷冻保存族群数据，以确保结果的一致性。
进行胃癌细胞系N87对曲妥单抗-类美坦素(maytansinoid)抗体-药物缀合物(T-DM1)之抗性选择，该选择系通过以个别细胞系之大约IC80(约10nM载荷物浓度)的剂量之处理周期来进行。亲代N87细胞固有地对缀合物(IC50＝1.7nM载荷物浓度；62ng/ml抗体浓度)敏感(图14)。将二个亲代N87细胞族群暴露至处理周期，且在仅大约四个月100nM T-DM1暴露周期之后，这二个族群(以下称为N87-TM-1及N87-TM-2)变成对于ADC分别具有相较于亲代细胞114及146倍之抗性(图14及图15A)。
有趣的是，观察到对于对应未缀合类美坦素游离药物DM1的最小交叉抗性(约2.2至2.5X)(图14)。
B.细胞毒性试验
ADC系如实例3所示制备。未缀合美坦素(maytansine)类似物(DM1)及耳抑素(auristatin)类似物系由Pfizer Worldwide Medicinal Chemistry(Groton,CT)制备。其它标准照护化学治疗剂购自Sigma(St.Louis,MO)。将细胞以低密度接种于96孔盘，接着在隔天用ADC及未缀合载荷物之10个浓度的3倍连续稀释液处理二次(duplicate)。将细胞在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中培养4天。盘系通过与96 AQueous One MTS溶液(Promega,Madison,WI)一起培养1.5小时加以收集，并在波长490nm下在Victor孔盘读取仪(Perkin-Elmer,Waltham,MA)上测量吸光度。IC50数值系使用采用XLfit(IDBS,Bridgewater,NJ)之四参数对数模型计算。
对其他曲妥单抗衍生ADC之交叉抗性数据系经测定。观察到对许多由不可切割连接子及具有抗微管蛋白作用机制之递送载荷物所组成之曲妥单抗衍生ADC的显著交叉抗性(图14)。例如，在N87-TM相较于N87-亲代细胞中，观察到T-mc8261(图14及图15B)及T-MalPeg8261(图14)(彼等分别代表经由不可切割之顺丁烯二酰亚胺基己酰基或Mal-PEG连接子连接至曲妥单抗之基于耳抑素之载荷物)的效力分别减少&gt;330倍及&gt;272倍。在N87-TM细胞中，观察到对T-mcMalPegMMAD(另一种具有不同的不可切割连接子递送单甲基海兔毒素(monomethyl dolastatin,MMAD)之曲妥单抗ADC)超过235倍的抗性(图14)。
值得注意的是，观察到当载荷物经由可切割之连接子递送时，N87-TM细胞系维持对载荷物之敏感性，即使这些药物在功能上抑制类似的目标(即微管去聚合化)。克服抗性之ADC实例包括但不限于T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101(图14及图15C)、T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101(图14及图15D)、T(K290C+K334C)-vc0101(图10及图11E)、T(K334C+K392C)-vc0101(图14及图15F)及T(κK183C+K290C)-vc0101(图14及图15G)。这些代表递送耳抑素类似物0101，但其中载荷物系于细胞内通过蛋白水解切割vc连接子而释放之基于曲妥单抗之ADC。
为了决定这些ADC抗性癌细胞是否对其他疗法具有广泛抗性，N87-TM细胞模型系使用一组具有各种作用机制之标准照护化学治疗剂处理。一般来说，微管及DNA功能之小分子抑制剂维持对N87-TM抗性细胞系有效(图14)。虽然这些细胞系经处理使产生对递送微管去聚合化剂类似物美坦素之ADC的抗性，但很少或没有观察到对数种微管蛋白去聚合化剂或聚合化剂之交叉抗性。类似地，两种细胞系皆维持对干扰DNA功能之药剂之敏感性，包括拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物剂、及烷化/交联剂。一般来说，N87-TM细胞并非对广泛范围之细胞毒素具有抗性，因此排除可能模拟药物抗性之一般性生长或细胞周期缺陷。
二个N87-TM族群亦维持对于对应未缀合药物(即DM1及0101；图14)之敏感性。因此，经处理使产生对曲妥单抗-类美坦素缀合物具有抗性之N87-TM细胞展示对经由不可切割连接子递送之其它基于微管之ADC之交叉抗性，但仍维持对未缀合微管抑制剂及其它化学治疗剂之敏感性。
为了测定在N87-TM细胞中对T-DM1抗性之分子机制，测定MDR1及MRP1药物流出泵之蛋白质表达水平。此系因为小分子微管蛋白抑制剂系MDR1及MRP1药物流出泵之已知底物(Thomas and Coley,2003,Cancer Control 10(2):159-165)。测定来自亲代N87及N87-TM抗性细胞之全细胞溶解物的这二种蛋白质的蛋白质表达水平(图16)。免疫印迹分析显示N87-TM抗性细胞不显著过度表达MRP1(图16A)或MDR1(图16B)蛋白质。综合所述，这些数据结合N87-TM细胞缺乏对药物流出泵已知底物(例如紫杉醇(paclitaxel)、多柔比星(doxorubicin))之交叉抗性，提示药物流出泵过度表达并不是N87-TM细胞中之T-DM1抗性的分子机制。
由于ADC之作用机制需要结合至特定抗原，因此抗原除尽或减少抗体结合可能是造成N87-TM细胞中之T-DM1抗性的原因。为了决定N87-TM细胞中是否显著除尽T-DM1之抗原，比较亲代N87及N87-TM抗性细胞之全细胞溶解物之HER2蛋白质表达水平(图17A)。免疫印迹分析显示N87-TM细胞相较于亲代N87细胞不具有明显减少量之HER2蛋白质表达。
结合至N87-TM细胞之细胞表面HER2抗原之抗体的量系经决定。在一项使用荧光激活细胞分选之细胞表面结合研究中，N87-TM细胞确实具有结合至细胞表面抗原之曲妥单抗约50％之下降(图17B)。由于N87细胞系高度表达HER2蛋白质之癌细胞系(Fujimoto-Ouchiet al.,2007,Cancer Chemother Pharmacol 59(6):795-805)，在这些细胞中HER2抗体结合减少约50％可能不代表在N87-TM细胞中造成对T-DM1抗性之机制。支持此解释之证据系在于，N87-TM抗性细胞维持对其他具有不同连接子及载荷物之HER2结合性曲妥单抗衍生ADC之敏感性(图14)。
为了以无偏差之方式决定T-DM1抗性的可能机制，亲代N87及N87-TM抗性细胞模型系经由蛋白质体方式进行分析，以全面性识别可能造成T-DM1抗性之膜蛋白质表达水平之变化。观察到523个蛋白质在两个细胞系模型中有显著的表达水平之变化(图18A)。要验证入选的这些预测蛋白质的变化，以N87以及N87-TM全细胞溶解物进行在N87-TM细胞中(相对于N87细胞)预测为表达不足(IGF2R,LAMP1,CTSB)(图18B)以及过量表达(CAV1)(图18C)的蛋白质的免疫印迹。将N87和N87-TM-2细胞经皮下植入NGS小鼠中制备体内肿瘤，以评估体内观察到的蛋白质变化是否模拟体外观察到的蛋白质变化。与N87肿瘤相比，N87-TM-2肿瘤保留CAV1蛋白质的过量表达(图18D)。虽然在两个模型中的小鼠基质皆呈现CAV1染色是可预期的，但只在N87-TM-2模型中看到上皮CAV1染色。
C.体内疗效试验
为了判定在细胞培养中观察到的抗性是否在体内重现，亲代N87细胞与N87-TM-2细胞被扩增并注射入雌性NOD scid γ(NSG)免疫不全小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)的侧腹中，小鼠获自The Jackson Labotatory(Bar Harbor,ME)。在小鼠右侧腹皮下注射N87或N87-TM细胞悬浮液(每次注射7.5×106细胞与50％基质胶)。当肿瘤到达约0.3克(～250mm3)时，小鼠被随机分入研究组。T-DM1缀合物或载剂在第0天用生理食盐水静脉施用，并重复施用总共4次，每次相隔4天(Q4Dx4)。每周测量肿瘤并按体积＝(宽度×宽度×长度)/2计算质量。进行时间对事件(肿瘤倍增)分析，并利用对数等级(Mantel-Cox)检定来评估显著性。在这些研究中，所有处理组的小鼠皆未观察到体重减轻。
小鼠用以下剂处理：(1)载剂对照PBS；(2)13mg/kg的曲妥单抗抗体，然后4 5mg/kg；(3)6mg/kg的T-DM1；(4)10mg/kg的T-DM1；(5)10mg/kg的T-DM1，然后3mg/kg的T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101；(6)3mg/kg的T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101。监测肿瘤大小，结果显示于图20。N87(图19和图20A)和N87-TM-2(图19和图20B)肿瘤显示出类似体外细胞毒性检定所见之ADC疗效曲线(图19和图20B)，其中N87-TM药物抗性细胞对T-DM1具有抗性，但仍对具可切割连接子之曲妥单抗衍生ADC有反应。事实上，对T-DM1具有抗性且生长至大约1克的肿瘤，转而用T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101治疗时得到有效缓解(图20B)。在本研究之时间对事件分析中，在N87模型中，T-DM1 6和10mg/kg防止大于50％的小鼠发生肿瘤倍增至少60天，但T-DM1在N87-TM-2模型中无法如此(图20C和20D)。T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101在3mg/kg之剂量下，于研究期间(约80天)防止小鼠N-87与N87-TM两种肿瘤的任何肿瘤倍增(图20C和20D)。
在另一研究中，在体外克服T-DM1抗性之所有可切割连接之ADC，在对T-DM1无反应的此N87-TM2肿瘤模型中保持有效(图19和图20E)。
接着评估T(κK183+K290C)-vc0101 ADC是否可以抑制对TDM1有抗性的肿瘤生长。经载剂或T-DM1处理的N87-TM肿瘤在这些治疗期间持续生长，然而在第14天转而用T(κK183C+K290C)-vc0101治疗的肿瘤立即得到缓解(图20F)。
实例15：体内T-DM1抗性模型
A.制备体内T-DM1抗性细胞
所有动物研究均由Pfizer Pearl River Institutional Animal Care and UseCommittee根据既定指南核准。为了制备异种移植物，母裸鼠(Nu/Nu)系经7.5×106N87细胞于50％基质胶(BD Biosciences)之皮下植入。当平均肿瘤体积到达约300mm3时，将动物随机分成两组：1)载剂对照组(n＝10)和2)T-DM1处理组(n＝20)。T-DM1ADC(6.5mg/kg)或载剂(PBS)在第0天用生理食盐水静脉施用动物，然后每周投药6.5mg/kg最长达30周。每周测量肿瘤两次或一次，并按体积＝(宽度x宽度x长度)/2计算质量。在这些研究中，所有处理组的小鼠皆未观察到体重减轻。
在T-DM1处理下，当个别肿瘤体积到达约600mm3时(为随机分配时肿瘤原始大小加倍)，动物被视为具有抗性或复发。与对照组比较，最初大部分肿瘤对T-DM1处理有反应，如图21A所示。更具体而言，20只小鼠中有17只最初对T-DM1处理有反应，但显著数量的肿瘤(20中之13)在T-DM1处理下复发。经过一段时间，植入的N87肿瘤细胞变得对T-DM1具有抗性(图21B)。收集最初对T-DM1处理没有反应的三个肿瘤，由IHC测定Her2表达，表示没有HER2表达变化。剩余10个复发肿瘤如下所述。
最初对T-DM1处理有反应然后复发的4个肿瘤，在第77天(小鼠1和16)、第91天(小鼠19)、第140天(小鼠6)转而用每周2.6mg/kg的T-vc0101处理。如图19C所示，在体内制备的T-DM1抗性肿瘤对T-vc0101有反应，表示获得的T-DM1抗性肿瘤对vc0101ADC处理具敏感性。
最初对T-DM1处理有反应然后复发的另外3个肿瘤，在第110天转而用每周2.6mg/kg的T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101处理(小鼠4、13、和18)。如图21D所示，在体内制备的T-DM1抗性肿瘤也对T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101具反应。后续的实验经实施以评估T(κK183C+K290C)-vc0101获得类似的结果，如图21E所示，这表示体内制备的T-DM1抗性肿瘤对T(κK183C+K290C)-vc0101处理具敏感性。
总而言之，经后续处理的所有T-DM1抗性肿瘤对vc0101ADC处理皆为敏感(7中之7)，表示体内抗性T-DM1肿瘤可用可切割vc0101缀合物处理。
将最初对T-DM1有反应然后复发的另外三个肿瘤(如图21B所示之小鼠7、17、和2)切除以用于体外表征。在体外培养经切除的肿瘤2至5个月之后，评估这些细胞对T-DM1的抗性并进行体外表征(参见本实例下面的B和C部分)。
B.细胞毒性试验
将经T-DM1处理而复发并于体外培养的细胞(如本实例A部分所述)接种至96孔盘中，接着隔天用ADC或未缀合载荷物的4倍连续稀释液投药。将细胞在潮湿的37℃/5％CO2培养箱中培养96小时。将CellTiter Glo溶液(Promega,Madison,WI)加入盘中并在波长490nm下在Victor孔盘读取仪(Perkin-Elmer,Waltham,MA)上测量吸光度。IC50数值系使用采用XLfit(IDBS,Bridgewater,NJ)之四参数对数模型计算。
细胞毒性筛选结果总结在表19和20。当与亲代细胞相比，细胞对T-DM1(图22A)具抗性但对可切割vc0101缀合物T-vc0101(数据未显示)、T(κK183C+K290C)-vc0101(图22B)、T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101(图22C)、和T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101(图22D)(表19)具敏感性。T-DM1抗性细胞令人意外地对亲代载荷物DM1及0101载荷物(表20)具敏感性。
表19:抗性细胞对ADC的敏感性
每个细胞系显示的IC50值
表20:抗性细胞系对游离载荷物的敏感性
细胞系 DM1-Sme Aur-0101 多柔比星
N87 10 0.5 48
N87-T-DM1_Ms2 23 0.40 46
N87-T-DM1_Ms7 20 0.60 79
N87-T-DM1_Ms17 27 0.28 34
C.以FACS和蛋白印迹分析Her2表达
Her2表达系于经T-DM1处理而复发并于体外培养的细胞(如本实例A部分所述)中表征。对于FACS分析，细胞系经胰蛋白酶消化、离心及重悬于新鲜培养基中。该等细胞接着与5μg/mL之曲妥单抗-PE(由eBiosciences(San Diego,CA)委托合成1:1PE标示之曲妥单抗)于4℃下培养一小时。该等细胞接着以PBS清洗二次且接着重悬于PBS中。使用Accuri流式细胞仪(BD Biosciences San Jose,CA)读取平均荧光强度。
对于蛋白印迹分析，将细胞使用RIPA溶解缓冲液(具有蛋白酶抑制剂以及磷酸酶抑制剂)在冰上溶解15分钟，接着涡旋，并在微量离心机中4℃下以最大速度离心。收集该上清液，并将4X样本缓冲液与还原剂加至样本中以标准化每个样本中的总蛋白。样本系于4至12％Bis tris胶上运行并转移至硝化纤维素膜上。将膜封闭1小时并在4℃下以HER2抗体(Cell Signalling,1:1000)培养过夜。然后将膜以1X TBST清洗3次并且以抗小鼠HRP抗体(Cell Signalling,1:5000)培养1小时，清洗3次并探测。
经FACS(图23A)与蛋白印迹(图23B)评估，T-DM1复发性肿瘤之HER2表达水平与对照肿瘤(无T-DM1处理)类似。
