KR20180083428A - 부위-특이적 접합을 위한 항체 및 항체 단편 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 부위-특이적 접합을 위한 치환된 시스테인을 포함하는 폴리펩티드, 항체 및 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.

Description

부위-특이적 접합을 위한 항체 및 항체 단편
본 발명은 부위-특이적 접합을 위한 아미노산을 도입하도록 조작된 항체 및 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
항체는 DNA를 알킬화하는 소분자 (예를 들어, 두오카르마이신 및 칼리케아미신), 미세관을 파괴하는 소분자 (예를 들어, 메이탄시노이드 및 아우리스타틴), 또는 DNA에 결합하는 소분자 (예를 들어, 안트라시클린)를 포함한 다양한 세포독성 약물에 접합되었다. 칼리케아미신에 접합된 인간화 항-CD33 항체를 포함하는 하나의 이러한 항체-약물 접합체 (ADC) - 밀로타르그(Mylotarg)™ (겜투주맙 오조가미신)는 급성 골수성 백혈병을 치료하기 위한 것으로 승인되었다. 아우리스타틴 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)에 접합된 CD30에 대한 키메라 항체를 포함하는 ADC인 애드세트리스(Adcetris)™ (브렌툭시맙 베도틴)는 호지킨 림프종 및 역형성 대세포 림프종의 치료를 위한 것으로 승인되었다.
ADC가 암 요법에 대한 가능성을 갖고 있지만, 세포독성 약물은 일반적으로 리신 측쇄를 통해 또는 활성화된 시스테인 술프히드릴 기를 제공하기 위해 항체에 존재하는 쇄간 디술피드 결합을 환원시킴으로써 항체에 접합된다. 그러나, 이 비-특이적 접합 접근법은 수많은 결점을 갖는다. 예를 들어, 항체 리신 잔기에 대한 약물 접합은 접합에 이용가능한 많은 리신 잔기 (~30개)가 항체에 존재한다는 사실에 의해 복잡해진다. 약물 대 항체 비 (DAR)의 최적수는 훨씬 더 낮기 때문에 (예를 들어, 약 4:1), 리신 접합은 종종 매우 불균질한 프로파일을 생성한다. 추가로, 많은 리신은 CDR 영역의 중요한 항원 결합 부위에 위치하고, 약물 접합은 항체 친화도의 감소로 이어질 수 있다. 다른 한편으로, 티올 매개된 접합은 주로 힌지 디술피드 결합에 수반되는 8개의 시스테인을 표적화하지만, 8개 중 어느 4개의 시스테인이 상이한 제제 중에서 일관되게 접합되는지 예측하고 확인하는 것은 여전히 어렵다.
최근에, 유리 시스테인 잔기의 유전자 조작은 티올-기재 화학에 의한 부위-특이적 접합을 가능하게 했다. 부위-특이적 ADC는 균질한 프로파일 및 널리 정의된 접합 부위를 가지며, 강력한 시험관내 세포독성 및 강한 생체내 항종양 활성을 나타냈다.
WO 2013/093809는 접합을 위한 시스테인 잔기를 도입하기 위해 특정 부위에 아미노산 치환을 포함하는 조작된 항체 불변 영역 (Fc, Cγ, Cκ, Cλ) 또는 그의 단편을 개시한다. IgG 중쇄 및 람다/카파 경쇄 불변 영역 내 수많은 Cys-돌연변이 부위가 개시되어 있다.
부위-특이적 접합을 위해 도입된 Cys 잔기를 사용하여 이루어지는 성공은 Cys-치환이 단백질 구조 또는 기능을 변경시키지 않는 적절한 부위를 선택하는 능력에 의존한다. 추가로, 상이한 접합 부위를 사용하는 것은 상이한 특징, 예컨대 ADC의 생물학적 안정성, 또는 접합성을 유발한다. 따라서, 정의된 접합 부위 및 목적하는 ADC 특징을 갖는 ADC를 생성하는 부위-특이적 접합 전략은 대단히 유용할 것이다.
본 발명은 부위-특이적 접합을 위한 치환된 시스테인을 포함하는 폴리펩티드, 항체 및 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 상용에 지나지 않는 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 실시양태 (E)에 의해 포괄되도록 의도된다.
E1. 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 위치 290에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E2. E1에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgG 중쇄 CH2 도메인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
E3. E2에 있어서, 상기 IgG가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 폴리펩티드.
E4. 항체 중쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 61과 정렬되는 경우에 서열식별번호: 61의 잔기 60에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E5. E4에 있어서, 조작된 시스테인 잔기가 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른, IgG CH2 도메인의 위치 290에 위치하는 것인 폴리펩티드.
E6. E5에 있어서, 상기 IgG가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 폴리펩티드.
E7. E1 또는 E4에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2) 중쇄 CH2 도메인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
E8. E1 또는 E4에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgD 중쇄 CH2 도메인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
E9. E1 또는 E4에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgE 중쇄 CH2 도메인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
E10. E1 또는 E4에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgM 중쇄 CH2 도메인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
E11. E1-E10 중 어느 하나에 있어서, 상기 불변 도메인이 인간 항체 불변 도메인인 폴리펩티드.
E12. E1-E11 중 어느 하나에 있어서, 상기 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 118, 246, 249, 265, 267, 270, 276, 278, 283, 292, 293, 294, 300, 302, 303, 314, 315, 318, 320, 332, 333, 334, 336, 345, 347, 354, 355, 358, 360, 362, 370, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 390, 392, 393, 401, 404, 411, 413, 414, 416, 418, 419, 421, 428, 431, 432, 437, 438, 439, 443, 444 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
E13. E1-E12 중 어느 하나에 있어서, 상기 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 118, 334, 347, 373, 375, 380, 388, 392, 421, 443 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
E14. E1-E13 중 어느 하나에 있어서, 상기 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 위치 334에 조작된 시스테인 잔기를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
E15. E1-E14 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
E16. 다음을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
(a) E1-E14 중 하나의 폴리펩티드, 및
(b) (i) 카바트의 넘버링에 따른 위치 183에 조작된 시스테인 잔기; 또는 (ii) 항체 경쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 63과 정렬되는 경우에 서열식별번호: 63의 잔기 76에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 경쇄 불변 영역.
E17. 다음을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
(a) E1-E14 중 하나의 폴리펩티드, 및
(b) (i) 카바트의 넘버링에 따른 위치 110, 111, 125, 149, 155, 158, 161, 185, 188, 189, 191, 197, 205, 206, 207, 208, 210 또는 그의 임의의 조합에 조작된 시스테인 잔기; (ii) 항체 경쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 63 (카파 경쇄)과 정렬되는 경우에 서열식별번호: 63의 잔기 4, 42, 81, 100, 103 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기; 또는 (iii) 항체 경쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 64 (람다 경쇄)와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 64의 잔기 4, 5, 19, 43, 49, 52, 55, 78, 81, 82, 84, 90, 96, 97, 98, 99, 101 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 경쇄 불변 영역.
E18. E16 또는 E17에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역이 카파 경쇄 불변 도메인 (CLκ)을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
E19. E16 또는 E17에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역이 람다 경쇄 불변 도메인 (CLλ)을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
E20. E1-E14 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 E15-E19 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 폴리펩티드 또는 항체는 상기 조작된 시스테인 부위를 통해 1종 이상의 치료제에 접합되는 것인 화합물.
E21. E20에 있어서, 치료제가 링커를 통해 폴리펩티드 또는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 접합되는 것인 화합물.
E22. 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 334, 375, 392 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E23. E22에 있어서, 불변 도메인이 IgG 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E24. 항체 중쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 104, 145, 162 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E25. E24에 있어서, 조작된 시스테인 잔기가 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른, IgG CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다의 위치 334, 375, 392 또는 그의 임의의 조합에 위치하는 것인 폴리펩티드.
E26. E22 또는 E24에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE 또는 IgM 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E27. 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 347, 388, 421, 443 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E28. E27에 있어서, 불변 도메인이 IgG CH3 도메인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
E29. 항체 중쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 117, 158, 191, 213 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E30. E29에 있어서, 조작된 시스테인 잔기가 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른, IgG CH3 도메인의 위치 347, 388, 421, 443 또는 그의 임의의 조합에 위치하는 것인 폴리펩티드.
E31. E27 또는 E29에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE 또는 IgM 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
E32. 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 347, 388, 421 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E33. E32에 있어서, 불변 도메인이 IgG 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
E34. 항체 중쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 117, 158, 191 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E35. E34에 있어서, 조작된 시스테인 잔기가 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른, IgG CH3 도메인의 위치 347, 388, 421 또는 그의 임의의 조합에 위치하는 것인 폴리펩티드.
E36. E32 또는 E34에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE 또는 IgM 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
E37. 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 290, 334, 392, 443 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E38. E37에 있어서, 불변 도메인이 IgG 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E39. 항체 중쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 60, 104, 162, 213 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E40. E39에 있어서, 조작된 시스테인 잔기가 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른, IgG CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다의 위치 290, 334, 392, 443 또는 그의 임의의 조합에 위치하는 것인 폴리펩티드.
E41. E37 또는 E39에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE 또는 IgM 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E42. 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 334, 388, 421, 443 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E43. E42에 있어서, 불변 도메인이 IgG 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E44. 항체 중쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 104, 158, 191, 213 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E45. E44에 있어서, 조작된 시스테인 잔기가 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른, IgG CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다의 위치 334, 388, 421, 443 또는 그의 임의의 조합에 위치하는 것인 폴리펩티드.
E46. E42 또는 E44에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE 또는 IgM 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E47. 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 334, 392, 421 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E48. E47에 있어서, 불변 도메인이 IgG 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E49. 항체 중쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 104, 162, 191 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E50. E49에 있어서, 조작된 시스테인 잔기가 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른, IgG CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다의 위치 334, 392, 421 또는 그의 임의의 조합에 위치하는 것인 폴리펩티드.
E51. E47 또는 E49에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE 또는 IgM 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E52. 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 위치 392에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E53. 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 위치 290, 443 또는 둘 다에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E54. E52 또는 E53에 있어서, 불변 도메인이 IgG 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E55. 항체 중쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 162에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E56. E55에 있어서, 조작된 시스테인 잔기가 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른, IgG CH3 도메인의 위치 392에 위치하는 것인 폴리펩티드.
E57. 항체 중쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 60, 213 또는 둘 다에 대응하는 위치에 조작된 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E58. E57에 있어서, 조작된 시스테인 잔기가 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른, IgG CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다의 위치 290, 443 또는 둘 다에 위치하는 것인 폴리펩티드.
E59. E52, E53, E55 및 E57 중 어느 하나에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, 또는 IgM 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E60. 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 290, 388, 443 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E61. E60에 있어서, 불변 도메인이 IgG 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E62. 항체 중쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 60, 158, 213 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E63. E62에 있어서, 조작된 시스테인 잔기가 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른, IgG CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다의 잔기 290, 388, 443 또는 그의 임의의 조합에 위치하는 것인 폴리펩티드.
E64. E60 또는 E62에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE 또는 IgM 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E65. 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 334, 375, 392 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E66. E65에 있어서, 불변 도메인이 IgG 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E67. 항체 중쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 104, 145, 162 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E68. E67에 있어서, 조작된 시스테인 잔기가 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른, IgG CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다의 위치 334, 375, 392 또는 그의 임의의 조합에 위치하는 것인 폴리펩티드.
E69. E65 또는 E67에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE 또는 IgM 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E70. 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 334, 347, 375, 380, 388, 392 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E71. E70에 있어서, 불변 도메인이 IgG 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E72. 항체 중쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 104, 117, 145, 150, 158, 162 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
E73. E72에 있어서, 조작된 시스테인 잔기가 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른, IgG CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다의 위치 334, 347, 375, 380, 388, 392 또는 그의 임의의 조합에 위치하는 것인 폴리펩티드.
E74. E70 또는 E72에 있어서, 불변 도메인이 IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE 또는 IgM 중쇄 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것인 폴리펩티드.
E75. E23, E25, E28, E30, E33, E35, E38, E40, E43, E45, E48, E50, E54, E56, E58, E61, E63, E66, D68, E71 및 E73 중 어느 하나에 있어서, 상기 IgG가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 폴리펩티드.
E76. E21-E75 중 어느 하나로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
E77. 다음을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
(a) E21-E75 중 어느 하나의 폴리펩티드, 및
(b) (i) 카바트의 넘버링에 따른 위치 183에 조작된 시스테인 잔기; 또는 (ii) 항체 경쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 63과 정렬되는 경우에 서열식별번호: 63의 잔기 76에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 경쇄 불변 영역.
E78. 다음을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
(a) E21-E75 중 어느 하나의 폴리펩티드, 및
(b) (i) 카바트의 넘버링에 따른 위치 110, 111, 125, 149, 155, 158, 161, 185, 188, 189, 191, 197, 205, 206, 207, 208, 210 또는 그의 임의의 조합에 조작된 시스테인 잔기; (ii) 항체 경쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 63 (카파 경쇄)과 정렬되는 경우에 서열식별번호: 63의 잔기 4, 42, 81, 100, 103 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기; 또는 (iii) 항체 경쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 64 (람다 경쇄)와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 64의 잔기 4, 5, 19, 43, 49, 52, 55, 78, 81, 82, 84, 90, 96, 97, 98, 99, 101 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 경쇄 불변 영역.
E79. E21-E75 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 E76-E78의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 폴리펩티드 또는 항체는 조작된 시스테인 부위를 통해 치료제에 접합되는 것인 화합물.
E80. E79에 있어서, 치료제가 링커를 통해 폴리펩티드 또는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 접합되는 것인 화합물.
E81. E79 또는 E80에 있어서, 다음인 화합물:
(a) 중쇄 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 334, 375, 392 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하거나; 또는 상기 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 104, 145,162 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하고;
(b) HIC 상대 체류 시간에 의해 측정된 바와 같은, 폴리펩티드 또는 미접합 항체에 대한 화합물의 소수성 변화가 약 1.0 내지 약 1.5, 약 1.0 내지 약 1.4, 약 1.0 내지 약 1.3, 또는 약 1.0 내지 약 1.2이다.
E82. E79 또는 E80에 있어서, 다음인 화합물:
(a) 중쇄 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 347, 388, 421, 443 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하거나; 또는 상기 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 117, 158, 191, 213 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하고;
(b) HIC 상대 체류 시간에 의해 측정된 바와 같은, 폴리펩티드 또는 미접합 항체에 대한 화합물의 소수성 변화가 약 1.5 이상, 약 1.6 이상, 약 1.7 이상, 약 1.8 이상, 약 1.9 이상, 또는 약 2.0 이상이다.
E83. E80에 있어서, 다음인 화합물:
(a) 중쇄 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 347, 388, 421 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하거나; 또는 상기 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 117, 158, 191 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하고;
(b) 링커가 숙신이미드 기를 포함하고;
(c) 72시간에 5% CO2 하 37℃에서 혈장 중 숙신아미드 가수분해의 퍼센트가 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%이다.
E84. E80에 있어서, 다음인 화합물:
(a) 중쇄 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 347, 388, 421 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하거나; 또는 상기 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 117, 158, 191 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하고;
(b) 링커가 숙신이미드 기를 포함하고;
(c) 72시간에 37℃에서 0.5mM 글루타티온 (pH 7.4) 중 숙신아미드 가수분해의 퍼센트가 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%이다.
E85. E80에 있어서, 다음인 화합물:
(a) 중쇄 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 290, 334, 392, 443 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하거나; 또는 상기 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 60, 104, 162, 213 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하고;
(b) 링커가 숙신이미드 기를 포함하고;
(c) 72시간에 5% CO2 하 37℃에서 혈장 중 숙신아미드 가수분해의 퍼센트가 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 또는 약 30% 이하이다.
E86. E80에 있어서, 다음인 화합물:
(a) 중쇄 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 290, 334, 392, 443 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하거나; 또는 상기 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 60, 104, 162, 213 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하고;
(b) 링커가 숙신이미드 기를 포함하고;
(c) 72시간에 37℃에서 0.5mM 글루타티온 (pH 7.4) 중 숙신아미드 가수분해의 퍼센트가 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 또는 약 30% 이하이다.
E87. E79 또는 E80에 있어서, 다음인 화합물:
(a) 중쇄 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 334, 388, 421, 443 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하거나; 또는 상기 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 104, 158, 191, 213 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하고;
(b) 72시간에 5% CO2 하 37℃에서 혈장 중 약물-대-항체 비 (DAR) 손실의 퍼센트가 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 또는 약 1% 이하이다.
E88. E79 또는 E80에 있어서, 다음인 화합물:
(a) 중쇄 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 334, 392, 421 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하거나; 또는 상기 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 104, 162, 191 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하고;
(b) 72시간에 37℃에서 0.5mM 글루타티온 (pH 7.4) 중 DAR 손실의 퍼센트가 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 또는 약 1% 이하이다.
E89. E82에 있어서, 다음인 화합물:
(a) 중쇄 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 290, 388, 443 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하거나; 또는 상기 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 60, 158, 213 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하고;
(b) 20분에 37℃에서 카텝신-매개된 링커 절단 (200 내지 20000 ng/mL 카텝신)의 퍼센트가 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%이다.
E90. E80에 있어서, 다음인 화합물:
(a) 중쇄 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 334, 375, 392 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하거나; 또는 상기 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 104, 145, 162 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하고;
(b) 4시간에 37℃에서 카텝신-매개된 (200 내지 20000 ng/mL 카텝신) 링커 절단의 퍼센트가 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하, 약 25% 이하, 약 20% 이하, 또는 약 15% 이하이다.
E91. E79 또는 E80에 있어서, 다음인 화합물:
(a) 중쇄 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 334, 347, 375, 380, 388, 392 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하거나; 또는 상기 불변 도메인이 서열식별번호: 62와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 62의 잔기 104, 117, 145, 150, 158, 162 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하고;
(b) 제21일에 45℃에서 5 mg/mL 농도에서의 단량체 형태의 화합물의 퍼센트가 약 96.0% 이상, 약 96.5% 이상, 약 97.0% 이상, 약 97.5% 이상, 약 98.0% 이상이다.
E92. E21 및 E80-E91 중 어느 하나에 있어서, 링커가 절단가능한 것인 화합물.
E93. E21 및 E80-E92 중 어느 하나에 있어서, 링커가 vc, mc, MalPeg6, m(H20)c, m(H20)cvc 또는 그의 조합을 포함하는 것인 화합물.
E94. E21 및 E80-E93 중 어느 하나에 있어서, 링커가 vc를 포함하는 것인 화합물.
E95. E20-E21 및 E79-E94 중 어느 하나에 있어서, 치료제가 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비-천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴, 튜부리신 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
E96. E20-E21 및 E79-E95 중 어느 하나에 있어서, 치료제가 아우리스타틴, 메이탄시노이드, 칼리케아미신, 튜부리신 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
E97. E20-E21 및 E79-E96 중 어느 하나에 있어서, 치료제가 아우리스타틴인 화합물.
E98. E97에 있어서, 아우리스타틴이 0101, 8261, 6121, 8254, 6780, 0131, MMAD, MMAE, MMAF 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
E99. E20-E21 및 E79-E96 중 어느 하나에 있어서, 치료제가 튜부리신인 화합물.
E100. 식 Ab-(L-D)를 가지며, 여기서 (a) Ab는 E76-E78 중 어느 하나의 항체이고; (b) L-D는 링커-약물 모이어티이고, 여기서 L은 링커이고, D는 약물인 항체 약물 접합체.
E101. E100에 있어서, L-D가 숙신이미드 기, 말레이미드 기, 가수분해된 숙신이미드 기 또는 가수분해된 말레이미드 기를 포함하는 것인 항체 약물 접합체.
E102. E100 또는 E101에 있어서, L-D가 말레이미드 기 또는 가수분해된 말레이미드 기를 포함하는 것인 항체 약물 접합체.
E103. E100-E102 중 어느 하나에 있어서, L-D가 6-말레이미도카프로일 (MC), 말레이미도프로파노일 (MP), 발린-시트룰린 (val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (ala-phe), p-아미노벤질옥시카르보닐 (PAB), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 (SPP), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1카르복실레이트 (SMCC), N-숙신이미딜 (4-아이오도-아세틸) 아미노벤조에이트 (SIAB) 또는 6-말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (MC-vc-PAB)을 포함하는 것인 항체 약물 접합체.
E104. E100-E102 중 어느 하나에 있어서, 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는 항체 약물 접합체:
Figure pct00001
여기서 각 경우에 독립적으로,
W는
Figure pct00002
이고;
R1은 수소 또는 C1-C8 알킬이고;
R2는 수소 또는 C1-C8 알킬이고;
R3A 및 R3B는 하기 중 어느 하나이고:
(i) R3A는 수소 또는 C1-C8 알킬이고;
R3B는 C1-C8 알킬이거나;
(ii) R3A 및 R3B는 함께 C2-C8 알킬렌 또는 C1-C8 헤테로알킬렌이고;
R5는
Figure pct00003
이고;
R6은 수소 또는 -C1-C8 알킬이다.
E105. E100-E102 중 어느 하나에 있어서, 화학식 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는 항체 약물 접합체:
Figure pct00004
여기서 각 경우에 독립적으로,
W는
Figure pct00005
이고;
R1은
Figure pct00006
이고;
Y는 -C2-C20 알킬렌-, -C2-C20 헤테로알킬렌-, -C3-C8 카르보시클로-, -아릴렌-, -C3-C8헤테로시클로-, -Cl-C10알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-Cl-Cl0알킬렌-, -Cl-Cl0알킬렌-(C3-C8카르보시클로)-, -(C3-C8카르보시클로)-Cl-C10알킬렌-, -Cl-Cl0알킬렌-(C3-C8헤테로시클로)- 또는 -(C3-C8 헤테로시클로)-Cl-Cl0알킬렌-, -C1-6알킬(OCH2CH2)1-10-, -(OCH2CH2)1-10-, -(OCH2CH2)1-10-C1-6알킬, -C(O)-C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-, -C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-C(O)-, -C1-6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-, 및 -C(O)-C1-6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6알킬-로부터 선택된 기 중 1개 이상이고;
Z는
Figure pct00007
또는 -NH2이고;
G는 할로겐, -OH, -SH, 또는 -S-C1-C6 알킬이고;
R2는 수소 또는 C1-C8 알킬이고;
R3A 및 R3B는 하기 중 어느 하나이고:
(i) R3A는 수소 또는 C1-C8 알킬이고;
R3B는 C1-C8 알킬이거나;
(ii) R3A 및 R3B는 함께 C2-C8 알킬렌 또는 C1-C8 헤테로알킬렌이고;
R5는
Figure pct00008
이고;
R6은 수소 또는 -C1-C8 알킬이고;
R10은 수소, -Cl-Cl0알킬, -C3-C8카르보시클릴, -아릴, -Cl-C10헤테로알킬, -C3-C8헤테로시클로, -Cl-Cl0알킬렌-아릴, -아릴렌-Cl-Cl0알킬, -Cl-Cl0알킬렌-(C3-C8카르보시클로), -(C3-C8 카르보시클로)-Cl-Cl0알킬, -Cl-Cl0알킬렌-(C3-C8헤테로시클로), 또는 -(C3-C8 헤테로시클로)-Cl-Cl0알킬이고, 여기서 아릴을 포함하는 R10 상의 아릴은 [R7]h로 임의로 치환되고;
R7은 각 경우에 독립적으로 F, Cl, I, Br, NO2, CN 및 CF3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
h는 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
E106. E100-E102 중 어느 하나에 있어서, 화학식 IIb의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는 항체 약물 접합체:
Figure pct00009
여기서 각 경우 독립적으로,
W는
Figure pct00010
이고;
R1은
Figure pct00011
이고;
Y는 -C2-C20 알킬렌-, -C2-C20 헤테로알킬렌-, -C3-C8 카르보시클로-, -아릴렌-, -C3-C8헤테로시클로-, -Cl-C10알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-Cl-Cl0알킬렌-, -Cl-Cl0알킬렌-(C3-C8카르보시클로)-, -(C3-C8카르보시클로)-Cl-C10알킬렌-, -Cl-Cl0알킬렌-(C3-C8헤테로시클로)-, 또는 -(C3-C8 헤테로시클로)-Cl-Cl0알킬렌-이고;
Z는
Figure pct00012
또는 -NH-Ab이고;
Ab는 항체이고;
R2는 수소 또는 C1-C8 알킬이고;
R3A 및 R3B는 하기 중 어느 하나이고:
(i) R3A는 수소 또는 C1-C8 알킬이고;
R3B는 C1-C8 알킬이거나;
(ii) R3A 및 R3B는 함께 C2-C8 알킬렌 또는 C1-C8 헤테로알킬렌이고;
R5는
Figure pct00013
이고;
R6은 수소 또는 -C1-C8 알킬이다.
E107. E20-E21 및 E79-E99 중 어느 하나의 화합물, 또는 E100-E107 중 어느 하나의 항체 약물 접합체; 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
E108. 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 E20-E21 및 E79-E99 중 어느 하나의 화합물, E100-E107 중 어느 하나의 항체 약물 접합체, 또는 E108의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환을 치료하는 방법.
E109. 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환을 치료하는데 사용하기 위한 E20-E21 및 E79-E99 중 어느 하나의 화합물, E100-E107 중 어느 하나의 항체 약물 접합체, 또는 E108의 조성물.
E110. 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환을 치료하기 위한 E20-E21 및 E79-E99 중 어느 하나의 화합물, E100-E107 중 어느 하나의 항체 약물 접합체, 또는 E108의 조성물의 용도.
E111. 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 E20-E21 및 E79-E99 중 어느 하나의 화합물, E100-E107 중 어느 하나의 항체 약물 접합체, 또는 E108의 조성물의 용도.
E112. 식 Ab-(L-D)를 가지며, 여기서
(a) Ab는 HER2에 결합하고,
(1) 서열식별번호: 2, 3 및 4를 포함하는 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(2) 서열식별번호: 17, 5, 13, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 또는 39 중 어느 것의 중쇄 불변 영역;
(3) 서열식별번호: 8, 9 및 10을 포함하는 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(4) 서열식별번호: 41, 11 또는 43 중 어느 것의 경쇄 불변 영역
을 포함하는 항체이고;
(b) L-D는 링커-약물 모이어티이고, 여기서 L은 링커이고, D는 약물이고,
단 중쇄 불변 영역이 서열식별번호: 5인 경우에 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 11이 아닌
항체 약물 접합체.
E113. E112에 있어서,
(a) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 17이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 41이거나;
(b) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 5이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 41이거나;
(c) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 17이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 11이거나;
(d) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 21이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 11이거나;
(e) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 23이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 11이거나;
(f) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 25이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 11이거나;
(g) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 27이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 11이거나;
(h) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 23이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 41이거나;
(i) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 25이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 41이거나;
(j) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 27이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 41이거나;
(k) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 29이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 11이거나;
(l) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 31이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 11이거나;
(m) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 33이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 43이거나;
(n) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 35이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 11이거나;
(o) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 37이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 11이거나;
(p) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 39이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 11 이거나; 또는
(q) 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 13이고, 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 43인
항체 약물 접합체.
E114. E112에 있어서,
(a) 중쇄는 서열식별번호: 18, 6, 14, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 또는 40 중 어느 것을 포함하고;
(b) 경쇄는 서열식별번호: 42, 12 또는 44 중 어느 것을 포함하고,
단 중쇄가 서열식별번호: 6인 경우에 경쇄는 서열식별번호: 12가 아닌
항체 약물 접합체.
E115. E114에 있어서,
(a) 중쇄는 서열식별번호: 18이고, 경쇄는 서열식별번호: 42이거나;
(b) 중쇄는 서열식별번호: 6이고, 경쇄는 서열식별번호: 42이거나;
(c) 중쇄는 서열식별번호: 18이고, 경쇄는 서열식별번호: 12이거나;
(d) 중쇄는 서열식별번호: 22이고, 경쇄는 서열식별번호: 12이거나;
(e) 중쇄는 서열식별번호: 24이고, 경쇄는 서열식별번호: 12이거나;
(f) 중쇄는 서열식별번호: 26이고, 경쇄는 서열식별번호: 12이거나;
(g) 중쇄는 서열식별번호: 28이고, 경쇄는 서열식별번호: 12이거나;
(h) 중쇄는 서열식별번호: 24이고, 경쇄는 서열식별번호: 42이거나;
(i) 중쇄는 서열식별번호: 26이고, 경쇄는 서열식별번호: 42이거나;
(j) 중쇄는 서열식별번호: 28이고, 경쇄는 서열식별번호: 42이거나;
(k) 중쇄는 서열식별번호: 30이고, 경쇄는 서열식별번호: 12이거나;
(l) 중쇄는 서열식별번호: 32이고, 경쇄는 서열식별번호: 12이거나;
(m) 중쇄는 서열식별번호: 34이고, 경쇄는 서열식별번호: 44이거나;
(n) 중쇄는 서열식별번호: 36이고, 경쇄는 서열식별번호: 12이거나;
(o) 중쇄는 서열식별번호: 38이고, 경쇄는 서열식별번호: 12이거나;
(p) 중쇄는 서열식별번호: 40이고, 경쇄는 서열식별번호: 12이거나; 또는
(q) 중쇄는 서열식별번호: 14이고, 경쇄는 서열식별번호: 44인
항체 약물 접합체.
E116. E112-E115 중 어느 하나에 있어서, 링커가 vc, mc, MalPeg6, m(H20)c 및 m(H20)cvc로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체 약물 접합체.
E117. E116에 있어서, 링커가 절단가능한 것인 항체 약물 접합체.
E118. E116 또는 E117에 있어서, 링커가 vc인 항체 약물 접합체.
E119. E112-E118 중 어느 하나에 있어서, 약물이 막 투과성인 항체 약물 접합체.
E120. E112-E119 중 어느 하나에 있어서, 약물이 아우리스타틴인 항체 약물 접합체.
E121. E120에 있어서, 아우리스타틴이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체 약물 접합체:
2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드;
2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드;
2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드, 트리플루오로아세트산 염;
2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드;
2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드;
2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드, 트리플루오로아세트산 염;
N-메틸-L-발릴-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드;
N-메틸-L-발릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드; 및
N-메틸-L-발릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드,
또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
E122. E120에 있어서, 아우리스타틴이 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물인 항체 약물 접합체.
E123. 식 Ab-(L-D)를 가지며, 여기서
(a) Ab는 HER2에 결합하고, 서열식별번호: 18을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 42를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체이고;
(b) L-D는 링커-약물 모이어티이고, 여기서 L은 vc의 링커이고, D는 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물의 아우리스타틴인
항체 약물 접합체.
E124. E112-E123 중 어느 하나의 항체 약물 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
E125. 식 Ab-(L-D)를 가지며, 여기서 Ab는 피브로넥틴 (FN)의 엑스트라-도메인 B (EDB)에 결합하는 항체이고, L-D는 링커-약물 모이어티이고, 여기서 L은 링커이고, D는 약물인 항체 약물 접합체.
E126. E125에 있어서, 상기 항체가 다음을 포함하는 것인 항체 약물 접합체:
(i) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH):
(a) 서열식별번호: 66 또는 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1),
(b) 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR-H2; 및
(c) 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR-H3; 및
(ii) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL):
(a) 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1),
(b) 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR-L2; 및
(c) 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR-L3.
E127. E125 또는 E126에 있어서, 링커가 vc, mc, MalPeg6, m(H20)c 및 m(H20)cvc로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체 약물 접합체.
E128. E127에 있어서, 링커가 절단가능한 것인 항체 약물 접합체.
E129. E127 또는 E128에 있어서, 링커가 vc인 항체 약물 접합체.
E130. E125-E129 중 어느 하나에 있어서, 약물이 막 투과성인 항체 약물 접합체.
E131. E125-E130 중 어느 하나에 있어서, 약물이 아우리스타틴인 항체 약물 접합체.
E132. E131에 있어서, 아우리스타틴이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체 약물 접합체:
2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드;
2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드;
2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드, 트리플루오로아세트산 염;
2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드;
2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드;
2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드, 트리플루오로아세트산 염;
N-메틸-L-발릴-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드;
N-메틸-L-발릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드; 및
N-메틸-L-발릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드,
또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
E133. E132에 있어서, 아우리스타틴이 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물인 항체 약물 접합체.
E134. E125-E133 중 어느 하나의 항체 약물 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
E135. E1-E14 및 E22-E75 중 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
E136. E15-E19 및 E76-E78 중 어느 하나의 항체를 코딩하는 핵산.
E137. E20, E21 및 E79-E99 중 어느 하나의 화합물의 항체 모이어티를 코딩하는 핵산.
E138. E100-E106, E112-E123 및 E125-E133 중 어느 하나의 항체 약물 접합체의 항체 모이어티를 코딩하는 핵산.
E139. 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이며, 여기서 상기 중쇄 불변 도메인은 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 위치 290에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 것인 핵산.
E140. 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산이며, 여기서 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 것인 단리된 핵산:
(i) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH):
(a) 서열식별번호: 66 또는 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR-H1),
(b) 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR-H2; 및
(c) 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR-H3; 및
(ii) 다음을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL):
(a) 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1),
(b) 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR-L2; 및
(c) 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR-L3.
E141. E135-E140 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
E142. 폴리펩티드 또는 항체를 발현하기에 적합한 조건 하에 E141의 숙주 세포를 배양하고, 상기 폴리펩티드 또는 항체를 단리하는 것을 포함하는, 폴리펩티드 또는 항체를 생산하는 방법.
도 1a-1b는 (a) T(kK183C+K290C)-vc0101 및 (b) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101 ADC를 도시한다. 각각의 흑색 원형은 모노클로날 항체에 접합된 링커/페이로드를 나타낸다. 하나의 이러한 링커/페이로드의 구조는 각각의 ADC에 대해 제시된다. 밑줄표시된 실체는 접합이 발생하는 항체 상의 아미노산 잔기에 의해 공급된다.
도 2a-2e는 트라스투주맙 유래된 항체가 상이한 링커 페이로드에 접합할 때의 체류 시간의 변화를 제시하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)로부터의 선택된 ADC의 스펙트럼을 도시한다.
도 3a-3b는 HER2에 대한 ADC 결합의 그래프를 도시한다. (a) HER2 양성 BT474 세포에 대한 직접 결합 및 (b) BT474 세포에 대한 PE 표지된 트라스투주맙과의 경쟁적 결합. 이들 결과는 이들 ADC에서의 항체의 결합 특성이 접합 과정에 의해 변경되지 않았다는 것을 나타낸다.
도 4는 트라스투주맙 유래된 ADC의 ADCC 활성을 도시한다.
도 5는 HER2 발현의 상이한 수준을 갖는 수많은 세포주에서의 수많은 트라스투주맙 유래된 ADC에 대한 nM 페이로드 농도로 보고된 시험관내 세포독성 데이터 (IC50)를 도시한다.
도 6은 HER2 발현의 상이한 수준을 갖는 수많은 세포주에서의 수많은 트라스투주맙 유래된 ADC에 대한 ng/ml 항체 농도로 보고된 시험관내 세포독성 데이터 (IC50)를 도시한다.
도 7a-7i는 N87 이종이식편에서의 9종의 트라스투주맙 유래된 ADC의 항종양 활성을 시간 경과에 따라 플롯팅한 종양 부피를 사용하여 도시한다. (a) T(kK183C+K290C)-vc0101; (b) T(kK183C)-vc0101; (c) T(K290C)-vc0101; (d) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101; (e) T(K290C+K334C)-vc0101; (f) T(K334C+K392C)-vc0101; (g) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101; (h) T-vc0101; (i) T-DM1. N87 위암 세포는 높은 수준의 HER2를 발현한다.
도 8a-8e는 HCC1954 이종이식편에서의 6종의 트라스투주맙 유래된 ADC의 항종양 활성을 시간 경과에 따라 플롯팅한 종양 부피를 사용하여 도시한다. (a) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101; (b) T(K290C+K334C)-vc0101; (c) T(K334C+K392C)-vc0101; (d) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101; (e) T-DM1. HCC1954 유방암 세포는 높은 수준의 HER2를 발현한다.
도 9a-9g는 JIMT-1 이종이식편에서의 7종의 트라스투주맙 유래된 ADC의 항종양 활성을 시간 경과에 따라 플롯팅한 종양 부피를 사용하여 도시한다. (a) T(kK183C+K290C)-vc0101; (b) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101; (c) T(K290C+K334C)-vc0101; (d) T(K334C+K392C)-vc0101; (e) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101; (f) T-vc0101; (g) T-DM1. JIMT-1 유방암 세포는 중간/낮은 수준의 HER2를 발현한다.
도 10a-10d는 MDA-MB-361(DYT2) 이종이식편에서의 5종의 트라스투주맙 유래된 ADC의 항종양 활성을 시간 경과에 따라 플롯팅한 종양 부피를 사용하여 도시한다. (a) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101; (b) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101; (c) T-vc0101; (d) T-DM1. MDA-MB-361(DYT2) 유방암 세포는 중간/낮은 수준의 HER2를 발현한다.
도 11a-11e는 PDX-144580 환자 유래된 이종이식편에서의 5종의 트라스투주맙 유래된 ADC의 항종양 활성을 시간 경과에 따라 플롯팅한 종양 부피를 사용하여 도시한다. (a) T(kK183C+K290C)-vc0101; (b) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101; (c) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101; (d) T-vc0101; (e) T-DM1. PDX-144580 환자 유래된 세포는 TNBC PDX 모델이다.
도 12a-12d는 PDX-37622 환자 유래된 이종이식편에서의 4종의 트라스투주맙 유래된 ADC의 항종양 활성을 시간 경과에 따라 플롯팅한 종양 부피를 사용하여 도시한다. (a) T(kK183C+K290C)-vc0101; (b) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101; (c) T(K297C+K334C)-vc0101; (d) T-DM1. PDX-37622 환자 유래된 세포는 중간 수준의 HER2를 발현하는 NSCLC PDX 모델이다.
도 13a-13b는 (a) T-DM1 또는 (b) T-vc0101로 처리되고 포스포히스톤 H3 및 IgG 항체에 대해 염색된 N87 종양 이종이식편의 면역조직세포화학을 도시한다. 방관자 활성은 T-vc0101에서 관찰된다.
도 14는 시험관내에서 T-DM1에 대해 저항성을 갖는 세포 (N87-TM1 및 N87-TM2) 또는 T-DM1에 대해 감수성인 모 세포 (N87 세포)에서의 수많은 트라스투주맙 유래된 ADC 및 유리 페이로드에 대한 nM 페이로드 농도 및 ng/ml 항체 농도로 보고된 시험관내 세포독성 데이터 (IC50)를 도시한다. N87 위암 세포는 높은 수준의 HER2를 발현한다.
도 15a-15g는 T-DM1 감수성 (N87 세포) 및 저항성 (N87-TM1 및 N87-TM2) 위암 세포에서의 7종의 트라스투주맙 유래된 ADC의 항종양 활성을 도시한다. (a) T-DM1; (b) T-mc8261; (c) T(297Q+K222R)-AcLysvc0101; (d) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101; (e) T(K290C+K334C)-vc0101; (f) T(K334C+K392C)-vc0101; (g) T(kK183C+K290C)-vc0101.
도 16a-16b는 T-DM1 감수성 (N87 세포) 및 저항성 (N87-TM1 및 N87-TM2) 위암 세포에서의 (a) MRP1 약물 유출 펌프 및 (b) MDR1 약물 유출 펌프 단백질 발현을 제시하는 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 17a-17b는 T-DM1 감수성 (N87 세포) 및 저항성 (N87-TM1 및 N87-TM2) 위암 세포의 HER2 발현 및 트라스투주맙에 대한 결합을 도시한다. (a) HER2 단백질 발현을 제시하는 웨스턴 블롯 및 (b) 세포 표면 HER2에 대한 트라스투주맙 결합.
도 18a-18d는 T-DM1 감수성 (N87 세포) 및 저항성 (N87-TM1 및 N87-TM2) 위암 세포에서의 단백질 발현 수준의 특징화를 도시한다. (a) 523 단백질에서의 단백질 발현 수준 변화; (b) IGF2R, LAMP1 및 CTSB의 단백질 발현을 제시하는 웨스턴 블롯; (c) CAV1의 단백질 발현을 제시하는 웨스턴 블롯; (d) N87 및 N87-TM2 세포의 이식으로부터 생체내 생성된 종양에서의 CAV1 단백질 발현의 IHC.
도 19a-19c는 (a) T-DM1 감수성 N87 모 세포; (b) T-DM1 저항성 N87-TM1 세포; (c) T-DM1 저항성 N87-TM2 세포의 이식으로부터 생체내 생성된 종양의 트라스투주맙 및 다양한 트라스투주맙 유래된 ADC에 대한 감수성을 도시한다.
도 20a-20f는 T-DM1 감수성 N87 모 세포 및 T-DM1 저항성 N87-TM2 또는 N87-TM1 세포의 이식으로부터 생체내 생성된 종양의 트라스투주맙 및 다양한 트라스투주맙 유래된 ADC에 대한 감수성을 도시한다. (a) N87 종양 크기를 트라스투주맙 또는 2종의 트라스투주맙 유래된 ADC의 존재 하에 시간 경과에 따라 플롯팅하였다; (b) N87-TM2 종양 크기를 트라스투주맙 또는 2종의 트라스투주맙 유래된 ADC의 존재 하에 시간 경과에 따라 플롯팅하였다; (c) N87 세포 종양이 트라스투주맙 또는 2종의 트라스투주맙 유래된 ADC의 존재 하에 크기가 두배로 된 시간; (d) N87-TM2 세포 종양이 트라스투주맙 또는 2종의 트라스투주맙 유래된 ADC의 존재 하에 크기가 두배로 된 시간; (e) N87-TM2 종양 크기를 7종의 상이한 트라스투주맙 유래된 ADC의 존재 하에 시간 경과에 따라 플롯팅하였다; (f) N87-TM1 종양 크기를 제14일에 첨가된 트라스투주맙 유래된 ADC의 존재 하에 시간 경과에 따라 플롯팅하였다.
도 21a-21e는 생체내 생성된 T-DM1 저항성 세포의 생성 및 특징화를 도시한다. (a) N87 위암 세포는 생체내 이식하였을 때 T-DM1에 대해 초기에 감수성이었다. (b) 시간 경과에 따라, 이식된 N87 세포는 T-DM1에 대해 저항성을 갖게 되었지만 (c) T-vc0101, (d) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 및 (e) T(kK183+K290C)-vc0101에 대해 감수성인 채로 남아있었다.
도 22a-22d는 T-DM1 감수성 모 N87 세포와 비교하여 생체내 생성된 T-DM1 저항성 세포 (N87-TDM)에서의 4종의 트라스투주맙 유래된 ADC의 시험관내 세포독성을 시간 경과에 따라 플롯팅한 종양 부피를 사용하여 도시한다. (a) T-DM1; (b) T(kK183+K290C)-vc0101; (c) T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101; (d) T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101.
도 23a-23b는 T-DM1 감수성 모 N87 세포와 비교하여 생체내 생성된 T-DM1 저항성 세포 (마우스 2, 17 및 18로부터의 N87-TDM1)에서의 HER2 단백질 발현 수준을 도시한다. (a) FACS 분석 및 (b) 웨스턴 블롯 분석. HER2 단백질 발현에서의 어떤 유의차도 관찰되지 않았다.
도 24a-24d는 N87-TDM1 (마우스 2, 7 및 17)에서의 T-DM1 저항성이 약물 유출 펌프로 인한 것이 아님을 도시한다. (a) MDR1 단백질 발현을 제시하는 웨스턴 블롯. 유리 약물 (b) 0101; (c) 독소루비신; (d) T-DM1의 존재 하에 T-DM1 저항성 세포 (N87-TDM1) 및 T-DM1 감수성 N87 모 세포의 시험관내 세포독성.
도 25a-25b는 (a) 시노몰구스 원숭이에게의 용량 투여 후 총 Ab 및 트라스투주맙 ADC (T-vc0101) 또는 T(kK183C+K290C) 부위 특이적 ADC 둘 다 및 (b) 시노몰구스 원숭이에게의 용량 투여 후 트라스투주맙의 ADC 분석물 (T-vc0101) 또는 다양한 부위 특이적 ADC의 농도 대 시간 프로파일 및 약동학/독성동태학을 도시한다.
도 26은 래트에서 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의한 상대 체류 값 대 노출 (AUC)을 도시한다. X-축은 HIC에 의한 상대 체류 시간을 나타내고; 반면에 Y-축은 래트에서의 약동학적 용량-정규화된 노출 (0 내지 336시간의 항체에 대한 "곡선하 면적", AUC를 10 mg/kg의 약물 용량으로 나눈 것)을 나타낸다. 기호 형상은 대략적인 약물 로딩 (DAR)을 나타낸다: 마름모형=DAR 2; 원형=DAR 4. 화살표는 T(kK183C+K290C)-vc0101을 나타낸다.
도 27은 T-vc0101 통상적인 접합체 ADC 및 T(kK183C+K290C)-vc0101 부위 특이적 ADC를 사용하는 독성 연구를 도시한다. T-vc0101은 5 mg/kg에서 중증 호중구감소증을 유도하였고, 반면에 T(kK183C+K290C)-vc0101은 9 mg/kg에서 호중구 수의 최소 하락을 유발하였다.
도 28a-28c는 (a) T(K290C+K334C)-vc0101; (b) T(K290C+K392C)-vc0101; 및 (c) T(K334C+K392C)-vc0101의 결정 구조를 도시한다. 도 28c에 제시된 바와 같이, 페이로드 기하구조를 고려하면, K290, K334, K392 부위 중 어느 것에서의 접합은 CH2 표면으로부터 떨어져 글리칸의 전체 궤적을 교란시킬 수 있으며 글리칸 및 CH2 구조 그 자체 및 결과적으로 Ch2-Ch3 계면을 탈안정화시킨다.
도 29는 다양한 vc0101 부위 돌연변이 ADC의 3mpk 투여에 대한 종양 성장 플롯 (N87)이다.
도 30은 LP#2에 접합될 때 다양한 부위 돌연변이체의 거동을 예시하는 미가공 SEC 자취이다.
도 31은 실시예 22의 ADC의 혈장 안정성을 제시한다. DAR 계산을 위해 아세틸화 생성물을 함유하는 중쇄 또는 경쇄 (질량 이동 = 993)를 "로딩된" 것으로 계수하였으며 반면에 탈아세틸화 생성물을 함유하는 것 (질량 이동 = 951)을 "비-로딩된 것"으로 계수하였다.
도 32는 DAR에 의해 측정된 바와 같은, 실시예 22의 ADC의 생체내 안정성을 제시한다.
도 33은 WI38-VA13 및 HT-29 세포에서 웨스턴 블롯에 의한 EDB+ FN 발현을 제시한다.
도 34a-34f는 각각의 개별 종양 보유 마우스에 대한 종양 성장 억제 곡선으로서 (a) 0.3, 0.75, 1.5 및 3 mg/kg에서의 EDB-L19-vc-0101; (b) 디술피드 연결된 EDB-L19-diS-DM1의 3 mg/kg 및 10 mg/kg에서의 EDB-L19-vc-0101; (C) 디술피드 연결된 EDB-L19-diS-C2OCO-1569의 1 및 3 mg/kg 및 5 mg/kg에서의 EDB-L19-vc-0101; (D) 각각 0.3, 1 및 3 mg/kg 및 1.5 mg/kg의 용량에서의 부위-특이적 접합된 EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 및 통상적으로 접합된 EDB-L19-vc-0101 (ADC1); (E) 0.3, 1 및 3 mg/kg의 용량에서의 부위-특이적 접합된 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101; 및 (F) 3 mg/kg에서의 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 군의, 인간 암의 높은 EDB+ FN 발현 NSCLC 환자 유래된 이종이식편 (PDX) 모델인 PDX-NSX-11122에서의 항종양 효능을 제시한다.
도 35a-35f는 (a) 0.3, 0.75, 1.5 및 3 mg/mg에서의 EDB-L19-vc-0101; (b) 0.3, 1 및 3 mg/kg에서의 EDB-L19-vc-0101 및 EDB-L19-vc-1569; (c) 각각 0.5, 1.5 및 3 mg/kg 및 0.1, 0.3 및 1 mg/kg에서의 EDB-L19-vc-0101 및 EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI; (d) 0.5, 1.5 및 3 mg/kg에서의 부위-특이적 접합된 EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 및 통상적으로 접합된 EDB-L19-vc-0101; (e) 1 및 3 mg/kg에서의 EDB-L19-vc-0101 및 EDB-(K94R)-vc-0101; 및 (f) 1 및 3 mg/kg에서의 EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 및 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101의, 인간 암의 높은 EDB+ FN 발현 NSCLC 세포주 이종이식편 (CLX) 모델인 H-1975에서의 항종양 효능을 제시한다.
도 36은 3 mg/kg에서의 EDB-L19-vc-0101 및 EDB-L19-vc-9411의, 인간 암의 중간 EDB+ FN 발현 결장 CLX 모델인 HT29에서의 항종양 효능을 제시한다.
도 37a-37b는 (a) 중간 내지 높은 EDB+FN 발현 췌장 PDX인 PDX-PAX-13565; 및 (b) 낮은 내지 중간 EDB+FN 발현 췌장 PDX인 PDX-PAX-12534에서 0.3, 1 및 3 mg/kg에서의 EDB-L19-vc-0101의 항종양 효능을 제시한다.
도 38은 인간 암의 중간 EDB+ FN 발현 림프종 CLX 모델인 라모스에서 1 및 3 mg/kg에서의 EDB-L19-vc-0101의 항종양 효능을 제시한다.
도 39a-39b는 각각의 개별 종양 보유 마우스에 대한 종양 성장 억제 곡선으로서 (a) 4.5 mg/kg에서의 EDB-mut1κK183C-K290C)-vc-0101; 및 (b) 4.5 mg/kg으로 투여된 EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101 군의, 마우스 동계 유방 암종 모델인 EMT-6에서의 항종양 효능을 제시한다.
도 40은 6 mg/kg에서의 부위-특이적 접합된 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4)과 비교하여 5 mg/kg에서의 통상적으로 접합된 EDB-L19-vc-0101에 대한 절대 호중구 수를 제시한다.
도 41은 표적 항원에 대한 항체 X 및 cys 돌연변이체 X(kK183C+K290C)의 경쟁적 결합을 제시한다. X 및 X(kK183C+K290C)를 경쟁 ELISA에서 시험하였으며, 여기서 표적 항원을 플레이트 상에 고정화시키고, 항체 X 및 cys 돌연변이체 X(kK183C+K290C) 둘 다를 일정한 농도의 비오티닐화 모 항체의 존재 하에 연속 희석물로 적용하였다. ELISA 플레이트 상에서 표적 항원 상에 결합한 채로 남아있는 비오티닐화 모 항체의 양을, 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 스트렙타비딘을 적용함으로써 결정하였다 (방법 참조).
도 42는 ADC 또는 비히클로 처리된 암컷 무흉선 마우스에서 Calu-6 인간 NSCLC 이종이식 종양의 성장 곡선을 제시한다. 각각의 처리군에서의 개별 마우스의 평균 종양 부피 (mm3, 평균 ± SEM)를 초기 투여 후의 날들에 대해 플롯팅하였다.
본 발명은 부위-특이적 접합을 위한 치환된 시스테인을 포함하는 폴리펩티드, 항체 및 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 특히, 항체 중쇄 불변 영역 내 위치 290 (카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따름)은 다양한 표적 (HER2를 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 대한 항체를 갖는 항체 약물 접합체 (ADC)를 제조하기 위해 부위 특이적 접합에 사용될 수 있는 것으로 발견되었다. 본원에 예시된 데이터는 위치 290에서 접합된 ADC 구축물이 다른 접합 부위와 비교하여 우수한 생체내 특성을 나타낸다는 것을 입증한다.
예를 들어, 실시예에 제시된 바와 같이, 다양한 접합 부위에서의 접합은 상이한 ADC 특징, 예컨대 생물물리학적 특성 (예를 들어, 소수성), 생물학적 안정성, 접합가능성 및 ADC 효능 (예를 들어, 페이로드 방출 동역학 및 ADC 대사)을 유발할 수 있다.
소수성 링커-페이로드, 예컨대 실시예에 사용된 vc-101은 ADC에 대한 특정한 도전을 만든다. 혈장 클리어런스 비율은 링커-페이로드의 소수성이 증가함에 따라 증가하여, 감소된 생체내 효능을 유발하는 것으로 보고되었다. 따라서, 전체 소수성을 감소시키는 것이 생체내 PK를 개선시킬 수 있는 것으로 제안되었다 (Lyon et al., Nature Biotechnology 33, 733-735 (2015)). 그러나, 본 발명자들은 감소된 소수성이 항상 개선된 PK와 상관관계가 있는 것은 아님을 일련의 실험을 통해 관찰하였다. 실제로, 많은 환경에서, 소수성은 유리한 PK 프로파일에 대한 신뢰할만한 예측인자가 아니다. 추가로, Cys-기재 부위-특이적 접합체에 대한 PK 프로파일은 트랜스글루타미나제 접합체처럼 거동하지 않는다. 따라서, 바람직한 접합 부위를 평가하기 위해 새로운 설계 스킴 및 기준이 필요했다.
본 발명자들에 의한 구조 연구는 바람직한 접합 부위의 선택에 대한 일부 초기 통찰을 제공하였다. 예를 들어, 특정 부위에서의 ADC 접합은 Fc 도메인의 구조를 변경할 수 있거나 또는 이 부위에서의 페이로드의 기하구조 때문에 항체의 글리코실화를 방해할 수 있다. 추가로, 특정 부위는 표면 노출의 적절한 균형을 제공할 수 있으며: 그것은 약물이 접합되도록 하기에 충분히 노출되지만, 약물이 생체내에서 대사되어 너무 빨리 혈장으로부터 클리어런스될 정도로 너무 노출되지는 않는다. 구조 연구에 기초하여, 수많은 후보 부위가 잠재적 접합 부위로서 확인되었다 (예를 들어, 중쇄 290, 392, 경쇄 183).
구조 연구 후, 추가의 검정이 설계되고 수행되었다. 주목할 만하게, 본 발명자들에 의해 평가된 여러 접합 부위 중에서, 위치 290은 초기에 다른 접합 부위와 비교하여 우수한 특성을 나타내지 않았다. 예를 들어, 마우스 모델에 기초한 생체내 약동학 (PK) 데이터는 위치 290이 특히 바람직하다는 것을 시사하지 못했다. 그러나, 시노몰구스 원숭이로부터의 생체내 PK 데이터는 놀랍게도 위치 290에서 접합된 ADC 분자가 이 접합 부위를 임상 용도에 보다 유리하게 만드는 우수한 PK 프로파일을 갖는다는 것을 제시하였다. 부위 290의 이점은 링커-페이로드의 소수성에 기초하여 예측될 수는 없었다.
우수한 생체내 PK 프로파일을 또한 제공한 다른 접합 부위는 392 (중쇄) 및 183 (경쇄)을 포함한다.
유리한 생체내 PK에 추가로, Cys-290 접합체는 또한 매우 낮은 수준의 고분자량 (HMW) 응집 및 유리한 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)을 나타냈다. 특히, 접합 사건은 종종 ADCC 기능의 상실을 유발하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, SGN-70A ADC에 대한 항체 성분인 항-CD70은 ADCC, 항체-의존성 세포성 식세포작용 (ADCP) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC) 기능을 나타냈다. 그럼에도 불구하고, 항-CD70-MMAF 접합체는 FcγR 결합이 결여되어 있다 (Kim et al., Biomol Ther (Seoul). 2015 Nov; 23(6): 493-509). 대조적으로, ADCC 기능은 본원에 개시된 Cys-290 ADC 접합체에서 손상되지 않았다.
추가로, 본원에 예시된 혈액 및 현미경 데이터는 Cys-290을 사용하는 부위-특이적 접합이 또한 통상적인 접합체와 비교하여 ADC (예를 들어, Ab-vc0101) 유도된 독성 (예컨대 호중구감소증 및 골수 독성)을 개선시켰다는 것을 제시한다.
최종적으로, 본원에 제공된 실시예는 또한 ADC 분자의 특정 적용에 따라, 수많은 후보 접합 부위가 특정 문제점을 해결하는데 사용될 수 있다는 것을 제시하였다. 예를 들어, 특정 부위는 보다 우수한 페이로드 대사를 제공하고, 일부 부위는 분자의 전체 소수성을 감소시키고, 일부 부위는 보다 빠른 또는 보다 느린 링커 절단을 가능하게 한다. 이들 바람직한 접합 부위는 ADC 분자의 최적화에 사용될 수 있다. 실시예 21 및 22 참조.
1. 항체-약물 접합체 (ADC)
ADC는, 전형적으로 링커의 사용을 통해 약물 페이로드에 접합된 항체 성분을 포함한다. ADC에 대한 통상적인 접합 전략은 항체 중쇄 및/또는 경쇄 상에 내인성으로 발견되는 리신 또는 시스테인을 통해 항체에 약물 페이로드를 무작위로 접합시키는 것에 의존한다. 따라서, 이러한 ADC는 상이한 약물:항체 비 (DAR)를 나타내는 종의 이종 혼합물이다. 대조적으로, 본원에 개시된 ADC는 항체 중쇄 및/또는 경쇄 상의 특정한 조작된 잔기에서 항체에 약물 페이로드를 접합시키는 부위 특이적 ADC이다. 이에 따라, 부위 특이적 ADC는 한정된 약물:항체 비 (DAR)를 갖는 종으로 구성된 ADC의 동종 집단이다. 따라서, 부위 특이적 ACD는 균일한 화학량론을 나타내어 접합체의 개선된 약동학, 생체분포 및 안전성 프로파일을 가져온다. 본 발명의 ADC는 링커 및/또는 페이로드에 접합된 본 발명의 항체 및 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은 식 Ab-(L-D)의 항체 약물 접합체를 제공하며, 여기서 (a) Ab는 항원에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, (b) L-D는 링커-약물 모이어티이고, 여기서 L은 링커이고, D는 약물이다.
또한 식 Ab-(L-D)p의 항체 약물 접합체가 본 발명에 포괄되며, 여기서 (a) Ab는 HER2에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, (b) L-D는 링커-약물 모이어티이고, 여기서 L은 링커이고, D는 약물이고, (c) p는 항체에 부착된 링커/약물 모이어티의 수이다. 부위 특이적 ADC의 경우, p는 ADC의 동종 성질로 인해 정수이다. 일부 실시양태에서, p는 4이다. 다른 실시양태에서, p는 3이다. 다른 실시양태에서, p는 2이다. 다른 실시양태에서, p는 1이다. 다른 실시양태에서, p는 4 초과이다.
A. 항체 및 접합 부위
본 발명의 폴리펩티드 및 항체는 부위 특이적 방식으로 페이로드에 접합된다. 이 접합 유형을 수용하기 위해, 불변 도메인은 1개 이상의 특정 부위에서 조작된 반응성 시스테인 잔기 (때때로 "Cys" 돌연변이체로 지칭됨)를 제공하도록 변형된다. 또한, 아실 공여자 글루타민-함유 태그 또는 내인성 글루타민이 트랜스글루타미나제 및 아민의 존재 하에 폴리펩티드 조작에 의해 반응성이 되는 트랜스글루타미나제-기재 접합에 사용될 수 있는 항체가 개시된다.
일반적으로, 항체 중쇄 또는 경쇄의 영역은 다양한 부류 구성원의 영역 내의 서열 변이의 상대적 결여에 기초하여 "불변" (C) 영역 또는 "가변" (V) 영역으로 정의된다. 항체의 "불변 영역"은 단독으로 또는 조합으로의 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 지칭할 수 있다. 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 Fc 수용체 (FcR) 결합, 항체-의존성 세포 독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여, 옵소닌화, 보체 의존성 세포독성의 개시, 및 비만 세포 탈과립화를 나타낸다.
항체 중쇄 및 경쇄의 불변 및 가변 영역은 도메인으로 폴딩된다. 이뮤노글로불린의 경쇄 상의 불변 영역은 일반적으로 "CL 도메인"으로 지칭된다. 중쇄의 불변 도메인 (예를 들어 힌지, CH1, CH2 또는 CH3 도메인)은 "CH 도메인"으로 지칭된다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체 (또는 그의 단편)의 불변 영역은 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 또는 그의 임의의 이소형 뿐만 아니라 그의 하위부류 및 돌연변이된 형태 중 어느 하나의 불변 영역으로부터 유래될 수 있다.
CH1 도메인은, 예를 들어 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 위치 약 118-215에 이르는 이뮤노글로불린 중쇄의 제1 (대부분 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고, 이뮤노글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대해 아미노 말단이고, 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 일부를 형성하지 않는다.
힌지 영역은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결하는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. 이 힌지 영역은 대략 25개 잔기를 포함하고, 유연하여, 따라서 2개의 N-말단 항원 결합 영역이 독립적으로 이동할 수 있게 한다. 힌지 영역은 3개의 별개의 도메인으로 세분될 수 있다: 상부, 중간 및 하부 힌지 도메인.
CH2 도메인은, 예를 들어 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 위치 약 231-340에 이르는 중쇄 이뮤노글로불린 분자의 부분을 포함한다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 쌍형성되지 않는다는 점에서 고유하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 쇄가 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 놓여있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체 (또는 그의 단편)는 IgG 분자, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래된 CH2 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, IgG는 인간 IgG이다.
CH3 도메인은 CH2 도메인의 N-말단으로부터 대략 110 잔기, 예를 들어 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 위치 약 341-447에 이르는 중쇄 이뮤노글로불린 분자의 부분을 포함한다. CH3 도메인은 전형적으로 항체의 C-말단 부분을 형성한다. 그러나, 일부 이뮤노글로불린에서, 추가의 도메인은 CH3 도메인으로부터 연장되어 분자의 C-말단 부분을 형성할 수 있다 (예를 들어 IgM의 μ 쇄 및 IgE의 ε 쇄 내의 CH4 도메인). 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체 (또는 그의 단편)는 IgG 분자, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래된 CH3 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, IgG는 인간 IgG이다.
CL 도메인은, 예를 들어 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 위치 약 108-214에 이르는 이뮤노글로불린 경쇄의 불변 영역 도메인을 포함한다. CL 도메인은 VL 도메인에 인접한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체 (또는 그의 단편)는 카파 경쇄 불변 도메인 (CLκ)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체 (또는 그의 단편)는 람다 경쇄 불변 도메인 (CLλ)을 포함한다. CLκ는 공지된 다형성 유전자좌 CLκ-V/A45 및 CLκ-L/V83 (카바트 넘버링을 사용함)을 가지며 따라서 다형성 Km(1): CLκ-V45/L83; Km(1,2): CLκ-A45/ L83; 및 Km(3): CLκ-A45/V83이 가능하다. 본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 ADC는 이들 경쇄 불변 영역 중 어느 것을 갖는 항체 성분을 가질 수 있다.
Fc 영역은 일반적으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터 또는 Pro230으로부터 (카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따름) 그의 카르복실-말단까지의 신장부로 정의된다. 본 발명의 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 위치 290에 치환된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본원에 개시 및 예시된 바와 같이, 위치 290에서의 접합은 놀랍게도 바람직한 생체내 PK 프로파일을 제공하였다.
추가의 시스테인 치환, 예컨대 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 위치 118, 246, 249, 265, 267, 270, 276, 278, 283, 292, 293, 294, 300, 302, 303, 314, 315, 318, 320, 332, 333, 334, 336, 345, 347, 354, 355, 358, 360, 362, 370, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 390, 392, 393, 401, 404, 411, 413, 414, 416, 418, 419, 421, 428, 431, 432, 437, 438, 439, 443, 444 또는 그의 임의의 조합이 도입될 수 있다. 특히, 위치 118, 334, 347, 373, 375, 380, 388, 392, 421, 443 또는 그의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 잔기 118은 또한 실시예에서 A114, A114C, C114 또는 114C로 지칭되는데, 이 부위의 초기 공개가 EU 인덱스 (118) 대신에 카바트 넘버링 (114)를 사용하였고 그 이후로 114 부위로서 관련 기술분야에서 일반적으로 지칭되어 왔기 때문이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 폴리펩티드 및 (b) (i) 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 위치 183에 조작된 시스테인 잔기; 또는 (ii) 항체 경쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 63과 정렬되는 경우에 서열식별번호: 63의 잔기 76에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 폴리펩티드 및 (b) (i) 카바트의 넘버링에 따른 위치 110, 111, 125, 149, 155, 158, 161, 185, 188, 189, 191, 197, 205, 206, 207, 208, 210 또는 그의 임의의 조합에 조작된 시스테인 잔기; (ii) 항체 경쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 63 (카파 경쇄)과 정렬되는 경우에 서열식별번호: 63의 잔기 4, 42, 81, 100, 103 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기; 또는 (iii) 항체 경쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 64 (람다 경쇄)와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 64의 잔기 4, 5, 19, 43, 49, 52, 55, 78, 81, 82, 84, 90, 96, 97, 98, 99, 101 또는 그의 임의의 조합에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 폴리펩티드 및 (b) (i) 카바트의 넘버링에 따른 위치 111, 149, 188, 207, 210 또는 그의 임의의 조합 (바람직하게는 111 또는 210)에 조작된 시스테인 잔기; 또는 (ii) 항체 카파 경쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 63과 정렬되는 경우에 서열식별번호: 63의 잔기 4, 42, 81, 100, 103 또는 그의 임의의 조합 (바람직하게는 잔기 4 또는 103)에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 폴리펩티드 및 (b) (i) 카바트의 넘버링에 따른 위치 110, 111, 125, 149, 155, 158, 161, 185, 188, 189, 191, 197, 205, 206, 207, 208, 210 또는 그의 임의의 조합 (바람직하게는 110, 111, 125, 149 또는 155)에 조작된 시스테인 잔기; 또는 (ii) 항체 람다 경쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 64와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 64의 잔기 4, 5, 19, 43, 49, 52, 55, 78, 81, 82, 84, 90, 96, 97, 98, 99, 101 또는 그의 임의의 조합 (바람직하게는 잔기 4, 5, 19, 43 또는 49)에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 람다 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
아미노산 변형은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있고, 많은 이러한 방법은 널리 공지되어 있고 통상의 기술자에게 상용적이다. 예를 들어, 비제한적으로, 아미노산 치환, 결실 및 삽입은 임의의 널리 공지된 PCR-기반 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 아미노산 치환은 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 이루어질 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Zoller and Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; 및 Kunkel, 1985, PNAS 82:488] 참조).
항원 결합의 유지가 요구되는 적용에서, 이러한 변형은 항체의 항원 결합 능력을 파괴하지 않는 부위에서 이루어져야 한다. 바람직한 실시양태에서, 1개 이상의 변형은 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역에서 이루어진다.
전형적으로, 표적에 관하여 항체에 대한 KD는 또 다른 비-표적 분자, 예컨대 비제한적으로, 무관한 물질 또는 환경에 수반되는 물질에 관한 KD보다 2배, 바람직하게는 5배, 보다 바람직하게는 10배 더 적을 것이다. 보다 바람직하게, KD는 비-표적 분자에 관한 KD보다 50배 더 적을 것이며, 예컨대 100배 또는 200배 더 적을 것이고; 보다 더 바람직하게는 500배 더 적을 것이며, 예컨대 1,000배 또는 10,000배 더 적을 것이다.
이 해리 상수의 값은 널리 공지된 방법에 의해 직접적으로 결정될 수 있고, 예를 들어 문헌 [Caceci et al., 1984, Byte 9: 340-362]에 제시된 바와 같은 방법에 의해 심지어 복합 혼합물에 대해서도 계산될 수 있다. 예를 들어, KD는 문헌 [Wong and Lohman, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5428-5432]에 개시된 바와 같은 이중-필터 니트로셀룰로스 필터 결합 검정을 사용하여 확립될 수 있다. 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA 및 유동 세포측정법 분석을 포함한, 표적에 대한 리간드, 예컨대 항체의 결합 능력을 평가하는 다른 표준 검정이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 항체의 결합 동역학 및 결합 친화도는 또한 관련 기술분야에 공지된 표준 검정, 예컨대 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해, 예를 들어 비아코어(Biacore)™ 시스템을 사용함으로써 평가될 수 있다.
항체가 표적에 결합하는 것을 그러한 표적의 또 다른 리간드, 예컨대 또 다른 항체가 표적에 결합하는 것과 비교하는 경쟁적 결합 검정이 수행될 수 있다. 50 퍼센트 결합 억제가 발생되는 농도는 Ki로 공지되어 있다. 이상적 조건 하에, Ki는 KD와 등가이다. Ki 값은 결코 KD보다 낮지 않을 것이므로, KD에 대한 상한치를 제공하기 위해 Ki의 측정을 편리하게 대체시킬 수 있다.
본 발명의 항체는 그의 표적에 대한 KD가 약 1x10-3 M 이하, 예컨대 약 1x10-3 M 이하, 약 9x10-4 M 이하, 약 8x10-4 M 이하, 약 7x10-4 M 이하, 약 6x10-4 M 이하, 약 5x10-4 M 이하, 약 4x10-4 M 이하, 약 3x10-4 M 이하, 약 2x10-4 M 이하, 약 1x10-4 M 이하, 약 9x10-5 M 이하, 약 8x10-5 M 이하, 약 7x10-5 M 이하, 약 6x10-5 M 이하, 약 5x10-5 M 이하, 약 4x10-5 M 이하, 약 3x10-5 M 이하, 약 2x10-5 M 이하, 약 1x10-5 M 이하, 약 9x10-6 M 이하, 약 8x10-6 M 이하, 약 7x10-6 M 이하, 약 6x10-6 M 이하, 약 5x10-6 M 이하, 약 4x10-6 M 이하, 약 3x10-6 M 이하, 약 2x10-6 M 이하, 약 1x10-6 M 이하, 약 9x10-7 M 이하, 약 8x10-7 M 이하, 약 7x10-7 M 이하, 약 6x10-7 M 이하, 약 5x10-7 M 이하, 약 4x10-7 M 이하, 약 3x10-7 M 이하, 약 2x10-7 M 이하, 약 1x10-7 M 이하, 약 9x10-8 M 이하, 약 8x10-8 M 이하, 약 7x10-8 M 이하, 약 6x10-8 M 이하, 약 5x10-8 M 이하, 약 4x10-8 M 이하, 약 3x10-8 M 이하, 약 2x10-8 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 9x10-9 M 이하, 약 8x10-9 M 이하, 약 7x10-9 M 이하, 약 6x10-9 M 이하, 약 5x10-9 M 이하, 약 4x10-9 M 이하, 약 3x10-9 M 이하, 약 2x10-9 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1 x 10-3 M 내지 약 1 x 10-13 M, 1 x 10-4 M 내지 약 1 x 10-13 M, 1 x 10-5 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 1 x 10-6 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 1 x 10-7 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 1 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-13 M, 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-13 M, 1 x 10-3 M 내지 약 1 x 10-12 M, 1 x 10-4 M 내지 약 1 x 10-12 M, 약 1 x 10-5 M 내지 약 1 x 10-12 M, 약 1 x 10-6 M 내지 약 1 x 10-12 M, 약 1 x 10-7 M 내지 약 1 x 10-12 M, 약 1 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-12 M, 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M, 1 x 10-3 M 내지 약 1 x 10-11 M, 1 x 10-4 M 내지 약 1 x 10-11 M, 약 1 x 10-5 M 내지 약 1 x 10-11 M, 약 1 x 10-6 M 내지 약 1 x 10-11 M, 약 1 x 10-7 M 내지 약 1 x 10-11 M, 약 1 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-11 M, 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-11 M, 1 x 10-3 M 내지 약 1 x 10-10 M, 1 x 10-4 M 내지 약 1 x 10-10 M, 약 1 x 10-5 M 내지 약 1 x 10-10 M, 약 1 x 10-6 M 내지 약 1 x 10-10 M, 약 1 x 10-7 M 내지 약 1 x 10-10 M, 약 1 x 10-8 M 내지 약 1 x 10-10 M, 또는 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-10 M일 수 있다.
일반적으로 나노몰 범위의 KD가 바람직하지만, 특정 실시양태에서, 예를 들어 구획에서 고도로 발현된 수용체를 표적화하고 오프-타켓 결합을 피하기 위해 낮은 친화도 항체가 바람직할 수 있다. 추가로, 일부 치료 용도는 항체 재순환을 용이하게 하기 위해 보다 낮은 결합 친화도를 갖는 항체로부터 이익을 얻을 수 있다.
본 개시내용의 항체는 그의 천연 대응물의 항원 결합 능력을 유지하여야 한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 Cys 치환 전 항체와 비교하여 본질적으로 동일한 친화도를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 Cys 치환 전 항체와 비교하여 감소된 친화도를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 Cys 치환 전 항체와 비교하여 증진된 친화도를 나타낸다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 Cys 치환 전 항체의 KD와 거의 동일한 해리 상수 (KD)를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 그의 동족 항원에 대한 해리 상수 (KD)가 Cys 치환 전 항체의 KD와 비교하여 약 1배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 약 250배, 약 300배, 약 400배, 약 500배, 약 600배, 약 700배, 약 800배, 약 900배, 또는 약 1000배 더 클 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 그의 동족 항원에 대한 KD가 Cys 치환 전 항체의 KD와 비교하여 약 1배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 약 100배, 약 150배, 약 200배, 약 250배, 약 300배, 약 400배, 약 500배, 약 600배, 약 700배, 약 800배, 약 900배, 또는 약 1000배 더 낮을 수 있다.