D.T-DM1抗性不是由于药物流出泵的表达
蛋白印迹显示细胞系并未表达MDR1(图24A)并且细胞对MDR-1底物游离药物0101没有抗性(图24B)。没有观察到对多柔比星的抗性(图24C)表示抗性机制不是经由MRP1。然而，细胞仍然对游离DM1(图24D)具有抗性。
实例16：药物动力学(PK)
向马来猴IV推注施用剂量5或6mg/kg之常规或位点特异性vc0101抗体药物缀合物之后，测定其暴露。使用配体结合检定(LBA)测量总抗体(总Ab；缀合mAb和未缀合mAb的测量值)和ADC(至少缀合一个药物分子的mAb)的浓度。除了使用AcLysvc0101的T(LCQ05)之外，其它所有情况皆使用vc0101制造ADC。使用常规缀合(非位点特异性缀合)自曲妥单抗制造ADC。
在对马来猴施用剂量后之总Ab以及曲妥单抗ADC(T-vc0101)(5mg/kg)或T(κK183C+K290C)位点特异性ADC(6mg/kg)的浓度对时间曲线、药物动力学/毒物动力学(图25A和表21)。与常规缀合物相比时，T(κK183C+K290C)位点特异性ADC的暴露具有同时增加的暴露及稳定性。
在对马来猴施用剂量后，对曲妥单抗(T-vc0101)(5mg/kg)或T(κK183C+K290C)、T(LCQ05)、T(K334C+K392C)、T(K290C+K334C)、T(K290C+K392C)及T(κK183C+K392C)位点特异性ADC(6mg/kg)的ADC分析物进行浓度对时间曲线及药物动力学/毒物动力学分析(图25B及表21)。与使用常规缀合的曲妥单抗ADC相比，几个位点特异性ADC(T(LCQ05)、T(κK183C+K290C)、T(K290C+K392C)、和T(κK183C+K392C))有较高的暴露。然而，其它两个位点特异性ADC(T(K290C+K334C)及T(K334C+K392C))没有比曲妥单抗ADC具有更高的暴露，表示并非所有位点特异性ADC都将具有比常规缀合制造的曲妥单抗ADC更好的药物动力学性质。
表21:药物动力学
实例17：疏水性交互作用层析之相对滞留值相较于大鼠中之暴露(AUC)
疏水性是蛋白质之物理性质，其可用疏水性交互作用层析法(HIC)加以评估，且蛋白质样本基于它们的相对疏水性会有不同的滞留时间。ADC与它们个别的抗体比较可通过计算相对滞留时间(RRT)进行，该相对滞留时间即是ADC之HIC滞留时间除以个别抗体之HIC滞留时间的比例。高度疏水性ADC具有较高的RRT，并且这些ADC的药物动力学性质可能也较不佳，特别是较低的曲线下面积(AUC，或暴露)。将具有不同位点突变之ADC的HIC值与其等在大鼠中测量之AUC相比时，观察到图26的分布。
RRT≥1.9的ADC显示较低的AUC值，然而具有较低RRT的ADC倾向具有较高的AUC，虽然这关系并非直接。在ADC T(κK183C+K290C)-vc0101观察到具有相对较高的RRT(平均值为1.77)，因此预期具有相对较低之AUC。令人意外地，所观察到之AUC相对为高，因此无法显而易见地自疏水性数据预测此ADC之暴露。
实施例18：毒性试验
在两个独立探索毒性试验中，总共10只雄性与雌性马来猴分成5个剂量组(1只/性别/剂量)，系经每三周一次IV投药(试验第1、22、和43天)。在试验的第46天(第3次施用剂量后3天)，将动物安乐死并按指定规程收集血液与组织样本。在生存中和尸检后进行临床观察、临床病理学、宏观与微观病理学评估。对于解剖病理学的评估，以主观、相对、研究特定之基础，记录组织病理学发现的严重性。
在3和5mg/kg马来猴探索毒性研究中，在第一次投药后第11天，T-vc0101造成暂时但明显(390/μl)至严重(40/μl至无法检出)的嗜中性粒细胞减少症。相反的，在任何测试时间点，所有经9mg/kg之T(κK183C+K290C)-vc0101投药的马来猴具有无至最小的嗜中性粒细胞减少症，其嗜中性粒细胞计数远高于500/μl(图27)。事实上，与载剂对照组相比，经T(κK183C+K290C)-vc0101投药的动物在第11天与14天显示平均的嗜中性粒细胞计数(&gt;1000μL)。
在显微镜下，经3和5mg/kgT-vc0101投药的马来猴骨髓中具化合物相关之M/E比增加。增加的骨髓球系细胞/红血球系细胞(M/E)比由减少的红血球系细胞前驱物，结合增加的主要成熟颗粒性白血球所组成。相比之下，在6和9mg/kg下，只有经6mg/kg/剂量之T(κK183C+K290C)-vc0101投药的雄性具最小至轻度的成熟颗粒性白血球之细胞数目增加(数据未显示)。
因此，血液学与显微数据明显显示，基于位点特异性突变技术的ADC缀合物T(κK183C+K290C)-vc010明显改善T-vc010诱导的骨髓毒性与嗜中性粒细胞减少症。
实例19：ADC结晶结构
得到T(K290C+K334C)-vc0101、T(K290C+K392C)-vc0101、和T(K334C+K392C)-vc0101的结晶结构。选择这些特定ADC用于结晶学，是因为缀合K290C+K334C和K334C+K392C双半胱氨酸变异体消除ADCC活性，但K290C+K392C则否。
用于结晶学之缀合Fc区系使用木瓜酵素切割ADC制备。使用相同条件：100mMNaCitrate pH 5.0+100mM MgCl2+15％PEG 4K，得到三个缀合IgG1-Fc区之相同型态的结晶。
保存于PDB中的野生型人IgG1-Fc结构相对相似，显示CH2-CH2结构域经由Asn297-连接聚醣(碳水化合物或聚醣天线)彼此接触，并且CH3-CH3结构域形成一个在结构之间相对恒定的稳定界面。Fc结构以“封闭”或“打开”构形存在，并且去糖基化Fc结构采用“打开”结构构形，因此证明是由聚醣天线将CH2结构域保持在一起。此外，未缀合Phe241Ala-IgG1Fc突变体公开结构(Yu et al.“Engineering Hydrophobic
Protein-Carbohydrate interactions to fine-tune monoclonalantibodies”.JACS 2013)显示一个部分无序的CH2结构域，因为此突变导致CH2-聚醣界面以及CH2-CH2界面之去稳定化(因芳族Phe残基不能稳定碳水化合物)。
人IgG Fc区之“CH2结构域”(亦称为“Cγ2”结构域)通常自约氨基酸231延伸至约氨基酸340。CH2结构域很特别，因为其不与另一结构域紧密配对。反而有两条N-连接分支碳水化合物链插入完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。目前推测认为碳水化合物可以提供结构域-结构域配对的替代作用，并帮助稳定CH2结构域(Burton et al.,1985,Molec.Immunol.22:161-206)。
“CH3结构域”包含Fc区中位于CH2结构域C端的残基片段(即从IgG的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447)。
T(K290C+K334C)-vc0101和T(K290C+K392C)-vc0101两者Fc区之解析结构相似，显示Fc二聚体含有高度有序之一个CH2和两个CH3(如野生型Fc)。然而，它们也含有一个与聚醣连接的无序CH2(图28A和图28B)。一个CH2结构域较高程度的去稳定化系归因于缀合位点与聚醣天线之间的近距离。考虑0101载荷物几何形状，在K290、K334、K392中任一位点之缀合，可能扰乱聚醣之整体轨迹而远离CH2表面，使聚醣以及CH2结构本身去稳定化，因此导致CH2-CH2界面(图28C)。相对于WT-Fc、Phe241Ala-Fc、或去糖基化-Fc，这些0101位点特异性地缀合双半胱氨酸-Fc-变异体具有较高程度的异质性。当工程化的半胱氨酸变异体位置被映像在与型IIb复合的WT-Fc结构上，其显示在C334的缀合可能直接干扰与FcγRIIb的结合(图28C)。这种由突变或缀合引起的CH2位置异质性可能导致FcRIIb结合显著的降低。因此，这些结果提示，构形异质性或0101与IgG1-Fc之中某些经工程化半胱氨酸组合的缀合，可能影响含有K334C位点的双半胱氨酸变异体的ADCC活性，或者两者皆可能造成此影响。
实例20：在其它抗体使用位点特异性缀合
用于制备本发明之位点特异性HER2 ADC的位点与修饰可以用在针对其它抗原的抗体上，并且仍然导致优于常规缀合之ADC的改善疗效。
使用常规缀合以及位点特异性缀合，将抗体A(针对肿瘤相关抗原)制成ADC。在二例中，使用的连接子皆为vc，使用的药物皆为耳抑素0101。对于位点特异性缀合，将抗体轻链上的K183位点以及抗体重链CH2结构域中的K290位点(使用卡巴之EU指数)改变成半胱氨酸(C)以允许缀合连接子/载荷物。
用于制备位点特异性ADC的方法类似于该些用于制备T(κK183C+K290C)-vc0101(同上)的方法。缀合效率为61％，缀合抗体的平均DAR为4，具有与T(κK183C+K290C)-vc0101相似的HIC-RRT曲线。
评估位点特异性缀合物(SSC)的热稳定性，SSC最低熔点为65℃，表示具有足够的稳定性。也评估SSC与其目标肿瘤抗原的结合，并与未缀合的抗体相比，基于ELISA结合检定中没有检测到结合能力降低，表示与载荷物连接子vc0101缀合后保留良好的结合亲和性。
接着在具肿瘤抗原表达升高的肿瘤细胞系中评估体外细胞毒性。在使用多个肿瘤细胞系的细胞毒性检定中，SSC具有与常规ADC可相比的细胞毒性效力。体内疗效试验进一步在异种移植肿瘤模型中执行，该模型用过度表达肿瘤抗原的肿瘤细胞接种。在一个模型中，使用3mg/kg剂量水平之SSC，在每周施用两次共4次之后导致肿瘤完全缓解。维持肿瘤缓解直到最后一次投药之后约60天，观察到肿瘤再生长。相对地，虽然常规ADC用相同投药计划，4次投药后也导至肿瘤缓解，但在最后一次投药之后约30天观察到肿瘤再生长，比用SSC早得多。在其它肿瘤模型的疗效试验中，观察到类似的维持较佳肿瘤缓解疗效的发现。这些数据指示，基于κK183C+K290C之抗体A位点特异性缀合物与常规制备的ADC相比，在投药动物中维持更好的暴露，表示改善SSC稳定性导致更好的药物动力学参数。
实例21。不同缀合位点导致不同ADC性质
A.合成cys-突变体ADC的一般程序：
使用以下两个LP：
在pH 7.4，50mM磷酸盐缓冲液中制备含有纳入经工程化半胱氨酸残基(如下表所示)的曲妥单抗溶液。加入PBS、EDTA(0.5M原液)、和TCEP(0.5M原液)致最终蛋白质浓度为10mg/mL、最终EDTA浓度为20mM，以及最终TCEP浓度大约6.6mM(100摩尔当量)。允许反应在室温下静置48小时，然后使用GE PD-10Sephadex G25管柱依照制造商说明缓冲交换至PBS中。所得溶液用约50当量的脱氢抗坏血酸盐(50mM原液在1:1EtOH/水中)处理。允许抗体在4℃下静置过夜，随后使用GE PD-10 Sephadex G25管柱依照制造商说明缓冲交换至PBS中。对一些突变体，采用稍微改变之上述程序。
将如此制备之抗体用含10％DMA(vol/vol)的PBS稀释至约2.5mg/mL，并经DMA中之10mM LP#1原液(10摩尔当量)处理。在室温下2小时之后，将混合物缓冲交换至PBS中(依照上述)并且在Superdex200管柱上以粒径排阻层析法纯化。单体流份经浓缩和滤器灭菌得到最终ADC。产品表征请参阅下表22。
表22:ADC性质总结
B.缀合实例之一般分析方法：
LCMS：管柱＝Waters BEH300-C4,2.1×100mm(P/N＝186004496)；仪器＝AcquityUPLC具SQD2质谱检测器；流速＝0.7mL/min；温度＝0℃；缓冲液A＝水+0.1％甲酸；缓冲液B＝乙腈+0.1％甲酸。梯度在2分钟内自3％B运行至95％B，在95％B保持0.75分钟，然后在3％B下再平衡。注射前立即用TCEP或DTT还原样本。以LCMS(400至2000道耳顿)监测洗出液，并且使用MaxEnt1将蛋白质尖峰去卷积。DAR报告为重量平均装载。
SEC：管柱：Superdex200(5/150GL)；移动相：磷酸盐缓冲盐水含2％乙腈，pH 7.4；流速＝0.25mL/min；温度＝室温；仪器：Agilent 1100 HPLC。
HIC：管柱：TSKGel丁基NPR，4.6mm×3.5cm(P/N＝S0557-835)；缓冲液A＝1.5M硫酸铵含10mM磷酸盐，pH 7；缓冲液B＝10mM磷酸盐，pH 7+20％异丙醇；流速＝0.8mL/min；温度＝室温；梯度＝12分钟内自0％B至100％B，保持100％B 2分钟，然后用100％A再平衡；仪器：Agilent 1100 HPLC。
C.测定位点特异性vc0101缀合物的疏水性
以疏水性交互作用层析法(上述方法)评估ADC#1至ADC#16，以决定不同缀合物的相对疏水性。已有报导ADC疏水性与总抗体暴露相关。
与未修饰的抗体相比，位点334、375、和392的缀合物展现最小滞留时间位移，而位点421、443、和347的缀合物显示最大滞留时间位移。计算每个ADC相对疏水性，将ADC滞留时间除以未修饰抗体滞留时间，因此得到“相对滞留时间”或“RRT”。RRT大约1表示该ADC具有与未修饰抗体大约相同的疏水性。每个ADC的RRT显示于表22。
D.位点特异性vc0101缀合物的ADC血浆稳定性
将ADC样本(约1.5mg/mL)稀释到小鼠、大鼠、和人类血浆中，得到50μg/mL ADC于血浆中之最终溶液。样本在37℃，5％CO2下培养并且于三个时间点(0、24小时、和72小时)取等分试样。将每个时间点取自血浆培养的ADC样本(25μL)，用IgG0在37℃下去糖基化1小时。去糖基化后，加入捕捉抗体(生物素化山羊抗人类IgG1 Fcγ片段特异性，浓度为1mg/mL于小鼠及大鼠血浆中；或生物素化抗曲妥单抗抗体，浓度为1mg/mL于人类血浆中)并且将该混合物在37℃加热1小时，之后第二个小时在室温下温和的摇动。将Dynabead MyOne链霉抗生物素蛋白T1磁珠加入样本并在室温下温和摇动培养1小时。样本盘接着用200μL PBS+0.05％Tween-20、200μL PBS和HPLC等级水清洗。用55μL之2％甲酸(FA)(v/v)洗脱经结合之ADC。每个样本取50μL等分试样转移至新盘，然后加入另外5μL的200mM TCEP。
以Xevo G2 Q-TOF质谱仪连接nanoAcquity UPLC(Waters)，使用BEH300 C4,1.7μm,0.3×100mm iKey管柱执行完整蛋白质分析。移动相A(MPA)由0.1％FA在水中(v/v)组成，移动相B(MPB)由0.1％FA在乙腈中(v/v)组成。层析分离系在流速0.3μL/min下，使用MPB在7分钟内从5％至90％之线性梯度达成。LC管柱温度设定为85℃。用MassLynx软件版本4.1进行数据收集。质量收集范围从700Da至2400Da。用Biopharmalynx版本1.33实施包括去卷积的数据分析。
监测一段时间内的装载与琥珀酰亚胺之开环(a+18道耳顿尖峰)。装载数据报告为与0小时DAR相比之DAR损失％。开环数据系报告为与存在于72小时之总物种相比的开环物种的％。几个位点突变体导致非常稳定的ADC(334C、421C、和443C)而一些位点损失显著量的连接子-载荷物(380C和114C)。开环率在各位点间变化显著。几个位点如392C、183C、和334C导致非常少的开环；而其它位点如421C、388C、和347C导致快速且自发性的开环。
导致快速且自发性开环的位点可能对制备具低疏水性及/或增加PK暴露的缀合物有用。该发现对于环稳定性与血浆稳定性相关的普遍理解背道而驰。因此在一些实施方式中，当使用高疏水性连接子-载荷物时，在421C、388C、和347C中之一或多个位点之缀合特别有利。在一些实施方式中，高疏水性是1.5或更高的相对滞留时间(RRT)值(以HIC测量)。在一些实施方式中，高疏水性是1.7或更高的RRT值。在一些实施方式中，高疏水性是1.8或更高的RRT值。在一些实施方式中，高疏水性是1.9或更高的RRT值。在一些实施方式中，高疏水性是2.0或更高的RRT值。