본 발명의 ADC를 제조하는데 사용된 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 발현 또는 증식을 위한 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 관심 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포에서 벡터 내에 유지될 수 있고, 이어서 숙주 세포는 향후 사용을 위해 확장 및 동결될 수 있다.
표 1은 본 발명의 부위 특이적 ADC를 구축하는데 사용된 인간화 HER2 항체의 아미노산 (단백질) 서열을 제공한다. 제시된 CDR은 카바트 넘버링에 의해 정의된다.
표 1에 제시된 항체 중쇄 및 경쇄는 트라스투주맙 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 갖는다. 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역은 트라스투주맙으로부터 유도체화되고, 본 발명의 ADC를 제조하는 경우에 부위 특이적 접합을 가능하게 하기 위한 1종 이상의 변형을 함유한다.
부위 특이적 접합을 가능하게 하기 위한 항체 불변 영역에서의 아미노산 서열에 대한 변형은 밑줄표시 및 볼드체이다. 트라스투주맙으로부터 유도체화된 항체에 대한 명명법은 T (트라스투주맙에 대한 것) 및 이어서 야생형 잔기에 대한 단일 문자 아미노산 코드와 이 옆에 변형 아미노산의 위치 및 유도체화된 항체에서 현재 그 위치에 있는 잔기에 대한 단일 문자 아미노산 코드이다. 이 명명법에 대한 2가지 예외는 경쇄 (카파) 상의 위치 183이 리신에서 시스테인으로 변형된 "kK183C" 및 경쇄 불변 영역의 C 말단에 부착된 8개의 아미노산 글루타민-함유 태그를 나타내는 "LCQ05"이다.
표 1에 제시된 변형 중 하나는 접합에 사용되지 않는다. 중쇄 상의 위치 222에서의 잔기 (카바트의 EU 인덱스를 사용함)는 변경되어 보다 동종인 항체 및 페이로드 접합체, 항체와 페이로드 사이의 보다 우수한 분자간 가교 및/또는 쇄간 가교의 유의한 감소를 유발할 수 있다.
표 1: 인간화 HER2 항체의 서열
Figure pct00014
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Figure pct00016
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ADC는 단독 또는 다른 위치와 조합된 위치 290 (카바트의 EU 인덱스에 따름)에서의 조작된 시스테인을 통한 부위 특이적 접합을 사용하여 임의의 항원에 대해 지시된 항체 성분으로 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인 (즉, 모든 6개의 CDR을 갖는 가변 영역, 또는 항체 가변 영역에 대해 적어도 90 퍼센트 동일한 동등한 영역), 다음으로 이루어진 군: 아바고보맙, 아바타셉트 (오렌시아(ORENCIA)®), 압식시맙 (레오프로(REOPRO)®, c7E3 Fab), 아달리무맙 (휴미라(HUMIRA)®), 아데카투무맙, 알렘투주맙 (캄파트(CAMPATH)®, 맙캄파트 또는 캄파트-1H), 알투모맙, 아펠리모맙, 아나투모맙 메페나톡스, 아네투무맙, 안루키주맙, 아르시투모맙, 아셀리주맙, 아틀리주맙, 아토롤리무맙, 바피뉴주맙, 바실릭시맙 (시뮬렉트(SIMULECT)®), 바비툭시맙, 벡투모맙 (림포스캔(LYMPHOSCAN)®), 벨리무맙 (림포-스타트-비(LYMPHO-STAT-B)®), 베르틸리무맙, 베실레소맙, βcept (엔브렐(ENBREL)®), 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)®), 비시로맙 브랄로바르비탈, 비바투주맙 메르탄신, 브렌툭시맙 베도틴 (애드세트리스(ADCETRIS)®), 카나키누맙 (ACZ885), 칸투주맙 메르탄신, 카프로맙 (프로스타신트(PROSTASCINT)®), 카투막소맙 (레모밥(REMOVAB)®), 세델리주맙 (심지아(CIMZIA)®), 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX)®), 클레놀릭시맙, 다세투주맙, 다클릭시맙, 다클리주맙 (제나팍스(ZENAPAX)®), 데노수맙 (AMG 162), 데투모맙, 도를리모맙 아리톡스, 도를릭시주맙, 둔투무맙, 두리물루맙, 두르물루맙, 에크로멕시맙, 에쿨리주맙 (솔리리스(SOLIRIS)®), 에도바코맙, 에드레콜로맙 (Mabl7-1A, 파노렉스(PANOREX)®), 에팔리주맙 (랍티바(RAPTIVA)®), 에펀구맙 (미코그랍(MYCOGRAB)®), 엘실리모맙, 엔리모맙 페골, 에피투모맙 시툭세탄, 에팔리주맙, 에피투모맙, 에프라투주맙, 에를리주맙, 에르투막소맙 (렉소문(REXOMUN)®), 에타라시주맙 (에타라투주맙, 비탁신(VITAXIN)®, 아베그린(ABEGRIN)™), 엑스비비루맙, 파놀레소맙 (뉴트로스펙(NEUTROSPEC)®), 파랄리모맙, 펠비주맙, 폰톨리주맙 (휴자프(HUZAF)®), 갈릭시맙, 간테네루맙, 가빌리모맙 (ABX-CBL(R)), 겜투주맙 오조가미신 (밀로타르그(MYLOTARG)®), 골리무맙 (CNTO 148), 고밀릭시맙, 이발리주맙 (TNX-355), 이브리투모맙 티욱세탄 (제발린(ZEVALIN)®), 이고보맙, 임시로맙, 인플릭시맙 (레미케이드(REMICADE)®), 이놀리모맙, 이노투주맙 오조가미신, 이필리무맙 (예르보이(YERVOY)®, MDX-010), 이라투무맙, 켈릭시맙, 라베투주맙, 레말레소맙, 레브릴리주맙, 레르델리무맙, 렉사투무맙 (HGS-ETR2, ETR2-ST01), 렉시투무맙, 리비비루맙, 린투주맙, 루카투무맙, 루밀릭시맙, 마파투무맙 (HGS-ETRl, TRM-I), 마슬리모맙, 마투주맙 (EMD72000), 메폴리주맙 (보사트리아(BOSATRIA)®), 메텔리무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미투모맙, 모롤리무맙, 모타비주맙 (누막스(NUMAX)™), 무로모납 (OKT3), 나콜로맙 타페나톡스, 나프투모맙 에스타페나톡스, 나탈리주맙 (티사브리(TYSABRI)®, 안테그렌(ANTEGREN)®), 네바쿠맙, 네렐리모맙, 니모투주맙 (테라심 hR3(THERACIM hR3)®, 테라-심-hR3(THERA-CIM-hR3)®, 테라록(THERALOC)®), 노페투모맙 메르펜탄 (베르루마(VERLUMA)®), 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오파투무맙, 오말리주맙 (졸레어(XOLAIR)®), 오레고보맙 (오바렉스(OVAREX)®), 오텔릭시주맙, 파기박시맙, 팔리비주맙 (시나기스(SYNAGIS)®), 파니투무맙 (ABX-EGF, 벡티빅스(VECTIBIX)®), 파스콜리주맙, 펨투모맙 (테라긴(THERAGYN)®), 페르투주맙 (2C4, 옴니타르그(OMNITARG)®), 펙셀리주맙, 핀투모맙, 포네주맙, 프릴릭시맙, 프리투무맙, 라니비주맙 (루센티스(LUCENTIS)®), 락시바쿠맙, 레가비루맙, 레슬리주맙, 리툭시맙 (리툭산(RITUXAN)®, 맙테라(MabTHERA)®), 로벨리주맙, 루플리주맙, 사투모맙, 세비루맙, 시브로투주맙, 시플리주맙 (MEDI-507), 손투주맙, 스타물루맙 (Myo-029), 술레소맙 (류코스캔(LEUKOSCAN)®), 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 타플리투모맙 팝톡스, 테피바주맙 (아우렉시스(AUREXIS)®), 텔리모맙 아리톡스, 테넬릭시맙, 테플리주맙, 티실리무맙, 토실리주맙 (악템라(ACTEMRA)®), 토랄리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레멜리무맙 (CP-675,206), 투코투주맙 셀모류킨, 투비루맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙 (CNTO 1275), 바팔릭시맙, 벨투주맙, 베팔리모맙, 비실리주맙 (누비온(NUVION)®), 볼로식시맙 (M200), 보투무맙 (휴마스펙트(HUMASPECT)®), 잘루투무맙, 자놀리무맙 (휴맥스-CD4), 지랄리무맙, 또는 졸리모맙 아리톡스.
일부 실시양태에서 항원 결합 도메인은 6개의 CDR 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고/거나, 이전 목록으로부터 선택된 항체와 결합에 대해 경쟁한다. 일부 실시양태에서 항원 결합 도메인은 이전 목록에서의 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서 항원 결합 도메인은 6개의 총 CDR을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 이전 목록에서의 항체와 동일한 항원에 결합한다.
일부 실시양태에서 항원 결합 도메인은 6개의 총 CDR을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합한다: PDGFRα, PDGFRβ, PDGF, VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, FGF, FGF2, HGF, KDR, FLT-1, FLK-1, Ang-2, Ang-1, PLGF, CEA, CXCL13, BAFF, IL-21, CCL21, TNF-α, CXCL12, SDF-I, bFGF, MAC-I, IL23p19, FPR, IGFBP4, CXCR3, TLR4, CXCR2, EphA2, EphA4, 에프린B2, EGFR(ErbBl), HER2(ErbB2 또는 pl85neu), HER3(ErbB3), HER4 ErbB4 또는 tyro2), SCl, LRP5, LRP6, RAGE, s100A8, s100A9, Navl.7, GLPl, RSV, RSV F 단백질, 인플루엔자 HA 단백질, 인플루엔자 NA 단백질, HMGBl, CD16, CD19, CD20, CD21, CD28, CD32, CD32b, CD64, CD79, CD22, ICAM-I, FGFRl, FGFR2, HDGF, EphB4, GITR, β-아밀로이드, hMPV, PIV-I, PIV-2, OX40L, IGFBP3, cMet, PD-I, PLGF, 네프로리신, CTD, IL- 18, IL-6, CXCL- 13, IL-IRl, IL-15, IL-4R, IgE, PAI-I, NGF, EphA2, uPARt, DLL-4, αvβ5, αvβ6, α5β1, α3β1, 인터페론 수용체 유형 I 및 유형 II, CD 19, ICOS, IL- 17, 인자 II, Hsp90, IGF, IGF-I, IGF-II, CD 19, GM-CSFR, PIV-3, CMV, IL- 13, IL-9, 및 EBV.
일부 실시양태에서 항원 결합 도메인은 TNF 슈퍼패밀리의 구성원 (수용체 또는 리간드)에 특이적으로 결합한다. TNF 슈퍼패밀리 구성원은 종양 괴사 인자-α ("TNF-α"), 종양 괴사 인자-β ("TNF-β"), 림프독소-α ("LT-α"), CD30 리간드, CD27 리간드, CD40 리간드, 4-1 BB 리간드, 아포-1 리간드 (또한 Fas 리간드 또는 CD95 리간드로 지칭됨), 아포-2 리간드 (또한 TRAIL로 지칭됨), 아포-3 리간드 (또한 TWEAK으로 지칭됨), 오스테오프로테게린 (OPG), APRIL, RANK 리간드 (또한 TRANCE로 지칭됨), TALL-I (또한 BIyS, BAFF 또는 THANK로 지칭됨), DR4, DR5 (또한 Apo-2, TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2, 또는 KILLER로 공지됨), DR6, DcRl, DcR2, DcR3 (또한 TR6 또는 M68로 공지됨), CARl, HVEM (또한 ATAR 또는 TR2로 공지됨), GITR, ZTNFR-5, NTR-I, TNFLl, CD30, LTBr, 4-1BB 수용체 및 TR9를 포함하나 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서 항원 결합 도메인은 5T4, ABL, ABCB5, ABCFl, ACVRl, ACVRlB, ACVR2, ACVR2B, ACVRLl, AD0RA2A, 아그레칸, AGR2, AICDA, AIFI, AIGl, AKAPl, AKAP2, AMH, AMHR2, 안지오제닌 (ANG), ANGPTl, ANGPT2, ANGPTL3, ANGPTL4, 아넥신 A2, ANPEP, APC, APOCl, AR, 아로마타제, ATX, AXl, AZGPl (아연-a-당단백질), B7.1, B7.2, B7-H1, BAD, BAFF, BAG1, BAIl, BCR, BCL2, BCL6, BDNF, BLNK, BLRl (MDR15), BIyS, BMP1, BMP2, BMP3B (GDFlO), BMP4, BMP6, BMP7, BMP8, BMP9, BMP11, BMP12, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BPAGl (플렉틴), BRCAl, C19orflO (IL27w), C3, C4A, C5, C5R1, CANTl, CASPl, CASP4, CAVl, CCBP2 (D6 / JAB61), CCLl (1-309), CCLI 1 (에오탁신), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-Id), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), MCAF, CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MEP-2), SLC, 엑소두스-2, CCL22(MDC / STC-I), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2/에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26(에오탁신-3), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CCL3 (MIP-Ia), CCL4 (MIP-Ib), CCL5(RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCNAl, CCNA2, CCNDl, CCNEl, CCNE2, CCRl (CKRl / HM145), CCR2 (mcp-IRB / RA),CCR3 (CKR3 / CMKBR3), CCR4, CCR5(CMKBR5 / ChemR13), CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6), CCR7 (CKR7 / EBI1),CCR8 (CMKBR8 / TERl / CKR-Ll), CCR9 (GPR-9-6), CCRLl (VSHKl), CCRL2 (L-CCR),CD164, CD19, CDlC, CD20, CD200, CD-22, CD24, CD28, CD3, CD33, CD35, CD37, CD38, CD3E, CD3G,CD3Z, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45RB, CD46, CD52, CD69, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CD8, CD80, CD81, CD83, CD86, CD105, CD137, CDHl (E-카드헤린), CDCP1CDH10, CDH12, CDH13, CDH18,CDH19, CDH20, CDH5, CDH7, CDH8, CDH9, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, CDKNlA (p21Wapl/Cipl), CDKNlB (p27Kipl), CDKNlC, CDKN2A (pl6INK4a),CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CEBPB, CERl, CHGA, CHGB, 키티나제, CHSTlO, CKLFSF2,CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, CLDN3, CLDN7 (클라우딘- 7), CLN3, CLU (클루스테린), CMKLRl, CMKORl (RDCl), CNRl, COLl 8Al, COL1A1.COL4A3, COL6A1, CR2, Cripto, CRP, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTLA4, CTL8, CTNNBl (b-카테닌), CTSB (카텝신 B), CX3CL1 (SCYDl), CX3CR1 (V28), CXCLl(GROl), CXCLlO (IP-IO), CXCL11 (I-TAC / IP-9), CXCL12 (SDFl), CXCL13, CXCL 14,CXCL 16, CXCL2 (GR02), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78 / LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR4, CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo),CYB5, CYCl, Cyr61, CYSLTRl, c-Met, DAB2IP, DES, DKFZp451J0118, DNCLl, DPP4, E2F1, ECGFl5EDGl, EFNAl, EFNA3, EFNB2, EGF, ELAC2, ENG, 엔도글린, ENOl, EN02, EN03, EPHAl, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHAlO, EPHBl, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, EPHRIN-Al, EPHRIN-A2, EPHRIN-A3, EPHRIN-A4, EPHRIN-A5, EPHRIN-A6, EPHRIN-Bl, EPHRIN-B2, EPHRTN-B3, EPHB4,EPG, ERBB2 (Her-2), EREG, ERK8, 에스트로겐 수용체, ESRl, ESR2, F3 (TF), FADD, 파르네실트랜스퍼라제, FasL, FASNf, FCER1A,FCER2, FCGR3A, FGF, FGF1 (aFGF), FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2 (bFGF), FGF20, FGF21 (예컨대 mimAb1), FGF22, FGF23, FGF3 (int-2),FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF8, FGF9, FGFR3, FIGF (VEGFD), FILl(EPSILON), FBLl (ZETA), FLJ12584, FLJ25530, FLRTl (피브로넥틴), FLTl, FLT-3, FOS, FOSLl(FRA-I), FY (DARC), GABRP (GABAa), GAGEBl, GAGECl, GALNAC4S-6ST, GATA3, GD2, GD3, GDF5, GDF8, GFIl, GGTl, GM-CSF, GNASl, GNRHl, GPR2 (CCRlO), GPR31, GPR44, GPR81 (FKSG80), GRCClO (ClO), 그렘린, GRP, GSN (겔솔린), GSTPl, HAVCR2, HDAC, HDAC4, HDAC5,HDAC7A, HDAC9, 헤지호그, HGF, HIFlA, HIPl, 히스타민 및 히스타민 수용체, HLA-A, HLA-DRA, HM74, HMOXl, HSP90, HUMCYT2A, ICEBERG, ICOSL, ID2, IFN-a, IFNAl, IFNA2, IFNA4,IFNA5, EFNA6, BFNA7, IFNB1, IFN감마, IFNWl, IGBPl, IGF1, IGF1R, IGF2, IGFBP2,IGFBP3, IGFBP6, DL-I, ILlO, ILlORA, ILlORB, IL-1, ILlRl (CD121a), ILlR2(CD121b), IL- IRA, IL-2, IL2RA (CD25), IL2RB(CD122), IL2RG(CD132), IL-4, IL-4R(CD123), IL-5, IL5RA(CD125), IL3RB(CD131), IL-6, IL6RA (CD126), IR6RB(CD130), IL-7, IL7RA(CD127), IL-8, CXCRl (IL8RA), CXCR2 (IL8RB/CD128), IL-9, IL9R (CD129), IL-10, IL10RA(CD210), IL10RB(CDW210B), IL-11, ILl IRA, IL-12, IL-12A, IL-12B, IL- 12RB1, IL-12RB2, IL-13, IL13RA1, IL13RA2, IL14, IL15, IL15RA, 1L16, IL17, IL17A, IL17B, IL17C, IL17R, IL18, IL18BP, IL18R1, IL18RAP, IL19, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, DL1F9, IL1HYl, IL1R1, IL1R2, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RL1, IL1RL2, IL1RN, IL2, IL20, IL20RA, IL21R, IL22, IL22R, IL22RA2, IL23,DL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL30, IL3RA, IL4,IL4R, IL6ST (당단백질 130), ILK, INHA, INHBA, INSL3, INSL4, IRAKI, IRAK2, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA6 (α 6 인테그린), ITGAV, ITGB3, ITGB4 (β 4 인테그린), JAK1, JAK3, JTB, JUN,K6HF, KAIl, KDR, KIM-1, KITLG, KLF5 (GC Box BP), KLF6, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, KRT1, KRT19 (케라틴 19), KRT2A, KRTHB6 (모발-특이적 유형 II 케라틴), LAMA5, LEP (렙틴), Lingo- p75, Lingo-Troy, LPS, LRP5, LRP6, LTA (TNF- b), LTB, LTB4R (GPR16), LTB4R2, LTBR, MACMARCKS, MAG 또는 Omgp, MAP2K7 (c-Jun), MCP-I, MDK, MIBl, 미드카인, MIF, MISRII, MJP-2,MK, MKI67 (Ki-67), MMP2, MMP9, MS4A1, MSMB,MT3 (메탈로티오넥틴-Ui), mTOR, MTSSl, MUCl (뮤신), MYC, MYD88, NCK2, 뉴로칸, 뉴레귤린-1, 뉴로필린-1, NFKBl, NFKB2, NGFB (NGF), NGFR, NgR-Lingo, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR- p75, NgR-Troy, NMEl (NM23A), NOTCH, NOTCH1, N0X5, NPPB, NROBl, NR0B2, NRlDl, NR1D2, NR1H2, NR1H3, NR1H4, NR1I2, NR1I3, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NR6A1, NRPl, NRP2, NT5E, NTN4, OCT-1, ODZ1, OPN1, OPN2, OPRDl, P2RX7, PAP, PARTl, PATE, PAWR, PCA3, PCDGF, PCNA, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMl, peg-아스파라기나제, PF4 (CXCL4), 플렉신 B2 (PLXNB2), PGF, PGR, 포스파칸, PIAS2, PI3 키나제, PIK3CG, PLAU (uPA), PLG5PLXDCl, PKC, PKC-β, PPBP (CXCL7), PPID, PRl, PRKCQ, PRKDl, PRL, PROC, PROK2, pro-NGF, 프로사포신, PSAP, PSCA, PTAFR, PTEN, PTGS2 (COX-2), PTN, RAC2 (P21Rac2), RANK, RANK 리간드, RARB, RGSl, RGS13, RGS3,RNFI10 (ZNF144), Ron, R0B02, RXR, 셀렉틴, S100A2, S100A8, S100A9, SCGB 1D2 (리포필린 B), SCGB2A1 (맘마글로빈 2),SCGB2A2 (맘마글로빈 1), SCYEl (내피 단핵구-활성화 시토카인), SDF2, SERPENA1, SERPINA3, SERPINB5 (마스핀), SERPINEl (PAI-I), SERPINFl, SHIP-I, SHIP-2, SHBl, SHB2, SHBG, SfcAZ,SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, SLIT2, SPPl, SPRRlB (Sprl), ST6GAL1, STABl, STAT6, STEAP, STEAP2, SULF-1, Sulf-2, TB4R2, TBX21, TCPlO, TDGFl, TEK, TGFA, TGFB1, TGFBlIl, TGFB2,TGFB3, TGFBI, TGFBRl, TGFBR2, TGFBR3, THlL, THBSl (트롬보스폰딘-1), THBS2/THBS4, THPO, TIE (Tie-1), TIMP3, 조직 인자, TIKI2, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6JLR7, TLR8, TLR9, TM4SF1, TNF, TNF-a, TNFAIP2 (B94), TNFAIP3, TNFRSFIlA, TNFRSFlA, TNFRSFlB, TNFRSF21, TNFRSF5, TNFRSF6 (Fas), TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFSFlO (TRAIL), TNFSFl 1 (TRANCE), TNFSF12 (AP03L), TNFSF13 (April), TNFSF13B,TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF 18, TNFSF4 (OX40 리간드), TNFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1BB 리간드), TOLLIP, 톨-유사 수용체, TLR2, TLR4, TLR9, T0P2A (토포이소머라제 Iia), TP53, TPMl, TPM2,TRADD, TRAFl, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, TRKA, TREMl, TREM2, TRPC6, TROY, TSLP, TWEAK, 티로시나제, uPAR, VEGF, VEGFB, VEGFC, 베르시칸, VHL C5, VLA-4, Wnt-1, XCLl (림포탁틴), XCL2 (SCM-Ib), XCRl (GPR5 / CCXCRl), YYl, 및 ZFPM2를 포함하나 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택된 1종 이상 표적에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 피브로넥틴 (FN)의 엑스트라-도메인 B (EDB)에 결합한다. FN-EDB는 선택적 스플라이싱의 메카니즘에 의해 피브로넥틴 분자 내로 삽입될 수 있는 91개 아미노산의 소형 도메인이다. FN-EDB의 아미노산 서열은 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트 및 마우스 사이에 100% 보존된다. FN-EDB는 배아 발생 동안 과다발현되고, 인간 암에서 광범위하게 발현되지만, 실질적으로 여성 생식 조직을 제외하고는 정상 성인에서 검출불가능하다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 중쇄 CDR 서열: (i) 서열식별번호: 66 또는 67에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94% 또는 적어도 95% 동일성을 공유하는 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR -H1), 서열식별번호: 68 또는 69에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94% 또는 적어도 95% 동일성을 공유하는 CDR-H2, 및 서열식별번호: 70에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94% 또는 적어도 95% 동일성을 공유하는 CDR-H3; 및/또는 (ii) 하기 경쇄 CDR 서열: 서열식별번호: 73에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94% 또는 적어도 95% 동일성을 공유하는 VL 상보성 결정 영역 1 (CDR-L1), 서열식별번호: 74에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94% 또는 적어도 95% 동일성을 공유하는 CDR-L2, 및 서열식별번호: 75에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94% 또는 적어도 95% 동일성을 공유하는 CDR-L3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) 서열식별번호: 65에 대해 적어도 50% 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및/또는 (ii) 서열식별번호: 72에 대해 적어도 50% 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 이들 VL 및 VH 서열의 임의의 조합은 또한 본 발명에 의해 포괄된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Fc 도메인을 포함한다. Fc 도메인은 IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgG, IgE 또는 IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)로부터 유래될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) 서열식별번호: 71 또는 77에 대해 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및/또는 (ii) 서열식별번호: 76 또는 78에 대해 적어도 50% 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 이들 중쇄 및 경쇄 서열의 임의의 조합은 또한 본 발명에 의해 포괄된다.
또한, 본원에 기재된 임의의 항-EDB 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대 표 33에 나열된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 중 어느 하나와 EDB에의 결합에 대해 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명은 본원에 기재된 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 조작된 폴리펩티드를 포함하는 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 조작된 폴리펩티드를 포함하는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 본원에 개시된 HER2 항체 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산, 및 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 본원에 개시된 항-EDB 항체 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산, 및 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 본원에 기재된 조작된 폴리펩티드, 이러한 조작된 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 발현하기에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하고, 폴리펩티드 또는 항체 또는 항원-결합 단편을 단리하는 것을 포함한다.
B. 약물
본 발명의 부위 특이적 ADC의 제조에 유용한 약물은 세포독성제, 세포증식억제제, 면역조정제 및 화학요법제를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 암의 치료에 유용한 임의의 치료제를 포함한다. 세포독성 효과는 표적 세포 (즉, 종양 세포)의 고갈, 제거 및/또는 사멸을 지칭한다. 세포독성제는 세포에 대해 세포독성 효과를 갖는 작용제를 지칭한다. 세포증식억제성 효과는 세포 증식의 억제를 지칭한다. 세포증식억제제는 세포에 대해 세포증식억제성 효과를 가짐으로써, 세포의 특정 하위세트 (즉, 종양 세포)의 성장 및/또는 확장을 억제하는 작용제를 지칭한다. 면역조정제는 시토카인 및/또는 항체의 생산 및/또는 T 세포 기능의 조정을 통해 면역 반응을 자극함으로써, 직접적으로 또는 간접적으로 또 다른 작용제가 더 효과적이게 하여 세포의 하위세트 (즉, 종양 세포)의 성장을 억제 또는 감소시키는 작용제를 지칭한다. 화학요법제는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물인 작용제를 지칭한다. 약물은 또한 약물 유도체일 수 있으며, 여기서 약물은 본 발명의 항체와의 접합을 가능하게 하도록 관능화되었다.
일부 실시양태에서 약물은 막 투과성 약물이다. 이러한 실시양태에서, 페이로드는 초기에 ADC를 내재화한 세포를 둘러싸는 세포가 페이로드에 의해 사멸되는 방관자 효과를 도출할 수 있다. 이것은 페이로드가 항체로부터 방출되고 (즉, 절단가능한 링커의 절단에 의함), 세포 막을 가로질러, 확산 시에 주위 세포의 사멸을 유도하는 경우에 발생한다.
개시된 방법에 따라, 약물은 식 Ab-(L-D)의 항체 약물 접합체를 제조하는데 사용되며, 여기서 (a) Ab는 특이적 표적에 결합하는 항체이고; (b) L-D는 링커-약물 모이어티이고, 여기서 L은 링커이고, D는 약물이다.
약물-대-항체 비 (DAR) 또는 약물 로딩은 항체당 접합된 약물 (D) 분자의 수를 나타낸다. 본 발명의 항체 약물 접합체는 부위 특이적 접합을 사용하여 본질적으로 ADC의 조성물에 1가지 DAR을 갖는 ADC의 동종 집단이 존재하도록 한다. 일부 실시양태에서, DAR은 1이다. 일부 실시양태에서, DAR은 2이다. 다른 실시양태에서, DAR은 3이다. 다른 실시양태에서, DAR은 4이다. 다른 실시양태에서, DAR은 4 초과이다.
통상적인 접합 (부위 특이적 접합 보다는)을 사용하는 것은 각각이 상이한 개별 DAR을 갖는 상이한 종의 ADC의 이종 집단을 생성한다. 이 방식으로 제조된 ADC의 조성물은 각각의 항체가 특정한 수의 약물 분자에 접합된 복수의 항체를 포함한다. 이에 따라, 조성물은 평균 DAR을 갖는다. T-DM1 (카드실라®)은 리신 잔기에서의 통상적인 접합을 사용하고, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 약물 분자가 로딩된 ADC를 포함하는 광범위한 분포로 약 4의 평균 DAR을 갖는다 (Kim et al., 2014, Bioconj Chem 25(7):1223-32).
DAR은 다양한 통상적인 수단, 예컨대 UV 분광분석법, 질량 분광분석법, ELISA 검정, 방사측정 방법, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 전기영동 및 HPLC에 의해 결정될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 ADC의 약물 성분은 항-유사분열 약물이다. 특정 실시양태에서, 항-유사분열 약물은 아우리스타틴 (예를 들어, 0101, 8261, 6121, 8254, 6780 및 0131; 하기 표 2 참조)일 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 아우리스타틴 약물은 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (또한 0101로 공지됨)이다.
아우리스타틴은 유사분열 동안 튜불린 중합의 억제를 통해 미세관의 형성을 억제함으로써 세포 증식을 억제한다. PCT 국제 공개 번호 WO 2013/072813 (이는 그 전문이 참조로 포함됨)은 본 발명의 ADC의 제조에 유용한 아우리스타틴을 개시하고 그러한 아우리스타틴을 제조하는 방법을 제공한다.
표 2: 약물
Figure pct00019
Figure pct00020
본 발명의 일부 측면에서, 세포독성제는 리포솜 또는 생체적합성 중합체를 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항체는 생체적합성 중합체와 접합되어, 혈청 반감기 및 생물활성을 증가시킬 수 있고/있거나 생체내 반감기를 연장시킬 수 있다. 생체적합성 중합체의 예는 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 그의 유도체, 및 쯔비터이온-함유 생체적합성 중합체 (예를 들어, 포스포릴콜린 함유 중합체)를 포함한다.
C. 링커
본 발명의 부위 특이적 ADC는 항체에 약물을 연결 또는 접합시키기 위한 링커를 사용하여 제조된다. 링커는 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하기 위해 약물 및 항체를 연결시키는데 사용될 수 있는 이관능성 화합물이다. 이러한 접합체는 약물의 종양 세포로의 선택적 전달을 가능하게 한다. 적합한 링커는, 예를 들어 절단가능한 및 비-절단가능한 링커를 포함한다. 절단가능한 링커는 전형적으로 세포내 조건 하에서의 절단에 감수성이다. 접합된 약물이 항체로부터 절단되는 주요 메카니즘은 리소솜의 산성 pH에서의 가수분해 (히드라존, 아세탈 및 시스-아코니테이트-유사 아미드), 리소솜 효소 (카텝신 및 다른 리소솜 효소)에 의한 펩티드 절단, 및 디술피드의 환원을 포함한다. 이들 다양한 절단 메카니즘의 결과로서, 항체에 약물을 연결시키는 메카니즘도 또한 폭넓게 달라지고, 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있다.
적합한 절단가능한 링커는 세포내 프로테아제, 예컨대 리소솜 프로테아제 또는 엔도솜 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드 링커, 예컨대 vc 및 m(H20)c-vc를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (하기 표 3). 구체적 실시양태에서, 링커는 링커가 절단되면 페이로드가 방관자 효과를 유도할 수 있도록 하는 절단가능한 링커이다. 방관자 효과는 막 투과성 약물이 항체로부터 방출되고 (즉, 절단가능한 링커의 절단에 의함), 세포 막을 가로질러, 확산 시에, 초기에 ADC를 내재화한 세포를 둘러싸는 세포의 사멸을 유도하는 경우이다.
적합한 비-절단가능한 링커는 mc, MalPeg6, Mal-PEG2C2, Mal-PEG3C2 및 m(H20)c를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (하기 표 3).
다른 적합한 링커는 특정 pH 또는 pH 범위에서 가수분해가능한 링커, 예컨대 히드라존 링커를 포함한다. 추가의 적합한 절단가능한 링커는 디술피드 링커를 포함한다. 링커, 예를 들어 mc 링커 등은 약물이 방출되도록 하기 위해 항체가 세포내에서 분해되어야 하는 정도로 항체에 공유 결합될 수 있다.
본 발명의 특정한 측면에서, 본 발명의 부위 특이적 ADC에서의 링커는 절단가능하고, vc일 수 있다.
항체에 접합된 많은 치료제는 수중 용해도가 있더라도 매우 낮고, 접합체의 응집으로 인해 접합체 상의 약물 로딩이 제한될 수 있다. 이를 극복하기 위한 하나의 접근법은 가용화 기를 링커에 부가하는 것이다. PEG 및 디펩티드로 이루어진 링커로 제조된 접합체가 사용될 수 있으며, 이는 항체에 부착된 PEG 이-산, 티올-산 또는 말레이미드-산, 디펩티드 스페이서, 및 안트라시클린 또는 두오카르마이신 유사체의 아민에 대한 아미드 결합을 갖는 것을 포함한다. 또 다른 예는 세포독성제에 결합된 PEG-함유 링커 디술피드 및 항체에 결합된 아미드로 제조된 접합체이다. PEG 기를 혼입시키는 접근법은 응집 및 약물 로딩에 있어서의 제한을 극복하는데 유익할 수 있다.
표 3: 링커
Figure pct00021
링커는 표 3에 도시된 바와 같은 분자의 좌측을 통해 모노클로날 항체에 부착되고 분자의 우측을 통해 약물에 부착된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 반응성 기가, 예를 들어 말레이미드, 아이오도아세트아미드, 피리딜 디술피드 또는 다른 티올-반응성 접합 파트너인 티올-반응성 작용제에 접합된다 (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671).
특정 실시양태에서, 본 발명은 식 Ab-(L-D)의 항체 약물 접합체를 제공하며, 여기서 (a) Ab는 특이적 표적에 결합하는 항체이고; (b) L-D는 링커-약물 모이어티이고, 여기서 L은 링커이고, D는 약물이다.
특정 실시양태에서, Ab-(L-D)는 숙신이미드 기, 말레이미드 기, 가수분해된 숙신이미드 기 또는 가수분해된 말레이미드 기를 포함한다.
특정 실시양태에서, Ab-(L-D)는 말레이미드 기 또는 가수분해된 말레이미드 기를 포함한다. 말레이미드, 예컨대 N-에틸말레이미드는 특히 7 미만의 pH 값에서 술프히드릴 기에 특이적인 것으로 간주되며, 여기서 다른 기는 양성자화된다.
특정 실시양태에서, Ab-(L-D)는 6-말레이미도카프로일 (MC), 말레이미도프로파노일 (MP), 발린-시트룰린 (val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (ala-phe), p-아미노벤질옥시카르보닐 (PAB), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 (SPP), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1카르복실레이트 (SMCC), N-숙신이미딜 (4-아이오도-아세틸) 아미노벤조에이트 (SIAB), 또는 6-말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (MC-vc-PAB)을 포함한다.
특정 실시양태에서, Ab-(L-D)는 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
Figure pct00022
여기서 각 경우에 독립적으로,
W는
Figure pct00023
이고;
R1은 수소 또는 C1-C8 알킬이고;
R2는 수소 또는 C1-C8 알킬이고;
R3A 및 R3B는 하기 중 어느 하나이고:
(iii) R3A는 수소 또는 C1-C8 알킬이고;
R3B는 C1-C8 알킬이거나;
(iv) R3A 및 R3B는 함께 C2-C8 알킬렌 또는 C1-C8 헤테로알킬렌이고;
R5는
Figure pct00024
이고;
R6은 수소 또는 -C1-C8 알킬이다.
특정 실시양태에서, Ab-(L-D)는 화학식 IIa의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
Figure pct00025
여기서 각 경우에 독립적으로,
W는
Figure pct00026
이고;
R1은
Figure pct00027
이고;
Y는 -C2-C20 알킬렌-, -C2-C20 헤테로알킬렌-, -C3-C8 카르보시클로-, -아릴렌-, -C3-C8헤테로시클로-, -Cl-C10알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-Cl-Cl0알킬렌-, -Cl-Cl0알킬렌-(C3-C8카르보시클로)-, -(C3-C8카르보시클로)-Cl-C10알킬렌-, -Cl-Cl0알킬렌-(C3-C8헤테로시클로)- 또는 -(C3-C8 헤테로시클로)-Cl-Cl0알킬렌-, -C1-6알킬(OCH2CH2)1-10-, -(OCH2CH2)1-10-, -(OCH2CH2)1-10-C1-6알킬, -C(O)-C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-, -C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-C(O)-, -C1-6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-, 및 -C(O)-C1-6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6알킬-로부터 선택된 기 중 1개 이상이고;
Z는
Figure pct00028
또는 -NH2이고;
G는 할로겐, -OH, -SH, 또는 -S-C1-C6 알킬이고;
R2는 수소 또는 C1-C8 알킬이고;
R3A 및 R3B는 하기 중 어느 하나이고:
(iii) R3A는 수소 또는 C1-C8 알킬이고;
R3B는 C1-C8 알킬이거나;
(iv) R3A 및 R3B는 함께 C2-C8 알킬렌 또는 C1-C8 헤테로알킬렌이고;
R5는
Figure pct00029
이고;
R6은 수소 또는 -C1-C8 알킬이고;
R10은 수소, -Cl-Cl0알킬, -C3-C8카르보시클릴, -아릴, -Cl-C10헤테로알킬, -C3-C8헤테로시클로, -Cl-Cl0알킬렌-아릴, -아릴렌-Cl-Cl0알킬, -Cl-Cl0알킬렌-(C3-C8카르보시클로), -(C3-C8 카르보시클로)-Cl-Cl0알킬, -Cl-Cl0알킬렌-(C3-C8헤테로시클로), 또는 -(C3-C8 헤테로시클로)-Cl-Cl0알킬이고, 여기서 아릴을 포함하는 R10 상의 아릴은 [R7]h로 임의로 치환되고;
R7은 각 경우에 독립적으로 F, Cl, I, Br, NO2, CN 및 CF3으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
h는 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
바람직하게, Y는 -C2-C20 알킬렌-, -C2-C20 헤테로알킬렌-; -C3-C8 카르보시클로-, -아릴렌-, -C3-C8헤테로시클로-, -Cl-C10알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-Cl-Cl0알킬렌-, -Cl-Cl0알킬렌-(C3-C8카르보시클로)-, -(C3-C8카르보시클로)-Cl-C10알킬렌-, -Cl-Cl0알킬렌-(C3-C8헤테로시클로)- 또는 -(C3-C8 헤테로시클로)-Cl-Cl0알킬렌-; -C1-6알킬(OCH2CH2)1-10-, -(OCH2CH2)1-10-, -(OCH2CH2)1-10-C1-6알킬, -C(O)-C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-, 및 -C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-C(O)-로부터 선택된 기 중 1개 이상이다.
바람직하게, Z는
Figure pct00030
또는 -NH2이다.
특정 실시양태에서, Ab-(L-D)는 화학식 IIb의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
Figure pct00031
여기서 각 경우 독립적으로,
W는
Figure pct00032
이고;
R1은
Figure pct00033
이고;
Y는 -C2-C20 알킬렌-, -C2-C20 헤테로알킬렌-, -C3-C8 카르보시클로-, -아릴렌-, -C3-C8헤테로시클로-, -Cl-C10알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-Cl-Cl0알킬렌-, -Cl-Cl0알킬렌-(C3-C8카르보시클로)-, -(C3-C8카르보시클로)-Cl-C10알킬렌-, -Cl-Cl0알킬렌-(C3-C8헤테로시클로)-, 또는 -(C3-C8 헤테로시클로)-Cl-Cl0알킬렌-이고;
Z는
Figure pct00034
또는 -NH-Ab이고;
Ab는 항체이고;
R2는 수소 또는 C1-C8 알킬이고;
R3A 및 R3B는 하기 중 어느 하나이고:
(iii) R3A는 수소 또는 C1-C8 알킬이고;
R3B는 C1-C8 알킬이거나;
(iv) R3A 및 R3B는 함께 C2-C8 알킬렌 또는 C1-C8 헤테로알킬렌이고;
R5는
Figure pct00035
이고;
R6은 수소 또는 -C1-C8 알킬이다.
바람직하게, Z는
Figure pct00036
또는 -NH-Ab이다.
특정 실시양태에서, Ab-(L-D)는 mcValCitPABC_MMAE ("vcMMAE")를 포함한다:
Figure pct00037
특정 실시양태에서, Ab-(L-D)는 mcValCitPABC_MMAD ("vcMMAD")를 포함한다:
Figure pct00038
특정 실시양태에서, Ab-(L-D)는 mcMMAD ("말레이미드 카프로일 MMAD)를 포함한다:
Figure pct00039
특정 실시양태에서, Ab-(L-D)는 mcMMAF ("말레이미드 카프로일 MMAF")를 포함한다:
Figure pct00040
화학식 I, IIa 및 IIb에 사용된 일반적 용어, 예컨대 알킬, 알케닐, 할로알킬; 헤테로시클릴의 정의는 용어의 통상적 및 보편적 의미에 따라 이해되어야 한다. 구체적으로, 이들 용어는 WO 2013/072813 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)의 15면, 21줄에서 18면, 14줄에 정의되어 있다.
D. 부위 특이적 ADC를 제조하는 방법
본 발명의 항체 약물 접합체를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 부위 특이적 ADC를 제조하는 방법은 (a) 링커를 약물에 연결시키고; (b) 링커 약물 모이어티를 항체에 접합시키고; (c) 항체 약물 접합체를 정제하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 ADC는 항체를 약물 페이로드에 접합시키기 위해 부위 특이적 방법을 사용한다.
한 실시양태에서, 부위 특이적 접합은 항체 불변 영역 내로 조작된 1개 이상의 시스테인 잔기를 통해 발생한다. 시스테인 잔기를 통한 부위 특이적 접합을 위한 항체를 제조하는 방법은 PCT 공개 번호 WO2013/093809 (이는 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 하기 위치 중 1개 이상은 시스테인이 되어 접합을 위한 부위로서의 역할을 하도록 변경될 수 있다: a) 중쇄 불변 영역 상의 잔기 246, 249, 265, 267, 270, 276, 278, 283, 290, 292, 293, 294, 300, 302, 303, 314, 315, 318, 320, 327, 332, 333, 334, 336, 345, 347, 354, 355, 358, 360, 362, 370, 373, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 390, 392, 393, 401, 404, 411, 413, 414, 416, 418, 419, 421, 428, 431, 432, 437, 438, 439, 443 및 444 (중쇄에 대해 카바트의 EU 인덱스에 따름) 및/또는 b) 경쇄 불변 영역 상의 잔기 111, 149, 183, 188, 207 및 210 (경쇄에 대해 카바트 넘버링에 따름).
특정 실시양태에서, a) 중쇄 불변 영역 상에서 시스테인이 되도록 변경될 수 있는 1개 이상의 위치는 290, 334, 392 및/또는 443 (중쇄에 대해 카바트의 EU 인덱스에 따름)이고/거나 b) 경쇄 불변 영역 상에서 상기 위치는 183 (경쇄에 대해 카바트 넘버링에 따름)이다.
보다 구체적인 실시양태에서, 카바트의 EU 인덱스에 따른 중쇄 불변 영역의 위치 290 및 카바트 넘버링에 따른 경쇄 불변 영역의 위치 183이 접합을 위한 시스테인으로 변경된다.
또 다른 실시양태에서, 부위 특이적 접합은 항체 불변 영역 내로 조작된 1개 이상의 아실 공여자 글루타민 잔기를 통해 발생한다. 글루타민 잔기를 통한 부위 특이적 접합을 위한 항체를 제조하는 방법은 PCT 공개 번호 WO2012/059882 (이는 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 항체는 3가지 상이한 방식으로 부위 특이적 접합에 사용된 글루타민 잔기를 발현하도록 조작될 수 있다.
글루타민 잔기를 함유하는 짧은 펩티드 태그는 경쇄 및/또는 중쇄의 수많은 상이한 위치 내로 (즉, N-말단에, C-말단에, 내부로) 혼입될 수 있다. 제1 실시양태에서, 글루타민 잔기를 함유하는 짧은 펩티드 태그는 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 부착될 수 있다. 하기 글루타민 함유 태그 중 1개 이상이 약물 접합을 위한 아실 공여자로서의 역할을 하기 위해 부착될 수 있다: GGLLQGPP (서열식별번호: 45), GGLLQGG (서열식별번호: 46), LLQGA (서열식별번호: 47), GGLLQGA (서열식별번호: 48), LLQ, LLQGPGK (서열식별번호: 49), LLQGPG (서열식별번호: 50), LLQGPA (서열식별번호: 51), LLQGP (서열식별번호: 52), LLQP (서열식별번호: 53), LLQPGK (서열식별번호: 54), LLQGAPGK (서열식별번호: 55), LLQGAPG (서열식별번호: 56), LLQGAP (서열식별번호: 57), LLQX1X2X3X4X5 (여기서 X1은 G 또는 P이고, X2는 A, G, P이거나 부재하고, X3은 A, G, K, P이거나 부재하고, X4는 G, K이거나 부재하고, X5는 K이거나 부재함) (서열식별번호: 58), 또는 LLQX1X2X3X4X5 (여기서 X1은 임의의 자연 발생 아미노산이고, X2, X3, X4 및 X5는 임의의 자연 발생 아미노산이거나 부재함) (서열식별번호: 59).
특정 실시양태에서, GGLLQGPP (서열식별번호: 60)는 경쇄의 C-말단에 부착될 수 있다.
특정 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 상의 잔기는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 글루타민 잔기로 변경될 수 있다. 특정 실시양태에서, 중쇄 상의 위치 297에서의 잔기 (카바트의 EU 인덱스를 사용함)는 글루타민 (Q)이 되어 접합을 위한 부위로서의 역할을 하도록 변경될 수 있다.
특정 실시양태에서, 중쇄 또는 경쇄 상의 잔기는 1개 이상의 내인성 글루타민이 접합을 위해 접근가능하게/반응성이 되도록 그 위치에서 비-글리코실화를 유발하도록 변경될 수 있다. 특정 실시양태에서, 중쇄 상의 위치 297에서의 잔기 (카바트의 EU 인덱스를 사용함)는 알라닌 (A)으로 변경될 수 있다. 이러한 경우에, 중쇄 상의 위치 295에서의 글루타민 (Q)은 그 때 접합에 사용될 수 있다.
접합체의 형성을 위한 최적 반응 조건은 반응 변수, 예컨대 온도, pH, 링커-페이로드 모이어티 유입량 및 첨가제 농도를 변경함으로써 실험적으로 결정될 수 있다. 다른 약물의 접합에 적합한 조건은 과도한 실험 없이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 조작된 시스테인 잔기를 통한 부위 특이적 접합은 하기 실시예 5A에서 예시된다. 글루타민 잔기를 통한 부위 특이적 접합은 하기 실시예 5B에서 예시된다.
항체 약물 접합체당 약물 분자의 수를 추가로 증가시키기 위해, 약물은 직쇄형 또는 분지형 폴리에틸렌 글리콜 중합체 및 단량체를 포함한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 접합될 수 있다. PEG 단량체는 다음 식을 갖는다: -(CH2CH2O)-. 약물 및/또는 펩티드 유사체는 직접적으로 또는 간접적으로, 즉 적절한 스페이서 기, 예컨대 당을 통해 PEG에 결합될 수 있다. PEG-항체 약물 조성물은 또한 생체내 약물 안정성 및 표적 부위로의 전달을 용이하게 하는 추가의 친지성 및/또는 친수성 모이어티를 포함할 수 있다. PEG-함유 조성물을 제조하는 대표적인 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 6,461,603; 6,309,633; 및 5,648,095에서 찾을 수 있다.
접합 후, 접합체는 통상적인 방법에 의해 미접합 반응물 및/또는 응집된 형태의 접합체로부터 분리 및 정제될 수 있다. 이것은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 한외여과/투석여과, 이온 교환 크로마토그래피 (IEC), 크로마토포커싱 (CF) HPLC, FPLC, 또는 세파크릴 S-200 크로마토그래피와 같은 과정을 포함할 수 있다. 분리는 또한 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의해 달성될 수 있다. 적합한 HIC 매질은 페닐 세파로스 6 패스트 플로우 크로마토그래피 매질, 부틸 세파로스 4 패스트 플로우 크로마토그래피 매질, 옥틸 세파로스 4 패스트 플로우 크로마토그래피 매질, 토요펄 에테르-650M 크로마토그래피 매질, 마크로-프렙 메틸 HIC 매질 또는 마크로-프렙 t-부틸 HIC 매질을 포함한다.
표 4는 실시예 섹션에서의 데이터를 생성하는데 사용된 HER2 ADC를 제시한다. 표 4에 제시된 부위 특이적 HER2 ADC (행 1-17)는 본 발명의 부위 특이적 ADC의 예이다.
본 발명의 부위 특이적 ADC를 제조하기 위해 본원에 개시된 임의의 항체는 본원에 개시된 임의의 링커를 통해 본원에 개시된 임의의 약물에 부위 특이적 기술을 사용하여 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 절단가능한 것 (예를 들어, vc)이다. 특정 실시양태에서, 약물은 아우리스타틴 (예를 들어, 0101)이다.
본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 ADC는 위치 290 (카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따름)에서의 조작된 시스테인을 통해 부위-특이적 접합될 수 있다. IgG1 항체 중쇄 CH2 영역은 서열식별번호: 61 또는 서열식별번호: 62에 제시되어 있다 (카바트의 EU 인덱스의 넘버링을 사용하는 K290은 볼드체 및 밑줄표시되어 있음)
Figure pct00041
Figure pct00042
조작된 시스테인은 단독으로 또는 하기 위치에서의 1개 이상의 조작된 시스테인 잔기와 조합되어 위치 290에 존재할 수 있다: a) 중쇄 불변 영역 상의 잔기 246, 249, 265, 267, 270, 276, 278, 283, 292, 293, 294, 300, 302, 303, 314, 315, 318, 320, 327, 332, 333, 334, 336, 345, 347, 354, 355, 358, 360, 362, 370, 373, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 390, 392, 393, 401, 404, 411, 413, 414, 416, 418, 419, 421, 428, 431, 432, 437, 438, 439, 443 및 444 (카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따름), 및/또는 b) 경쇄 불변 영역 상의 잔기 111, 149, 183, 188, 207 및 210 (카바트 넘버링에 따름).
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 ADC는 다음을 포함하는 항체 카파 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다: (i) 카바트의 넘버링에 따른 위치 183에 조작된 시스테인 잔기; 또는 (ii) 상기 불변 도메인이 서열식별번호: 63과 정렬되는 경우에 서열식별번호: 63의 잔기 76에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기. 이 조작된 시스테인은 또한 카바트의 넘버링을 사용하여 "K183C"로 지칭되고, 하기에 볼드체 및 밑줄로 제시되어 있다. 본 발명의 펩티드, 항체 및 ADC는 인간 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 잔기 183에 대응하는 아미노산 위치에 조작된 시스테인 잔기 (하기에 제시된 "K183C" 잔기로 지칭됨)를 포함하는 람다 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
Figure pct00043
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 폴리펩티드 및 (b) (i) 카바트의 넘버링에 따른 위치 111, 149, 188, 207, 210 또는 그의 임의의 조합 (바람직하게는 111 또는 210)에 조작된 시스테인 잔기; 또는 (ii) 항체 카파 경쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 63과 정렬되는 경우에 서열식별번호: 63의 잔기 4, 42, 81, 100, 103 또는 그의 임의의 조합 (바람직하게는 잔기 4 또는 103)에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 폴리펩티드 및 (b) (i) 카바트의 넘버링에 따른 위치 110, 111, 125, 149, 155, 158, 161, 185, 188, 189, 191, 197, 205, 206, 207, 208, 210 또는 그의 임의의 조합 (바람직하게는 110, 111, 125, 149 또는 155)에 조작된 시스테인 잔기; 또는 (ii) 항체 람다 경쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 64와 정렬되는 경우에 서열식별번호: 64의 잔기 4, 5, 19, 43, 49, 52, 55, 78, 81, 82, 84, 90, 96, 97, 98, 99, 101 또는 그의 임의의 조합 (바람직하게는 잔기 4, 5, 19, 43 또는 49)에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 람다 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
Figure pct00044
표 4: HER2 ADC (1C=절단가능한; N=비-절단가능한)
Figure pct00045
2. 제제 및 용도
본원에 기재된 폴리펩티드, 항체 및 ADC는 제약 제제로서 제제화될 수 있다. 제약 제제는 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 조성물은 본원에 개시된 ADC 중 1종 초과를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 조성물은 동결건조 제제 또는 수용액 형태의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington: The Science and practice of Pharmacy 21st Ed., 2005, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover)를 추가로 포함할 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트란; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는 염"은 분자 또는 거대분자의 제약상 허용되는 유기 또는 무기 염을 지칭한다. 제약상 허용되는 부형제는 본원에 추가로 기재되어 있다.
1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본 발명의 1종 이상의 ADC의 다양한 제제가 투여를 위해 사용될 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 약리학상 유효한 물질의 투여를 용이하게 하는 상대적으로 불활성인 물질이다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 점조도를 제공할 수 있거나, 또는 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정화제, 습윤제 및 유화제, 다양한 오스몰농도를 위한 염, 캡슐화제, 완충제, 및 피부 침투 증진제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 부형제 뿐만 아니라 비경구 및 경구 약물 전달을 위한 제제가 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000]에 제시되어 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 이들 작용제는 주사에 의한 투여 (예를 들어, 복강내로, 정맥내로, 피하로, 근육내로 등)를 위해 제제화된다. 따라서, 이들 작용제는 제약상 허용되는 비히클, 예컨대 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 등과 조합될 수 있다. 특정한 투여 요법, 즉 용량, 시기 및 반복은 특정한 개체 및 그러한 개체의 의료 병력에 좌우될 것이다.
본 발명의 ADC의 치료 제제는 목적하는 순도를 갖는 ADC를 동결건조 제제 또는 수용액 형태의 임의적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005)와 혼합하여 저장용으로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 염, 예컨대 염화나트륨; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈™, 플루로닉스™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.
본 발명의 ADC를 함유하는 리포솜은 문헌 [Eppstein, et al., 1985, PNAS 82:3688-92; Hwang, et al., 1908, PNAS 77:4030-4]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 바와 같은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 순환 시간이 증진된 리포솜은 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함한 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 한정된 세공 크기의 필터를 통해 압출되어 목적하는 직경을 갖는 리포솜이 수득된다.
활성 성분은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이것은, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료적 ADC 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내로 배치된다.
적합한 표면-활성제는, 특히 비-이온성 작용제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어, 트윈™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄 (예를 들어, 스판(Span)™ 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성제를 갖는 조성물은 편리하게는 0.05 내지 5%의 표면-활성제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 다른 성분, 예를 들어 필요한 경우에 만니톨 또는 다른 제약상 허용되는 비히클이 첨가될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
적합한 에멀젼은 상업적으로 입수가능한 지방 에멀젼, 예컨대 인트라리피드(INTRALIPID)™, 리포신(LIPOSYN)™, 인포누트롤(INFONUTROL)™, 리포푼딘(LIPOFUNDIN)™ 및 리피피산(LIPIPHYSAN)™을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 사전-혼합된 에멀젼 조성물 중에 용해될 수 있거나 또는 대안적으로 오일 (예를 들어, 대두 오일, 홍화 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 옥수수 오일 또는 아몬드 오일) 중에 용해될 수 있고, 인지질 (예를 들어, 난 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과의 혼합 시 에멀젼이 형성된다. 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스가 첨가되어 에멀젼의 장성을 조정할 수 있다는 것이 인지될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 최대 20% 오일, 예를 들어 5 내지 20%를 함유할 것이다. 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0 μm, 특히 0.1 내지 0.5 μm의 지방 액적을 포함할 수 있고, 5.5 내지 8.0 범위의 pH를 가질 수 있다. 에멀젼 조성물은 ADC를 인트라리피드™ 또는 그의 성분 (대두 오일, 난 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본 발명의 1종 이상의 ADC를 포함하는 1종 이상의 용기, 및 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 따른 사용에 대한 지침서를 포함한다. 일반적으로, 이들 지침서는 치유적 치료를 위한 ADC의 투여에 관한 설명을 포함한다.
본 발명의 ADC의 사용에 관한 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 서브-유닛 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급된 지침서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상의 서면 지침서이지만, 기계-판독가능한 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 운반되는 지침서)가 또한 허용된다.
본 발명의 키트는 적합한 포장 내에 있다. 적합한 포장은 바이알, 병, 단지, 가요성 포장 (예를 들어, 실링된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한 특정 장치, 예컨대 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내 적어도 1종의 활성제는 본 발명의 ADC이다. 용기는 제2 제약 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 임의로 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 정상적으로, 키트는 용기, 및 용기 상에 있거나 이와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다.
본 발명의 ADC는 치료, 진단 또는 비-치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 친화도 정제 작용제로서 (예를 들어, 시험관내 정제를 위해), 진단제로서 (예를 들어, 특정 세포, 조직 또는 혈청에서의 관심 항원의 발현을 검출하기 위해) 사용될 수 있다.
치료 용도를 위해, 본 발명의 ADC는 포유동물, 특히 인간에게 통상적인 기술에 의해, 예컨대 정맥내로 (볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해), 근육내로, 복강내로, 뇌척수내로, 피하로, 관절내로, 활막내로, 척수강내로, 경구로, 국소로 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 적합하게는 종양내, 종양 주위, 병변내 또는 병변 주위 경로에 의해 투여된다. 본 발명의 ADC는 예방적 치료 또는 치유적 치료에 사용될 수 있다
3. 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수 용어는 단수형을 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 그의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 통상적으로 사용되는 것들이다.
용어 "L-D"는 링커 (L)에 연결된 약물 (D)로부터 생성되는 링커-약물 모이어티를 지칭한다. 용어 "약물 (D)"은 질환을 치료하는데 유용한 임의의 치료제를 지칭한다. 약물은 생물학적 또는 검출가능한 활성을 가지며, 예를 들어 세포독성제, 화학요법제, 세포증식억제제 또는 면역조정제이다. 암 치료와 관련하여, 치료제는 종양 세포의 고갈, 제거 및/또는 사멸을 포함한, 종양에 대한 세포독성 효과를 갖는다. 용어 약물, 페이로드 및 약물 페이로드는 상호교환가능하게 사용된다. 특정 실시양태에서, 치료제는 종양 세포의 고갈, 제거 및/또는 사멸을 포함한, 종양에 대한 세포독성 효과를 갖는다. 특정 실시양태에서, 약물은 항유사분열제이다. 특정 실시양태에서, 약물은 아우리스타틴이다. 특정 실시양태에서, 약물은 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (또한 0101로 공지됨)이다. 특정 실시양태에서, 약물은 바람직하게는 막 투과성이다.
용어 "링커 (L)"는 약물 페이로드에 대한 항체의 직접 또는 간접 연결을 기재한다. 항체에 대한 링커의 부착은 다양한 방식으로, 예컨대 표면 리신, 산화된 탄수화물에 대한 환원-커플링, 쇄간 디술피드 연결을 환원시키는 것에 의해 유리된 시스테인 잔기, 특정 부위에서 조작된 반응성 시스테인 잔기, 및 트랜스글루타미나제 및 아민의 존재 하에 폴리펩티드 조작에 의해 반응성이 된 아실 공여자 글루타민-함유 태그 또는 내인성 글루타민을 통해 달성될 수 있다. 본 발명은 항체를 약물 페이로드에 연결하기 위해 부위 특이적 방법을 사용한다. 한 실시양태에서, 접합은 항체 불변 영역 내로 조작된 시스테인 잔기를 통해 발생한다. 또 다른 실시양태에서, 접합은 a) 펩티드 태그를 통해 항체 불변 영역에 부가되거나, b) 항체 불변 영역 내로 조작되거나, 또는 c) 주위 잔기를 조작함으로써 접근가능하게/반응성이 된 아실 공여자 글루타민 잔기를 통해 발생한다. 링커는 절단가능하거나 (즉, 세포내 조건 하에서 절단에 감수성임) 또는 비-절단가능하다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커이다.
항체의 "항원-결합 단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 전장 항체의 단편 (바람직하게는 실질적으로 동일한 결합 친화도를 가짐)을 지칭한다. 항원-결합 단편의 예는 다음을 포함한다: Fab 단편; F(ab')2 단편; Fd 단편; Fv 단편; dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 디술피드-연결된 Fv (dsFv); 항-이디오타입 (항-Id) 항체; 인트라바디; 단일 쇄 Fv (scFv, 예를 들어, 문헌 [Bird et al. Science 242:423-426 (1988) 및 Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)] 참조); 및 디아바디 (예를 들어, 문헌 [Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-1123] 참조). 본 발명의 항원-결합 단편은 본원에 기재된 조작된 항체 불변 도메인을 포함하지만, 천연 항체의 전장 Fc-영역을 포함할 필요는 없다. 예를 들어, 본 발명의 항원-결합 단편은 "미니바디"일 수 있다 (VL-VH-CH3 또는 (scFv-CH3)2; 문헌 [Hu et al., Cancer Res. 1996; 56(13):3055-61, 및 Olafsen et al., Protein Eng Des Sel. 2004;17(4):315-23] 참조).
가변 도메인에서의 잔기는 항체 컴파일링의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인을 위해 사용되는 넘버링 시스템인 카바트에 따라 넘버링된다. 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]을 참조한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축, 또는 그 내로의 삽입에 상응하여 아미노산이 더 적을 수 있거나, 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물 (카바트에 따라 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따라 잔기 82a, 82b 및 82c)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열을 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 상동성 영역에서 정렬함으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. 카바트 넘버링을 부여하기 위한 다양한 알고리즘이 이용가능하다. 달리 나타내지 않는 한, 2012년 출시 버전의 애비시스 (www.abysis.org)에서 구현된 알고리즘이 가변 영역에 카바트 넘버링을 부여하기 위해 본원에서 사용된다.
달리 명시되지 않는 한, 항체의 인간 IgG 중쇄 불변 도메인에서의 아미노산 잔기는 본원에서 "카바트의 EU 인덱스"로 지칭되는, 문헌 [Kabat et al., 1991]에 기재된 바와 같은 문헌 [Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1):78-85]의 EU 인덱스에 따라 넘버링된다. 전형적으로, Fc 도메인은 인간 IgG1 불변 도메인의 아미노산 잔기 약 236에서 약 447을 포함한다. C 넘버링 사이의 대응은, 예를 들어 IGMT 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 경쇄 불변 도메인의 아미노산 잔기는 문헌 [Kabat et al., 1991]에 따라 넘버링된다. 항체 불변 도메인 아미노산 잔기의 넘버링은 또한 국제 특허 공개 번호 WO 2013/093809에 제시되어 있다.
IgG 중쇄 불변 도메인에서의 카바트의 EU 인덱스의 사용에 대한 유일한 예외는 실시예에 기재된 잔기 A114이다. A114는 카바트 넘버링을 참조하고, 상응하는 EU 인덱스 번호는 118이다. 이것은 이 부위에서의 부위 특이적 접합의 초기 공개가 카바트 넘버링을 사용하였고 이 부위를 A114C로 지칭하였으며, 그 이후로 "114" 부위로서 관련 기술분야에서 광범위하게 사용되어 왔기 때문이다. 문헌 [Junutula et al., Nature Biotechnology 26, 925 - 932 (2008)]을 참조한다. 관련 기술분야에서 이 부위의 통상적 용법과 일치되도록, "A114", "A114C", "C114" 또는 "114C"가 실시예에서 사용된다.
달리 명시되지 않는 한, 항체의 경쇄 불변 도메인에서의 아미노산 잔기는 문헌 [Kabat et al., 1991]에 따라 넘버링된다.
질의 서열의 아미노산 잔기는, 질의 아미노산 서열을 참조 서열과 정렬함으로써 그 잔기의 위치가 참조 서열의 지정된 위치 (예를 들어, 서열식별번호: 61 또는 62의 위치 60 또는 서열식별번호: 63의 위치 76)에 매칭되는 경우에, 그 지정된 위치에 "대응한다". 이러한 정렬은 수동으로 또는 디폴트 파라미터를 사용하여 널리 공지된 서열 정렬 프로그램, 예컨대 ClustalW2 또는 "BLAST 2 서열"을 사용하여 수행될 수 있다.
"Fc 융합" 단백질은 1종 이상의 폴리펩티드가 Fc 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 단백질이다. Fc 융합체는 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 융합 파트너와 조합한다.
본원에 사용된 용어 "약"은 값의 +/- 10%를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "조작된" (조작된 시스테인에서와 같이) 및 "치환된" (치환된 시스테인에서와 같이)은 상호교환가능하게 사용되고, 폴리펩티드 또는 항체에 또 다른 모이어티를 부착시키기 위한 접합 부위를 생성하기 위해 아미노산을 시스테인으로 돌연변이시키는 것을 지칭한다.
생물학적 기탁
본 발명의 대표적인 물질은 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 2015년 11월 17일에 기탁되었다. ATCC 수탁 번호 PTA- 122672를 갖는 벡터 T(K290C)-HC는 서열식별번호: 18의 중쇄 서열을 코딩하는 DNA 삽입물을 포함하고, ATCC 수탁 번호 PTA- 122673을 갖는 벡터 T(kK183C)-LC는 서열식별번호: 42의 경쇄 서열을 코딩하는 DNA 삽입물을 포함한다. 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이러한 조약 (부다페스트 조약) 하의 규정의 조항 하에 이루어졌다. 이것은 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조항 하에 ATCC로부터 이용가능할 것이고, 이는 화이자, 인크.와 ATCC 사이의 협정에 따르며, 상기 협정은 관련 미국 특허의 허여 시 또는 임의의 미국 또는 타국 특허 출원의 공중에의 공개 시 중 빠른 시점에, 공중에 대한 기탁 배양물의 자손의 영구적이고 비제한적인 이용가능성을 보장하고, 35 U.S.C. 섹션 122 및 그에 대한 미국 특허청장의 규칙 (886 OG 638에 대한 특정한 언급이 있는 37 C.F.R. 섹션 1.14 포함)에 따라 특허청장에 의해 자격이 있는 것으로 결정된 자에 대한 상기 자손의 이용가능성을 보장한다.
본 출원의 양수인은 기탁된 물질의 배양물이 적합한 조건 하에 배양될 때 사멸 또는 상실 또는 파괴되는 경우에, 그 물질을 통지 하에 또 다른 동일한 것으로 신속하게 대체할 것에 동의하였다. 기탁된 물질의 이용가능성은 특허법에 따라 임의의 정부의 권한 하에 승인된 권리에 반하여 본 발명을 실시하는 것에 대한 허가로서 해석되지 않는다.
실시예
본 발명은 하기 실험 실시예를 참조하여 추가로 상세히 기재된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되고, 달리 명시되지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 어떤 방식으로도 하기 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안되고, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 분명해지는 임의의 및 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1: 접합을 위한 트라스투주맙 유래된 항체의 제조
A. 시스테인을 통한 접합
시스테인 잔기를 통한 부위 특이적 접합을 위한 트라스투주맙 유도체를 제조하는 방법을 일반적으로 PCT 공개 WO2013/093809 (이는 그 전문이 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 경쇄 상의 1개 이상의 잔기 (카바트 넘버링 스킴을 사용하여 183) 또는 중쇄 상의 1개 이상의 잔기 (카바트의 EU 인덱스를 사용하여 290, 334, 392 및/또는 443)를 부위 지정 돌연변이유발에 의해 시스테인 (C) 잔기로 변경시켰다.
B. 트랜스글루타미나제를 통한 접합
글루타민 잔기를 통한 부위 특이적 접합을 위한 트라스투주맙 유도체를 제조하는 방법을 일반적으로 PCT 공개 WO2012/059882 (이는 그 전문이 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 트라스투주맙을 3가지 상이한 방식으로 접합에 사용되는 글루타민 잔기를 발현하도록 조작하였다.
제1 방법의 경우, 글루타민 잔기를 함유하는 8개 아미노산 잔기 태그 (LCQ05)를 경쇄의 C-말단에 부착하였다.
제2 방법의 경우, 중쇄 상의 잔기 (카바트의 EU 인덱스를 사용하여 위치 297)를 부위 지정 돌연변이유발에 의해 아스파라긴 (N)에서 글루타민 (Q) 잔기로 변경시켰다.
제3 방법의 경우, 중쇄 상의 잔기 (카바트의 EU 인덱스를 사용하여 위치 297)를 아스파라긴 (N)에서 알라닌 (A)으로 변경시켰다. 이것은 위치 297에서의 비-글리코실화 및 위치 295에서의 접근가능한/반응성 내인성 글루타민을 생성한다.
추가적으로, 트라스투주맙 유도체의 일부는 접합에 사용되지 않는 변경을 갖는다. 중쇄 상의 위치 222에서의 잔기 (카바트의 EU 인덱스를 사용하여 위치 297)를 리신 (K)에서 아르기닌 (R) 잔기로 변경시켰다. K222R 치환은 보다 동종인 항체 및 페이로드 접합체, 항체와 페이로드 사이의 보다 우수한 분자간 가교, 및/또는 항체 경쇄의 C 말단 상의 글루타민 태그와의 쇄간 가교의 유의한 감소를 유발하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2: 트라스투주맙 유래된 항체를 발현하는 안정하게 형질감염된 세포의 생산
단일 및 이중 시스테인 조작된 트라스투주맙 유래된 항체 변이체가 세포에서 안정하게 발현되고 대규모 생산될 수 있는지 결정하기 위해, CHO 세포를 9종의 트라스투주맙 유래된 항체 변이체 (T(κK183C), T(K290C), T(K334C), T(K392C), T(κK183C+K290C), T(κK183C+K392C), T(K290C+K334C), T(K334C+K392C) 및 T(K290C+K392C))를 코딩하는 DNA로 형질감염시키고, 안정한 높은 생산 풀을 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 절차를 사용하여 단리하였다. 접합 연구를 위한 T(κK183C+K334C)를 생산하기 위해, HEK-293 세포 (ATCC 수탁 # CRL-1573)를 표준 방법을 사용하여 이 이중-시스테인 조작된 항체 변이체를 코딩하는 중쇄 및 경쇄 DNA로 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 2-칼럼 과정, 즉 단백질-A 친화도 포획에 이어서 TMAE 칼럼, 또는 3-칼럼 과정, 즉 단백질-A 친화도 포획에 이어서 TMAE 칼럼 및 그 다음 CHA-TI 칼럼을 사용하여 농축된 CHO 풀 출발 물질로부터 이들 트라스투주맙 변이체를 단리하였다. 이들 정제 과정을 사용하여, 모든 조작된 시스테인 트라스투주맙 유래된 항체 변이체 제제는 분석용 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정된 바와 같은 >97% 관심 피크 (POI)를 함유하였다 (표 5). 표 5에 제시된 이들 결과는 모든 10종의 트라스투주맙 유래된 시스테인 변이체에 대한 단백질 A 수지로부터의 용리 후 허용되는 수준의 고분자량 (HMW) 응집 종이 검출되었다는 것 및 이러한 바람직하지 않은 HMW 종은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 제거될 수 있다는 것을 입증한다. 추가적으로, 데이터는 인간 IgG1 불변 영역에서의 단백질 A 결합 부위가 조작된 시스테인 잔기의 존재에 의해 변경되지 않았다는 것을 입증하였다.
표 5: 트라스투주맙 유래된 시스테인 항체 변이체의 생산
Figure pct00046
ND = 결정되지 않음
실시예 3: 트라스투주맙 유래된 항체의 완전성
조작된 시스테인 및 트랜스글루타미나제 변이체가 표준 항체 제조 플랫폼 과정을 따랐을 것임을 보장하기 위해 트라스투주맙 야생형 항체에 비해 중요한 생물물리학적 특성을 평가하도록 상기 변이체의 분자적 평가를 수행하였다.
안정한 CHO 발현을 통해 생산된 정제된 조작된 시스테인 항체 변이체 제제의 완전성을 결정하기 위해, 피크의 퍼센트 순도를 비-환원 모세관 겔 전기영동 (캘리퍼 랩칩 GXII: 퍼킨 엘머, 매사추세츠주 월섬)을 사용하여 계산하였다. 결과는 조작된 시스테인 항체 변이체 T(κK183C+K290C) 및 T(K290C+K334C)가 트라스투주맙 야생형 항체와 유사한 낮은 수준의 두 단편 및 고분자량 종 (HMMS)을 함유하였다는 것을 제시한다. 대조적으로, T(K334C+K392C)는 평가된 다른 이중 조작된 시스테인 변이체에 비해 높은 수준의 단편화된 항체 피크를 함유하였다 (표 6). 이들 결과는 조작된 시스테인의 특정 조합이 부위-특이적 접합을 위해 의도된 항체의 완전성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다.