表23:各种ADC的血浆稳定性
E.位点特异性vc0101缀合物之谷胱甘肽稳定性
将ADC样本稀释到谷胱甘肽水溶液中，得一最终GSH浓度为0.5mM与最终蛋白质浓度为约0.1mg/mL在pH 7.4磷酸盐缓冲液中。然后将样本在37℃下培养，并在三个时间点取出等分试样以测定DAR(T-0、T-3天、T-6天)。来自每个时间点的等分试样以TCEP处理并用LC-MS依照实例#21.A所述方法加以分析。
监测一段时间内的装载与琥珀酰亚胺之开环(a+18道耳顿尖峰)。装载数据报告为与0小时DAR相比之DAR损失％。(表24)开环数据系报告为与存在于72小时之总物种相比的开环物种的％。几个位点突变体导致非常稳定的ADC(334C、421C、和443C)而一些位点损失显著量的连接子-载荷物(380C和114C)。开环率在各位点间变化显著。几个位点如392C、183C、和334C导致非常少的开环；而其它位点如421C、388C、和347C导致显著开环。此检定的结果与血浆稳定性结果十分相关(实例21.D)，表示硫醇媒介之去缀合是血浆中载荷物损失之主要途径。综合起来，这些结果提示特定位点诸如334、443、290、和392可能特别适用于可通过硫醇媒介之去缀合而快速损失之载荷物-连接子的缀合。这样的载荷物-连接子包括该些利用一般顺丁烯二酰亚胺-己酰基(mc)和顺丁烯二酰亚胺-己酰基-ValCit(vc)键联(例如vc-101、vc-MMAE、mc-MMAF等)。
表24:各种vc0101位点特异性缀合物的谷胱甘肽稳定性
F.选定位点特异性vc0101缀合物在小鼠之药物动力学评估
无荷瘤无胸腺雌性nu/nu(裸)小鼠(6至8周龄)获自Charles RiverLaboratories。所有使用小鼠的程序均由实验动物照顾及使用委员会根据既定指南核准。对小鼠(n＝3或4)施用单次静脉内剂量3mg/kg基于抗体组分的ADC。投药后0.083、6、24、48、96、168、和336小时，自每只小鼠尾静脉收集血液样本。以LBA测定总抗体(TAb)和ADC浓度，其中使用绵羊抗人IgG抗体来捕捉，使用山羊抗人IgG抗体来测定TAb或者使用抗载荷物抗体用来测定ADC。使用Watson LIMS版本7.4(Thermo)分析每只动物之血浆浓度数据。暴露因位点而异。由290C和443C突变体制成的ADC展现最低暴露，而由κ-183C和392C位点制成的ADC展现最高暴露。对于许多应用而言，具高暴露的位点可能是首选，因这将导致治疗剂存续时间增加。然而，对于某些应用而言，可首选使用具较低暴露的缀合物(如290C和443C)。具体而言，需要较低暴露(即较低PK)的应用可包含但不限于在脑、CNS、和眼睛中之使用。适应症包括癌症，特别是脑癌、CNS癌症和/或眼癌。
表25:各种位点特异性vc0101 ADC的PK暴露
G.位点特异性vc0101缀合物之组织蛋白酶切割
将组织蛋白酶B用6mM二硫苏糖醇(DTT)在150mM醋酸钠，pH温度37℃下活化15分钟。然后取50ng活化组织蛋白酶-B与20uL的1mg/mL ADC混合于最终浓度2mM DTT、50mM醋酸钠，pH 5.2中。在37℃下培养20分钟、1h、2h、和4h之后，使用10uM E-64半胱氨酸蛋白酶抑制剂(在pH 8.5，250mM硼酸盐缓冲液中)淬熄反应。在检定之后，使用TCEP还原样本并且使用实例21A所述条件以LC/MS分析。数据显示连接子切割速率主要取决于缀合的位点。特定位点切割非常快速，如443C、388C、和290C；而其它位点切割非常缓慢，如334C、375C、和392C。在一些实施方式中，缀合至使其本身适合缓慢切割的位点可能有利。在其它实施方式中，快速切割是首选。举例来说，快速地释放载荷物以减少在胞内体中花费的时间是较适合的。在进一步实施方式中，快速载荷物切割可能有利地允许载荷物在缀合分子所无法穿透处的穿透，如某些实质肿瘤实体肿瘤处。在进一步实施方式中，快速切割可允许载荷物被递送至不表达抗体之抗原的邻近细胞，因此允许治疗例如异质肿瘤。
表26:各种位点特异性vc0101 ADC的连接子切割动力学
H.位点特异性vc0101缀合物之热稳定性
将ADC用含10mM EDTA的PBS(pH 7.4)稀释为0.2mg/mL。将ADC置于密闭小瓶中并加热至45℃。以1周为间隔取出等分试样(10μL)，通过粒径排阻层析法(SEC)评估一段时间内所形成的高分子量物种(HMWS)与低分子量物种(LMWS)之水平。SEC条件概述于实例21.A。在这些条件下，单体在约3.6分钟时洗脱。单体尖峰左侧任何洗脱的蛋白质材料被当作HMWS，并且单体尖峰右侧任何洗脱的蛋白质材料被当作LMWS。结果显示于下表27。选定ADC显示优异热稳定性，诸如κ-183C、375C、和334C；而其它ADC显示显著的分解，诸如443C和392C+443C。
表27:各种位点特异性vc0101ADC的热稳定性
I.各种vc0101位点突变体之疗效
抗体-药物缀合物之体内疗效试验在使用N87细胞系之目标表达性异种移植模型中实施。将50％基质胶中大约750万个肿瘤细胞经皮下植入6至8周龄裸鼠中，直到肿瘤大小到达介于250至350mm3。药物通过推注尾静脉注射投药。动物系经注射10、3、或1mg/kg之抗体药物缀合物总共四次，每4天一次(在第1、5、9、和13天)。每周测量所有实验动物之体重变化。前50天，每周用测径器测量肿瘤体积两次，之后每周测量一次，并且用以下公式计算：肿瘤体积＝(长度×宽度2)/2。动物在肿瘤体积到达2500mm3之前被人道处死。在第一周治疗后，通常观察到肿瘤大小减少。治疗终止后，持续监测动物的肿瘤再生长(长达治疗后100天)。来自3mpk投药组的数据显示在图29。从388C和347C突变体制备的ADC展现出比从334C、κ-183C、392C、和443C突变体制备的ADC略低的效力。
J.昂塞拉霉素(uncialamycin)载荷物与各种突变体之缀合
如实例#1所述，制备一组用于缀合之曲妥单抗半胱氨酸突变体。得到的突变体(5mg/mL)以LP#2(6摩尔当量)于含10％DMA的PBS中处理。在室温下2h后，反应经LCMS评估以测定装载，并经SEC评估以测定适当折叠和不产生聚集。结果总结在表28，原始SEC结果显示在图30。
可以看出，多种位点突变体导致表达良好的单体ADC(334C、375C、和392C)。其它位点突变体无法装载(例如246C、k149C、k111C)、产生聚集(例如443C、421C、347C)、或导致可能部分解折叠之晚洗脱ADC(例如380C、388C、290C、和k183C)。综合所述，这些结果提示特定载荷物可能需要优化以识别导致生物物理稳定与正确折叠ADC之位点。
表28:各种曲妥单抗突变体对LP#2的缀合的结果列表
K.总结
如实例证明，缀合位点可影响LP去缀合、LP代谢、tAb暴露、连接子切割速率、ADC聚集、ADC疏水性、和体内PK特性。
视ADC分子的特定应用而定，数个候选缀合位点可用来解决特定问题。例如，假如需要较低的疏水性，位点334、375、392或其组合可能是较佳的，因与未修饰的抗体相比，它们在滞留时间上展现最小位移。在另一实例中，导致快速且自发性开环的位点(例如421C、388C、347C、或或其组合)可能对制备具低疏水性及/或增加PK暴露的缀合物有用。位点诸如334、443、290、392或其组合可能特别适用于可通过硫醇媒介之去缀合而快速损失之载荷物-连接子的缀合。
实例22：位点特异性微管溶素ADC
A.合成cys-突变体ADC的一般程序：
使用以下两个LP。基于微管溶素的LP的详细合成方案在2016年2月1日申请之美国临时专利申请案62/289,485中详述，并全文以引用方式并入本文中。
方法A：市售赫赛汀(HERCEPTIN)抗体与连接子载荷物经内部双硫键缀合。曲妥单抗抗体溶液(约15mg/mL)系于含50mM EDTA的50mM磷酸盐缓冲盐水(pH 7.0)中制备。三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)系以于蒸馏水中之5mM溶液添加(约2.0摩尔当量)。将所得溶液加热至37℃达1h。待冷却后，将反应以适当体积的PBS和二甲基乙酰胺(DMA)处理，使所得溶液在含约10％DMA(vol/vol)的PBS中达约5mg/mL。适当的连接子载荷物系以于DMA中之10mM原液添加(约7当量)，并允许反应于室温下静置或温和搅拌。70分钟后，使用GE PD-10Sephadex G25管柱依照制造商说明，将反应缓冲交换至PBS中。将获得的材料稍微浓缩(用超过滤装置)并且在Superdex200管柱上以粒径排阻层析法纯化。单体流份经浓缩和滤器灭菌得到最终ADC。
方法B：连接子-载荷物与含经工程化半胱氨酸残基之曲妥单抗抗体之位点特异性缀合。在pH 7.4，50mM磷酸盐缓冲液中制备含有纳入经工程化半胱氨酸残基如位点118、334、和392(使用卡巴之EU指数，见WO2013093809)的曲妥单抗溶液。加入PBS、EDTA(0.5M原液)、和TCEP(0.5M原液)致最终蛋白质浓度为约10mg/mL、最终EDTA浓度为约20mM，以及最终TCEP浓度大约6.6mM(100摩尔当量)。允许反应在室温下静置2至48小时，然后使用GE PD-10Sephadex G25管柱依照制造商说明缓冲交换至PBS中。替代方法如渗滤或透析亦可用于特定情况中。所得溶液用约50当量的脱氢抗坏血酸盐(50mM原液在1:1EtOH/水中)处理。允许抗体在4℃下静置过夜，随后使用GE PD-10Sephadex G25管柱依照制造商说明缓冲交换至PBS中。同样地，替代方法如渗滤或透析亦可用于特定情况中。
将如此制备之抗体用含10％DMA(vol/vol)的PBS稀释至约2.5mg/mL，并经DMA中之10mM适当连接子-载荷物原液(10摩尔当量)处理。在室温下2小时之后，将混合物缓冲交换至PBS中(依照上述)并且在Superdex 200管柱上以粒径排阻层析法纯化。单体流份经浓缩和滤器灭菌得到最终ADC。
表29:微管溶素ADC和用于制备其的载荷连接子的结构
表30:ADC的分析特征
B.体外细胞检定程序
将目标表达性(BT474(乳癌)、N87(胃癌)、HCC1954(乳癌)、MDA-MB-361-DYT2(乳癌))细胞或不表达(HT-29)细胞接种至96孔细胞培养盘24小时后进行处理。将细胞以10个浓度的3倍连续稀释抗体-药物缀合物或游离化合物(无抗体缀合至药物)处理两次。处理后96小时，细胞存活性系以CellTiterAQueousOne Solution Cell Proliferation MTSAssay(Promega)测定。相对细胞存活性系测定为未处理对照之百分比。IC50数值系使用采用XLfit v4.2之四参数对数模型#203计算。结果显示于表31。
表31:所选ADC的体外细胞毒性数据
C.ADC之体外血浆稳定性检定
将ADC样本(约1.5mg/mL)稀释到小鼠血浆(Lampire Biological Laboratories)中，得到10％ADC、90％血浆之最终溶液。分析三个时间点以测定它们的DAR(T-0、T-24hr和T-48hr)。在每个时间点进行免疫沉淀方法以富集ADC。简言之，每个等分试样以20％MPER(Thermo Fisher Scientific)1:1稀释并加入等量的生物素化小鼠抗人Fc抗体和山羊抗人κ抗体(SouthernBiotech)。样本在4℃下培养二小时，然后加入链霉抗生物素蛋白亲和素Dynabeads(Thermo Fisher Scientific)。样本在KingFisher仪器上，以由10％MPER、0.05％TWEEN 20、和两次PBS组成的四个清洗步骤处理。用0.15％甲酸洗脱珠上的ADC。样本用2M Tris pH 8.5将pH值调整至7.8，并用PNGaseF(New England Biolabs)移除其N-连接聚醣。样本用TCEP还原并以LC-MS，通过993(母体)相对于951(去乙酰化)之质量偏移高度，分析乙酰水解ADC之％。结果显示于图31。结果说明，微管溶素LP#3与首选位点如K334C和K392C的连接可导致改善ADC血浆稳定性。这进而可能导致改善的体内暴露与改善的疗效。相信通过这些位点赋予的改善稳定性，将适用于其它受代谢性质不佳所困扰的载荷物类别。
D.ADC体内稳定性
血液样本系于最终ADC投药后72小时自N87异种移植试验中之选定荷瘤小鼠中获得。从3mpk投药组取得样本。如此获得之ADC样本系以PNGase(New England Biolab)在37℃下处理1小时进行去糖基化。培养后，加入捕捉抗体(生物素化山羊抗人Fc 1.0mg/mL,Jackson ImmunoResearch)，并且将混合物在37℃下加热一小时，之后第二个小时在室温下温和的摇动。将Dynabead MyOne链霉抗生物素蛋白T1珠(Invitrogen)加入样本并在室温下温和摇动培养至少30分钟。样本盘接着用200μL PBS+0.05％Tween 20、200μL PBS、和HPLC等级水清洗。用55μL之2％甲酸(v/v)洗脱经结合之ADC。每个样本取五十微升等分试样转移至新盘，然后加入另外5μL的200mM TCEP。
以Xevo G2 QTof质谱仪连接Nano Acquity(waters)和BEH300 C4,1.7μm，0.3×100mm管柱(Waters)，使用Masslynx v4.1版作为收集软件，执行完整蛋白质分析。管柱温度设定为85℃。移动相A由0.1％TFA(TFA)在水中组成。移动相B由TFA在乙腈：1-丙醇(1:1,v/v)中组成。层析分离系在流速18μL/min下，使用移动相B在7分钟内从5至90％之线性梯度达成。用Biopharmalynx版本1.33(Waters)实施包括去卷积的数据分析。结果显示于表32。结果指示，与绞链(常规)缀合物ADC#T1相比，在334位点的微管溶素缀合物(ADC#T3)具改善的体内稳定性。
表32:ADC的体内稳定性(DAR测定)
实例 0h施用后DAR％ 72h施用后DAR％ 72h剩余DAR％
ADC#T1 3.8 0.6 16％
ADC#T3 1.8 1.7 95％
E.体内N87肿瘤异种移植模型：
抗体-药物缀合物之体内疗效试验利用使用N87细胞系之目标表达性异种移植模型实施。在疗效试验中，将50％基质胶中750万个肿瘤细胞经皮下植入6至8周龄裸鼠中，直到肿瘤大小到达介于250至350mm。通过推注尾静脉注射进行投药。根据肿瘤对治疗的反应，对动物注射1至10mg/mL抗体药物缀合物，每四天一次共治疗四次。每周测量所有实验动物之体重变化。前50天，每周用测径器测量肿瘤体积两次，之后每周测量一次，并且用以下公式计算：肿瘤体积5＝(长度×宽度)/2。动物在肿瘤体积到达2500mm之前被人道处死。在第一周治疗后，观察到肿瘤大小减少。治疗终止后，可持续监测动物的肿瘤再生长。测试ADC#T1和#T3在N87小鼠异种移植体内筛选模型中之结果显示在图32。结果说明，LP#3与首选位点如K334C的连接可导致改善体内疗效。与ADC#T1(常规绞链缀合物)相比，改善疗效可能是改善ADC#T3(334C缀合物)的ADC稳定性的结果。值得注意的是，尽管事实上ADC#T3之DAR为ADC#T1的一半，但ADC#T3的疗效显著大于ADC#T1。
实例23：使用抗EDB抗体之位点特异性ADC
在这个实例中，基于抗EDB抗体之ADC的疗效与PK曲线系经研究。例示性抗EDB抗体L19之序列，系显示于表33。本实例中提供的数据也包括其中导入某些突变(其不影响L19的结合亲和性)的L19突变体。这些突变体的CDR序列与L19的完全相同。举例来说，EDB-(H16-K222R)是用来进行基于转谷氨酰胺酶的ADC缀合的L19突变体。这些ADC与总体来说以EDB为目标的ADC之额外细节，系于2016年10月17日申请之美国临时专利申请案62/409,081中详细叙述，并且全文以引用方式并入本文中。
表33:抗EDB抗体的序列
23.1.EDB ADC的体外结合