표 6: 비-환원 전기영동도로부터 계산된 피크의 퍼센트 순도
Figure pct00047
실시예 4: 페이로드 약물 화합물의 생성
아우리스타틴 약물 화합물 0101, 0131, 8261, 6121, 8254 및 6780을 PCT 공개 WO2013/072813 (이는 그 전문이 본원에 포함됨)에 기제된 방법에 따라 제조하였다. 공개된 출원에서, 아우리스타틴 화합물은 표 7에 제시된 넘버링 시스템에 의해 나타내어진다.
표 7
Figure pct00048
PCT 공개 WO2013/072813에 따라 약물 화합물 0101을 하기 절차에 따라 제조하였다.
Figure pct00049
단계 1. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (#53)의 합성. 일반적 절차 D에 따라, 디클로로메탄 (20 mL, 0.1 M) 및 N,N-디메틸포름아미드 (3 mL) 중 #32 (2.05 g, 2.83 mmol, 1 당량), 아민 #19 (2.5 g, 3.4 mmol, 1.2 당량), HATU (1.29 g, 3.38 mmol, 1.2 당량) 및 트리에틸아민 (1.57 mL, 11.3 mmol, 4 당량)으로부터 조 목적 물질을 합성하고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (구배: 헵탄 중 0%에서 55% 아세톤)에 의해 정제하여 #53 (2.42g, 74%)을 고체로서 생성하였다. LC-MS: m/z 965.7 [M+H+], 987.6 [M+Na+], 체류 시간 = 1.04분; HPLC (프로토콜 A): m/z 965.4 [M+H+], 체류 시간 = 11.344분 (순도 > 97%); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), 회전이성질체의 혼합물인 것으로 추정됨, 특징적인 신호: δ 7.86-7.91 (m, 2H), [7.77 (d, J=3.3 Hz) 및 7.79 (d, J=3.2 Hz), 총 1H], 7.67-7.74 (m, 2H), [7.63 (d, J=3.2 Hz) 및 7.65 (d, J=3.2 Hz), 총 1H], 7.38-7.44 (m, 2H), 7.30-7.36 (m, 2H), 7.11-7.30 (m, 5H), [5.39 (ddd, J=11.4, 8.4, 4.1 Hz) 및 5.52 (ddd, J=11.7, 8.8, 4.2 Hz), 총 1H], [4.49 (dd, J=8.6, 7.6 Hz) 및 4.59 (dd, J=8.6, 6.8 Hz), 총 1H], 3.13, 3.17, 3.18 및 3.24 (4 s, 총 6H), 2.90 및 3.00 (2 br s, 총 3H), 1.31 및 1.36 (2 br s, 총 6H), [1.05 (d, J=6.7 Hz) 및 1.09 (d, J=6.7 Hz), 총 3H].
단계 2. 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드 (#54 또는 0101)의 합성. 일반적 절차 A에 따라, 디클로로메탄 (10 mL, 0.07 M) 중 #53 (701 mg, 0.726 mmol)으로부터 조 목적 물질을 합성하고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (구배: 디클로로메탄 중 0%에서 10% 메탄올)에 의해 정제하였다. 잔류물을 디에틸 에테르 및 헵탄으로 희석하고, 진공 하에 농축시켜 #54 (또는 0101) (406 mg, 75%)를 백색 고체로서 수득하였다. LC-MS: m/z 743.6 [M+H+], 체류 시간 = 0.70분; HPLC (프로토콜 A): m/z 743.4 [M+H+], 체류 시간 = 6.903분, (순도 > 97%); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), 회전이성질체의 혼합물인 것으로 추정됨, 특징적인 신호: δ [8.64 (br d, J=8.5 Hz) 및 8.86 (br d, J=8.7 Hz), 총 1H], [8.04 (br d, J=9.3 Hz) 및 8.08 (br d, J=9.3 Hz), 총 1H], [7.77 (d, J=3.3 Hz) 및 7.80 (d, J=3.2 Hz), 총 1H], [7.63 (d, J=3.3 Hz) 및 7.66 (d, J=3.2 Hz), 총 1H], 7.13-7.31 (m, 5H), [5.39 (ddd, J=11, 8.5, 4 Hz) 및 5.53 (ddd, J=12, 9, 4 Hz), 총 1H], [4.49 (dd, J=9, 8 Hz) 및 4.60 (dd, J=9, 7 Hz), 총 1H], 3.16, 3.20, 3.21 및 3.25 (4 s, 총 6H), 2.93 및 3.02 (2 br s, 총 3H), 1.21 (s, 3H), 1.13 및 1.13 (2 s, 총 3H), [1.05 (d, J=6.7 Hz) 및 1.10 (d, J=6.7 Hz), 총 3H], 0.73-0.80 (m, 3H).
약물 화합물 MMAD, MMAE 및 MMAF를 PCT 공개 WO 2013/072813에 개시된 방법에 따라 사내 제조하였다.
약물 화합물 DM1을 미국 특허 번호 5,208,020에 약술된 절차를 통해 구입한 메이탄시놀로부터 사내 제조하였다.
실시예 5: 트라스투주맙-유래된 항체의 생접합
본 발명의 트라스투주맙-유래된 항체를 링커를 통해 페이로드에 접합시켜 ADC를 생성하였다. 사용된 접합 방법은 부위 특이적 접합 (즉, 특정한 시스테인 잔기 또는 특정한 글루타민 잔기를 통함) 또는 통상적인 접합이었다.
A. 시스테인 부위 특이적
표 8의 ADC를 하기 기재된 시스테인 부위 특이적 방법을 통해 접합시켰다.
표 8
Figure pct00050
500 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP) 용액 (50 내지 100 몰 당량)을 항체 (5 mg)에 첨가하여 최종 항체 농도가 20 mM EDTA를 함유하는 PBS 중 5-15 mg/mL이도록 하였다. 반응을 37℃에서 2.5시간 동안 정치시킨 후에, 항체를 겔 여과 칼럼 (PD-10 탈염 칼럼, 지이 헬스케어)을 사용하여 5 mM EDTA를 함유하는 PBS로 완충제 교환하였다. 생성된 5 mM EDTA를 함유하는 PBS 중 항체 (5-10 mg/mL)를 새로 제조된 1:1 PBS/EtOH 중 DHA의 50 mM 용액 (최종 DHA 농도 = 1 mM - 4 mM)으로 처리하고, 4℃에서 밤새 정치시켰다.
항체/DHA 혼합물을 5 mM EDTA를 함유하는 PBS로 완충제 교환하고 (평형 완충제의 pH는 인산을 사용하여 ~7.0으로 조정됨), 50 KDa MW 컷오프 스핀 농축 장치를 사용하여 농축시켰다. 생성된 5 mM EDTA를 함유하는 PBS 중 항체 (항체 농도 ~5-10 mg/ml)를 DMA 중 10 mM 말레이미드 페이로드의 5-7 몰 당량으로 처리하였다. 1.5-2.5시간 동안 정치시킨 후, 물질을 완충제 교환하였다 (PD-10). SEC에 의한 정제를 (필요에 따라) 수행하여 임의의 응집된 물질 및 남아있는 유리 페이로드를 제거하였다.
B. 트랜스글루타미나제 부위 특이적
표 9의 ADC를 하기 기재된 트랜스글루타미나제 부위 특이적 방법을 통해 접합시켰다.
표 9
Figure pct00051
아미드교환 반응에서, 항체 상의 글루타민은 아실 공여자로서 작용하고, 아민-함유 화합물은 아실 수용자 (아민 공여자)로서 작용하였다. 33 μM의 농도의 정제된 HER2 항체를 언급되지 않은 한 0.31 mM 환원 글루타티온을 갖는 pH 범위 7.5-8의 트리스 HCl 완충제 및 150 - mM 염화나트륨 중 2% (w/v) 스트렙토베르티실리움 모바라엔세(Streptoverticillium mobaraense) 트랜스글루타미나제 (악티바(ACTIVA)™, 아지노모토, 일본)의 존재 하에 33 - 83.3 μM AcLysvc-0101 범위인 10 - 25 M 과량의 아실 수용자와 함께 인큐베이션하였다. 반응 조건을 개별 아실 공여자에 대해 조정하였으며, 여기서 T(LCQ05+K222R)은 환원 글루타티온 없이 pH 8.0에서 10M 과량의 아실 수용자를 사용하고, T(N297Q+K222R) 및 T(N297Q)는 pH 7.5에서 20M 과량의 아실 수용자를 사용하고, T(N297A+K222R+LCQ05)는 pH 7.5에서 25M 과량의 아실 수용자를 사용하였다. 37℃에서 16-20시간 동안 인큐베이션한 후, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 크로마토그래피 방법, 예컨대 지이 헬스케어로부터의 상업용 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여 맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe)™ 수지 또는 부틸 세파로스 하이 퍼포먼스 (지이 헬스케어, 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 항체를 정제하였다.
C. 통상적인 접합
표 10 및 11의 ADC를 하기 기재된 통상적인 접합 방법을 통해 접합시켰다.
표 10
Figure pct00052
표 11
Figure pct00053
항체를 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS, 론자) 내로 투석하였다. 투석된 항체를 5 mM 2, 2', 2", 2"'-(에탄-1,2-디일디니트릴로)테트라아세트산 (EDTA)을 함유하는 PBS (pH 7)를 사용하여 15 mg/mL로 희석하였다. 생성된 항체를 2-3 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP, 증류수 중 5 mM)로 처리하고, 37℃에서 1-2시간 동안 정치시켰다. 실온으로 냉각시킬 때, 디메틸아세트아미드 (DMA)를 첨가하여 10% (v/v) 총 유기부를 달성하였다. 혼합물을 DMA 중 10 mM 원액으로서 8-10 당량의 적절한 링커-페이로드로 처리하였다. 반응을 실온에서 1-2시간 동안 정치시킨 다음, 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 제조업체의 지침서에 따라 사용하여 DPBS (pH 7.4)로 완충제 교환하였다.
폐환된 채로 남아있는 물질 (표 10의 ADC)을 지이 슈퍼덱스200 칼럼 및 PBS (pH 7.4) 용리액을 갖는 지이 AKTA 익스플로러 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정제하였다. 최종 샘플을 ~5 mg/mL 단백질로 농축시키고, 필터를 멸균하고, 하기 약술된 질량 분광분석법 조건을 사용하여 로딩에 대해 조사하였다.
숙신이미드 고리 가수분해에 사용된 물질 (표 11의 ADC)을 한외여과 장치 (50 KDa MW 컷오프)를 사용하여 50 mM 보레이트 완충제 (pH 9.2)로 즉시 완충제 교환하였다. 생성된 용액을 48시간 동안 45℃로 가열하였다. 생성된 용액을 냉각시키고, PBS로 완충제-교환하고, 임의의 응집된 물질을 제거하기 위해 (하기 기재된 바와 같이) SEC에 의해 정제하였다. 최종 샘플을 ~5 mg/mL 단백질로 농축시키고, 필터를 멸균하고, 하기 약술된 질량 분광분석법 조건을 사용하여 로딩에 대해 검사하였다.
D. T-DM1 접합
트라스투주맙-메이탄시노이드 접합체 (T-DM1)는 트라스투주맙 엠탄신 (카드실라®)과 구조적으로 유사하다. T-DM1은 이관능성 링커 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 통해 DM1 메이탄시노이드에 공유 결합된 트라스투주맙 항체로 구성된다. 술포-SMCC를 먼저 10:1 반응 화학량론으로, 50 mM 인산칼륨, 2 mM EDTA, pH 6.8 중 25℃에서 1시간 동안 항체 상의 유리 아민에 접합시킨 다음, 미결합 링커를 접합된 항체로부터 탈염시킨다. 이어서, 이 항체-MCC 중간체를 10:1 반응 화학량론으로, 50 mM 인산칼륨, 50 mM NaCl, 2mM EDTA, pH 6.8 중 25℃에서 밤새 MCC 링커 항체 상의 유리 말레이미도 말단에 있는 DM1 술피드에 접합시킨다. 이어서, 남아있는 미반응 말레이미드를 L-시스테인으로 캡핑하고, ADC를 슈퍼덱스200 칼럼을 통해 분획화하여 비-단량체 종을 제거한다 (Chari et al., 1992, Cancer Res 52:127-31).
실시예 6: ADC의 정제
ADC를 일반적으로 하기 기재된 바와 같은 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 정제 및 특징화하였다. 의도된 접합 부위 상의 약물 로딩을 하기에 보다 자세히 기재된 바와 같이 질량 분광측정법 (MS), 역상 HPLC 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 포함한 다양한 방법을 사용하여 결정하였다. 이들 3종의 분석 방법의 조합은 항체 상에 페이로드의 로딩을 검증 및 정량화함으로써 각각의 접합체에 대한 DAR의 정확한 결정치를 제공하기 위한 다양한 방법을 제공한다.
A. 정제용 SEC
ADC는 단백질 응집체를 제거하고 반응 혼합물에 남아있는 페이로드-링커의 흔적을 제거하기 위해 Akta 익스플로러 FPLC 시스템 상에서 워터스 슈퍼덱스200 10/300GL 칼럼을 사용하는 SEC 크로마토그래피를 사용하여 일반적으로 정제하였다. 가끔, ADC는 SEC 정제 전에 응집체 및 소분자가 없었고, 따라서 정제용 SEC에 적용하지 않았다. 사용된 용리액은 1 mL/분 유량의 PBS였다. 이들 조건 하에, 응집된 물질 (실온에서 약 10분에 용리됨)을 비-응집된 물질 (실온에서 약 15분에 용리됨)로부터 용이하게 분리하였다. 소수성 페이로드-링커 조합은 빈번하게 SEC 피크의 "우측-이동"을 유발하였다. 어떤 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이 SEC 피크 이동은 링커-페이로드와 고정상과의 소수성 상호작용으로 인한 것일 수 있다. 일부 경우에, 이 우측-이동은 접합된 단백질이 비-접합된 단백질로부터 부분적으로 분해되는 것을 가능하게 하였다.
B. 분석용 SEC
ADC의 순도 및 단량체 스테이터스를 평가하기 위해 용리액으로서 PBS를 사용하여 애질런트 1100 HPLC 상에서 분석용 SEC를 수행하였다. 용리액을 220 및 280 nM에서 모니터링하였다. 칼럼이 TSK겔 G3000SW 칼럼 (7.8x300mm, 카탈로그 번호 R874803P)인 경우에, 사용된 이동상은 30분 동안 0.9 mL/분의 유량으로의 PBS였다. 칼럼이 바이오셉SEC3000 칼럼 (7.8x300 mm)인 경우에, 사용된 이동상은 25분 동안 1.0 mL/분의 유량으로의 PBS였다.
실시예 7: ADC의 특징화
A. 질량 분광분석법 (MS)
샘플은 대략 20 μl의 샘플 (PBS 중 대략 1 mg/ml ADC)을 20 μl의 20 mM 디티오트레이톨 (DTT)과 합함으로써 LCMS 분석을 위해 준비하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 정치시킨 후에, 샘플을 애질런트 포로쉘 300SB-C8 (2.1x75mm) 칼럼이 장착된 애질런트 110 HPLC 시스템 내로 주사하였다. 시스템 온도를 60℃로 설정하였다. 물 (0.1% 포름산 조절제 함유) 중 20%에서 45% 아세토니트릴의 5분 구배를 이용하였다. 용리액을 UV (220 nM) 및 워터스 마이크로매스 ZQ 질량 분광계 (ESI 이온화; 콘 전압: 20V; 공급원 온도: 120℃; 탈용매화 온도: 350℃)에 의해 모니터링하였다. 다중-하전 종을 함유하는 조 스펙트럼을 매스링스 4.1 소프트웨어 패키지 내 MaxEnt1을 제조업체의 지침서에 따라 사용하여 디콘볼루션하였다.
B. 항체당 로딩의 MS 결정
ADC를 제조하기 위한 항체에의 페이로드의 총 로딩은 약물 항체 비 또는 DAR로 지칭된다. DAR을 제조된 각각의 ADC에 대해 계산하였다 (표 12).
전체 용리 윈도우 (통상적으로 5분)에 대한 스펙트럼을 단일 합계 스펙트럼 (즉, 전체 샘플의 MS를 나타내는 질량 스펙트럼)으로 합하였다. ADC 샘플에 대한 MS 결과를 동일한 비-로딩된 대조군 항체의 상응하는 MS에 직접적으로 비교하였다. 이것은 로딩/비로딩된 중쇄 (HC) 피크 및 로딩/비로딩된 경쇄 (LC) 피크의 확인을 가능하게 하였다. 다양한 피크의 비는 하기 방정식 (방정식 1)에 기초하여 로딩을 확립하는데 사용될 수 있다. 계산은 일반적으로 유효한 가정인 것으로 결정된, 로딩 및 비-로딩된 쇄가 동등하게 이온화한다는 가정에 기초한다.
DAR을 확립하기 위해 하기 계산을 수행하였다:
방정식 1:
로딩 = 2*[LC1/(LC1+LC0)]+2*[HC1/(HC0+HC1+HC2)]+4*[HC2/(HC0+HC1+HC2)]
여기서 나타낸 변수는 다음의 상대 존재비이다: LC0 = 비로딩된 경쇄, LC1 = 단일 로딩된 경쇄, HC0 = 비로딩된 중쇄, HC1 = 단일 로딩된 중쇄, 및 HC2 = 이중 로딩된 중쇄. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 보다 많이 로딩된 종, 예컨대 LC2, LC3, HC3, HC4, HC5 등을 포괄하기 위해 이 계산의 확장을 포괄한다는 것을 인지할 것이다.
하기 방정식 2는 비-조작된 시스테인 잔기 상의 로딩의 양을 추정하는데 사용된다. 조작된 Fc 돌연변이체의 경우, 경쇄 (LC) 상의 로딩은, 정의에 의해, 비특이적 로딩인 것으로 간주하였다. 더욱이, 단지 LC만을 로딩하는 것은 HC-LC 디술피드 가교의 우연한 환원 (즉, 항체가 "과다-환원됨")의 결과인 것으로 가정되었다. 과량의 말레이미드 친전자체가 접합 반응에 사용된다면 (일반적으로 단일 돌연변이체에 대해 대략 5 당량 및 이중 돌연변이체에 대해 10 당량), 경쇄 상의 임의의 비특이적 로딩은 중쇄 상의 상응하는 양의 비-특이적 로딩 (즉, 파괴된 HC-LC 디술피드의 다른 "절반")을 동반한 것으로 가정되었다. 이들 가정을 기억하면서, 하기 방정식 (방정식 2)을 사용하여 단백질 상의 비-특이적 로딩의 양을 추정하였다:
방정식 2:
비특이적 로딩 = 4*[LC1/(LC1+LC0)]
여기서 나타낸 변수는 다음의 상대 존재비이다: LC0 = 비로딩된 경쇄, LC1 = 단일 로딩된 경쇄.
표 12: ADC의 약물 항체 비 (DAR)
Figure pct00054
C. 로딩의 부위를 확립하기 위한 패브리케이터(FabRICATOR)®를 사용한 단백질분해
시스테인 돌연변이 ADC의 경우, 항체 상으로의 친전자성 페이로드의 임의의 비특이적 로딩은 "내부" 시스테인 잔기 (즉, 전형적으로 HC-HC 또는 HC-LC 디술피드 가교의 부분인 것)로도 또한 지칭되는 "쇄간"에서 발생하는 것으로 가정된다. 내부 시스테인 잔기 (다르게는 전형적으로 HC-HC 또는 HC-LC 사이의 S-S를 형성하는 것) 상으로의 로딩에 비해 Fc 도메인 내 조작된 시스테인 상으로의 친전자체의 로딩을 구별하기 위해, 접합체를 항체의 Fab 도메인과 Fc 도메인 사이를 절단하는 것으로 공지된 프로테아제로 처리하였다. 하나의 이러한 프로테아제는 제노비스에 의해 "패브리케이터®"로 시판되며 문헌 [von Pawel-Rammingen et al., 2002, EMBO J. 21:1607]에 기재된 시스테인 프로테아제 IdeS이다.
간략하게, 제조업체의 제안된 조건에 따라, ADC를 패브리케이터® 프로테아제로 처리하고 샘플을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플은 대략 20 μl의 샘플 (PBS 중 대략 1 mg/mL)을 20 μl의 20 mM 디티오트레이톨 (DTT)과 합하고 혼합물을 실온에서 5분 동안 정치시킴으로써 LCMS 분석을 위해 준비하였다. 인간 IgG1의 이 처리는 모두 크기가 약 23 내지 26 KDa 범위인 다음 3개의 항체 단편을 생성하였다: 전형적으로 LC-HC 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 내부 시스테인을 포함하는 LC 단편; 3개의 내부 시스테인 (여기서 1개는 전형적으로 LC-HC 디술피드 결합을 형성하고, 다른 2개의 시스테인은 항체의 힌지 영역에서 발견되며, 전형적으로 항체의 2개의 중쇄 사이에 HC-HC 디술피드 결합을 형성함)을 포함하는 N-말단 HC 단편; 및 본원에 개시된 구축물에서 돌연변이에 의해 도입된 것 이외의 다른 어떤 반응성 시스테인도 함유하지 않는 C-말단 HC 단편. 샘플을 상기 기재된 바와 같이 MS에 의해 분석하였다. 로딩 계산을 이전에 (상기) 기재된 것과 동일한 방식으로 수행하여 LC, N-말단 HC 및 C-말단 HC의 로딩을 정량화하였다. C-말단 HC 상의 로딩은 "특이적" 로딩인 것으로 간주되고 반면에 LC 및 N-말단 HC 상의 로딩은 "비특이적" 로딩인 것으로 간주된다.
로딩 계산을 교차-검사하기 위해, ADC의 하위세트를 또한 하기 섹션에 보다 자세히 기재된 바와 같은 대안적 방법 (역상 고성능 액체 크로마토그래피 [rpHPLC]-기반 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 [HIC]-기반 방법)을 사용하여 로딩에 대해 평가하였다.
D. 역상 HPLC 분석
샘플은 대략 20 ul의 샘플 (PBS 중 대략 1 mg/mL)을 20 ul의 20 mM 디티오트레이톨 (DTT)과 합함으로써 역상 HPLC 분석을 위해 준비하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 정치시킨 후에, 샘플을 애질런트 포로쉘 300SB-C8 (2.1x75mm) 칼럼이 장착된 애질런트 1100 HPLC 시스템 내로 주사하였다. 시스템 온도를 60℃로 설정하고, 용리액을 UV (220 nM 및 280 nM)에 의해 모니터링하였다. 물 (0.1% TFA 조절제 함유) 중 20%에서 45% 아세토니트릴의 20분 구배를 이용하였다: T=0분: 25% 아세토니트릴; T=2분: 25% 아세토니트릴; T=19분: 45% 아세토니트릴; 및 T=20분: 25% 아세토니트릴. 이들 조건을 사용하여, 항체의 HC 및 LC를 기준선 분리하였다. 이 분석의 결과는 LC가 대부분 비변형된 채로 남아있고 (T(kK183C) 및 T(LCQ05) 함유 항체는 예외) 반면에 HC는 변형된다는 것을 나타낸다 (데이터는 제시되지 않음).
E. 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)
화합물은 PBS를 사용하여 샘플을 대략 1 mg/ml로 희석함으로써 HIC 분석을 위해 준비하였다. 샘플을 TSK-겔 부틸 NPR 칼럼 (4.6 x 3.5 mm, 2.5 μm 세공 크기; 도소 바이오사이언시스 부품 #14947)을 갖는 애질런트 1200 HPLC 상으로의 15 μl의 자동-주사에 의해 분석하였다. 시스템은 온도조절장치가 구비된 오토-샘플러, 칼럼 가열기 및 UV 검출기를 포함한다.
구배 방법을 하기와 같이 사용하였다:
이동상 A: 1.5M 황산암모늄, 50 mM 이염기성 인산칼륨 (pH7); 이동상 B: 20% 이소프로필 알콜, 50mM 이염기성 인산칼륨 (pH 7); T=0분 100% A; T=12분, 0% A.
체류 시간은 표 13에 제시된다. 선택된 스펙트럼은 도 2a-2e에 제시된다. 부위-특이적 접합을 사용한 ADC (T(kK183C+K290C)-vc0101, T(K334C+K392C)-vc0101 및 T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101) (도 1a-1c)는 주로 1개의 피크를 나타냈고 반면에 통상적인 접합을 사용한 ADC (T-vc0101 및 T-DM1) (도 2d-2e)는 차등적으로 로딩된 접합체의 혼합물을 나타냈다.
표 13: 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의한 ADC 체류 시간
Figure pct00055
ND=결정되지 않음
RT=HIC 상에서의 체류 시간 (분)
RRT=ADC의 RT를 5.0-5.2분의 전형적 체류 시간을 갖는 벤치마크 미접합 야생형 트라스투주맙의 RT에 의해 나눔으로써 계산된 평균 상대 체류 시간
F. 열안정성
시차 주사 열량측정법 (DCS)을 사용하여 조작된 시스테인 및 트랜스글루타미나제 항체 변이체, 및 상응하는 Aur-06380101 부위-특이적 접합체의 열적 안정성을 결정하였다. 이 분석을 위해, PBS-CMF pH 7.2 중에 제제화된 샘플을 오토샘플러가 구비된 마이크로칼 VP-캐필러리 DSC (지이 헬스케어 바이오-사이언시스, 뉴저지주 피스카타웨이)의 샘플 트레이로 내로 분배하고, 10℃에서 5분 동안 평형화시킨 다음, 시간당 100℃의 속도로 110℃까지 스캐닝하였다. 16초의 여과 기간을 선택하였다. 미가공 데이터를 기준선 보정하고, 단백질 농도를 정규화하였다. 오리진 소프트웨어 7.0 (오리진랩 코포레이션, 매사추세츠주 노샘프턴)을 사용하여 데이터를 적절한 수의 전이를 갖는 MN2-스테이트 모델에 피팅하였다.
모든 단일 및 이중 시스테인 조작된 항체 변이체 뿐만 아니라 조작된 LCQ05 아실 공여자 글루타민-함유 태그 항체는 제1 용융 전이 (Tm1) >65℃에 의해 결정된 바와 같은 탁월한 열적 안정성을 나타냈다 (표 14).
부위 특이적 접합 방법을 사용하여 0101에 접합된 트라스투주맙 유래된 모노클로날 항체를 또한 평가하였으며, 이는 또한 예외적 열적 안정성을 갖는 것으로 나타났다 (표 15). 그러나, T(K392C+L443C)-vc0101 ADC에 대한 Tm1은 미접합 항체에 비해 -4.35℃였기 때문에 페이로드의 접합에 의해 가장 영향을 받았다.
종합하면 이들 결과는 조작된 시스테인 및 아실 공여자 글루타민-함유 태그 항체 변이체 둘 다가 열적으로 안정하다는 것 및 vc 링커를 통한 0101의 부위-특이적 접합이 탁월한 열적 안정성을 갖는 접합체를 생성하였다는 것을 입증하였다. 추가로, 미접합 항체에 비해 T(K392C+L443C)-vc0101에 대해 관찰된 더 낮은 열적 안정성은 조작된 시스테인 잔기의 특정 조합에의 vc 링커를 통한 0101의 접합이 ADC의 안정성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타냈다.
표 14: 조작된 트라스투주맙 유래된 변이체의 열적 안정성
Figure pct00056
표 15: 아우리스타틴 0101에 접합된 부위-특이적 접합체의 열적 안정성
Figure pct00057
실시예 8: HER2에 대한 ADC 결합
A. 직접 결합
BT474 세포 (HTB-20)를 트립신처리하고, 스핀 다운시키고, 신선한 배지 중에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 ADC 또는 미접합 트라스투주맙의 연속 희석물과 함께 1 μg/ml의 출발 농도로 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 항-인간 알렉사플루오르 488 2차 항체 (Cat# A-11013, 라이프 테크놀로지스)와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 2회 세척한 다음, PBS 중에 재현탁시켰다. 평균 형광 강도를 아큐리 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)를 사용하여 판독하였다.
표 16: HER2에 대한 ADC 결합
Figure pct00058
EC50=절반-최대 결합을 제공하는 항체 또는 ADC의 농도.
도 3a 및 표 16에 제시된 바와 같이, ADC T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101, T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101, T(kK183C+K290C)-vc0101, T(kK183C+K392C)-vc0101, T(K290C+K392C)-vc0101은 직접 결합에 의해 T-DM1 및 트라스투주맙과 유사한 결합 친화도를 가졌다. 이것은 본 발명의 ADC에서의 항체에 대한 변형 및 링커-페이로드의 부가가 결합에 유의하게 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다.
B. FACS에 의한 경쟁적 결합
BT474 세포를 트립신처리하고, 스핀 다운시키고, 신선한 배지 중에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 1 μg/mL의 트라스투주맙-PE (이바이오사이언시스 (캘리포니아주 샌디에고)에 의해 맞춤 합성된 1:1 PE 표지된 트라스투주맙)와 조합된 ADC 또는 미접합 트라스투주맙의 연속 희석물과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 2회 세척한 다음, PBS 중에 재현탁시켰다. 평균 형광 강도를 아큐리 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)를 사용하여 판독하였다.
도 3b에 제시된 바와 같이, ADC T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101, T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101, T(kK183C+K290C)-vc0101, T(kK183C+K392C)-vc0101, T(K290C+K392C)-vc0101은 PE 표지된 트라스투주맙에 대한 경쟁적 결합에 의해 T-DM1 및 트라스투주맙과 유사한 결합 친화도를 가졌다. 이것은 본 발명의 ADC에서의 항체에 대한 변형 및 링커-페이로드의 부가가 결합에 유의하게 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다.
실시예 9: 인간 FcRn에 대한 ADC 결합
FcRn은 pH 의존성 방식으로 하위유형에 상관없이 IgG와 상호작용하고, 항체가 리소솜 구획에 진입하여 여기서 분해되는 것을 방지함으로써 항체를 분해로부터 보호하는 것으로 관련 기술분야에서 여겨진다. 따라서, 야생형 IgG1-Fc 영역 내로의 반응성 시스테인의 도입을 위한 위치를 선택하는 것에 대한 고려는 조작된 시스테인을 포함하는 항체의 FcRn 결합 특성 및 반감기 변경을 피하기 위한 것이다.
비아코어(BIAcore)® 분석을 수행하여 트라스투주맙 유래된 모노클로날 항체 및 그의 각각의 ADC의 인간 FcRn에의 결합에 대한 정상-상태 친화도 (KD)를 결정하였다. 비아코어® 기술은 트라스투주맙 유래된 모노클로날 항체 또는 그의 각각의 ADC가 층 상에 고정화된 인간 FcRn 단백질에 결합할 때 센서의 표면 층에서의 굴절률의 변화를 이용한다. 결합을 표면으로부터 굴절되는 레이저 광의 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 검출하였다. 인간 FcRn을 BirA 시약 (카탈로그 #: BIRA500, 아비디티, 엘엘씨, 콜로라도주 오로라)을 사용하여 조작된 Avi-태그를 통해 특이적으로 비오티닐화하고, 스트렙타비딘 (SA) 센서 칩 상에 고정화시켜 센서 상의 FcRn 단백질의 균일한 배향을 가능하게 하였다. 다음에, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), 0.5% 계면활성제 P20을 갖는 20mM MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 pH 6.0 (MES-EP) 중 다양한 농도의 트라스투주맙 유래된 모노클로날 항체 또는 그의 각각의 ADC를 칩 표면 상에 주사하였다. 표면을 주사 주기 사이에 HBS-EP + 0.05% 계면활성제 P20 (지이 헬스케어, 뉴저지주 피스카타웨이), pH 7.4를 사용하여 재생시켰다. 정상-상태 결합 친화도를 트라스투주맙 유래된 모노클로날 항체 또는 그의 각각의 ADC에 대해 결정하고, 이들을 야생형 트라스투주맙 항체 (IgG1 Fc 영역에 시스테인 돌연변이를 포함하지 않고, 페이로드의 TGase 조작된 태그 또는 부위-특이적 접합을 포함하지 않음)와 비교하였다.
이들 데이터는 본 발명의 나타낸 위치에서의 IgG-Fc 영역 내로의 조작된 시스테인 잔기의 혼입이 FcRn에 대한 친화도를 변경시키지 않았다는 것을 입증하였다 (표 17).
표 17: 인간 FcRn에 결합하는 부위-특이적 접합체의 정상-상태 친화도
Figure pct00059
ND=결정되지 않음
실시예 10: Fcγ 수용체에 대한 ADC 결합
페이로드에 대한 접합이 항체 관련된 기능 특성, 예컨대 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)에 영향을 미칠 수 있는지 이해하기 위해 인간 Fc-γ 수용체에 대한 부위-특이적 접합을 사용하는 ADC의 결합을 평가하였다. FcγIIIa (CD16)는 NK 세포 및 대식세포 상에서 발현되고, 이 수용체와 항체 결합을 통한 표적 발현 세포와의 공동-결속은 ADCC를 유도한다. 비아코어® 분석을 사용하여 트라스투주맙 유래된 모노클로날 항체 및 그의 각각의 ADC의 Fc-γ 수용체 IIa (CD32a), IIb(CD32b), IIIa (CD16) 및 FcγRI (CD64)에 대한 결합을 검사하였다.
이 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 검정을 위해, 재조합 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (Her2/neu) 세포외 도메인 단백질 (시노 바이올로지칼 인크., 중국 베이징)을 CM5 칩 (지이 헬스케어, 뉴저지주 피스카타웨이) 상에 고정화시키고, 트라스투주맙 유래된 모노클로날 항체 또는 그의 각각의 ADC의 ~300-400 반응 유닛 (RU)을 포획하였다. T-DM1을 양성 대조군으로서 이 평가에 포함시켰는데, 그것이 미접합 트라스투주맙 항체에 필적하는 Fcγ 수용체에 대한 접합후 결합 특성을 유지하는 것으로 제시되었기 때문이다. 다음에, 다양한 농도의 Fcγ 수용체 FcγIIa (CD32a), FcγIIb(CD32b), FcγIIIa (CD16a) 및 FcγRI (CD64)을 표면 상에 주사하고, 결합을 결정하였다.
FcγR IIa, IIb 및 IIIa는 빠른 온/오프 속도를 나타냈고 따라서 센소그램을 정상 상태 모델에 피팅하여 KD 값을 수득하였다. FcγRI은 보다 느린 온/오프 속도를 나타냈고 따라서 데이터를 동역학적 모델에 피팅하여 KD 값을 수득하였다.
조작된 시스테인 위치 290 및 334에서의 페이로드의 접합은 그의 미접합 대응 항체 및 T-DM1과 비교하여, 구체적으로 CD16a, CD32a 및 CD64에 대한 FcγR 친화도의 중간 상실을 나타냈다 (표 18). 그러나, 부위 290, 334 및 392에서의 동시 접합은 T(K290C+K334C)-vc0101 및 T(K334C+K392C)-vc0101에서 관찰된 바와 같이 CD16a, CD32a 및 CD32b에 대한 친화도의 상당한 상실을 유발하였지만 CD64에 대해서는 그러하지 않았다 (표 18). 흥미롭게도, T(κK183C+K290C)-vc0101은 K290C 위치에 약물 페이로드를 보유함에도 불구하고 본 연구에서 평가된 모든 FcγR에 대한 필적하는 결합을 나타냈다 (표 18). 예상된 바와 같이 트랜스글루타미나제 매개된 T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101은 평가된 어떤 Fcγ 수용체에도 결합하지 않았으며, 이는 아실 공여자 글루타민-함유 태그의 위치가 N-연결된 글리코실화를 제거하기 때문이다. 반대로, T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101은 Fcγ 수용체에 대한 완전 결합을 유지하였으며, 이는 글루타민-함유 태그가 인간 카파 경쇄 불변 영역 내에 조작되어 있기 때문이다.
종합하면, 이들 결과는 접합된 페이로드의 위치가 FcγR에 대한 ADC의 결합에 영향을 미칠 수 있고, 접합체의 항체 기능에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사하였다.
표 18: CD16a, CD32a, CD32b 및 CD64에 결합하는 Fcγ 수용체에 대한 부위-특이적 접합체의 결합 친화도
Figure pct00060
ND = 결정되지 않음, NB = 결합 부재
실시예 11: ADCC 활성
ADCC 검정에서, Her2-발현 세포주 BT474 및 SKBR3을 표적 세포로서 사용하였으며, 동시에 NK-92 세포 (콘퀘스트에 의해 제조된 50세 백인 남성으로부터의 말초 혈액 단핵 세포로부터 유래된 인터류킨-2 의존성 자연 킬러 세포주) 또는 건강한 공여자 (#179)로부터의 새로 채혈한 혈액으로부터 단리된 인간 말초 혈액 단핵구 (PBMC)를 이펙터 세포로서 사용하였다.
1 X 104개 세포/100 μl/웰의 표적 세포 (BT474 또는 SKBR3)를 96-웰 플레이트에 배치하고, 37℃/5% CO2에서 RPMI1640 배지에서 밤새 배양하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 60 μl 검정 완충제 (10 mM HEPES를 함유하는 RPMI1640 배지), 20 μl의 1 μg/ml 항체 또는 ADC로 대체하고, 이어서 이펙터 대 표적 비를 PBMC의 경우 BT474에 대해 50:1 또는 SKBR3에 대해 25:1, NK92 세포의 경우 10:1을 달성하기 위해 각각의 웰에 20 μl의 1 X 105개 (SKBR3에 대해) 또는 5x105개 (BT474에 대해) PBMC 현탁액 또는 두 세포주에 대해 2.5 X 105개 NK92 세포를 첨가하였다. 모든 샘플을 삼중으로 실행하였다.
검정 플레이트를 6시간 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이션한 다음, 실온으로 평형화시켰다. 세포 용해로부터의 LDH 방출을 560 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장에서 시토톡스-원(CytoTox-One)™ 시약을 사용하여 측정하였다. 양성 대조군으로서, 8 μL의 트리톤을 첨가하여 대조군 웰에서 최대 LDH 방출을 생성하였다. 도 4에 제시된 특이적 세포독성을 하기 식을 사용하여 계산하였다:
Figure pct00061
"실험"은 상기 기재된 조건 중 하나로 측정된 신호에 상응한다.
"자발적 이펙터"는 PBMC 단독의 존재 하에 측정된 신호에 상응한다.
"자발적 표적"은 표적 세포 단독의 존재 하에 측정된 신호에 상응한다.
"최대 표적"은 세제-용해된 표적 세포 단독의 존재 하에 측정된 신호에 상응한다.
도 4는 트라스투주맙, T-DM1 및 vc0101 ADC 접합체에 대해 시험된 ADCC 활성을 제시한다. 데이터는 트라스투주맙 및 T-DM1의 보고된 ADCC 활성과 일치한다. N297Q의 돌연변이가 글리코실화 부위에 존재하기 때문에, T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101은 ADCC 활성을 가질 것으로 예상되지 않았으며, 이는 또한 검정에서 확인되었다. 단일 돌연변이 (LCQ05를 포함한 K183C, K290C, K334C, K392C) ADC의 경우, ADCC 활성은 유지되었다. 놀랍게도, 이중 돌연변이 (K183C+K290C, K183C+K392C, K183C+K334C K290C+K392C, K290C+K334C, K334C+K392C) ADC의 경우, ADCC 활성은 K334C 부위와 연관된 2종의 이중 돌연변이 ADC (K290C+K334C 및 K334C+K392C)를 제외하고는 모두에서 유지되었다.
실시예 12: 시험관내 세포독성 검정
항체-약물 접합체를 실시예 3에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 저밀도로 시딩하고, 이어서 다음 날 ADC 및 미접합 페이로드를 3배 연속 희석물로 사용하여 10개 농도에서 이중으로 처리하였다. 세포를 가습 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1.5시간 동안 셀타이터(CellTiter)® 96 아퀴어스 원 MTS 용액 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)과 함께 인큐베이션하여 수거하고, 빅터 플레이트 판독기 (퍼킨-엘머, 매사추세츠주 월섬) 상에서 파장 490 nm에서 흡광도 측정하였다. IC50 값을 XL피트 (IDBS, 뉴저지주 브리지워터)로 4-파라미터 로지스틱 모델을 사용하여 계산하고, 도 5에서 nM 페이로드 농도로 및 도 6에서 ng/ml 항체 농도로 보고하였다. IC50은 +/- 표준 편차로 제시되며, 독립적 결정의 수가 괄호 안에 표시된다.
vc-0101 또는 AcLysv-0101 링커-페이로드를 함유하는 ADC는 벤치마크 ADC인 T-DM1 (카드실라)과 비교하여, Her2-양성 세포 모델에 대해 고도로 강력하고 Her2-음성 세포에 대해 선택적이었다.
트라스투주맙에 대한 부위-특이적 접합으로 합성된 ADC는 Her2 세포 모델에 대해 높은 수준의 효력 및 선택성을 나타냈다. 주목할 만하게, 여러 트라스투주맙-vc0101 ADC는 중간 또는 낮은 Her2-발현 세포 모델에서 T-DM1보다 더 강력하였다. 예를 들어, MDA-MB-175-VII 세포 (1+ Her2 발현을 가짐)에서 T(kK183C+K290C)-vc0101에 대한 시험관내 세포독성 IC50은 T-DM1에 대한 3626 ng/ml와 비교하여, 351 ng/ml이다 (~10배 더 낮음). 2++ 수준 Her2 발현을 갖는 세포, 예컨대 MDA-MB-361-DYT2 및 MDA-MB-453 세포의 경우, T(kK183C+K290C)-vc0101에 대한 IC50은 T-DM1에 대한 38- 40 ng/ml와 비교하여, 12 - 20 ng/ml이다.
실시예 13: 이종이식편 모델
본 발명의 트라스투주맙 유래된 ADC를 N87 위암 이종이식편 모델, 37622 폐암 이종이식편 모델 및 다수의 유방암 이종이식편 모델 (즉, HCC 1954, JIMT-1, MDA-MB-361(DYT2) 및 144580 (PDX) 모델)에서 시험하였다. 하기 기재된 각각의 모델에 대해 제1 용량을 제1일에 제공하였다. 종양을 적어도 1주 1회 측정하고, 그의 부피를 다음 식으로 계산하였다: 종양 부피 (mm3) = 0.5 x (종양 폭2)(종양 길이). 최대 8-10 마리의 동물 및 최소 6-8 마리의 동물이 포함되는 각각의 처리군에 대한 평균 종양 부피 (± S. E. M.)를 계산하였다.
A. N87 위 이종이식편
면역결핍 마우스에서 높은 수준 HER2 발현을 갖는 N87 세포주 (ATCC CRL-5822)로부터 확립된 인간 종양 이종이식편의 생체내 성장에 대한 트라스투주맙 유래된 ADC의 효과를 검사하였다. 이종이식편을 생성하기 위해, 누드 (Nu/Nu, 찰스 리버 랩, 매사추세츠주 윌밍톤) 암컷 마우스에 50% 매트리겔 (비디 바이오사이언시스) 중 7.5 x106개 N87 세포를 피하로 이식하였다. 종양이 250 내지 450 mm3의 부피에 도달하였을 때, 다양한 처리군 사이의 종양 덩이의 균일성을 보장하기 위해 종양을 단계화하였다. N87 위 모델에 PBS 비히클, 트라스투주맙 ADC (0.3, 1 및 3 mg/kg) 또는 T-DM1 (1, 3 및 10mg/kg)을 4일 간격으로 4회 (Q4dx4) 정맥내로 투여하였다 (도 7).
데이터는 트라스투주맙 유래된 ADC가 용량-의존성 방식으로 N87 위 이종이식편의 성장을 억제하였다는 것을 입증한다 (도 7a-7h).
도 7i에 예시된 바와 같이, T-DM1은 1 및 3 mg/kg에서 종양 성장을 지연시켰고, 10 mg/kg에서 종양의 완전 퇴행을 나타냈다. 그러나, T(kK183C+K290C)-vc0101은 1 및 3 mg/kg에서 완전 퇴행 및 0.3 mg/kg에서 부분 퇴행을 제공하였다 (도 7a). 데이터는 T(kK183C+K290C)-vc0101이 이 모델에서 T-DM1보다 현저히 더 강력하다는 것 (~10배)을 제시한다.
183+290과 비교하여 DAR4를 갖는 ADC로부터의 유사한 생체내 효능 (도 6e, 6f 및 6g)을 수득하였다 (도 7a). 추가로, DAR2 ADC인 단일 돌연변이체를 평가하였다 (도 7b, 7c 및 7d). 일반적으로, 이들 ADC는 DAR4 ADC와 비교하여 덜 효과적이지만 T-DM1보다는 더 효과적이다. DAR2 ADC 중에서, LCQ05가 생체내 효능 데이터에 기초하여 가장 강력한 ADC인 것으로 보인다.
B. HCC1954 유방 이종이식편
HCC1954 (ATCC# CRL-2338)는 높은 HER2 발현 유방암 세포주이다. 이종이식편을 생성하기 위해, SHO 암컷 마우스 (찰스 리버, 매사추세츠주 윌밍톤)에 50% 매트리겔 (비디 바이오사이언시스) 중 5 x106개 HCC1954 세포를 피하로 이식하였다. 종양이 200 내지 250 mm3의 부피에 도달하였을 때, 다양한 처리군 사이의 종양 덩이의 균일성을 보장하기 위해 종양을 단계화하였다. HCC1954 유방 모델에 PBS 비히클, 트라스투주맙 유래된 ADC 및 음성 대조군 ADC를 Q4dx4로 정맥내로 투여하였다 (도 8a-8e).
데이터는 트라스투주맙 ADC가 용량-의존성 방식으로 HCC1954 유방 이종이식편의 성장을 억제하였다는 것을 입증한다. 1 mg/kg 용량을 비교하면, vc0101 접합체는 T-DM1보다 더 효과적이었다. 0.3 mg/kg 용량을 비교하면, DAR4 로딩된 ADC (도 8b, 8c 및 8d)는 DAR2 로딩된 ADC보다 더 효과적이었다 (도 8a). 추가로, 1 mg/kg에서의 음성 대조군 ADC는 비히클 대조군과 비교하여 종양 성장에 대해 매우 최소의 영향을 미쳤다 (도 8d). 그러나, T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101은 종양을 완전히 퇴행시켰고, 이는 표적 특이성을 나타낸다.
C. JIMT-1 유방 이종이식편
JIMT-1은 중간/낮은 Her2를 발현하는 유방암 세포주이고, 트라스투주맙에 대해 본래 저항성을 갖는다. 이종이식편을 생성하기 위해, 누드 (Nu/Nu) 암컷 마우스에 50% 매트리겔 (비디 바이오사이언시스) 중 5 x106개 JIMT-1 세포 (DSMZ# ACC-589)를 피하로 이식하였다. 종양이 200 내지 250 mm3의 부피에 도달하였을 때, 다양한 처리군 사이의 종양 덩이의 균일성을 보장하기 위해 종양을 단계화하였다. JIMT-1 유방 모델에 PBS 비히클, T-DM1 (도 9g), 부위 특이적 접합을 사용하는 트라스투주맙 유래된 ADC (도 9a-9e), 통상적인 접합을 사용하는 트라스투주맙 유래된 ADC (도 9f) 및 음성 대조군 huNeg-8.8 ADC를 Q4dx4로 정맥내로 투여하였다.
데이터는 모든 시험된 vc0101 접합체가 용량-의존성 방식으로 종양 감소를 유발한다는 것을 입증한다. 이들 ADC는 1 mg/kg에서 종양 퇴행을 유발할 수 있다. 그러나, T-DM1은 심지어 6 mg/kg에서도 이 중간/낮은 Her2 발현 모델에서 불활성이다.
D. MDA-MB-361(DYT2) 유방 이종이식편
MDA-MB-361(DYT2)는 중간/낮은 Her2를 발현하는 유방암 세포주이다. 이종이식편을 생성하기 위해, 누드 (Nu/Nu) 암컷 마우스에 4분 동안 100 cGy/분을 조사하고, 3일 후에 50% 매트리겔 (비디 바이오사이언시스) 중 1.0 x107개 MDA-MB-361(DYT2) 세포 (ATCC# HTB-27)를 피하로 이식하였다. 종양이 300 내지 400 mm3의 부피에 도달하였을 때, 다양한 처리군 사이의 종양 덩이의 균일성을 보장하기 위해 종양을 단계화하였다. DYT2 유방 모델에 PBS 비히클, 부위 특이적 및 통상적인 접합을 사용하는 트라스투주맙 유래된 ADC, T-DM1 및 음성 대조군 ADC를 Q4dx4로 정맥내로 투여하였다 (도 10a-10d).
데이터는 트라스투주맙 ADC가 용량-의존성 방식으로 DYT2 유방 이종이식편의 성장을 억제하였다는 것을 입증한다. DYT2가 중간/낮은 Her2 발현 세포주일지라도, 그것은 다른 Her2 낮은/중간 발현 세포주보다 미세관 억제제에 더 감수성이다.
E. 144580 환자-유래된 유방암 이종이식편
면역결핍 마우스에서 적절한 동의 절차에 따라 수득된 새로 절제된 144580 유방 종양의 단편으로부터 확립된 인간 종양 이종이식편의 생체내 성장에 대한 트라스투주맙 유래된 ADC의 효과를 검사하였다. 새로운 생검을 취하였을 때 144580의 종양 특징화는 3중 음성 (ER-, PR-, 및 HER2-) 유방암 종양으로서의 것이었다. 144580 유방 환자-유래된 이종이식편을 누드 (Nu/Nu) 암컷 마우스에서 동물에서 동물로 단편으로서 생체내 피하 계대시켰다. 종양이 150 내지 300 mm3의 부피에 도달하였을 때, 다양한 처리군 사이의 종양 크기의 균일성을 보장하기 위해 종양을 단계화하였다. 144580 유방 모델에 PBS 비히클, 부위 특이적 접합을 사용하는 트라스투주맙 ADC, 통상적인 접합을 사용하는 트라스투주맙 유래된 ADC 및 음성 대조군 ADC를 4일마다 4회 (Q4dx4) 정맥내로 투여하였다 (도 11a-11e).
이 HER2- (임상 정의에 의해) PDX 모델에서, T-DM1은 시험된 모든 용량 (1, 5, 3 및 6 mg/kg)에서 비효과적이었다 (도 10e). DAR4 vc0101 ADC의 경우 (도 11a, 11c 및 11d), 3 mg/kg은 종양 퇴행을 유발할 수 있다 (도 11c에서 심지어 1 mg/kg에서도). DAR2 vc0101 ADC (도 11b)는 3 mg/kg에서 DAR4 ADC보다 덜 효과적이다. 그러나, DAR 2 vc0101 ADC는 T-DM1과는 달리 6 mg/kg에서 효과적이다.
F. 37622 환자-유래된 비소세포 폐암 이종이식편
여러 ADC를 적절한 동의 절차에 따라 수득된 37622의 환자-유래된 비소세포 폐암 이종이식편 모델에서 시험하였다. 37622 환자-유래된 이종이식편을 누드 (Nu/Nu) 암컷 마우스에서 동물에서 동물로 단편으로서 생체내 피하 계대시켰다. 종양이 150 내지 300 mm3의 부피에 도달하였을 때, 다양한 처리군 사이의 종양 크기의 균일성을 보장하기 위해 종양을 단계화하였다. 37622 PDX 모델에 PBS 비히클, 부위 특이적 접합을 사용하는 트라스투주맙 유래된 ADC, T-DM1 및 음성 대조군 ADC를 4일마다 4회 (Q4dx4) 정맥내로 투여하였다 (도 12a-12d).
Her2의 발현을 변형된 헤르셉테스트에 의해 프로파일링하고, 세포주에서 관찰된 것보다 더 이종성을 갖는 2+로서 분류하였다. 링커-페이로드로서 vc0101과 접합된 ADC (도 12a-12c)는 1 및 3 mg/kg에서 효과적이었으며 종양 퇴행을 유발하였다. 그러나, T-DM1은 단지 10 mg/kg에서 일부 치료 이익을 제공하였다 (도 12d). vc0101 ADC로부터의 1 mg/kg과 T-DM1로부터의 10 mg/kg에서의 결과를 비교함으로써 vc0101 ADC가 T-DM1보다 10배 더 강력한 것으로 보인다. 방관자 효과는 이질적 종양에 대한 효능에 중요할 수 있다.
T-DM1 ADC의 방출된 대사물은 막 불투과성 화합물인 리신-캡핑된 mcc-DM1 링커 페이로드 (즉, Lys-mcc-DM1)인 것으로 나타났다 (Kovtun et al., 2006, Cancer Res 66:3214-21; Xie et al., 2004, J Pharmacol Exp Ther 310:844). 그러나, T-vc0101 ADC로부터의 방출된 대사물은 Lys-mcc-DM1보다 더 많은 막 투과성을 갖는 화합물인 아우리스타틴 0101이다. 이웃 세포를 사멸시키는 방출된 ADC 페이로드의 능력이 방관자 효과로 공지되어 있다. 막 투과성 페이로드의 방출로 인해, T-vc0101은 강한 방관자 효과를 도출할 수 있으며 반면에 T-DM1은 그렇지 않다. 도 13은 6 mg/kg의 T-DM1 (도 Xa) 또는 3 mg/kg의 T-vc0101 (도 Xb)의 단일 용량을 받은 다음 수거되고 96시간 후에 포르말린 고정으로 처리된 N87 세포주 이종이식 종양으로부터의 면역조직세포화학을 제시한다. 두 ADC의 페이로드에 대한 제안된 작용 메카니즘의 판독으로서 종양 절편을 인간 IgG에 대해 염색하여 종양 세포에 결합된 ADC를 검출하고, 포스포히스톤 H3 (pHH3)에 대해 염색하여 유사분열 세포를 검출하였다.
ADC는 두 경우에 종양의 주변부에서 검출된다. T-DM1 처리된 종양 (도 13a)에서, pHH3 양성 종양 세포의 대다수는 ADC에 가까이 위치한다. 그러나, T-vc0101 처리된 종양 (도 13b)에서, pHH3 양성 종양 세포의 대다수는 ADC의 위치를 너머 확장되고 (흑색 화살표가 몇몇 예를 강조함), 종양 내부에 있다. 이것은 절단가능한 링커 및 막 투과성 페이로드를 갖는 ADC가 생체내에서 강한 방관자 효과를 도출할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 14: 시험관내 T-DM1 저항성 모델
A. 시험관내 T-DM1 저항성 세포의 생성
N87 세포를 2개의 개별 플라스크 내에서 계대시키고, 각각의 플라스크를 생물학적 복제를 가능하게 하기 위해 저항성-생성 프로토콜에 대해 동일하게 처리하였다. 세포를 3일 동안 대략 IC80 농도 (10 nM 페이로드 농도)에서 T-DM1 접합체의 5회 주기에 노출시키고, 이어서 처리 없이 대략 4 내지 11일 회복시켰다. T-DM1 접합체의 10 nM에서의 5회 주기 후에, 세포를 유사한 방식으로 100 nM T-DM1의 6회 추가의 주기에 노출시켰다. 절차는 임상에서 세포독성 치료제에 대해 전형적으로 사용되는 최대 허용 용량으로의 만성, 다중-주기 (투약/휴약) 투여에 이어서 회복 기간을 모의실험하도록 의도되었다. N87로부터 유래된 모 세포는 N87로 지칭되고, T-DM1에 만성적으로 노출된 세포는 N87-TM으로 지칭된다. 중간- 내지 높은-수준 약물 저항성이 N87-TM 세포에 대해 4개월 이내에 발생하였다. 계속된 약물 노출 후에 저항성의 수준이 더 이상 증가하지 않았을 때 주기 치료의 ~3 - 4개월 후에 약물 선택 압력이 제거되었다. 반응 및 표현형은 그 후 대략 3 - 6개월 동안 배양된 세포주에서 안정한 것으로 남아있었다. 그 후에, 세포독성 검정에 의해 측정된 바와 같은 저항성 표현형의 크기의 감소가 때때로 관찰되었으며, 이 경우에 조기 계대 동결-보존된 T-DM1 저항성 세포를 추가의 연구를 위해 해동시켰다. 모든 보고된 특징화는 세포의 안정화를 보장하기 위해 적어도 2 - 8주 동안 T-DM1 선택 압력의 제거 후에 수행하였다. 데이터는 결과에서의 일관성을 보장하기 위해 모델 개발 후 대략 1 - 2년에 걸쳐 단일 선택으로부터 유래된 다양한 해동된 동결보존 집단으로부터 수집하였다. 위암 세포주 N87을 각각의 세포주에 대해 대략 IC80 (~10nM 페이로드 농도)인 용량으로의 처리 주기에 의해 트라스투주맙-메이탄시노이드 항체-약물 접합체 (T-DM1)에 대한 저항성에 대해 선택하였다. 모 N87 세포는 접합체에 대해 본래 감수성이었다 (IC50 = 1.7 nM 페이로드 농도; 62ng/ml 항체 농도) (도 14). 모 N87 세포의 2개 집단을 처리 주기에 노출시키고, 100 nM T-DM1에서의 단지 대략 4개월 노출 주기 후에, 이들 2개 집단 (이하에서 N87-TM-1 및 N87-TM-2로 명명됨)은 모 세포와 비교하여 각각 114배 및 146배로 ADC에 대해 불응성이 되었다 (도 14 및 도 15a). 흥미롭게도, 상응하는 미접합 메이탄시노이드 유리 약물인 DM1에 대한 최소 교차-저항성 (~ 2.2 - 2.5X)이 관찰되었다 (도 14).
B. 세포독성 연구
ADC를 실시예 3에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 미접합 메이탄신 유사체 (DM1) 및 아우리스타틴 유사체는 화이자 월드와이드 메디시날 케미스트리 (코네티컷주 그로톤)에 의해 제조되었다. 다른 표준 관리 화학요법제는 시그마 (미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 저밀도로 시딩하고, 이어서 다음 날 ADC 및 미접합 페이로드를 3배 연속 희석물로 사용하여 10개 농도에서 이중으로 처리하였다. 세포를 가습 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1.5시간 동안 셀타이터® 96 아퀴어스 원 MTS 용액 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)과 함께 인큐베이션하여 수거하고, 빅터 플레이트 판독기 (퍼킨-엘머, 매사추세츠주 월섬) 상에서 파장 490 nm에서 흡광도 측정하였다. IC50 값을 XL피트 (IDBS, 뉴저지주 브리지워터)로 4-파라미터 로지스틱 모델을 사용하여 계산하였다.
다른 트라스투주맙 유래된 ADC에 대한 교차-저항성 프로파일을 결정하였다. 비-절단가능한 링커로 구성되고 항-튜불린 작용 메카니즘을 갖는 페이로드를 전달하는 많은 트라스투주맙 유래된 ADC에 대한 유의한 교차-저항성이 관찰되었다 (도 14). 예를 들어, N87-TM 대 N87-모 세포에서, 각각 비-절단가능한 말레이미도카프로일 또는 Mal-PEG 링커를 통해 트라스투주맙에 연결된 아우리스타틴-기재 페이로드를 나타내는 T-mc8261 (도 14 및 도 15b) 및 T-MalPeg8261 (도 14)에 대해 >330배 및 >272배 감소된 효력이 관찰되었다. N87-TM 세포에서 모노메틸 돌라스타틴 (MMAD)을 전달하는 상이한 비-절단가능한 링커를 갖는 또 다른 트라스투주맙 ADC인 T-mcMalPegMMAD에 대해 235배 초과의 저항성이 관찰되었다 (도 14).
주목할 만하게, N87-TM 세포주는 이들 약물이 유사한 표적을 기능상 억제하도라도 (즉, 미세관 탈중합) 절단가능한 링커를 통해 전달되는 경우에 페이로드에 대한 감수성을 유지하였다는 것이 관찰되었다. 저항성을 극복한 ADC의 예는 T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 (도 14 및 도 15c), T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101 (도 14 및 도 15d), T(K290C+K334C)-vc0101 (도 10 및 도 11e), T(K334C+K392C)-vc0101 (도 14 및 도 15f) 및 T(kK183C+K290C)-vc0101 (도 14 및 도 15g)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들은 아우리스타틴 유사체 0101을 전달하는 트라스투주맙-기재 ADC를 나타내지만, 페이로드는 vc 링커의 단백질분해적 절단에 의해 세포내 방출된다.
이들 ADC-저항성 암 세포가 다른 요법에 대해 광범위하게 저항성을 갖는지 여부를 결정하기 위해, N87-TM 세포 모델을 다양한 작용 메카니즘을 갖는 표준 관리 화학요법제의 패널로 처리하였다. 일반적으로, 미세관 및 DNA 기능의 소분자 억제제는 N87-TM 저항성 세포주에 대해 효과적인 것으로 남아있었다 (도 14). 이들 세포가 미세관 탈중합제의 유사체인 메이탄신을 전달하는 ADC에 대해 저항성을 갖게 되었지만, 여러 튜불린 탈중합제 또는 중합제에 대해서는 최소 교차-저항성이 관찰되거나 관찰되지 않았다. 유사하게, 두 세포주는 토포이소머라제 억제제, 항-대사물 및 알킬화제/가교제를 포함한, DNA 기능을 방해하는 작용제에 대한 감수성을 유지하였다. 일반적으로, N87-TM 세포는 약물 저항성을 모방할 수 있는 일반 성장 또는 세포 주기 결함을 배제하면서, 광범위한 세포독성에 대해 불응성이 아니었다.
두 N87-TM 집단은 또한 상응하는 미접합 약물 (즉, DM1 및 0101; 도 14)에 대한 감수성을 유지하였다. 따라서, 트라스투주맙-메이탄시노이드 접합체에 대해 불응성인 N87-TM 세포는 비-절단가능한 링커를 통해 전달되는 경우에 다른 미세관-기재 ADC에 대한 교차-저항성을 나타냈지만, 미접합 미세관 억제제 및 다른 화학요법제에 대한 감수성은 유지하였다.
N87-TM 세포에서 T-DM1에 대한 저항성의 분자 메카니즘을 결정하기 위해 MDR1 및 MRP1 약물 유출 펌프의 단백질 발현 수준을 결정하였다. 이것은 소분자 튜불린 억제제가 MDR1 및 MRP1 약물 유출 펌프의 공지된 기질이기 때문이었다 (Thomas and Coley, 2003, Cancer Control 10(2):159-165). 모 N87 및 N87-TM 저항성 세포의 총 세포 용해물로부터의 이들 2종 단백질의 단백질 발현 수준을 결정하였다 (도 16). 이뮤노블롯 분석은 N87-TM 저항성 세포가 MRP1 (도 16a) 또는 MDR1 (도 16b) 단백질을 유의하게 과다발현하지 않는다는 것을 제시하였다. 종합하면, N87-TM 세포에서 약물 유출 펌프의 공지된 기질 (예를 들어 파클리탁셀, 독소루비신)에 대한 교차-저항성의 결여와 조합된 이들 데이터는 약물 유출 펌프 과다발현이 N87-TM 세포에서 T-DM1 저항성의 분자 메카니즘이 아니라는 것을 시사한다.
ADC에 대한 작용 메카니즘이 특정 항원에 대한 결합을 요구하기 때문에, 항원 고갈 또는 감소된 항체 결합은 N87-TM 세포에서 T-DM1 저항성을 설명할 수 있다. T-DM1에 대한 항원이 N87-TM 세포에서 유의하게 고갈되었는지 결정하기 위해, 모 N87 및 N87-TM 저항성 세포의 총 세포 용해물로부터의 HER2 단백질 발현 수준을 비교하였다 (도 17a). 이뮤노블롯 분석은 N87-TM 세포가 모 N87 세포와 비교하여 현저하게 감소된 양의 HER2 단백질 발현을 나타내지 않았다는 것을 제시하였다.
N87-TM 세포의 세포 표면 HER2 항원에 결합하는 항체의 양을 결정하였다. 형광 활성화 세포 분류를 사용하는 세포 표면 결합 연구에서, N87-TM 세포는 세포 표면 항원에 대한 트라스투주맙 결합의 ~50% 감소를 나타냈다 (도 17b). N87 세포는 암 세포주 사이에서 HER2 단백질의 높은 발현자이기 때문에 (Fujimoto-Ouchi et al., 2007, Cancer Chemother Pharmacol 59(6):795-805), 이들 세포에서 HER2 항체 결합의 ~50% 감소는 아마도 N87-TM 세포에서 T-DM1에 대한 저항성의 구동 메카니즘을 나타내지 않는다. 이 해석을 지지하는 증거는 N87-TM 저항성 세포가 상이한 링커 및 페이로드를 갖는 다른 HER2 결합 트라스투주맙 유래된 ADC에 대해 감수성인 채로 남아있다는 것이다 (도 14).
편견없는 접근법으로 T-DM1 저항성의 잠재적 메카니즘을 결정하기 위해, 모 N87 및 N87-TM 저항성 세포 모델을 단백질체학적 접근법을 통해 프로파일링하여 T-DM1 저항성을 담당할 수 있는 막 단백질 발현 수준의 변화를 전반적으로 확인하였다. 두 세포주 모델 사이에 523 단백질의 유의한 발현 수준 변화가 관찰되었다 (도 18a). 이들 예측된 단백질 변화의 선택을 검증하기 위해, N87 및 N87-TM 전세포 용해물에 대한 이뮤노블롯을 N87 세포에 비해 N87-TM 세포에서 과소-발현될 것으로 예측된 단백질 (IGF2R, LAMP1, CTSB) (도 18b) 및 과다-발현될 것으로 예측된 단백질 (CAV1) (도 18c)에 대해 수행하였다. 생체내 종양을 NSG 마우스 내로 N87 및 N87-TM-2 세포의 피하 이식에 의해 생성하여 생체내에서 관찰된 단백질 변화가 시험관내에서 관찰된 것을 모방하는지 여부를 평가하였다. N87-TM-2 종양은 N87 종양과 비교하여 CAV1 단백질의 과다-발현을 유지하였다 (도 18d). 두 모델에서 마우스 기질에서의 CAV1 염색이 예상되지만, 상피 CAV1 염색은 단지 N87-TM-2 모델에서만 관찰되었다.
C. 생체내 효능 연구
세포 배양에서 관찰된 저항성이 생체내에서도 재현되는지 결정하기 위해, 모 N87 세포 및 N87-TM-2 세포를 확장시키고, 더 잭슨 래보러토리 (메인주 바 하버)로부터 입수한 암컷 NOD scid 감마 (NSG) 면역결핍 마우스 (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)의 측복부 내로 주사하였다. 마우스의 우측 측복부에 N87 또는 N87-TM 세포의 현탁액 (주사당 7.5 x 106개 세포, 50% 매트리겔 사용)을 피하로 주사하였다. 종양이 ~0.3 g (~250 mm3)에 도달하였을 때 마우스를 연구 군으로 무작위화하였다. T-DM1 접합체 또는 비히클을 제0일에 염수 중의 것으로 정맥내로 투여하고, 4일 간격으로 총 4회 용량을 반복하였다 (Q4Dx4). 종양을 매주 측정하고, 덩이를 부피 = (폭 x 폭 x 길이)/2로서 계산하였다. 사건까지의 시간 분석 (종양 배가)을 수행하고, 유의성을 로그-순위 (맨텔-콕스) 검정에 의해 평가하였다. 이들 연구에서 모든 처리군에서의 마우스에 대해 어떤 체중 감소도 관찰되지 않았다.
마우스를 하기 작용제로 처리하였다: (1) 비히클 대조군 PBS, (2) 13 mg/kg에 이어서 4.5 mg/kg의 트라스투주맙 항체; (3) 6 mg/kg의 T-DM1; (4) 10 mg/kg의 T-DM1; (5) 10 mg/kg의 T-DM1에 이어서 3 mg/kg의 T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101; (6) 3 mg/kg의 T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101. 종양 크기를 모니터링하였으며, 결과는 도 20에 나타나 있다. N87 (도 19 및 도 20a) 및 N87-TM-2 (도 19 및 도 20b) 종양은 시험관내 세포독성 검정에서 관찰된 것 (도 19 및 20b)과 유사한 ADC 효능 프로파일을 나타으며, 여기서 N87-TM 약물 저항성 세포는 T-DM1에 대해 불응성이었지만, 절단가능한 링커를 갖는 트라스투주맙 유래된 ADC에 대해 여전히 반응하였다. 실제로, T-DM1에 대해 불응성이었고 약 1 그램으로 성장한 종양을 T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101로의 요법으로 전환시켰으며, 이는 효과적으로 퇴행하였다 (도 20b). 본 연구의 사건까지의 시간 분석에서, 6 및 10 mg/kg의 T-DM1은 N87 모델에서 적어도 60일 동안 마우스의 >50%에서 종양 배가를 방지하였지만, T-DM1은 N87-TM-2 모델에서 그렇게 하지 못했다 (도 20c 및 20d). 3 mg/kg으로 투여된 T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101은 연구의 지속기간 (~80일) 동안 마우스에서 N87 및 N87-TM 종양 둘 다의 임의의 종양 배가를 방지하였다 (도 20c 및 20d).
또 다른 연구에서, 시험관내 T-DM1 저항성을 극복한 모든 절단가능한 연결된 ADC는 T-DM1에 대해 비-반응성인 이 N87-TM2 종양 모델에서 효과적인 것으로 남아있었다 (도 19 및 도 20e).
이어서 T(kK183+K290C)-vc0101 ADC가 TDM1에 대해 불응성인 종양의 성장을 억제할 수 있는지 평가하였다. 비히클 또는 T-DM1로 처리된 N87-TM 종양은 이들 처리 내내 성장하였지만, 제14일에 T(kK183C+K290C)-vc0101 요법으로 전환시킨 종양은 즉시 퇴행하였다 (도 20f).
실시예 15: 생체내 T-DM1 저항성 모델
A. 생체내 T-DM1 저항성 세포의 생성
모든 동물 연구는 확립된 가이드라인에 따라 화이자 펄 리버 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 이종이식편을 생성하기 위해, 누드 (Nu/Nu) 암컷 마우스에 50% 매트리겔 (비디 바이오사이언시스) 중 7.5 x106개 N87 세포를 피하로 이식하였다. 평균 종양 부피가 ~ 300 mm3에 도달하였을 때 동물을 다음 2개의 군으로 무작위화하였다: 1) 비히클 대조군 (n =10) 및 2) T-DM1 처리군 (n = 20). T-DM1 ADC (6.5 mg/kg) 또는 비히클 (PBS)을 제0일에 염수 중의 것으로 정맥내로 투여한 다음, 동물에 최대 30주까지 6.5 mg/kg을 매주 투여하였다. 종양을 1주에 2회 또는 매주 측정하고, 덩이를 부피 = (폭 x 폭 x 길이)/2로서 계산하였다. 이들 연구에서 모든 처리군에서의 마우스에 대해 어떤 체중 감소도 관찰되지 않았다.
개별 종양 부피가 ~600 mm3 (무작위화시 종양의 원래 크기의 2배)에 도달하였을 때 동물은 T-DM1 처리 하에 불응성 또는 재발성인 것으로 간주하였다. 대조군과 비교하여, 대부분의 종양은 도 21a에 제시된 바와 같이 초기에 T-DM1 처리에 반응하였다. 보다 구체적으로, 20마리 마우스 중 17마리는 초기 T-DM1 처리에 반응하였지만 상당수의 종양 (20개 중 13개)은 T-DM1 처리 하에 재발하였다. 시간 경과에 따라 이식된 N87 종양 세포는 T-DM1에 대해 저항성을 갖게 되었다 (도 21b). 초기에 T-DM1에 처리에 반응하지 않은 3개 종양을 IHC에 의한 Her2 발현 결정을 위해 수거하였으며 이는 어떤 HER2 발현 변화도 없음을 나타낸다. 남아있는 10개 재발성 종양은 하기에 기재된다.
초기에 T-DM1 처리에 반응한 다음 재발한 4개 종양을 제77일 (마우스 1 및 16), 제91일 (마우스 19), 제140일 (마우스 6)에 2.6 mg/kg의 매주 T-vc0101 처리로 전환시켰다. 도 19c에 제시된 바와 같이, 생체내 생성된 T-DM1 저항성 종양은 T-vc0101에 반응하였으며 이는 획득된 T-DM1 저항성 종양이 vc0101 ADC 처리에 감수성이라는 것을 나타낸다.
초기에 T-DM1 처리에 반응한 다음 재발한 또 다른 3개 종양을 제110일 (마우스 4, 13 및 18)에 2.6 mg/kg의 매주 T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 처리로 전환시켰다. 도 21d에 제시된 바와 같이, 생체내 생성된 T-DM1 저항성 종양은 또한 T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101에 반응하였다. 후속 실험을 수행하여 T(kK183C+K290C)-vc0101을 평가하였고, 유사한 결과가 수득되었으며, 이는 도 21e에 제시된 바와 같이 생체내 생성된 T-DM1 저항성 종양이 T(kK183C+K290C)-vc0101 처리에 감수성이었다는 것을 나타낸다.
요약하면, 후속 처리를 갖는 모든 T-DM1 불응성 종양은 vc0101 ADC 처리에 감수성이었으며 (7개 중 7개) 이는 생체내 저항성 T-DM1 종양이 절단가능한 vc0101 접합체로 치료될 수 있다는 것을 나타낸다.