为了评估抗EDB抗体和ADC与EDB的相对结合，将0.5或1μg/ml于PBS中的人7-EDB-89涂布至MaxiSorp 96孔盘中并在4℃下温和摇动培养过夜。然后将盘倒空，用200μlPBS清洗，并在室温下用100μl封闭液(Blocking Buffer)(ThermoScientific)封闭3小时。移除封闭液，用PBS清洗孔，并与100μl以ELISA检定缓冲液(EAB；0.5％BSA/0.02％Tween-20/PBS)连续稀释(4倍)的抗EDB抗体或ADC一起培养。将盘的第一行空出，并将盘的最后一行填充EAB作为空白对照组。使该孔盘于室温下培养3小时。移除试剂并用200μl于PBS中之0.03％Tween-20(PBST)清洗盘。将以EAB稀释5000倍的抗人IgG-Fc-HRP(Thermo/Pierce)100μl加到孔中并在室温下培养15分钟。该孔盘用200μl PBST清洗，然后加入100μl BioFX TMB(Fisher)，允许颜色在室温下显色4分钟。该反应用100μl的0.2N硫酸终止，并用Victor孔盘读取仪(Perkin Elmer,Waltham,MA)读取450nm处的吸光度。
表34提供抗EDB抗体和ADC与人7-EDB-89蛋白质片段(以ELISA格式结合至96孔盘)的相对结合。以EDB为目标的所有抗体和ADC，皆以在19pM至58pM之范围内的类似亲和性结合至目标蛋白。相对地，非以EDB为目标的抗体和ADC具有&gt;10,000pM之高EC50值。
表34.抗EDB抗体和结合至人EDB的ADC
平均EC50±标准差和测定数(n)。ND＝未测定。
23.2抗EDB ADC的体外细胞毒性
细胞培养。WI38-VA13是获自ATCC之经SV40转形的人类肺纤维母细胞，并维持在补充有10％FBS、1％MEM非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、100单位/ml青霉素-链霉素、和2mMGlutaMax的MEM Eagles培养基(Cell-Gro)中。HT29衍生自人结直肠癌(ATCC)并维持在补充有10％FBS和1％谷氨酰胺的DMEM培养基中。
EDB+FN转录物检测。为了进行EDB+FN的基因表达与转录物分析，用TrypLEExpress(Gibco)从细胞培养瓶解离吸附增生的WI38-VA13和HT29细胞。使用RNeasy Mini试剂组(Qiagen)自该收集的细胞沉淀物纯化总RNA。在RNA纯化期间，残余的DNA以RNase-FreeDNase Set(Qiagen)移除。使用高容量的RNA-to-cDNA试剂组(Applied Biosystems)将总RNA逆转录成cDNA。使用具UNG之TaqMan Universal Master Mix II(AppliedBiosystems)，以定量实时PCR分析cDNA。EDB+FN1信号系通过TaqMan引物Hs01565271_m1检测，并用来自ACTB(TaqMan引物Hs99999903_m1)和GAPDH(TaqMan引物Hs99999905_m1)两者信号的平均值标准化。所有引物来自ThermoFisher Scientific。显示来自代表性实验的数据。
通过蛋白印迹法检测EDB+FN蛋白质。为了以蛋白印迹法检测EDB+FN，通过细胞刮取收集吸附增生的WI38-VA13和HT29细胞。在具蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂的细胞溶解缓冲液(Cell Signaling Technology)中制备细胞溶解物。在具蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂的RIPA溶解缓冲液或2X细胞溶解缓冲液(Cell Signaling Technology)中制备肿瘤溶解物。蛋白质溶解物以SDS-PAGE分析，然后以蛋白印迹法分析。将蛋白质转移至硝化纤维素膜，然后以5％牛乳/TBS封闭，随后与EDB-L19抗体和抗GAPDH抗体(Cell SignalingTechnology)在4℃下培养过夜。清洗过后，将抗EDB印迹与ECL HRP连接抗人IgG二级抗体(GE Healthcare)在室温下培养1小时。清洗后，EDB+FN信号以Pierce ECL 2蛋白印迹法底物(Thermo Scientific)显色并用X射线胶卷检测。抗GAPDH印迹与缀合有Alexa Fluor 680的抗兔IgG二级抗体(Invitrogen)于封闭液中在室温下培养1小时。清洗后，以LI-COROdyssey影像系统检测该GAPDH信号。使用Bio-Rad GS-800 Calibrated ImagingDensitometer进行EDB蛋白印迹的密度测定分析，并且使用Quantity One版本4.6.9的软件定量。显示来自代表性实验的数据。
图33显示在WI38-VA13和HT29细胞中以蛋白印迹分析EDB+FN1的表达。当于体外生长时，EDB+FN于WI38-VA13细胞系中表达，但不在HT29结肠癌细胞系中表达。
通过流动式细胞测量术检测EDB+FN蛋白质。EDB-L19抗体被使用来通过流动式细胞测量术测量WI38-VA13或HT29细胞的细胞表面上之EDB+FN表达。细胞通过非酵素细胞解离缓冲液(Gibco)解离，并在冰上以冷流动式缓冲液(FB,3％BSA/PBS+Ca+Mg)培养以封闭。该细胞然后与一级抗体在冰上于FB中培养。培养后，以冷PBS-Ca-Mg清洗细胞，然后以存活性染色(Biosciences)培养来区别生存细胞与死亡细胞(根据制造商程序)。信号以BDFortessa流式细胞仪分析并且使用BD FACS DIVA软件分析数据。显示来自代表性实验的数据。
表35总结蛋白印迹、qRT-PCR和流动式细胞测量术的结果。数据证明WI38-VA13是EDB+FN阳性，HT29是EDB+FN阴性。
表35.WI38 VA13和HT29细胞中EDB+FN表达的表征
体外细胞毒性试验。增生的WI38-VA13或HT29细胞系使用非酵素细胞解离缓冲液自培养瓶中收集，并且以1000细胞/孔的96孔盘(Corning)在加湿室(37℃,5％CO2)中培养过夜。隔天，将细胞用抗EDB ADC或同型物对照组非EDB结合性ADC处理，方法为加入10个浓度的50μl的3X原液两次(in duplicate)。在一些实验中，细胞以1500细胞/孔接种并且在同一天处理。然后将细胞与抗EDB ADC或同型物对照组非EDB结合性ADC培养四天。收集当天，将50μl的Cell Titer Glo(Promega)加入细胞并在室温下培养0.5小时。发光系于Victor孔盘读取仪(Perkin Elmer,Waltham,MA)上测量。相对细胞存活性系测定为未处理对照孔之百分比。IC50数值系使用采用XLfit v4.2(IDBS)之四参数对数模型#203计算。
表36显示在WI38-VA13(EDB+FN阳性肿瘤细胞系)与HT29结肠癌细胞(EDB+FN阴性肿瘤细胞系)上实施之细胞毒性检定中，抗EDB ADC处理之IC50(抗体的ng/ml)。抗EDB ADC在EDB+FN表达性细胞系中诱导细胞死亡。所有具vc-0101连接子-载荷物的抗EDB ADC有类似的IC50值，范围约从184ng/ml到216ng/ml(EDB-L19-vc-0101、EDB-(κK183C-K290C)-vc-0101、EDB-mut1-vc-0101、EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101)。阴性对照组vc-0101ADC的效力实质上较低，其IC50值比抗EDB-vc-0101ADC高约70至200倍。所有vc-0101ADC在EDB+FN阴性肿瘤细胞系HT29中，具有更高(46至83倍)的IC50值。因此，抗EDB ADC的体外的细胞毒性系依赖EDB+FN的表达。
其它具有“vc”蛋白酶可切割连接子之基于耳抑素的抗EDB ADC(EDB-L19-vc-9411和EDB-L19-vc-1569)在WA38-VA13细胞中也显示有效的细胞毒性，与相对应的阴性对照组ADC相比，具有约50至180倍的高选择性；以及与非表达性细胞系相比，约25至140倍的选择性。EDB-L19-diS-DM1 ADC与vc-0101 ADC具类似的效力，然而，与阴性对照组ADC(约3倍)和HT29细胞(约0.9倍)相比，具有远远较低的选择性。
表36.抗EDB ADC和对照非EDB结合的ADC的体外细胞毒性
平均IC50±标准差和测定数(n)。ND＝未测定。
23.3：位点特异性EDB ADC的体内疗效
抗EDB ADC系于细胞系异种移植(CLX)、病患衍生异种移植(PDX)和同基因型肿瘤模型中评估。使用如本文先前所述之免疫组织化学(IHC)检定，检测EDB+FN的表达。
为制备CLX模型，将8×106至10×106个H-1975、HT29、或Ramos肿瘤系细胞经皮下植入雌性无胸腺裸小鼠中。将用来接种的Ramos和H-1975细胞分别悬浮在50％和100％基质胶(BD Biosciences)中。对于Ramos模型，在细胞接种之前，动物接受全身照射(4Gy)以促进肿瘤的建立。当平均肿瘤体积到达约160至320mm3时，将动物随机分入治疗组，每组8至10只小鼠。ADC或载剂(PBS)在第0天静脉施用动物，然后每4天投药一次，共4至8次剂量。每周测量肿瘤一次或两次并按体积(mm3)＝(宽度×宽度×长度)/2计算肿瘤体积。监测动物体重4至9周，在任何治疗组中没有观察到动物体重减轻。
为制备PDX模型，从供体动物收集肿瘤并将约3×3mm肿瘤片段，使用10针规套管针皮下植入雌性无胸腺裸小鼠(PDX-NSX-11122模型)或NOD SCID小鼠(PDX-PAX-13565和PDX-PAX-12534模型)侧腹。当平均肿瘤体积到达约160至260mm3时，将小暑随机分入治疗组，每组7至10只小鼠。ADC或载剂(PBS)投药方案与施用途径及肿瘤测量程序与前述CLX模型相同。监测动物体重5至14周，在任何治疗组中没有观察到动物体重减轻。肿瘤生长抑制以平均肿瘤大小±SEM作图。
EDB+FN之表达。如表37所示，EDB+FN在H-1975、HT29和Ramos之CLX模型、PDX-NSX-11122、PDX-PAX-13565和PDX-PAX-12534之PDX模型和EMT-6同基因型肿瘤模型中的表达，系于IHC检定中经由EDB-L19抗体的结合及随后检测来测量。CLX HT-29是中度表达性CLX，然而当于体外检测时为阴性，因为在CLX中之蛋白质的表达主要衍生自肿瘤基质。
表37.EDB+FN的表达
疗效模型 肿瘤类型 EDB+FN整体表达
PDX-NSX-11122 NSCLC PDX 高
EMT-6 同系小鼠乳腺癌(乳房) 高
PDX-PAX-13565 胰腺癌PDX 中度/高
H-1975 NSCLC CLX 中度/高
HT29 结直肠癌CLX 中度
Ramos Burkitt’s淋巴瘤CLX 中度
PDX-PAX-12534 胰腺癌PDX 低/中度
PDX-NSX-11122 NSCLC PDX。各种ADC的效应系于PDX-NSX-11122(表达高度EDB+FN之人类癌症NSCLC PDX模型)中评估。图34A显示EDB-L19-vc-0101(ADC1)在0.3、0.75、1.5和3mg/kg下的抗肿瘤活性。数据证明EDB-L19-vc-0101(ADC1)以剂量依赖方式在3mg/kg和1.5mg/kg下显示肿瘤缓解。
比较vc连接ADC与双硫键连接ADC的抗肿瘤疗效。图34B和34C分别显示3mg/kg的EDB-L19-vc-0101(ADC1)与10mg/kg的双硫键连接EDB-L19-diS-DM1(ADC5)抗肿瘤活性的比较，以及1和3mg/kg的EDB-L19-vc-0101(ADC1)与5mg/kg的双硫键连接EDB-L19-diS-C2OCO-1569(ADC6)抗肿瘤活性的比较。如图34B和34C所示，与同型阴性对照组ADC及使用双硫键连接子制备的ADC(即EDB-L19-diS-DM1与EDB-L19-dis-C2OCO-1569)相比，EDB-L19-vc-0101(ADC1)证明有更大的疗效。另外，荷瘤动物以EDB-L19-vc-0101(ADC1)治疗，在1mg/kg下可延缓肿瘤生长，在3mg/kg下可完全缓解肿瘤。数据证明EDB-L19-vc-0101(ADC1)以剂量依赖方式抑制PDX-NSX-11122 NSCLC异种移植物之生长。
评估位点特异性与常规缀合的ADC的活性。图34D显示位点特异性缀合EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101(ADC2)与常规缀合EDB-L19-vc-0101(ADC1)分别在剂量0.3、1、和3mg/kg以及剂量1.5mg/kg下的抗肿瘤疗效比较。基于剂量水平的疗效是可相比的，且EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101(ADC2)以剂量依赖方式导致肿瘤缓解。
评估具有各种突变之vc-0101抗EDB ADC的活性。图34E显示位点特异性缀合EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)在剂量0.3、1和3mg/kg下的抗肿瘤疗效。EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)在1和3mg/kg下诱导肿瘤缓解。图34F显示在图34E中投药3mg/kg的EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)组之10只个别荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制曲线。在研究结束时(95天)，3mg/kg组中的10只小鼠有8只小鼠(80％)的肿瘤完全与持久性缓解。
H-1975 NSCLC CLX。各种vc连接耳抑素和CPI的ADC的效应系于H-1975(中度至高度EDB+FN表达性人类癌症NSCLC CLX模型)中评估。图35A显示所评估之EDB-L19-vc-0101(ADC1)在0.3、0.75、1.5和3mg/mg下的抗肿瘤活性。数据证明EDB-L19-vc-0101(ADC1)以剂量依赖方式在3mg/kg及低至1.5mg/kg下显示肿瘤缓解。图35B显示EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-L19-vc-1569(ADC10)在0.3、1和3mg/kg下之抗肿瘤活性评估。数据证明EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-L19-vc-1569(ADC10)以剂量依赖方式显示肿瘤缓解。
比较vc连接耳抑素ADC与CPI ADC的抗肿瘤活性。如图35C所示，EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI(ADC9)分别在0.5、1.5和3mg/kg以及0.1、0.3和1mg/kg下评估。EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI(ADC9)皆在所评估最高剂量下显示肿瘤缓解。
评估位点特异性与常规缀合的抗EDB ADC的活性。图35D显示位点特异性缀合EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101(ADC2)与常规缀合EDB-L19-vc-0101(ADC1)在剂量0.5、1.5、和3mg/kg下的抗肿瘤疗效比较。基于剂量水平的疗效是可相比的，且EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101(ADC2)以剂量依赖方式导致肿瘤缓解。