초기에 T-DM1에 반응한 다음 재발한 추가의 3개 종양 (도 21b에 제시된 바와 같은 마우스 7, 17 및 2)을 시험관내 특징화를 위해 절제하였다. 절제된 종양을 시험관내에서 2-5개월 배양한 후에 이들 세포를 T-DM1에 대한 저항성에 관해 평가하고 시험관내 특징화하였다 (하기 본 실시예의 섹션 B 및 C 참조).
B. 세포독성 연구
T-DM1 처리로부터 재발하고 시험관내 배양된 세포 (본 실시예의 섹션 A에 기재된 바와 같음)를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 다음 날 ADC 또는 미접합 페이로드의 4배 연속 희석물을 투여하였다. 세포를 가습 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 96시간 동안 인큐베이션하였다. 셀타이터 글로 용액 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)을 플레이트에 첨가하고, 빅터 플레이트 판독기 (퍼킨-엘머, 매사추세츠주 월섬) 상에서 파장 490 nm에서 흡광도 측정하였다. IC50 값을 XL피트 (IDBS, 뉴저지주 브리지워터)로 4-파라미터 로지스틱 모델을 사용하여 계산하였다.
세포독성 스크리닝 결과는 표 19 및 20에 요약되어 있다. 세포는 모와 비교하였을 때 T-DM1에 대해 저항성을 가졌지만 (도 22a) 절단가능한 vc0101 접합체 T-vc0101 (데이터는 제시되지 않음), T(kK183C+K290C)-vc0101 (도 22b), T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101 (도 22c) 및 T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101 (도 22d)에 대해 감수성이었다 (표 19). T-DM1 저항성 세포는 놀랍게도 모 페이로드 DM1 뿐만 아니라 0101 페이로드에 대해 감수성이었다 (표 20).
표 19: ADC에 대한 저항성 세포 감수성
Figure pct00062
IC50 값은 각각의 세포주에 대해 제시됨
표 20: 유리 페이로드에 대한 저항성 세포주 감수성
Figure pct00063
C. FACS 및 웨스턴 블롯에 의한 Her2 발현
T-DM1 처리로부터 재발하고 시험관내 배양된 세포 (본 실시예의 섹션 A에 기재된 바와 같음)에 대해 Her2 발현을 특징화하였다. FACS 분석을 위해, 세포를 트립신처리하고, 스핀 다운시키고, 신선한 배지 중에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 5 μg/mL의 트라스투주맙-PE (이바이오사이언시스 (캘리포니아주 샌디에고)에 의해 맞춤 합성된 1:1 PE 표지된 트라스투주맙)와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 2회 세척한 다음, PBS 중에 재현탁시켰다. 평균 형광 강도를 아큐리 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)를 사용하여 판독하였다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, 세포를 15분 동안 얼음 상에서 RIPA 용해 완충제 (프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제 함유)를 사용하여 용해시킨 다음 볼텍싱하고, 4℃에서 마이크로원심분리에서 최대 속도도 스핀 다운시켰다. 상청액을 수집하고, 4X 샘플 완충제 및 환원제를 샘플에 첨가하여 각각의 샘플에서의 총 단백질에 대해 정규화하였다. 샘플을 4-12% 비스 트리스 겔 상에서 전개시키고, 니트로셀룰로스 막 상으로 옮겼다. 막을 1시간 동안 차단시키고, 4℃에서 밤새 HER2 항체 (셀 시그널링, 1:1000)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 막을 1X TBST 중에서 3회 세척하고, 1시간 동안 항-마우스 HRP 항체 (셀 시그널링, 1:5000)와 함께 인큐베이션하고, 3회 세척하고, 프로빙하였다.
T-DM1 재발성 종양의 HER2 발현 수준은 FACS (도 23a) 및 웨스턴 블롯 (도 23b)에 의해 평가된 바와 같이 대조군 종양 (T-DM1 처리 부재)과 유사하였다.
D. T-DM1 저항성은 약물 유출 펌프의 발현으로 인한 것이 아님
세포주는 웨스턴 블롯에 의해 MDR1을 발현하지 않고 (도 24a), 세포는 MDR-1 기질 유리 약물 0101에 대해 저항성을 갖지 않는다 (도 24b). 독소루비신에 대한 저항성은 관찰되지 않았으며 (도 24c) 이는 저항성 메카니즘이 MRP1을 통한 것이 아님을 나타낸다. 그러나, 세포는 유리 DM1에 대해 여전히 저항성을 갖는다 (도 24d).
실시예 16: 약동학 (PK)
통상적인 또는 부위 특이적 vc0101 항체 약물 접합체의 노출을 시노몰구스 원숭이에게의 5 또는 6 mg/kg의 IV 볼루스 용량 투여 후에 결정하였다. 총 항체의 농도 (총 Ab; 접합된 mAb 및 미접합 mAb 둘 다의 측정) 및 ADC (적어도 1종의 약물 분자에 접합된 mAb)를 리간드 결합 검정 (LBA)을 사용하여 측정하였다. ADC는 모든 경우에 vc0101을 사용하여 제조하였고, 예외로 T(LCQ05)는 AcLysvc0101을 사용하였다. 통상적인 접합 (부위 특이적 접합이 아님)을 사용하여 트라스투주맙으로부터 ADC를 제조하였다.
시노몰구스 원숭이에게의 용량 투여 후 총 Ab 및 트라스투주맙 ADC (T-vc0101) (5mg/kg) 또는 T(kK183C+K290C) 부위 특이적 ADC (6mg/kg) 둘 다의 농도 대 시간 프로파일 및 약동학/독성동태학 (도 25a 및 표 21). T(kK183C+K290C) 부위 특이적 ADC의 노출은 통상적인 접합체와 비교하였을 때 증가된 노출 및 안정성 둘 다를 갖는다.
시노몰구스 원숭이에게의 용량 투여 후 트라스투주맙의 ADC 분석물 (T-vc0101) (5mg/kg) 또는 T(kK183C+K290C), T(LCQ05), T(K334C+K392C), T(K290C+K334C), T(K290C+K392C) 및 T(kK183C+K392C) 부위 특이적 ADC (6mg/kg)의 농도 대 시간 프로파일 및 약동학/독성동태학 (도 25b 및 표 21). 여러 부위 특이적 ADC (T(LCQ05), T(kK183C+K290C), T(K290C+K392C) 및 T(kK183C+K392C))의 노출은 통상적인 접합을 사용하는 트라스투주맙 ADC의 경우와 비교하여 더 높다. 그러나, 2종의 다른 부위 특이적 ADC (T(K290C+K334C) 및 T(K334C+K392C))의 노출은 트라스투주맙 ADC보다 더 높은 노출을 갖지 않으며, 이는 모든 부위 특이적 ADC가 통상적인 접합을 사용하여 제조된 트라스투주맙 ADC보다 더 우수한 약동학적 특성을 갖지는 않을 것임을 나타낸다.
표 21: 약동학
Figure pct00064
실시예 17: 래트에서의 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 상대 체류 값 대 노출 (AUC).
소수성은 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의해 평가될 수 있는 단백질의 물리적 특성이고, 단백질 샘플의 체류 시간은 그의 상대 소수성을 기준으로 상이하다. ADC는 ADC의 HIC 체류 시간을 각각의 항체의 HIC 체류 시간으로 나눈 비인 상대 체류 시간 (RRT)을 계산함으로써 그의 각각의 항체와 비교될 수 있다. 고도로 소수성인 ADC는 보다 높은 RRT를 갖고, 이들 ADC는 또한 보다 많은 약동학적 책임, 구체적으로 보다 낮은 곡선하 면적 (AUC 또는 노출)을 가질 수 있다는 것이 가능하다. 다양한 부위 돌연변이를 갖는 ADC의 HIC 값을 래트에서의 그의 측정된 AUC와 비교하였을 때, 도 26에서의 분포가 관찰되었다.
RRT ≥1.9를 갖는 ADC는 보다 낮은 AUC 값을 나타냈으며, 반면에 보다 낮은 RRT를 갖는 ADC는 관계가 직접적이진 않았지만 보다 높은 AUC를 갖는 경향이 있었다. ADC T(kK183C+K290C)-vc0101은 상대적으로 더 높은 RRT (1.77의 평균 값)를 갖는 것으로 관찰되었고, 따라서 상대적으로 더 낮은 AUC를 가질 것으로 예상되었다. 놀랍게도, 관찰된 AUC는 비교적 높았고, 따라서 소수성 데이터로부터 이 ADC의 노출을 예측하는 것은 명백하지 않았다.
실시예 18: 독성 연구
2개의 독립적인 탐색적 독성 연구에서, 총 10마리의 수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이를 5개의 투여량 군 (1/성별/투여량)으로 나누고, 3주마다 1회 (연구 제1일, 제22일 및 제43일) IV 투여하였다. 연구 제46일 (제3 용량 투여 3일 후)에 동물을 안락사시키고, 프로토콜 명시된 혈액 및 조직 샘플을 수집하였다. 임상 관찰, 임상 병리상태, 육안 및 현미경 병리상태 평가를 생존시 및 부검후 수행하였다. 해부 병리학 평가를 위해, 조직병리학 발견의 중증도를 주관적, 상대적, 연구 특이적 기준으로 기록하였다.
3 및 5 mg/kg에서의 시노몰구스 원숭이 탐색적 독성 연구에서, T-vc0101은 제1 용량 후 제11일에 일시적이지만 현저한 (390개/μl) 내지 중증 (40개/μl 내지 비-검출가능) 호중구감소증을 유발하였다. 대조적으로 9 mg/kg에서, T(kK183C+K290C)-vc0101이 투여된 모든 시노몰구스 원숭이는 호중구감소증을 갖지 않거나 시험된 임의의 시점에서 500개/μl를 훨씬 초과하는 호중구 수를 갖는 최소 호중구감소증을 가졌다 (도 27). 실제로, T(kK183C+K290C)-vc0101 투여된 동물은 비히클 대조군과 비교하여 제11일 및 제14일에 평균 호중구 수 (>1000개/μL)를 나타냈다.
3 및 5 mg/kg에서의 골수의 현미경검사에 의하면, T-vc0101이 투여된 시노몰구스 원숭이는 화합물-관련 증가된 M/E 비를 가졌다. 증가된 골수/적혈구 (M/E) 비는 주로 성숙 과립구의 증가와 조합된 감소된 적혈구 전구체로 이루어졌다. 대조적으로, 6 및 9 mg/kg에서, 단지 6 mg/kg/용량의 T(kK183C+K290C)-vc0101이 투여된 수컷만이 성숙 과립구의 최소 내지 경도의 증가된 세포충실성을 가졌다 (데이터는 제시되지 않음).
따라서, 혈액 및 현미경 데이터는 부위-특이적-돌연변이 기술에 기초한 ADC 접합체인 T(kK183C+K290C)-vc010이 T-vc010 유도된 골수 독성 및 호중구감소증을 분명하게 개선시킨다는 것을 명확히 나타냈다.
실시예 19: ADC 결정 구조
T(K290C+K334C)-vc0101, T(K290C+K392C)-vc0101 및 T(K334C+K392C)-vc0101에 대해 결정 구조를 수득하였다. K290C+K392C가 아닌 K290C+K334C 및 K334C+K392C 이중 시스테인-변이체에 대한 접합이 ADCC 활성을 제거하였기 때문에 이들 특정한 ADC를 결정학을 위해 선택하였다.
결정학을 위해 ADC의 파파인 절단을 사용하여 접합된 Fc 영역을 제조하였다. 다음 동일한 조건을 사용하여 3종의 접합된 IgG1-Fc 영역에 대해 동일한 형태의 결정을 수득하였다: 100mM Na시트레이트 pH 5.0 + 100mM MgCl2 + 15% PEG 4K.
PDB에 침착된 야생형 인간 IgG1-Fc 구조는 비교적 유사하며 이는 CH2-CH2 도메인이 Asn297-연결된 글리칸 (탄수화물 또는 글리칸 안테나)을 통해 서로 접촉한다는 것 및 CH3-CH3 도메인이 구조 사이에 비교적 일정한 안정한 계면을 형성한다는 것을 제시한다. Fc 구조는 "폐쇄" 또는 "개방" 입체형태로 존재하고, 탈글리코실화 Fc 구조는 "개방" 구조 입체형태를 채택하여 글리칸 안테나가 CH2 영역을 함께 유지한다는 것을 입증한다. 추가적으로, 미접합 Phe241Ala-IgG1 Fc 돌연변이체의 공개된 구조 (Yu et al. "Engineering Hydrophobic Protein-Carbohydrate interactions to fine-tune monoclonal antibodies". JACS 2013)는 1개의 부분적으로 무질서한 CH2 도메인을 제시하는데, 이는 방향족 Phe 잔기가 탄수화물을 안정화시킬 수 없으므로 이 돌연변이가 CH2-글리칸 계면 및 CH2-CH2 계면의 탈안정화를 유도하기 때문이다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인" (또한 "Cγ2"로 지칭됨)은 통상적으로 약 아미노산 231에서 약 아미노산 340에 이른다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 쌍형성되지 않는다는 점에서 고유하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 쇄가 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 놓여있다. 탄수화물은 도메인-도메인 쌍형성에 대한 대체물을 제공할 수 있고 CH2 도메인을 안정화시키는데 도움을 줄 수 있는 것으로 추측되었다 (Burton et al., 1985, Molec. Immunol. 22: 161-206).
"CH3 도메인"은 Fc 영역 내의 CH2 도메인에 대해 C-말단인 잔기의 스트레치 (즉, IgG의 약 아미노산 잔기 341에서 약 아미노산 잔기 447까지)를 포함한다.
T(K290C+K334C)-vc0101 및 T(K290C+K392C)-vc0101 Fc 영역 둘 다에 대한 해석된 구조는 유사하였으며 이는 Fc 이량체가 고도로 질서있는 1개의 CH2 및 2개의 CH3을 함유하였다는 것 (야생형 Fc처럼)을 제시한다. 그러나, 이들은 또한 글리칸이 부착된 무질서한 CH2를 함유한다 (도 28a 및 도 28b). 1개의 CH2 도메인의 보다 높은 탈안정화 정도는 글리칸 안테나에 대한 접합 부위의 근접도에 기인하였다. 0101 페이로드 기하구조를 고려하면, K290, K334, K392 부위 중 어느 것에서의 접합은 CH2 표면으로부터 떨어져 글리칸의 전체 궤적을 교란시킬 수 있으며 글리칸 및 CH2 구조 그 자체 및 결과적으로 CH2-CH2 계면을 탈안정화시킨다 (도 28c). WT-Fc, Phe241Ala-Fc 또는 탈글리코실화-Fc에 비해 보다 높은 불균질성 정도가 이들 0101 부위-특이적으로 접합된 이중 시스테인-Fc-변이체에 대해 이용가능하다. 조작된 시스테인-변이체 위치를 FcγR 유형 IIb와 복합체를 이룬 WT-Fc의 구조 상에 맵핑하였을 때, C334에서의 접합은 FcγRIIb에 대한 결합을 직접적으로 방해할 수 있다는 것을 제시하였다 (도 28c). 돌연변이 또는 접합에 의해 유발된 CH2 위치지정에서의 이 불균질성은 FcRIIb 결합의 유의한 감소를 유발할 수 있다. 따라서 이들 결과는 입체형태 불균질성 또는 IgG1-Fc 내 조작된 시스테인의 특정 조합에 대한 0101의 접합이 K334C 부위를 함유하는 이중 시스테인 변이체에 대한 ADCC 활성에 영향을 미칠 수 있다는 것, 또는 아마도 둘 다가 그러할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 20: 다른 항체에서의 부위 특이적 접합의 사용
본 발명의 부위 특이적 HER2 ADC를 제조하는데 사용된 부위 및 변형은 다른 항원에 대해 지시된 항체에 사용될 수 있고, 여전히 통상적으로 접합된 ADC보다 개선된 효능을 나타낸다.
항체 A (종양-연관 항원에 대해 지시됨)를 통상적인 접합 뿐만 아니라 부위 특이적 접합을 사용하여 ADC로 제조하였다. 두 경우에서 사용된 링커는 vc였고, 사용된 약물은 아우리스타틴 0101이었다. 부위 특이적 접합을 위해, 항체 경쇄 상의 부위 K183 및 항체 중쇄의 CH2 영역에서의 K290 (카바트의 EU 인덱스를 사용함)을 링커/페이로드에의 접합이 가능하도록 시스테인 (C)으로 변경시켰다.
부위 특이적 ADC를 제조하는데 사용된 방법은 T(kK183C+K290C)-vc0101을 제조하는데 사용된 것 (상기)과 유사하였다. 접합 효율은 61%였고, 접합된 항체는 T(kK183C+K290C)-vc0101과 유사한 HIC-RRT 프로파일로 4의 평균 DAR을 가졌다.
부위 특이적 접합체 (SSC)의 열적 안정성을 평가하였고, SSC의 최저 융점은 65℃이었으며, 이는 충분한 안정성을 나타낸다. SSC의 그의 표적 종양 항원에의 결합을 또한 미접합 항체와 비교하여 평가하였고, ELISA 기반 결합 검정에서 결합 능력의 감소는 검출되지 않았으며, 이는 페이로드 링커 vc0101과의 접합 후에 결합 친화도의 양호한 유지를 나타낸다.
이어서, 시험관내 세포독성을 종양 항원의 상승된 발현을 갖는 종양 세포주에서 평가하였다. SSC는 다중 종양 세포주를 사용하는 세포독성 검정에서 통상적인 ADC와 필적하는 세포독성 효력을 나타냈다. 종양 항원을 과다-발현하는 종양 세포로 접종된 이종이식 종양 모델에서 생체내 효능 연구를 추가로 수행하였다. 한 모델에서, 3 mg/kg의 투여량 수준에서, SSC는 4회 용량이 1주에 2회 투여된 후 완전한 종양 퇴행을 유도하였다. 종양 퇴행은 종양 재성장이 관찰되었을 때인 마지막 투여 후 약 60일까지 유지되었다. 대조적으로, 동일한 스케줄로 투여된 통상적인 ADC도 또한 4회 용량 후 종양 퇴행을 유도하였으며, 종양 재성장은 SSC에서의 경우보다 훨씬 더 이른, 마지막 투여 후 약 30일에 관찰되었다. 종양 퇴행 유지라는 보다 우수한 효능의 유사한 발견이 다른 종양 모델에서의 효능 연구에서 관찰되었다. 이들 데이터는 kK183C+K290C에 기초한 항체 A의 부위 특이적 접합체가 통상적으로 제조된 ADC보다 투여된 동물에서의 노출을 보다 잘 유지하였으며, 이는 SSC의 개선된 안정성이 보다 우수한 약동학적 파라미터를 생성한다는 것을 시사한다.
실시예 21: 상이한 접합 부위는 상이한 ADC 특성을 유발함
A. cys-돌연변이 ADC의 합성을 위한 일반적 절차:
하기 2종의 LP를 사용하였다:
Figure pct00065
조작된 시스테인 잔기를 포함하는 트라스투주맙의 용액 (하기 표에 제시된 바와 같음)을 50 mM 포스페이트 완충제, pH 7.4 중에서 제조하였다. PBS, EDTA (0.5 M 스톡), 및 TCEP (0.5 M 스톡)를 첨가하여 최종 단백질 농도가 10 mg/mL이고, 최종 EDTA 농도가 20 mM이고, 최종 TCEP 농도가 대략 6.6 mM (100 몰 당량)이도록 하였다. 반응물을 실온에서 48시간 동안 정치시킨 다음, 지이 PD-10 세파덱스 G25 칼럼을 제조업체의 지침서에 따라 사용하여 PBS로 완충제 교환하였다. 생성된 용액을 대략 50 당량의 데히드로아스코르베이트 (1:1 EtOH/물 중 50 mM 스톡)로 처리하였다. 항체를 4℃에서 밤새 정치시키고, 후속적으로 지이 PD-10 세파덱스 G25 칼럼을 제조업체의 지침서에 따라 사용하여 PBS로 완충제 교환하였다. 일부 돌연변이체에 대해 상기 절차의 약간의 변형을 사용하였다.
그렇게 제조된 항체를 10% DMA (vol/vol)를 함유하는 PBS 중 ~2.5 mg/mL로 희석하고, DMA 중 10 mM 원액으로서 LP#1 (10 몰 당량)로 처리하였다. 실온에서 2시간 후에, 혼합물을 PBS로 완충제 교환하고 (상기에 따름), 슈퍼덱스200 칼럼 상에서 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 단량체 분획을 농축시키고, 여과 멸균하여 최종 ADC를 얻었다. 생성물 특징화에 대해 하기 표 22를 참조한다.
표 22: ADC 특성의 요약:
Figure pct00066
B. 접합 실시예에 대한 일반적 분석 방법:
LCMS: 칼럼 = 워터스 BEH300-C4, 2.1 x 100 mm (P/N = 186004496); 기기 = SQD2 질량분석기 검출기가 구비된 액퀴티 UPLC; 유량 = 0.7 mL/분; 온도 = 80℃; 완충제 A = 물 + 0.1% 포름산; 완충제 B = 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 구배는 2분에 걸쳐 3%B에서 95%B로 실행하고, 0.75분 동안 95%B에서 유지하고, 이어서 3% B에서 재평형화시켰다. 샘플을 주사 직전에 TCEP 또는 DTT로 환원시켰다. 용리액을 LCMS (400-2000 달톤)에 의해 모니터링하고, 단백질 피크를 MaxEnt1을 사용하여 디콘볼루션하였다. DAR을 중량 평균 로딩으로서 보고하였다.
SEC: 칼럼: 슈퍼덱스200 (5/150 GL); 이동상: 2% 아세토니트릴을 함유하는 포스페이트 완충 염수, pH 7.4; 유량 = 0.25 mL/분; 온도 = 주위; 기기: 애질런트 1100 HPLC.
HIC: 칼럼: TSK겔 부틸 NPR, 4.6mm x 3.5 cm (P/N = S0557-835); 완충제 A = 10 mM 포스페이트를 함유하는 1.5 M 황산암모늄, pH 7; 완충제 B = 10 mM 포스페이트, pH 7 + 20% 이소프로필 알콜; 유량 = 0.8 mL/분; 온도 = 주위; 구배 = 12분에 걸쳐 0%B에서 100%B, 2분 동안 100%B에서 유지, 이어서 100%A에서 재-평형화; 기기: 애질런트 1100 HPLC.
C. 부위 특이적 vc0101 접합체의 소수성의 결정
ADC#1 - ADC#16을 다양한 접합체의 상대 소수성을 결정하기 위해 소수성 상호작용 크로마토그래피 (상기 방법)에 의해 평가하였다. ADC 소수성은 총 항체 노출과 상관관계가 있는 것으로 보고되었다.
부위 334, 375 및 392에 대한 접합체는 비변형 항체와 비교하여 체류 시간의 가장 작은 이동을 나타냈으며 반면에 부위 421, 443 및 347에 대한 접합체는 체류 시간의 가장 큰 이동을 나타냈다. 각각의 ADC의 상대 소수성은 ADC의 체류 시간을 비변형 항체의 체류 시간으로 나눔으로써 계산하였으며, 따라서 "상대 체류 시간" 또는 "RRT"가 생성되었다. ~1의 RRT는 ADC가 비변형 항체와 거의 동일한 소수성을 갖는다는 것을 나타낸다. 각각의 ADC에 대한 RRT는 표 22에 제시된다.
D. 부위 특이적 vc0101 접합체의 ADC 혈장 안정성
ADC 샘플 (~1.5 mg/mL)을 마우스, 래트 또는 인간 혈장 내로 희석하여 혈장 중 50 μg/mL ADC의 최종 용액을 산출하였다. 샘플을 5% CO2 하에 37℃에서 인큐베이션하고, 분취물을 3개 시점 (0, 24시간 및 72시간)에서 취하였다. 혈장 인큐베이션으로부터의 각각의 시점의 ADC 샘플 (25 μL)을 1시간 동안 37℃에서 IgG0으로 탈글리코실화하였다. 탈글리코실화 후, 포획 항체 (마우스 및 래트 혈장의 경우 1 mg/mL의 특이적 비오티닐화 염소 항-인간 IgG1 Fcγ 단편, 또는 인간 혈장의 경우 1 mg/mL의 비오티닐화 항-트라스투주맙 항체)를 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 37℃에서 가열하고, 이어서 또 다른 1시간 동안 실온에서 완만하게 진탕하였다. 다이나비드 마이원 스트렙타비딘 T1 자기 비드를 샘플에 첨가하고, 완만하게 진탕하면서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플 플레이트를 200 μL PBS + 0.05% 트윈-20, 200 μL PBS 및 HPLC 등급 물로 세척하였다. 결합된 ADC를 55 μL의 2% 포름산 (FA) (v/v)으로 용리시켰다. 각각의 샘플의 50 μL 분취물을 새로운 플레이트로 옮기고, 이어서 추가 5 μL의 200 mM TCEP를 첨가하였다.
무손상 단백질 분석은 BEH300 C4, 1.7 μm, 0.3 x 100 mm iKey 칼럼을 사용하여 나노액퀴티 UPLC (워터스)와 커플링된 Xevo G2 Q-TOF 질량 분광계로 수행하였다. 이동상 A (MPA)는 물 중 0.1% FA (v/v)로 이루어졌고, 이동상 B (MPB)는 아세토니트릴 중 0.1% FA (v/v)로 이루어졌다. 크로마토그래피 분리는 7분에 걸쳐 5%에서 90%로의 MPB의 선형 구배를 사용하여 0.3 μL/분의 유량으로 달성하였다. LC 칼럼 온도를 85℃로 설정하였다. 데이터 획득을 매스링스 소프트웨어 버전 4.1로 수행하였다. 질량 획득 범위는 700 Da에서 2400 Da까지였다. 디콘볼루션을 포함한 데이터 분석은 바이오파마링스 버전 1.33을 사용하여 수행하였다.
로딩 및 숙신이미드 개환 (+18 달톤 피크)을 시간 경과에 따라 모니터링하였다. 로딩 데이터는 0시간 DAR과 비교하여 %DAR 손실로서 보고된다. 개환 데이터는 72시간에 존재하는 총 종과 비교하여 개환 종의 %로서 보고된다. 여러 부위 돌연변이체는 매우 안정한 ADC를 유발하였으며 (334C, 421C 및 443C) 반면에 일부 부위는 유의한 양의 링커-페이로드를 상실하였다 (380C 및 114C). 개환의 비율은 부위 사이에 상당히 달랐다. 여러 부위, 예컨대 392C, 183C 및 334C는 매우 적은 개환을 유발하였으며 반면에 다른 부위, 예컨대 421C, 388C 및 347C는 신속하고 자발적인 개환을 유발하였다.
신속하고 자발적인 개환을 유발하는 부위는 감소된 소수성 및/또는 증가된 PK 노출을 갖는 접합체의 생성에 유용할 수 있다. 이 발견은 고리 안정성이 혈장 안정성과 상관관계가 있다는 지배적인 이해와 상반된다. 따라서 일부 측면에서, 부위 421C, 388C 및 347C 중 1개 이상에서의 접합은 높은 소수성을 갖는 링커-페이로드를 사용할 때 특히 유리할 수 있다. 일부 측면에서, 높은 소수성은 1.5 이상의 상대 체류 시간 (RRT) 값 (HIC에 의해 측정된 바와 같음)이다. 일부 측면에서, 높은 소수성은 1.7 이상의 RRT 값이다. 일부 측면에서, 높은 소수성은 1.8 이상의 RRT 값이다. 일부 측면에서, 높은 소수성은 1.9 이상의 RRT 값이다. 일부 측면에서, 높은 소수성은 2.0 이상의 RRT 값이다.
표 23: 다양한 ADC의 혈장 안정성
Figure pct00067
E. 부위 특이적 vc0101 접합체의 글루타티온 안정성
ADC 샘플을 수성 글루타티온 내로 희석하여 포스페이트 완충제, pH 7.4 중 0.5 mM의 최종 GSH 농도 및 ~0.1 mg/mL의 최종 단백질 농도를 산출하였다. 이어서, 샘플을 37℃에서 인큐베이션하고, 분취물을 3개의 시점에서 수거하여 DAR (T-0, T-3일, T-6일)을 결정하였다. 각각의 시점으로부터의 분취물을 TCEP로 처리하고, 실시예 #21.A에 기재된 방법에 따라 LC-MS에 의해 분석하였다.
로딩 및 숙신이미드 개환 (+18 달톤 피크)을 시간 경과에 따라 모니터링하였다. 로딩 데이터는 0시간 DAR과 비교하여 %DAR 손실로서 보고된다. (표 24) 개환 데이터는 72시간에 존재하는 총 종과 비교하여 개환 종의 %로서 보고된다. 여러 부위 돌연변이체는 매우 안정한 ADC를 유발하였으며 (334C, 421C 및 443C) 반면에 일부 부위는 유의한 양의 링커-페이로드를 상실하였다 (380C 및 114C). 개환의 비율은 부위 사이에 상당히 달랐다. 여러 부위, 예컨대 392C, 183C 및 334C는 매우 적은 개환을 유발하였으며 반면에 다른 부위, 예컨대 421C, 388C 및 347C는 상당한 개환을 유발하였다. 본 검정의 결과는 혈장 안정성 결과 (실시예 21.D)와 매우 많은 상관관계가 있으며 이는 티올-매개된 탈접합이 혈장에서의 페이로드 상실의 주요 경로라는 것을 시사한다. 종합하면, 이들 결과는 특정한 부위, 예컨대 334, 443, 290 및 392가 티올-매개된 탈접합을 통해 용이하게 상실된 페이로드-링커의 접합에 특히 유용할 수 있다는 것을 시사한다. 이러한 페이로드-링커는 통상의 말레이미드-카프로일 (mc) 및 말레이미드-카프로일-ValCit (vc) 연결 (예를 들어 vc-101, vc-MMAE, mc-MMAF 등)을 이용하는 것을 포함한다.
표 24: 다양한 vc0101 부위 특이적 접합체의 글루타티온 안정성
Figure pct00068
F. 마우스에서의 선택 부위 특이적 vc0101 접합체의 약동학적 평가
비-종양 보유 무흉선 암컷 nu/nu (누드) 마우스 (6-8주령)를 찰스 리버 래보러토리즈로부터 입수하였다. 마우스를 사용하는 모든 절차는 확립된 가이드라인에 따라 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 마우스 (n = 3 또는 4)에 항체 성분을 기준으로 3 mg/kg의 ADC의 단일 정맥내 용량을 투여하였다. 혈액 샘플을 투여후 0.083, 6, 24, 48, 96, 168 및 336시간에 꼬리 정맥을 통해 각각의 마우스로부터 수집하였다. 총 항체 (Tab) 및 ADC 농도를 LBA에 의해 결정하였으며, 여기서 양 항-인간 IgG 항체를 포획에 사용하거나, 염소 항-인간 IgG 항체를 Tab의 검출에 사용하거나, 또는 항-페이로드 항체를 ADC의 검출에 사용하였다. 각각의 동물에 대한 혈장 농도 데이터는 왓슨 LIMS 버전 7.4 (써모)를 사용하여 분석하였다. 노출은 부위를 기준으로 달랐다. 290C 및 443C 돌연변이체로부터 제조된 ADC는 가장 낮은 노출을 나타냈으며, 반면에 카파-183C 및 392C 부위로부터 제조된 ADC는 가장 높은 노출을 나타냈다. 많은 적용의 경우, 높은 노출을 갖는 부위가 바람직할 수 있는데, 이것이 치료제의 증가된 지속기간으로 이어질 것이기 때문이다. 그러나, 특정 적용의 경우, 보다 낮은 노출을 갖는 접합체 (예컨대 290C 및 443C)를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 특히, 보다 낮은 노출 (즉, 보다 낮은 PK)이 바람직한 적용은 뇌, CNS 및 눈에서의 사용을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 적응증은 특히 뇌, CNS 및/또는 눈의 암을 포함한다.
표 25: 다양한 부위-특이적 vc0101 ADC의 PK 노출
Figure pct00069
G. 부위 특이적 vc0101 접합체의 카텝신 절단
카텝신 B를 37℃에서 15분 동안 150 mM 아세트산나트륨, pH 5.2 중 6 mM 디티오트레이톨 (DTT)을 사용하여 활성화시켰다. 이어서, 활성화된 카텝신-B 50 ng을 2 mM DTT, 50 mM 아세트산나트륨, pH 5.2의 최종 농도에서 1 mg/mL의 ADC 20 uL와 혼합하였다. 반응물을 20분, 1시간, 2시간 및 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후 250 mM 보레이트 완충제, pH 8.5 중 10 uM E-64 시스테인 프로테아제 억제제를 사용하여 켄칭하였다. 검정 후에, 샘플을 TCEP를 사용하여 환원시키고, 실시예 21.A에 기재된 조건을 사용하여 LC/MS에 의해 분석하였다. 데이터는 링커 절단의 비율이 접합의 부위에 대단히 좌우된다는 것을 제시하였다. 특정한 부위, 예컨대 443C, 388C 및 290C는 매우 빨리 절단되며 반면에 다른 부위, 예컨대 334C, 375C 및 392C는 매우 느리게 절단된다. 일부 측면에서, 절단을 느리게 하는데 도움이 되는 부위에 접합시키는 것이 유리할 수 있다. 다른 측면에서, 빠른 절단이 바람직하다. 예를 들어, 페이로드를 빨리 방출시켜 엔도솜에서 소요되는 시간을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 추가 측면에서 신속한 페이로드 절단은 유리하게는 접합된 분자가 침투할 수 없는 곳, 예컨대 특정 고형 종양에서 페이로드의 침투를 허용할 수 있다. 추가 측면에서, 신속한 절단은 페이로드가 항체의 항원을 발현하지 않는 인접 세포에 전달되는 것을 허용하여, 예를 들어 이종 종양의 치료를 가능하게 할 수 있다.
표 26: 다양한 부위-특이적 vc0101 ADC의 링커 절단 동역학
Figure pct00070
H. 부위 특이적 vc0101 접합체의 열적 안정성
ADC를 10 mM EDTA를 함유하는 PBS (pH 7.4) 중에 0.2 mg/mL로 희석하였다. ADC를 밀봉된 바이알에 넣고, 45℃로 가열하였다. 분취물 (10 μL)을 1-주 증분으로 수거하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 시간 경과에 따라 형성된 고분자량 종 (HMWS) 및 저분자량 종 (LMWS)의 수준을 평가하였다. SEC 조건은 실시예 21.A에 약술된다. 이들 조건 하에, 단량체는 대략 3.6분에 용리되었다. 단량체 피크의 좌측으로 용리되는 임의의 단백질 물질을 HMWS로 계수하고, 단량체 피크의 우측으로 용리되는 임의의 단백질 물질을 LMWS로 계수하였다. 결과는 하기 표 27에 제시된다. 선택 ADC, 예컨대 카파-183C, 375C 및 334C는 탁월한 열적 안정성을 나타냈으며, 반면에 다른 ADC, 예컨대 443C 및 392C+443C는 유의한 분해를 나타냈다.
표 27: 다양한 부위-특이적 vc0101 ADC의 열적 안정성
Figure pct00071
I. 다양한 vc0101 부위-돌연변이체의 효능
항체-약물 접합체의 생체내 효능 연구를 N87 세포주를 사용하여 표적-발현 이종이식편 모델에서 수행하였다. 종양 크기가 250 내지 350mm3에 도달할 때까지 50% 매트리겔 중 대략 750만개 종양 세포를 6-8주령 누드 마우스 내에 피하로 이식하였다. 약물을 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 동물에게 총 4회, 4일마다 1회 (제1일, 제5일, 제9일 및 제13일) 10, 3 또는 1 mg/kg의 항체 약물 접합체를 주사하였다. 모든 실험 동물을 매주 체중 변화에 대해 모니터링하였다. 종양 부피를 캘리퍼 장치에 의해 처음 50일 동안 1주 2회 측정하고, 그 후 매주 1회 측정하고, 하기 식으로 계산하였다: 종양 부피 = (길이 x 폭2) / 2. 동물을 인도적으로 그의 종양 부피가 2500 mm3에 도달하기 전에 희생시켰다. 종양 크기는 일반적으로 처리 제1 주 후에 감소되는 것으로 관찰되었다. 동물을 처리가 중단된 후 (처리후 최대 100일) 종양 재성장에 대해 계속적으로 모니터링하였다. 3mpk 투여군으로부터의 데이터가 도 29에 제시된다. 388C 및 347C 돌연변이체로부터 생성된 ADC는 334C, 카파-183C, 392C 및 443C 돌연변이체로부터의 ADC보다 약간 더 낮은 효력을 나타냈다.