评估具有各种突变之vc-0101抗EDB ADC的活性。图35E显示EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-mut1-vc-0101(ADC3)在1和3mg/kg下的抗肿瘤疗效。图35F显示位点特异性EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101(ADC2)和EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)在1和3mg/kg下的抗肿瘤疗效。这4个ADC在H-1975模型中证明具有类似的疗效，不论它们是否包含κK183C-K290C突变。另外，所有测试ADC都导致强健的抗肿瘤疗效，包括在3mg/kg下的肿瘤缓解。这些数据证明κK183C-K290C突变之导入，不会负面地影响ADC的疗效。
HT29结肠CLX。各种vc连接耳抑素ADC的效应系于HT29(中度EDB+FN表达性人类癌症结肠CLX模型)中评估。如图36所示，EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-L19-vc-9411(ADC7)系测试在3mg/kg下之抗肿瘤活性。EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-L19-vc-9411(ADC7)两者皆在3mg/kg剂量下显示肿瘤随着时间缓解。
PDX-PAX-13565和PDX-PAX-12534胰脏PDX。EDB-L19-vc-0101(ADC1)的抗肿瘤疗效系于人类胰脏PDX模型中评估。如图37A所示，EDB-L19-vc-0101(ADC1)系以0.3、1和3mg/kg于PDX-PAX-13565(中度至高度EDB+FN表达性胰脏PDX)中评估。如图37B所示，EDB-L19-vc0101(ADC1)系以0.3、1和3mg/kg于PDX-PAX-12534(低度至中度EDB+FN表达性胰脏PDX)中评估。EDB-L19-vc-0101(ADC1)在两个胰脏PDX模型评估中皆依剂量依赖方式证明肿瘤缓解。
Ramos淋巴癌CLX。EDB-L19-vc-0101(ADC1)的抗肿瘤疗效系于Ramos(中度EDB+FN表达性淋巴瘤CLX模型)中评估。EDB-L19-vc-0101(ADC1)系在1和3mg/kg下评估抗肿瘤活性。如图38所示，EDB-L19-vc-0101(ADC1)依剂量依赖方式在剂量3mg/kg下显示肿瘤缓解。
EMT-6乳房同基因型模型。EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)之抗肿瘤疗效系于EMT-6(在免疫活性背景下之小鼠同基因型乳癌模型)中评估。如图39A所示，EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)在4.5mg/kg下证明肿瘤生长抑制。肿瘤生长抑制系以十一只荷瘤动物中之平均肿瘤大小±SEM作图。图39B显示在投药4.5mg/kg的EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)组之11只个别荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制曲线。
在研究结束时(34天)，4.5mg/kg组中的11只小鼠有9只小鼠(82％)的肿瘤完全与持久性缓解。
23.4：位点特异性EDB ADC的药物动力学(PK)
常规缀合EDB-L19-vc-0101(ADC1)与位点特异性缀合EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)缀合的抗体药物缀合物的暴露，系分别在马来猴中以静脉(IV)推注剂量施用5或6mg/kg之后测定。使用配体结合检定(LBA)测量总抗体(总Ab；缀合mAb和未缀合mAb的测量值)、ADC(至少缀合一个药物分子的mAb)的浓度，并使用质谱仪测量经释放之载荷物0101的浓度。总Ab和ADC浓度的定量系通过配体结合检定(LBA)使用具荧光检测之工作站之达成。所使用的生物素化捕捉蛋白质为绵羊抗hIgG，且检测抗体系用于总抗体之Alexa Fluor 647山羊抗hIgG或用于ADC之Alexa Fluor 647抗0101 mAb(数据经Watson 7.4版LIMS系统处理)。使用蛋白质沉淀制备用于未缀合载荷物分析之体内样本，并且注射至使用正Turbo IonSpray电喷洒离子化(ESI)以及多反应监测(MRM)模式之ABSciex API5500(QTRAP)质谱仪上。743.6→188.0以及751.6→188.0的跃迁(transition)分别用于分析物与氘化内部标准物。数据收集与处理系以Analyst软件版本1.5.2(AppliedBiosystems/MDS Sciex,Canada)进行。
以EDB-L19-vc-0101 ADC(5mg/kg)与EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 ADC(6mg/kg)投药至马来猴之总Ab、ADC和经释放之载荷物的药物动力学系显示于表38。与常规缀合物相比，位点特异性缀合之EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 ADC的暴露显示出增加的暴露(以剂量标准化AUC测量为约2.3倍增加)与增加的缀合稳定性。缀合稳定性系通过将位点特异性缀合EDB-mut2(κK183C-K290C)-vc-0101 ADC与常规EDB-L19-vc-0101 ADC相比，而分别具有较高的ADC/Ab比(84％对75％)和较低的经释放载荷物暴露(剂量标准化AUC；0.0058对0.0082μg*h/mL)二者来评估。NA＝不适用。
表38.非人灵长类的药物动力学总结
23.5：位点特异性EDB ADC的毒性试验
在Wistar-Han大鼠与马来猴的探索性重复剂量(Q3Wx3)试验中，表征了常规的EDB-L19-vc-0101(ADC1)和位点特异性缀合的EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)的非临床安全性特性。大鼠和马来猴被视为适用于毒性评估的药学相关非临床物种，乃因其与人EDB+FN有100％蛋白质序列同源性，以及抗体EDB-L19(Ab1)和EDB-mut1(κK183C-K290C)(Ab4)对大鼠、人和猴子具有类似的结合亲和性(以Biacore检定，如实例2所示)。
在Wistar Han大鼠与马来猴中分别评估最高达10和5mg/kg/剂量的EDB-L19-vc-0101(ADC1)，并在马来猴中评估最高达12mg/kg/剂量的EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)。大鼠或猴子每三周(第1、22、和43天)静脉投药一次并且在第46天(第3次剂量后3天)被安乐死。评估动物的临床症状、体重变化、食物消耗、临床病理学参数、器官重量、和宏观与显微观察。在这些试验中，注意到动物并无死亡情形或临床状况的显著改变。
在大鼠和猴子中之EDB+FN表达性组织/器官中，没有目标依赖性毒性之迹象。在两个物种中，主要的毒性为可逆的骨髓抑制与相关的血液学变化。在猴子中，用常规缀合EDB-L19-vc-0101(ADC1)在5mg/kg/剂量下见到明显暂时的嗜中性粒细胞减少症，然而用位点特异性缀合EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)在6mg/kg/剂量下只见到对嗜中性粒细胞计数之最小影响，如表39和图40所示。点代表平均值，误差杠代表与平均值±1个标准偏差(SD)。
数据证明位点特异性缀合显著缓解骨髓抑制。EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)的毒性特性和这些缀合物的目标非依赖性效应一致，并且EDB-L19-vc-0101(ADC1)与EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)之最高非严重毒性剂量(HNSTD)分别测定为≥5mg/kg/剂量和≥12mg/kg/剂量。
表39.研究期间食蟹猴绝对嗜中性粒细胞计数
实例24：具有以肿瘤抗原为目标的抗体之位点特异性ADC
24.1.制备位点特异性ADC缀合物
24.1.1制备双cyc突变体(κK183C+K290C)。
为了证实双cys突变体κK183C+K290C所媒介的位点特异性药物缀合，赋予与常规抗体药物缀合物相比显著的效益，研究另一个针对肿瘤相关抗原的抗体，称为抗体X(以下简称X)。抗体X系从其小鼠亲代抗体人化而来。为了制备具耳抑素0101之位点特异性抗体药物缀合物，我们制备了在κ轻链上具κK183C突变与在hIgG1重链恒定区上具K290C突变的X-hIgG1/kappa。抗体X和其双cys突变体版本X(κK183C+K290C)的两个蛋白质制品系经制备，并在竞争ELISA中评估它们与目标抗原的相对结合活性。在此检定中，抗体X与cys突变体X(κK183C+K290C)皆被测试它们与它们的共同亲代抗体竞争与固定在ELISA盘上之目标抗原结合之能力。如图41所示，抗体X和X(κK183C+K290C)具有相等的与目标抗原竞争结合之活性，表示在重链与轻链恒定区之cys突变不会影响抗体对目标抗原的结合活性。
方法
竞争性ELISA。96孔盘(高度结合CoStar盘)系经目标抗原Fc融合蛋白涂布。经封闭液(1％牛血清白蛋白于PBST中)1至3连续稀释抗体X和cys突变体X(κK183C+K290C)溶液，系于恒定浓度的生物素化亲代抗体存在下加入盘。在培养2小时后，清洗孔盘并加入以封闭液稀释5000倍之经HRP缀合之链霉抗生物素蛋白(Southern Biotech)。允许与链霉抗生物素蛋白培养40分钟，之后以TMB溶液显色10分钟。显色反应以添加0.18M H2SO4停止，并测量450nM之吸光度。数据作图及分析系利用Microsoft Excel及Graphpad-Prism软件进行。
24.1.2 制备X-vc0101和X(κK183C+K290C)-vc0101缀合物
24.1.2.1 制备常规ADC(X-vc0101)
通过三(2-羧基乙基)膦(TCEP)部分还原抗体X，接着使经还原的半胱氨酸残基与顺丁烯二酰亚胺官能化连接子-载荷物vc0101反应来制备常规的ADC。具体而言，抗体经由添加2.2倍摩尔过量之TCEP于100mM HEPES缓冲液pH 7.0及1mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)于37℃下部分还原2小时。该vc0101接着被添加至反应混合物，连接子-载荷物/抗体之比系7：1，并在15％v/v之二甲基乙酰胺(DMA)存在下在25℃下再反应1小时。N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)被添加以封端未反应之硫醇，接着加入L-半胱氨酸以淬熄任何未反应之连接子-载荷物。该反应混和物在4℃下在PBS(pH 7.4)中透析过夜，并用粒径排阻层析法(SEC；AKTAavant，Superdex200树脂)纯化。纯化的ADC经缓冲交换至20mM组氨酸、85mg/mL蔗糖pH5.8中并储存在-70℃下。ADC经由分析SEC表征以求纯度；经由HIC和LC-ESI MS计算药物-抗体比(DAR)。蛋白浓度系经由UV分光光度计测定。
24.1.2.2 制备位点特异性ADC X(κK183C+K290C)-vc0101
工程化的双cys突变体X(κK183C+K290C)系经12倍摩尔过量之TCEP于100mM HEPES缓冲液pH7.0及1mM DTPA中在37℃下完全还原6小时，接着除盐以移除过量TCEP。该经还原之抗体于2mM去氢抗坏血酸(DHA)中在4℃下培养16小时以重新形成链间双硫键。在除盐后，以连接子-载荷物/抗体摩尔比10：1加入顺丁烯二酰亚胺官能化连接子-载荷物vc0101，并在15％v/v之二甲基乙酰胺(DMA)存在下在25℃下再反应2小时。反应混合物经由疏水性交互作用层析法(HIC，AKTA avant，丁基HP树脂)除盐与纯化。纯化的ADC经缓冲交换至20mM组氨酸、85mg/mL蔗糖pH5.8中并储存在-70℃下。ADC经由SEC表征以求纯度；经由HIC、逆相UPLC和LC-ESI MS计算DAR。蛋白浓度系经由UV分光光度计测定。
24.1.2.3ADC药物分布
制备用于HIC分析之化合物，其系将样本用PBS稀释至大约1mg/ml。通过将15μl之样本自动注射至具有TSK-GEL丁基NPR管柱(4.6×3.5mm，2.5μm孔径大小；TosohBiosciences部件#14947)之Agilent 1200HPLC上来进行分析。该系统包括具有恒温器之自动取样器、管柱加热器及UV检测器。梯度方法的使用如下：移动相A：1.5M硫酸铵、50mM磷酸氢二钾(pH7)；移动相B：20％异丙基醇、50mM磷酸氢二钾(pH 7)；T＝0min.100％A；T＝12min.0％A。
药物分布特性显示于表40。虽然两个ADC显示类似的平均DAR，但是使用位点特异性缀合之ADC(X(KK183C+K290C)-vc0101)主要显示一个尖峰(94％是4DAR)，而使用常规缀合之ADC(X-vc0101)显示不同装载缀合物之混合物(51％是4DAR)。这种均质的药物分布特性是位点特异性ADC相较于常规ADC的主要优点。
表40:ADC的药物分布(HIC分析)
ADC 平均DAR 0DAR 2DAR 3DAR 4DAR 6DAR 8DAR
X-vc0101 3.8 2％ 26％ 0％ 51％ 19％ 2％
X(<sub>K</sub>K183C+K290C)-vc0101 3.9 0％ 0％ 6.3％ 93.7％ 0％ 0％
24.2. J145 ADC作为单一药剂在Calu-6人类非小细胞肺癌细胞系异种移植模型中的评估
对荷瘤动物施用3mg/kg的ADC X-vc0101(常规缀合物)与ADC X(κK183C+K290C)-vc0101，在第15天最后一剂候选药物之后两组皆导致肿瘤缓解，平均肿瘤体积分别为60mm3和53mm3。在试验第26天，载剂组被安乐死时，两个治疗组均显示一致的肿瘤缓解。从第47天至第58天，常规缀合物组中的五只动物有两只脱离治疗效果并且描述为生长迅速，然而X(κK183C+K290C)-vc0101一致地显示肿瘤缓解。在第58天，常规缀合物和ADC X(κK183C+K290C)-vc0101的平均肿瘤体积分别为825mm3和23mm3。(表41和图42)
到试验第61天，常规ADC组基于肿瘤体积超过3520mm3处死而失去一只动物。X(κK183C+K290C)-vc0101组显示一致的肿瘤缓解直到第82天，随后显示肿瘤再生长，到试验结束时所存在的最大质量为试验第111天的1881mm3。(表41和图42)
ADC X(κK183C+K290C)-vc0101在3mg/kgQ4DX4之投药方案下，对Calu-6人类NSCLCCDX模型显示一致的抗肿瘤效果直到试验第82天。在试验初期时间点，ADC X-vc0101显示可相比的肿瘤细胞杀灭，然而在试验期间到第47天肿瘤脱离治疗效果并且大小迅速增加。
结论是ADC X(κK183C+K290C)-vc0101在Calu-6人类NSCLC CDX模型中具有较好的抗肿瘤活性，有较多动物存活直到第111天。
表41:ADC或载剂对照治疗的单个鼠的肿瘤体积
(111天治疗组每个组动物中(n＝5)单个肿瘤体积用mm3表示；Ave:平均)
方法
肿瘤异种移植开始于七只5至8周龄雌性无胸腺裸小鼠世代，每只小鼠右侧腹皮下注射0.1毫升体积之5×106Calu-6(ATCC,Cat#HTB-56)人类肺肿瘤细胞，其悬浮在由含10％胎牛血清(HyClone#SH30088.03HI)之Eagle’s Minimum Essential Medium(ATCC,Cat#30-2003)培养基制成之50％基质胶(BD Biosciences,Cat#356234)中。当平均肿瘤大小达100至150mm3时开始测试物品的投药，其中按(mm3)＝(a×b2/2)计算肿瘤体积，其中“b”是最小直径，“a”是最大直径。肿瘤体积与体重数据每周收集两次。第一次投药后30小时与最后一次(第四次)投药后30小时，自每组两只小鼠收集血液样本(各10μl)。将血液稀释到190μLHBS-EP缓冲液中并立即储存在-80℃下。自收集血液的相同动物中，于最后一次(第四次)投药后30小时以尸检收集肿瘤团块并快速冷冻。
将ADC X(κK183C+K290C)-vc0101以6mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、和0.3mg/kg的剂量，依照Q4D×4投药计划(每四天施用一次共四次)静脉施用至荷瘤动物。
将ADC X-vc0101(常规缀合物)以3mg/kg的剂量，依照Q4D×4投药计划(每四天施用一次共四次)静脉施用至荷瘤动物。
24.3.药物动力学试验。
X-vc0101及X(κK183C+K290C)-vc0101在相同剂量水平6mg/kg下，显示可相比的PK/TK特性，包括Cmax、暴露(AUC)和半衰期(t1/2)(表42)。X-vc0101和X(κK183C+K290C)-vc0101两者在6mg/kg下，以及X(κK183C+K290C)-vc0101在额外更高剂量9和12mg/kg下当暴露到达高得多的水平时，都观察到类似的总Ab与ADC之暴露水平(即AUC)。这表示在动物中投药的两种ADC化合物于整个实验期间保持大部分完整，且两种化合物在体内具类似的稳定性。
表42:IV施用后，猴子中X-vc0101和X(κK183C+K290C)-vc0101总抗体和ADC的平均药物动力学参数
C最大＝最大药物浓度；T最大＝至C最大的时间,AUC＝浓度-时间曲线下面积；t1/2＝半衰期；AUC从0-504小时计算
方法
在IV推注施用6mg/kg的X-vc0101或6、9和12mg/kg的X(κK183C+K290C)-vc0101)至马来猴之后，测定常规(X-vc0101)或位点特异性(X(κK183C+K290C)-vc0101)抗体药物缀合物(ADC)的暴露。血浆样本系在投药前、在IV施用各剂量后0.25、6、24、72、168、336和504小时收集。使用配体结合检定(LBA)测定总抗体(总Ab；缀合mAb和未缀合mAb的测量值)和ADC(至少缀合一个药物分子的mAb)的浓度。各剂量的药物动力学(PK)/毒物动力学(TK)参数系自X-vc0101和X(κK183C+K290C)-vc0101两者之总Ab及ADC之浓度对时间曲线计算(表42)。
24.4.毒性试验
在两个独立探索毒性试验中，雄性与雌性马来猴系经每三周一次IV投药(试验第1、22、和43天)。在试验的第46天(第3次施用剂量后3天)，将动物安乐死并按指定规程收集血液与组织样本。在生存中和尸检后进行临床观察、临床病理学、宏观与微观病理学评估。对于解剖病理学的评估，以主观、相对、研究特定之基础，记录组织病理学发现的严重性。
在这些试验之一中，以6mg/kg/剂量的载剂或X-hIgG1-vc0101施用马来猴(2只/性别/组)。在另一试验中，以6、9、和12mg/kg/剂量的载剂或X(κK183C+K290C)-vc0101施用猴子(1只/性别/组)。施用6mg/kg/剂量的X-hIgG1-vc0101的一只雄性和一只雌性猴子在试验第11天被选择性地安乐死，因临床症状与临床病理学数据表明严重发热性嗜中性粒细胞减少症。相比之下，在观察到类似暴露的相同剂量水平下(见先前部分)，所有施用X(κK183C+K290C)-vc0101的马来猴存活直到试验第46天进行排定尸检。在6mg/kg剂量下的骨髓显微结果中，所有施用X-hIgG1-vc0101的马来猴(总共4只)具有化合物相关之最小至中度全细胞类型(骨髓球系细胞和红血球系细胞)之细胞数减少；然而在施用X(κK183C+K290C)-vc0101的马来猴(总共2只)的骨髓中没有显微结果。在观察到高得多的暴露水平之9和12mg/kg较高剂量下，仅在施用9mg/kg/剂量的X(κK183C+K290C)-vc0101的马来猴(总共2只)骨髓中发现最小至轻度之骨髓球系细胞/红血球系细胞(M/E)比增加，此主要系因成熟嗜中性细胞数增加与红血球系细胞谱系之细胞数减少；但在施用12mg/kg/剂量的X(κK183C+K290C)-vc0101的猴子(总共2只)中则无。
表43：死亡率和骨髓中显微结果
因此，死亡率与显微数据显示，基于位点特异性突变技术的ADC缀合物X(κK183C+K290C)-vc0101明显改善X-hIgG1-vc0101诱导的骨髓毒性与嗜中性粒细胞减少症。
实例25：具抗体1.1之位点特异性ADC
25.1.制备用于位点特异性缀合之抗体1.1
制备用于经由反应性半胱氨酸残基之位点特异性缀合的1.1抗体之方法，大致系如PCT公开案WO2013/093809所述实施。将κ轻链恒定区上的一个残基(使用卡巴编号方案的K183)与IgG1重链恒定区上的一个残基(使用卡巴之EU指数的K290)以定点突变改变为半胱氨酸(C)残基。
25.2.生产稳定转染细胞以表达Her2-PT经工程化半胱氨酸变异体抗体
为生产用于缀合试验的1.1-κK183C-K290C，CHO细胞系经编码1.1-κK183C-K290C之DNA转染，并且使用该领域广为周知之标准程序分离稳定高生产池。使用三管柱方法，即蛋白质A亲和性捕捉、然后TMAE管柱及接着CHA-TI管柱，自经浓缩CHO池起始材料中分离1.1-κK183C-K290C。使用这些纯化方法，1.1-κK183C-K290C制剂含有如分析性粒径排阻层析所测得之98.6％关注峰(POI)(表44)。表44结果显示在1.1-κK183C+K290C自蛋白质A树脂洗脱后，检测到可接受水平的高分子质量物种(HMMS)，而且这种非所欲之HMMS物种可使用TMAE与CHA-TI层析法移除。该数据亦证明人类IgG1恒定区中之蛋白质A结合位点，并未受到在位置290(EU指数编号)之工程化的半胱氨酸残基的存在而改变。
表44:1.1-κK183C-K290抗体的生产总结
25.3.抗体1.1之位点特异性缀合
顺丁烯二酰亚胺官能化连接子-载荷物与1.1-κK183C-K290C之缀合，系通过以15倍摩尔过量之三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)于100mM之HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液)pH7.0及1mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)中于37℃完全还原抗体6小时，接着除盐以移除多余的TCEP而达成。该经还原之1.1-κK183C-K290C抗体于1.5mM去氢抗坏血酸(DHA)、100mM HEPES pH 7.0及1mM DTPA中在4℃下培养16小时以重新形成链间双硫键。所欲之连接子-载荷物被添加至该反应混合物，该连接子-载荷物/抗体之摩尔比为7，在15％v/v之二甲基乙酰胺(DMA)存在下在25℃下再反应1小时。经过1小时之培养期后，6倍过量之L-Cys被添加以淬熄任何未反应之连接子-载荷物。该反应混合物经由疏水性交互作用层析法(HIC)，使用丁基琼脂糖HP管柱(GE Lifesciences)纯化。该方法利用1M KPO4、50mM TrispH7.0来结合，并以50mM Tris,pH 7.0经10CV洗脱ADC。进一步表征该ADC，经由粒径排阻层析法(SEC)分析纯度，以疏水交互作用层析法(HIC)及液体层析电喷洒离子化串联质谱(LC-ESI MS)或逆相层析法(RP)计算药物-抗体比(装载量或DAR)。ADC与它们个别的抗体比较可通过计算相对滞留时间(RRT)进行，该相对滞留时间即是ADC之HIC滞留时间除以个别抗体之HIC滞留时间的比例。蛋白浓度系经由UV分光光度计测定。表45结果显示，1.1-κK183C-K290C经工程化半胱氨酸抗体有效地缀合顺丁烯二酰亚胺官能化连接子-载荷物vc0101，产生均质之ADC，具有预测与期望数量的载荷物(即DAR 3.9)。
表45:1.1-KK183C+K290C-vc0101位点特异性缀合物的性质
25.4. 1.1-κK183C-K290C抗体和1.1-κK183C-K290C-vc0101 ADC的生物分析表征
25.4.1 热稳定性
示差扫描量热仪(DCS)系用于测定1.1-κK183C-K290C抗体及对应Aur-06380101位点特异性缀合物之热稳定性。在此分析中，以20mM组氨酸pH 5.8、8.5％蔗糖、0.05mg/mlEDTA调制之样本系经分配至具有自动取样器之Micr℃al VP毛细管DSC的试样盘(GEHealthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)中，在10℃下平衡5分钟，接着以每小时100℃的速率扫描至最高110℃。选择16秒之过滤期。原始数据系经基准校正，该蛋白质浓度系经标准化。Origin软件7.0(OriginLab Corporation,Northampton,MA)被用于适配该数据至具有适当数量之转换(transition)之MN2-State模型。
1.1-κK183C-K290C抗体展现优异的热稳定性，其第一熔融转变(Tm1)为72.78℃，且所生成之1.1-κK183C-K290C-vc0101位点特异性缀合物(SSC)显示良好及可相比的稳定性，本文中所述之T-κK183C-K290C-vc0101和EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc0101SSC两者经测定之第一熔融转变(Tm1)皆&gt;65℃(表46)。一并考虑这些结果证明，工程化的半胱氨酸1.1-(κK183C-K94R-K290C)抗体为热稳定的，且经由vc连接子位点特异性缀合0101产生具有良好热稳定性之缀合物。
表46:1.1-κK183C-K290C抗体和对应位点特异性耳抑素0101缀合物的热稳定性
抗体或ADC Tm1(℃) Tm2(℃) Tm3(℃) 表观Fab Tm(℃)
1.1-κK183C-K290C 72.78±0.09 83.02±0.64 85.60±0.21 84.9
1.1-κK183C-K290C-vc0101 65.40±0.17 82.04±0.75 85.09±0.15 84.5
25.4.2 1.1-κK183C-K290C抗体及对应之位点特异性耳抑素0101缀合物之完整性
实施非还原性Caliper毛细管胶体电泳(Caliper LabChip GXII:Perkin ElmerWaltham,MA)分析以测定1.1-κK183C-K290C抗体和对应之vc0101位点特异性缀合物的纯度与完整性。结果显示半胱氨酸工程化之1.1-κK183C-K290C抗体展现良好的完整性，％IgG为&gt;96％，且类似的位点特异性缀合物制剂含有&lt;8％的断裂ADC。1.1-κK183C-K290C-vc0101位点特异性缀合物之完整性高于使用替代方法(即粒径排阻层析法对疏水性交互作用层析法)纯化之EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc0101观察到的完整性，并且相对于使用常规缀合方法制备的ADC(即EDB-L19-vc-0101)有显著改善(如表47所示)。这些结果支持，经由分别在IgG1和κ恒定区上之工程化的半胱氨酸K290C和K183C的位点特异性缀合所产出之ADC，与使用抗体恒定区内之内源性半胱氨酸之常规缀合方法所制备者相比，具有显著改善之完整性。
表47:1.1-κK183C-K290C抗体和位点特异性vc0101缀合物的的完整性
ND＝未测定
25.5.1.1-κK183C-K290C-vc0101之药物动力学(PK)
向马来猴IV推注施用剂量6或12mg/kg之位点特异性缀合1.1-KK183C+K290C-vc0101ADC后，测定其暴露。使用配体结合检定(LBA)测量总抗体(总Ab；缀合Ab和未缀合Ab的测量值)和ADC(至少缀合一个药物分子的Ab)的浓度。
总Ab和1.1-KK183C+K290C-vc0101位点特异性ADC之浓度对时间曲线和药物动力学/毒物动力学系如表48所示。1.1-KK183C+K290C-vc0101 ADC的暴露大致依剂量依赖方式增加。另外，KK183C+K290C-vc0101ADC的暴露与在本文中所述曲妥单抗位点特异性缀合物T(κK183C+K290C)类似且可相比，当与常规缀合的ADC相比，其暴露与稳定性两者皆增加(表44)。
表48:药物动力学
表49:残基编码表
表50:核酸序列
本发明在以上个别部分中提及的各种特征和实施例，可在经必要修正之后(mutatis mutandis)，视情况适用于其它部分。因此，在一个部分中阐明的特征可与其它部分中阐明的特征视情况合并。此处之所有引证文献(包括专利、专利申请案、论文、教科书、及引证序列编号)以及该等引证文献中所引证之文献，整体以引用方式并入本文中。若一或多篇该等纳入文献及类似材料与本申请案有不同或冲突之处，包括但不限于经定义之用语、用语之使用、经描述之技术或该类似物，以本申请案为主。
序列表
&lt;110&gt; 辉瑞公司
&lt;120&gt; 用于位点特异性缀合之抗体和抗体片段
&lt;130&gt; PC72296A
&lt;150&gt; 62/260,854
&lt;151&gt; 2015-11-30
&lt;150&gt; 62/289,744
&lt;151&gt; 2016-02-01
&lt;150&gt; 62/409,323
&lt;151&gt; 2016-10-17
&lt;160&gt; 84
&lt;170&gt; PatentIn version 3.5
&lt;210&gt; 1
&lt;211&gt; 120
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
&lt;210&gt; 2
&lt;211&gt; 5
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 2
Asp Thr Tyr Ile His
1 5
&lt;210&gt; 3
&lt;211&gt; 17
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 3
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
&lt;210&gt; 4
&lt;211&gt; 11
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 4
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
&lt;210&gt; 5
&lt;211&gt; 329
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
&lt;210&gt; 6
&lt;211&gt; 449
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
&lt;210&gt; 7
&lt;211&gt; 107
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
&lt;210&gt; 8
&lt;211&gt; 11
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 8
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
&lt;210&gt; 9
&lt;211&gt; 7
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 9
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
&lt;210&gt; 10
&lt;211&gt; 9
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 10
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
&lt;210&gt; 11
&lt;211&gt; 107
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 11
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
&lt;210&gt; 12
&lt;211&gt; 214
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
&lt;210&gt; 13
&lt;211&gt; 330
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 13
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
&lt;210&gt; 14
&lt;211&gt; 450
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
&lt;210&gt; 15
&lt;211&gt; 329
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Cys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
&lt;210&gt; 16
&lt;211&gt; 449
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly
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Gly Lys
450
&lt;210&gt; 23
&lt;211&gt; 329
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 23
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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325
&lt;210&gt; 24
&lt;211&gt; 449
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
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&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
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385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
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420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
&lt;210&gt; 25
&lt;211&gt; 329
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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&lt;211&gt; 330
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&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
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1 5 10 15
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20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
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&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
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115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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340 345 350
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370 375 380
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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35 40 45
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325
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
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35 40 45
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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325
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&lt;220&gt;
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Cys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Cys Ser Pro
435 440 445
Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
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Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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100 105 110
Gly Pro Pro
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&lt;220&gt;
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Leu Leu Gln Gly Pro Pro
210 215 220
&lt;210&gt; 45
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&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
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Gly Gly Leu Leu Gln Gly Pro Pro
1 5
&lt;210&gt; 46
&lt;211&gt; 7
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&lt;400&gt; 46
Gly Gly Leu Leu Gln Gly Gly
1 5
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&lt;211&gt; 5
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&lt;400&gt; 47
Leu Leu Gln Gly Ala
1 5
&lt;210&gt; 48
&lt;211&gt; 7
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&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 48
Gly Gly Leu Leu Gln Gly Ala
1 5
&lt;210&gt; 49
&lt;211&gt; 7
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&lt;220&gt;
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Leu Leu Gln Gly Pro Gly Lys
1 5
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&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
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Leu Leu Gln Gly Pro Gly
1 5
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&lt;220&gt;
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Leu Leu Gln Gly Pro Ala
1 5
&lt;210&gt; 52
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&lt;220&gt;
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Leu Leu Gln Gly Pro
1 5
&lt;210&gt; 53
&lt;211&gt; 4
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Leu Leu Gln Pro
1
&lt;210&gt; 54
&lt;211&gt; 6
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 54
Leu Leu Gln Pro Gly Lys
1 5
&lt;210&gt; 55
&lt;211&gt; 8
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 55
Leu Leu Gln Gly Ala Pro Gly Lys
1 5
&lt;210&gt; 56
&lt;211&gt; 7
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 56
Leu Leu Gln Gly Ala Pro Gly
1 5
&lt;210&gt; 57
&lt;211&gt; 6
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 57
Leu Leu Gln Gly Ala Pro
1 5
&lt;210&gt; 58
&lt;211&gt; 8
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MISC_FEATURE
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; Xaa can be Gly or Pro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MISC_FEATURE
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; Xaa can be Ala, Gly, Pro, or absent
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MISC_FEATURE
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; Xaa can be Ala, Gly, Lys, Pro, or absent
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MISC_FEATURE
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; Xaa can be Gly, Lys or absent
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MISC_FEATURE
&lt;222&gt; (8)..(8)
&lt;223&gt; Xaa can be Lys or absent
&lt;400&gt; 58
Leu Leu Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
&lt;210&gt; 59
&lt;211&gt; 8
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MISC_FEATURE
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; Xaa can be any naturally occurring amino acid
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MISC_FEATURE
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; Xaa can be any naturally occurring amino acids or absent
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MISC_FEATURE
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; Xaa can be any naturally occurring amino acids or absent
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MISC_FEATURE
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; Xaa can be any naturally occurring amino acids or absent
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MISC_FEATURE
&lt;222&gt; (8)..(8)
&lt;223&gt; Xaa can be any naturally occurring amino acids or absent
&lt;400&gt; 59
Leu Leu Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
&lt;210&gt; 60
&lt;211&gt; 8
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 60
Gly Gly Leu Leu Gln Gly Pro Pro
1 5
&lt;210&gt; 61
&lt;211&gt; 110
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 61
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
&lt;210&gt; 62
&lt;211&gt; 217
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 62
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
&lt;210&gt; 63
&lt;211&gt; 107
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 63
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
&lt;210&gt; 64
&lt;211&gt; 106
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 64
Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
&lt;210&gt; 65
&lt;211&gt; 116
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 65
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
&lt;210&gt; 66
&lt;211&gt; 5
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 66
Ser Phe Ser Met Ser
1 5
&lt;210&gt; 67
&lt;211&gt; 7
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 67
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
1 5
&lt;210&gt; 68
&lt;211&gt; 17
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 68
Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
&lt;210&gt; 69
&lt;211&gt; 6
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 69
Ser Gly Ser Ser Gly Thr
1 5
&lt;210&gt; 70
&lt;211&gt; 7
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 70
Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr
1 5
&lt;210&gt; 71
&lt;211&gt; 446
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 71
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
&lt;210&gt; 72
&lt;211&gt; 108
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 72
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
&lt;210&gt; 73
&lt;211&gt; 12
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 73
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala
1 5 10
&lt;210&gt; 74
&lt;211&gt; 7
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 74
Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
&lt;210&gt; 75
&lt;211&gt; 9
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 75
Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro Pro Thr
1 5
&lt;210&gt; 76
&lt;211&gt; 215
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 76
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
&lt;210&gt; 77
&lt;211&gt; 445
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 77
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Cys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
&lt;210&gt; 78
&lt;211&gt; 215
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 78
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Cys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
&lt;210&gt; 79
&lt;211&gt; 987
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 79
gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacatgcc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc cccgggt 987
&lt;210&gt; 80
&lt;211&gt; 321
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 80
cggaccgtgg ccgctccctc cgtgttcatc ttcccaccct ccgacgagca gctgaagtcc 60
ggcaccgcct ccgtcgtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag 120
tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aactcccagg aatccgtcac cgagcaggac 180
tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc accctgaccc tgtcctgcgc cgactacgag 240
aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag 300
tccttcaacc ggggcgagtg c 321
&lt;210&gt; 81
&lt;211&gt; 1335
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 81
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agtttttcga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatct attagtggta gttcgggtac cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaagac acggccgtat attactgtgc gaaaccgttt 300
ccgtattttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcgagtgc gtcgaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacatgcccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtctc cgggt 1335
&lt;210&gt; 82
&lt;211&gt; 987
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; Artificial Sequence
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 82
gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacatgcc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 987
&lt;210&gt; 83
&lt;211&gt; 645
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&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 83
gaaattgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctttt tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat tatgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagacgggtc gtattccgcc gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagct gcgcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
&lt;210&gt; 84
&lt;211&gt; 321
&lt;212&gt; DNA
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&lt;220&gt;
&lt;223&gt; Synthetic Construct
&lt;400&gt; 84
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagctgcgc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
PCT/RO/134表

Claims (22)

1.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，所述恒定结构域在根据卡巴的EU指数编号的位置290上包含工程化的半胱氨酸残基。
2.如权利要求第1项的多肽，其中所述恒定结构域包含IgG重链CH2结构域。
3.一种多肽，其包含抗体重链恒定结构域，当所述恒定结构域与SEQ ID NO:61比对时，所述恒定结构域在对应SEQ ID NO:61的残基60的位置上包含工程化的半胱氨酸残基。
4.如权利要求第3项的多肽，其中所述经取代的半胱氨酸残基系位于IgG CH2结构域的根据卡巴的EU指数编号的位置290上。
5.如权利要求第1至4项中任一项的多肽，其中所述恒定结构域在下述位置上进一步包含工程化的半胱氨酸残基，所述位置选自由根据卡巴的EU指数编号的118、246、249、265、S267、270、276、278、283、292、293、294、300、302、303、314、315、318、320、332、333、334、336、345、347、354、355、358、360、362、370、373、375、376、378、380、382、386、388、390、392、393、401、404、411、413、414、416、418、419、421、428、431、432、437、438、439、443、444及其任何组合所组成的群组。
6.如权利要求第1至5项中任一项的多肽，其中所述恒定结构域在下述位置上进一步包含工程化的半胱氨酸残基，所述位置选自由根据卡巴的EU指数编号的118、334、347、373、375、380、388、392、421、443及其任何组合所组成的群组。
7.如权利要求第1至5项中任一项的多肽，其中所述恒定结构域在根据卡巴的EU指数编号的位置334上进一步包含工程化的半胱氨酸残基。
8.一种抗体或其抗原结合片段，包含如权利要求第1至7项中任一项的多肽。
9.一种抗体或其抗原结合片段，包含：
(a)如权利要求第1至7项中任一项的多肽，及
(b)抗体轻链恒定区，其包含(i)在根据卡巴编号的位置183上的工程化的半胱氨酸残基；或(ii)当所述恒定结构域与SEQ ID NO:63比对时，在对应SEQ ID NO:63的残基76的位置上的工程化的半胱氨酸残基。
10.如权利要求第9项的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链恒定区包含κ轻链恒定结构域(CLκ)。
11.如权利要求第9项的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链恒定区包含λ轻链恒定结构域(CLλ)。
12.一种化合物，其包含如权利要求第1至7项中任一项的多肽或如权利要求第8至11项中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述多肽或抗体经由所述工程化的半胱氨酸位点缀合治疗剂。
13.如权利要求第12项的化合物，其中所述治疗剂选自由下列所组成的群组：细胞毒性剂、细胞抑制剂、化学治疗剂、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、微小RNA、肽核酸、非天然氨基酸、肽、酶、荧光标签、生物素及其任何组合。
14.如权利要求第12或13项的化合物，其中所述治疗剂经由连接子缀合所述多肽或所述抗体或其抗原结合片段。
15.如权利要求第14项的化合物，其中所述连接子为可切割的。
16.如权利要求第14或15项的化合物，其中所述连接子包含vc、mc、MalPeg6、m(H20)c、m(H20)cvc或其组合。
17.如权利要求第14至16项中任一项的化合物，其中所述连接子为vc。
18.如权利要求第12至17项中任一项的化合物，其中所述治疗剂为耳抑素或微管溶素。
19.如权利要求第12至18项中任一项的化合物，其中所述治疗剂为耳抑素。
20.如权利要求第19项的化合物，其中所述耳抑素选自由下列所组成的群组：0101、8261、6121、8254、6780、0131、MMAD、MMAE和MMAF。
21.一种医药组合物，其包含如权利要求第12至20项中任一项的化合物及医药上可接受的载剂。
22.一种治疗癌症、自体免疫疾病、发炎性疾病或感染性疾病的方法，包括向所需个体施用治疗有效量的如权利要求第12至20项中任一项的化合物或如权利要求第21项的医药组合物。
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