J. 다양한 돌연변이체에 대한 운시알라마이신 페이로드의 접합
트라스투주맙 시스테인 돌연변이체의 패널을 실시예 #1에 기재된 바와 같이 접합을 위해 제조하였다. 생성된 돌연변이체 (5 mg/mL)를 10% DMA를 함유하는 PBS 중 LP#2 (6 몰 당량)로 처리하였다. 실온에서 2시간 후에 반응물을 LCMS에 의해 평가하여 로딩을 결정하고, SEC에 의해 평가하여 적절한 폴딩 및 응집의 결여를 결정하였다. 결과는 표 28에 요약되고, 미가공 SEC 결과는 도 30에 제시된다.
볼 수 있는 바와 같이, 다양한 부위 돌연변이체는 잘 거동하는 단량체 ADC (334C, 375C 및 392C)를 생성한다. 다른 부위 돌연변이체는 로딩하지 못하거나 (예를 들어 246C, k149C, k111C), 응집하지 못하거나 (예를 들어 443C, 421C, 347C), 또는 아마도 부분적으로 언폴딩된 느리게-용리되는 ADC를 생성한다 (예를 들어 380C, 388C, 290C 및 k183C). 종합하면, 이들 결과는 생물물리학적으로 안정하고 적절하게 폴딩된 ADC를 생성하는 부위를 확인하기 위해 특정한 페이로드가 최적화를 요구할 수 있다는 것을 시사한다.
표 28: LP#2에의 다양한 트라스투주맙 돌연변이체의 접합에 대한 표로 제시된 결과
Figure pct00072
K. 요약
실시예에 의해 입증된 바와 같이, 접합의 부위는 LP 탈접합, LP 대사, tAb 노출, 링커 절단의 비율, ADC 응집, ADC 소수성 및 생체내 PK 프로파일에 영향을 미칠 수 있다.
ADC 분자의 특정 적용에 따라, 수많은 후보 접합 부위가 특정 문제점을 해결하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 보다 적은 소수성이 요구되는 경우에, 부위 334, 375, 392 또는 그의 조합이 바람직할 수 있는데, 이들이 비변형 항체와 비교하여 체류 시간의 가장 적은 이동을 나타냈기 때문이다. 또 다른 예에서, 신속하고 자발적인 개환을 유발하는 부위 (예를 들어, 421C, 388C, 347C 또는 그의 조합)는 감소된 소수성 및/또는 증가된 PK 노출을 갖는 접합체의 생성에 유용할 수 있다. 부위, 예컨대 334, 443, 290, 392 또는 그의 조합은 티올-매개된 탈접합을 통해 용이하게 상실되는 페이로드-링커의 접합에 특히 유용할 수 있다.
실시예 22: 부위-특이적 튜부리신 ADC
A. cys-돌연변이 ADC의 합성을 위한 일반적 절차:
하기 2종의 LP를 사용하였다. 튜부리신-기재 LP의 상세한 합성 반응식은 2016년 2월 1일에 출원된 미국 가출원 62/289,485에 상세히 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00073
방법 A: 상업용 헤르셉틴 항체와 내부 디술피드를 통한 링커 페이로드와의 접합. 트라스투주맙 항체의 용액 (~15 mg/mL)을 50 mM EDTA를 함유하는 50 mM 포스페이트 완충 염수 (pH 7.0) 중에서 제조하였다. 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP)를 증류수 중 5 mM 용액으로서 (~2.0 몰 당량) 첨가하였다. 생성된 용액을 1시간 동안 37℃로 가열하였다. 냉각 시에, 반응물을 적절한 부피의 PBS 및 디메틸 아세트아미드 (DMA)로 처리하여 생성된 용액이 ~10% DMA (vol/vol)를 함유하는 PBS 중 ~5 mg/mL가 되게 하였다. 적절한 링커 페이로드를 DMA 중 10 mM 스톡으로서 (~7 당량) 첨가하고, 반응물을 정치시키거나 또는 실온에서 완만히 교반하였다. 70분 후에, 반응물을 지이 PD-10 세파덱스 G25 칼럼을 사용하여 제조업체의 지침서에 따라 PBS로 완충제 교환하였다. 생성된 물질을 다소 농축시키고 (한외여과에 의해), 슈퍼덱스200 칼럼 상에서 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 단량체 분획을 농축시키고, 여과 멸균하여 최종 ADC를 얻었다.
방법 B: 조작된 시스테인 잔기를 함유하는 트라스투주맙 항체에 대한 링커-페이로드의 부위-특이적 접합. 조작된 시스테인 잔기, 예컨대 부위 118, 334 및 392 (카바트의 EU 인덱스를 사용함, WO2013093809 참조)를 함유하는 트라스투주맙의 용액을 50 mM 포스페이트 완충제, pH 7.4 중에서 제조하였다. PBS, EDTA (0.5 M 스톡), 및 TCEP (0.5 M 스톡)를 최종 단백질 농도가 ~10 mg/mL이고, 최종 EDTA 농도가 ~20 mM이고, 최종 TCEP 농도가 대략 ~6.6 mM (100 몰 당량)이도록 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2-48시간 동안 정치시킨 다음, 지이 PD-10 세파덱스 G25 칼럼을 제조업체의 지침서에 따라 사용하여 PBS로 완충제 교환하였다. 대안적 방법, 예컨대 투석여과 또는 투석이 또한 특정한 상황에 유용하다. 생성된 용액을 대략 50 당량의 데히드로아스코르베이트 (1:1 EtOH/물 중 50 mM 스톡)로 처리하였다. 항체를 4℃에서 밤새 정치시키고, 후속적으로 지이 PD-10 세파덱스 G25 칼럼을 제조업체의 지침서에 따라 사용하여 PBS로 완충제 교환하였다. 다시, 대안적 방법, 예컨대 투석여과 또는 투석이 또한 특정한 상황에 유용하다.
그렇게 제조된 항체를 10% DMA (vol/vol)를 함유하는 PBS 중 ~2.5 mg/mL로 희석하고, DMA 중 10 mM 원액으로서 적절한 링커-페이로드 (10 몰 당량)로 처리하였다. 실온에서 2시간 후에, 혼합물을 PBS로 완충제 교환하고 (상기에 따름), 슈퍼덱스200 칼럼 상에서 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 단량체 분획을 농축시키고, 여과 멸균하여 최종 ADC를 얻었다.
표 29: 튜부리신 ADC 및 이들을 제조하는데 사용된 페이로드 링커의 구조
Figure pct00074
표 30: ADC의 분석 특징화
Figure pct00075
B. 시험관내 세포 검정 절차
표적 발현 (BT474 (유방암), N87 (위암), HCC1954 (유방암), MDA-MB-361-DYT2 (유방암)) 또는 비-발현 (HT-29) 세포를 처리 전에 24시간 동안 96-웰 세포 배양 플레이트에 시딩하였다. 세포를 3배 연속 희석된 항체-약물 접합체 또는 유리 화합물 (약물에 접합된 항체가 없음)로 10개 농도에서 이중으로 처리하였다. 세포 생존율을 처리 96시간 후에 셀타이터(CellTiter) 96® 아퀴어스 원 용액 세포 증식 MTS 검정 (프로메가)에 의해 결정하였다. 상대 세포 생존율을 비처리 대조군의 백분율로서 결정하였다. IC50 값을 XL피트 v4.2로 4 파라미터 로지스틱 모델 #203을 사용하여 계산하였다. 결과는 하기 표 31에 제시된다.
표 31: 선택된 ADC에 대한 시험관내 세포독성 데이터
Figure pct00076
C. ADC의 시험관내 혈장 안정성 검정
ADC 샘플 (~1.5 mg/mL)을 마우스 혈장 (램파이어 바이올로지칼 래보러토리즈) 내로 희석하여 10% ADC, 90% 혈장의 최종 용액을 수득하였다. 3개의 시점을 분석하여 그의 DAR (T-0, T-24시간 및 T-48시간)을 결정하였다. 각각의 시점은 ADC를 풍부화하기 위해 면역침전 과정을 겪었다. 간략하게, 각각의 분취물을 20% MPER (써모 피셔 사이언티픽) 중에 1:1로 희석하고, 동등량의 비오티닐화 마우스 항-인간 Fc 및 염소 항-인간 카파 항체 (서던바이오테크)를 첨가하였다. 샘플을 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 스트렙타비딘 디나비즈 (써모 피셔 사이언티픽)를 첨가하였다. 샘플을 10% MPER, 0.05% 트윈 20 및 2회 PBS로 이루어진 4개의 세척 단계로 킹피셔 기기에서 처리하였다. ADC를 0.15% 포름산을 사용하여 비드로부터 용리시켰다. 샘플을 2M 트리스 pH 8.5를 사용하여 7.8로 pH 조정하고, 그의 N-연결된 글리칸을 PNGaseF (뉴잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 제거하였다. 샘플을 TCEP를 사용하여 환원시키고, 질량 이동의 높이 993 (모) 대 951 (탈아세틸화)에 의해 % 아세테이트 가수분해된 ADC에 대해 LC-MS에 의해 분석하였다. 결과는 도 31에 제시된다. 결과는 바람직한 부위, 예컨대 K334C 및 K392C에 대한 튜부리신 LP#3의 부착이 ADC 혈장 안정성을 개선시킬 수 있다는 것을 예시한다. 이것은 차례로 개선된 생체내 노출 및 개선된 효능을 유발할 가능성이 있다. 이들 부위에 의해 부여된 개선된 안정성은 대사 문제를 겪는 다른 페이로드 부류로 번역될 것으로 여겨진다.
D. ADC의 생체내 안정성
혈액 샘플을 N87 이종이식편 연구로부터의 선택 종양 보유 마우스로부터 ADC의 최종 투여 후 72시간에 수득하였다. 샘플을 3mpk 투여 군으로부터 취하였다. 그렇게 수득된 ADC 샘플을 1시간 동안 37℃에서 PNGase (뉴잉글랜드 바이오랩)로 처리함으로써 탈글리코실화하였다. 인큐베이션 후, 포획 항체 (1.0 mg/mL의 비오티닐화 염소 항-인간 Fc, 잭슨 이뮤노리서치)를 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 37℃에서 가열하고, 또 다른 1시간 동안 실온에서 완만히 진탕시켰다. 다이나비드 마이원 스트렙타비딘 T1 비드 (인비트로젠)를 샘플에 첨가하고, 완만히 진탕시키면서 적어도 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플 플레이트를 200 μL PBS + 0.05% 트윈 20, 200 μL PBS 및 HPLC 등급 물로 세척하였다. 결합된 ADC를 55 μL의 2%의 포름산 (v/v)으로 용리시켰다. 각각의 샘플 50 마이크로리터를 새로운 플레이트로 옮기고, 이어서 추가 5 μL의 200 mM TCEP를 첨가하였다.
무손상 단백질 분석을 매스링스 v4.1을 획득 소프트웨어로 사용하면서, 나노 액퀴티 (워터스)와 커플링된 Xevo G2 QTof 질량 분광계 및 BEH300 C4, 1.7 μm, 0.3 x 100 mm 칼럼 (워터스)으로 수행하였다. 칼럼 온도를 85℃로 설정하였다. 이동상 A는 물 중 0.1% TFA (TFA)로 이루어졌다. 이동상 B는 아세토니트릴: 1-프로판올 (1:1, v/v) 중 0.1% TFA로 이루어졌다. 크로마토그래피 분리는 7분에 걸쳐 이동상 B 5에서 90%의 선형 구배를 사용하여 18 μL/분의 유량으로 달성하였다. 디컨볼루션을 포함하는 데이터 분석은 바이오파마링스 v1.33 (워터스)을 사용하여 수행하였다. 결과는 표 32에 제시된다. 결과는 334 부위에서의 튜부리신 접합체 (ADC#T3)가 힌지 (통상적인) 접합체 ADC#T1과 비교하여 생체내 안정성을 개선시켰다는 것을 나타낸다.
표 32: ADC의 생체내 안정성 (DAR에 의해 측정된 바와 같음)
Figure pct00077
E. 생체내 N87 종양 이종이식편 모델:
항체-약물 접합체의 생체내 효능 연구를 N87 세포주를 사용하는 표적 발현 이종이식편 모델로 수행하였다. 효능 연구를 위해, 종양 크기가 250 내지 350 mm에 도달할 때까지 50% 매트리겔 중 750만개 종양 세포를 6-8주령 누드 마우스 내에 피하로 이식하였다. 투여는 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 수행하였다. 처리에 대한 종양 반응에 따라, 동물에게 4일마다 4회 처리되는 1-10 mg/kg의 항체 약물 접합체를 주사하였다. 모든 실험 동물을 매주 체중 변화에 대해 모니터링하였다. 종양 부피를 캘리퍼 장치에 의해 처음 50일 동안 1주 2회 및 그 후 매주 1회 측정하고, 하기 식으로 계산하였다: 종양 부피 5 = (길이 x 폭) /2. 동물을 인도적으로 그의 종양 부피가 2500 mm에 도달하기 전에 희생시켰다. 종양 크기는 처리 제1 주 후에 감소되는 것으로 관찰되었다. 동물을 처리가 중단된 후 종양 재성장에 대해 계속적으로 모니터링할 수 있다. N87 마우스 이종이식편 생체내 스크리닝 모델에서의 ADC #T1 및 #T3의 시험의 결과는 도 32에 제시된다. 결과는 바람직한 부위, 예컨대 K334C에 대한 LP#3의 부착이 개선된 생체내 효능을 유발할 수 있다는 것을 예시한다. 개선된 효능은 아마도 ADC#T1 (통상적인 힌지 접합체)과 비교하여 ADC#T3 (334C 접합체)의 개선된 ADC 안정성의 결과이다. ADC#T3의 효능은 ADC#T3이 ADC#T1의 DAR의 2분의 1이라는 사실에도 불구하고 ADC#T1보다 유의하게 더 크다는 것을 주목한다.
실시예 23: 항-EDB 항체를 사용하는 부위-특이적 ADC
본 실시예에서, 항-EDB 항체를 기재로 한 ADC의 효능 및 PK 프로파일을 조사하였다. 예시적인 항-EDB 항체인 L19의 서열은 표 33에 제시된다. 본 실시예에 제공된 데이터는 또한 특정 돌연변이 (이는 L19의 결합 친화도에 영향을 미치지 않았음)가 도입된 L19 돌연변이체를 포함한다. 이들 돌연변이체의 CDR 서열은 L19의 것과 동일하다. 예를 들어, EDB-(H16-K222R)는 트랜스글루타미나제-기재 ADC 접합에 사용된 L19 돌연변이체이다. 이들 ADC 및 EDB를 표적화하는 ADC의 추가 세부사항은 일반적으로 2016년 10월 17일에 출원된 미국 가출원 62/409,081에 상세히 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
표 33: 항-EDB 항체의 서열
Figure pct00078
23.1. EDB ADC의 시험관내 결합
EDB에 대한 항-EDB 항체 및 ADC의 상대 결합을 평가하기 위해, 맥시소르프 96-웰 플레이트를 PBS 중 0.5 또는 1 μg/ml의 인간 7-EDB-89로 코팅하고, 완만히 진탕시키면서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 비우고, 200 μl PBS로 세척하고, 실온에서 3시간 동안 100 μl의 차단 완충제 (써모사이언티픽)에 의해 차단하였다. 차단 완충제를 제거하고, 웰을 PBS로 세척하고, ELISA 검정 완충제 (EAB; 0.5% BSA / 0.02% 트윈-20/ PBS) 중 연속 희석된 (4배) 항-EDB 항체 또는 ADC 100 μl와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트의 제1 칼럼은 비어있는 채로 두고, 플레이트의 마지막 칼럼은 블랭크 대조군으로서 EAB로 채웠다. 플레이트를 3시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 시약을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.03% 트윈-20 (PBST) 200 μl로 세척하였다. EAB 중에 1:5000 희석된 항-인간 IgG-Fc-HRP (써모/피어스)를 100 μl로서 웰에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 200 μl의 PBST로 세척한 다음, 100 μl의 BioFX TMB (피셔)를 첨가하고, 색이 실온에서 4분 동안 발색되도록 하였다. 반응을 100 μl의 0.2N 황산으로 정지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 빅터 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머, 매사추세츠주 월섬) 상에서 판독하였다.
표 34는 ELISA 포맷에서 96-웰 플레이트에 결합된 인간 7-EDB-89 단백질 단편에 대한 항-EDB 항체 및 ADC의 상대 결합을 제공한다. EDB를 표적화하는 모든 항체 및 ADC는 19 pM 내지 58 pM 범위의 유사한 친화도로 표적 단백질에 결합하였다. 대조적으로, 비-EDB 표적화 항체 및 ADC는 높은 EC50 값 >10,000 pM을 갖는다.
표 34. 인간 EDB에 결합하는 항-EDB 항체 및 ADC.
Figure pct00079
평균 EC50 ± 표준 편차 및 결정의 수 (n). ND = 결정되지 않음.
23.2: 항-EDB ADC의 시험관내 세포독성
세포 배양. WI38-VA13은 ATCC로부터 입수한 SV40-형질전환된 인간 폐 섬유모세포이며, 이를 10% FBS, 1% MEM 비-필수 아미노산, 1% 피루브산나트륨, 100 유닛/ml 페니실린-스트렙토마이신 및 2 mM 글루타맥스가 보충된 MEM 이글스 배지 (셀-그로)에서 유지한다. HT29는 인간 결장직장 암종으로부터 유래된 것이며 (ATCC), 이를 10% FBS 및 1% 글루타민이 보충된 DMEM 배지에서 유지한다.
EDB+ FN 전사체 검출. EDB+ FN의 유전자 발현 및 전사체 분석을 위해, 부착 증식하는 WI38-VA13 및 HT29 세포를 트리플 익스프레스 (깁코)를 사용하여 세포-배양 플라스크로부터 해리하였다. RN이지 미니 키트 (퀴아젠)를 사용하여 수집된 세포 펠릿으로부터 총 RNA를 정제하였다. 잔류 DNA를 RNA 정제 동안 RNase-무함유 DNase 세트 (퀴아젠)에 의해 제거하였다. 고용량 RNA-투-cDNA 키트 (어플라이드 바이오시스템즈)를 총 RNA에서 cDNA의로의 역전사에 사용하였다. cDNA를 UNG (어플라이드 바이오시스템즈)로 택맨 유니버셜 마스터 믹스 II를 사용하여 정량적 실시간 PCR에 의해 분석하였다. EDB+ FN1 신호를 택맨 프라이머 Hs01565271_m1에 의해 검출하고, ACTB (택맨 프라이머 Hs99999903_m1) 및 GAPDH (택맨 프라이머 Hs99999905_m1)로부터의 두 신호의 평균을 사용하여 정규화하였다. 모든 프라이머는 써모피셔 사이언티픽으로부터의 것이었다. 대표적인 실험으로부터의 데이터가 제시된다.
웨스턴 블롯팅에 의한 EDB+ FN 단백질 검출. 웨스턴 블롯팅에 의한 EDB+ FN의 검출을 위해, 부착 증식하는 WI38-VA13 및 HT29 세포를 세포 스크레이핑에 의해 수거하였다. 세포 용해물을 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제를 갖는 세포 용해 완충제 (셀 시그널링 테크놀로지) 중에서 제조하였다. 종양 용해물을 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제를 갖는 RIPA 용해 완충제 또는 2X 세포 용해 완충제 (셀 시그널링 테크놀로지) 중에서 제조하였다. 단백질 용해물을 SDS-PAGE 및 이어서 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 ?긴 다음, 5% 밀크/TBS로 차단하고, 이어서 4℃에서 밤새 EDB-L19 항체 및 항-GAPDH 항체 (셀 시그널링 테크놀로지)와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후에, 항-EDB 블롯을 실온에서 1시간 동안 ECL HRP-연결된 항-인간 IgG 2차 항체 (지이 헬스케어)와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후에, EDB+ FN 신호를 피어스 ECL 2 웨스턴 블롯팅 기질 (써모 사이언티픽)에 의해 발생시키고, X선 필름에 의해 검출하였다. 항-GAPDH 블롯을 실온에 1시간 동안 차단 완충제 중 알렉사 플루오르 680 접합된 항-토끼 IgG 2차 항체 (인비트로젠)와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후에, GAPDH 신호를 리-코르 오디세이 영상화 시스템에 의해 검출하였다. EDB 웨스턴 블롯의 밀도측정 분석을 바이오-라드 GS-800 보정된 영상화 밀도계를 사용하여 수행하고, 퀀터티 원 버전 4.6.9 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 대표적인 실험으로부터의 데이터가 제시된다.
도 33은 WI38-VA13 및 HT29 세포에서 웨스턴 블롯에 의한 EDB+ FN1 발현을 제시한다. EDB+ FN은 시험관내에서 성장시킨 경우 WI38-VA13 세포주에서 발현되지만 HT29 결장 암종 세포주에서는 발현되지 않는다.
유동 세포측정법에 의한 EDB+ FN 단백질 검출. EDB-L19 항체를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 WI38-VA13 또는 HT29 세포의 세포 표면 상에서의 EDB+ FN의 발현을 측정하였다. 세포를 비-효소적 세포 해리 완충제 (깁코)에 의해 해리하고, 차단을 위해 얼음 상에서 저온 유동 완충제 (FB, 3% BSA/PBS+Ca+Mg)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 FB 중 얼음 상에서 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 차가운 PBS -Ca-Mg로 세척한 다음, 생존 및 사멸 세포를 구별하기 위해 생존 염색제 (바이오사이언시스)와 함께 제조업체의 절차에 따라 인큐베이션하였다. 신호를 BD 포르테사 유동 세포측정기 상에서 분석하고, 데이터를 BD FACS DIVA 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 대표적인 실험으로부터의 데이터가 제시된다.
표 35는 웨스턴 블롯, qRT-PCR 및 유동 세포측정법으로부터의 결과를 요약한다. 데이터는 WI38-VA13이 EDB+ FN 양성이고 HT29가 EDB+ FN 음성이라는 것을 입증한다.
표 35. WI38 VA13 및 HT29 세포에서의 EDB+ FN 발현의 특징화
Figure pct00080
시험관내 세포독성 검정. 증식하는 WI38-VA13 또는 HT29 세포를 비-효소적 세포 해리 완충제를 갖는 배양 플라스크로부터 수거하고, 가습 챔버 (37℃, 5% CO2)에서 밤새 96-웰 플레이트 (코닝)에 1000개 세포/웰로 배양하였다. 다음 날, 세포를 항-EDB ADC 또는 이소형 대조군 비-EDB-결합 ADC를 50 μl의 3X 스톡으로 10개 농도에서 이중으로 첨가함으로써 처리하였다. 일부 실험에서, 세포를 1500개 세포/웰로 플레이팅하고, 동일한 날에 처리하였다. 이어서, 세포를 4일 동안 항-EDB ADC 또는 이소형 대조군 비-EDB-결합 ADC와 함께 인큐베이션하였다. 수거 일에, 50 μl의 셀 타이어 글로 (프로메가)를 세포에 첨가하고, 실온에서 0.5시간 인큐베이션하였다. 발광을 빅터 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머, 매사추세츠주 월섬) 상에서 측정하였다. 상대 세포 생존율을 비처리 대조군 웰의 백분율로서 결정하였다. IC50 값을 XL피트 v4.2 (IDBS)로 4-파라미터 로지스틱 모델 #203을 사용하여 계산하였다.
표 36은 WI38-VA13 (EDB+ FN 양성 종양 세포주) 및 HT29 결장 암종 세포 (EDB+ FN 음성 종양 세포주)에 대해 수행된 세포독성 검정에서 항-EDB ADC 처리의 IC50 (ng/ml의 항체)을 제시한다. 항-EDB ADC는 EDB+ FN 발현 세포주에서 세포 사멸을 유도하였다. IC50 값은 대략 184 ng/ml 내지 216 ng/ml 범위로, vc-0101 링커-페이로드를 갖는 모든 항-EDB ADC에 대해 유사하였다 (EDB-L19-vc-0101, EDB-(κK183C-K290C)-vc-0101, EDB-mut1-vc-0101, EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101). 음성 대조군 vc-0101 ADC는 실질적으로 덜 강력하였으며, IC50 값이 항-EDB-vc-0101 ADC보다 대략 70배 내지 200배 더 높았다. 모든 vc-0101 ADC는 EDB+ FN 음성 종양 세포주인 HT29에서 46배 내지 83배 더 높은 IC50 값을 가졌다. 따라서, 항-EDB ADC는 그의 시험관내 세포독성에 대해 EDB+ FN 발현에 좌우된다.
"vc" 프로테아제-절단가능한 링커를 갖는 다른 아우리스타틴-기재 항-EDB ADC인 EDB-L19-vc-9411 및 EDB-L19-vc-1569는 또한 상응하는 음성 대조군 ADC와 비교하여 약 50배 내지 180배의 높은 선택성 및 비-발현 세포주와 비교하여 약 25배 내지 140배의 선택성으로 WA38-VA13 세포에서 강력한 세포독성을 나타냈다. EDB-L19-diS-DM1 ADC는 vc-0101 ADC와 유사한 효력을 나타냈지만, 음성 대조군 ADC (약 3배) 및 HT29 세포 (약 0.9배)와 비교하여 훨씬 더 낮은 선택성을 가졌다.
표 36. 항-EDB ADC 및 대조군 비-EDB-결합 ADC의 시험관내 세포독성.
Figure pct00081
평균 IC50 ± 표준 편차 및 결정의 수 (n). ND = 결정되지 않음.
23.3: 부위-특이적 EDB ADC의 생체내 효능
항-EDB ADC를 세포주 이종이식편 (CLX), 환자 유래된 이종이식편 (PDX) 및 동계 종양 모델에서 평가하였다. EDB+ FN의 발현을 본원 상기에 기재된 바와 같은 면역조직화학적 (IHC) 검정을 사용하여 검출하였다.
CLX 모델을 생성하기 위해, H-1975, HT29 또는 라모스 종양 세포주의 8x106개 내지 10x106개 세포를 암컷 무흉선 누드 마우스 내에 피하로 이식하였다. 접종을 위한 라모스 및 H-1975 세포를 각각 50% 및 100% 매트리겔 (비디 바이오사이언시스) 중에 현탁시켰다. 라모스 모델의 경우, 동물은 종양의 확립을 용이하게 하기 위해 세포 접종 전에 전신 조사 (4 Gy)를 받았다. 평균 종양 부피가 대략 160 내지 320 mm3에 도달하였을 때, 동물을 처리군으로, 각각의 군에 8-10마리 마우스로 무작위화하였다. ADC 또는 비히클 (PBS)을 제0일에 정맥내로 투여한 다음, 동물에게 4 내지 8회 용량을 4일마다 1회 투여하였다. 종양을 매주 1회 또는 2회 측정하고, 종양 부피를 부피 (mm3) = (폭 x 폭 x 길이)/2로 계산하였다. 동물의 체중을 4 내지 9주 동안 모니터링하였으며, 어떤 처리군에서도 동물 체증 감소는 관찰되지 않았다.
PDX 모델을 생성하기 위해, 종양을 공여자 동물로부터 수집하고, 종양 단편 대략 3x3 mm를 10 게이지 투관침을 사용하여 암컷 무흉선 누드 마우스 (PDX-NSX-11122 모델의 경우) 또는 NOD SCID 마우스 (PDX-PAX-13565 및 PDX-PAX-12534 모델의 경우)의 측복부 내에 피하로 이식하였다. 평균 종양 부피가 대략 160 내지 260 mm3에 도달하였을 때 마우스를 처리군으로, 각각의 군에 7-10마리 마우스로 무작위화하였다. ADC 또는 비히클 (PBS) 투여 요법 및 투여 경로 뿐만 아니라 종양 측정 절차는 CLX 모델에 대해 상기 기재된 것과 동일하다. 동물의 체중을 5 내지 14주 동안 모니터링하였으며, 어떤 처리군에서도 동물 체증 감소는 관찰되지 않았다. 종양 성장 억제는 종양 크기 ± SEM의 평균으로서 플롯팅된다.
EDB+ FN의 발현. 표 37에 제시된 바와 같이, H-1975, HT29 및 라모스 CLX 모델, PDX-NSX-11122, PDX-PAX-13565 및 PDX-PAX-12534 PDX 모델, 및 EMT-6 동계 동계 종양 모델에서의 EDB+ FN의 발현을 IHC 검정에서 EDB-L19 항체의 결합 및 후속적 검출에 의해 측정하였다. CLX HT-29는 중간 발현 CLX이지만 시험관내에서 검사하였을 때 종양 기질로부터 유래된 CLX에서의 단백질 발현의 우세로 인해 음성이었다.
표 37. EDB+ FN의 발현
Figure pct00082
PDX-NSX-11122 NSCLC PDX. 다양한 ADC의 효과를 EDB+ FN의 높은 수준을 발현하는 인간 암의 NSCLC PDX 모델인 PDX-NSX-11122에서 평가하였다. 도 34a는 0.3, 0.75, 1.5 및 3 mg/kg에서의 EDB-L19-vc-0101 (ADC1)의 항종양 활성을 제시한다. 데이터는 EDB-L19-vc-0101 (ADC1)이 3 mg/kg 및 1.5 mg/kg에서 용량 의존성 방식으로 종양 퇴행을 나타냈다는 것을 입증한다.
vc-연결된 ADC의 항종양 효능을 디술피드-연결된 ADC와 비교하였다. 도 34b 및 34c는 각각, 10 mg/kg의 디술피드 연결된 EDB-L19-diS-DM1 (ADC5)와 비교한 3 mg/kg의 EDB-L19-vc-0101 (ADC1)의 항종양 활성, 및 5 mg/kg의 디술피드 연결된 EDB-L19-diS-C2OCO-1569 (ADC6)와 비교한 1 및 3 mg/kg의 EDB-L19-vc-0101 (ADC1)의 항종양 활성을 제시한다. 도 34b 및 34c에 제시된 바와 같이, EDB-L19-vc-0101 (ADC1)는 이소형 음성 대조군 ADC 및 디술피드 링커인 EDB-L19-diS-DM1 및 EDB-L19-dis-C2OCO-1569를 사용하여 생성된 ADC와 비교하여 더 큰 효능을 나타냈다. 추가로, EDB-L19-vc-0101 (ADC1)로 처리된 종양을 보유하는 동물은 1 mg/kg에서 종양 성장을 지연시켰고 3 mg/kg에서 완전 퇴행을 나타냈다. 데이터는 EDB-L19-vc-0101 (ADC1)이 용량-의존성 방식으로 PDX-NSX-11122 NSCLC 이종이식편의 성장을 억제한다는 것을 입증한다.
부위-특이적 및 통상적으로 접합된 ADC의 활성을 평가하였다. 도 34d는 각각 0.3, 1 및 3 mg/kg 및 1.5 mg/kg의 용량에서 통상적으로 접합된 EDB-L19-vc-0101 (ADC1)와 비교하여 부위-특이적 접합된 EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 (ADC2)의 항종양 효능을 제시한다. 용량-수준 기반 효능은 유사하였으며, EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 (ADC2)은 용량 의존성 방식으로 종양 퇴행을 유도하였다.
다양한 돌연변이를 갖는 vc-0101 항-EDB ADC의 활성을 평가하였다. 도 34e는 0.3, 1 및 3 mg/kg의 용량에서 부위-특이적 접합된 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4)의 항종양 효능을 제시한다. EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4)은 1 및 3 mg/kg에서 종양 퇴행을 유도하였다. 도 34f는 도 34e의 3 mg/kg으로 투여된 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) 군에서의 10마리 개별 종양 보유 마우스에 대한 종양 성장 억제 곡선을 제시한다. 3 mg/kg 군에서의 종양 퇴행은 완전하였으며, 연구의 종료 시 (95일)에 10마리 마우스 중 8마리 (80%)에서 지속되었다.
H-1975 NSCLC CLX. 다양한 vc-연결된 아우리스타틴 및 CPI ADC의 효과를 인간 암의 중간 내지 높은 EDB+ FN 발현 NSCLC CLX 모델인 H-1975에서 평가하였다. 도 35a는 0.3, 0.75, 1.5 및 3 mg/mg에서 항종양 활성에 대해 평가된 EDB-L19-vc-0101 (ADC1)을 제시한다. 데이터는 EDB-L19-vc-0101 (ADC1)이 3 mg/kg에서, 낮게는 1.5 mg/kg에서 용량 의존성 방식으로 종양 퇴행을 나타냈다는 것을 입증한다. 도 35b는 EDB-L19-vc-0101 (ADC1) 및 EDB-L19-vc-1569 (ADC10)를 0.3, 1 및 3 mg/kg에서 항종양 활성에 대해 평가하였다는 것을 제시한다. 데이터는 EDB-L19-vc-0101 (ADC1) 및 EDB-L19-vc-1569 (ADC10)가 용량 의존성 방식으로 종양 퇴행을 나타냈다는 것을 입증한다.
vc-연결된 아우리스타틴 ADC의 항종양 활성을 CPI ADC와 비교하였다. 도 35c에 제시된 바와 같이, EDB-L19-vc-0101 (ADC1) 및 EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI (ADC9)를 각각 0.5, 1.5 및 3 mg/kg 및 0.1, 0.3 및 1 mg/kg에서 평가하였다. EDB-L19-vc-0101 (ADC1) 및 EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI (ADC9)는 둘 다 평가된 가장 높은 용량에서 종양 퇴행을 나타냈다.
부위-특이적 및 통상적으로 접합된 항-EDB ADC의 활성을 평가하였다. 도 35d는 0.5, 1.5 및 3 mg/kg의 용량에서 통상적으로 접합된 EDB-L19-vc-0101 (ADC1)과 비교하여 부위-특이적 접합된 EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 (ADC2)의 항종양 효능을 제시한다. 용량-수준 기반 효능은 유사하였으며, EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 (ADC2)은 용량 의존성 방식으로 종양 퇴행을 유도하였다.
다양한 돌연변이를 갖는 vc-0101 항-EDB ADC의 활성을 평가하였다. 도 35e는 1 및 3 mg/kg에서 EDB-L19-vc-0101 (ADC1) 및 EDB-mut1-vc-0101 (ADC3)의 항종양 효능을 제시한다. 도 35f는 1 및 3 mg/kg에서 부위-특이적 EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101 (ADC2) 및 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4)의 항종양 효능을 제시한다. 4종의 ADC는 이들이 κK183C-K290C 돌연변이를 함유하였는지 여부에 상관없이 H-1975 모델에서 유사한 효능을 나타냈다. 추가로, 시험된 모든 ADC는 3 mg/kg에서의 종양 퇴행을 포함한 강건한 항종양 효능을 유발하였다. 이들 데이터는 κK183C-K290C 돌연변이의 도입이 ADC의 효능에 부정적 영향을 미치지 않았다는 것을 입증한다.
HT29 결장 CLX. 다양한 vc-연결된 아우리스타틴 ADC의 효과를 인간 암의 중간 EDB+ FN 발현 결장 CLX 모델인 HT29에서 평가하였다. 도 36에 제시된 바와 같이, EDB-L19-vc-0101 (ADC1) 및 EDB-L19-vc-9411 (ADC7)을 3 mg/kg에서 항종양 활성에 대해 시험하였다. EDB-L19-vc-0101 (ADC1) 및 EDB-L19-vc-9411 (ADC7) 둘 다는 시간 경과에 따라 3 mg/kg 용량에서 종양 퇴행을 나타냈다.
PDX-PAX-13565 및 PDX-PAX-12534 췌장 PDX. EDB-L19-vc-0101 (ADC1)의 항종양 효능을 인간 췌장 PDX 모델에서 평가하였다. 도 37a에 제시된 바와 같이, EDB-L19-vc-0101 (ADC1)을 중간 내지 높은 EDB+FN 발현 췌장 PDX인 PDX-PAX-13565에서 0.3, 1 및 3 mg/kg에서 평가하였다. 도 37b에 제시된 바와 같이, EDB-L19-vc-0101 (ADC1)을 낮은 내지 높은 EDB+FN 발현 췌장 PDX인 PDX-PAX-12534에서 0.3, 1 및 3 mg/kg에서 평가하였다. EDB-L19-vc-0101 (ADC1)은 평가된 두 췌장 PDX 모델에서 용량 의존성 방식으로 종양 퇴행을 나타냈다.
라모스 림프종 CLX. EDB-L19-vc-0101 (ADC1)의 항종양 효능을 중간 EDB+ FN 발현 림프종 CLX 모델인 라모스에서 평가하였다. EDB-L19-vc-0101 (ADC1)을 1 및 3 mg/kg에서 항종양 활성에 대해 평가하였다. 도 38에 제시된 바와 같이, EDB-L19-vc-0101 (ADC1)은 용량 의존성 방식으로 3 mg/kg 용량에서 종양 퇴행을 나타냈다.
EMT-6 유방 동계 모델. EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4)의 항종양 효능을 면역적격 배경에서 마우스 동계 유방 암종 모델인 EMT-6에서 평가하였다. 도 39a에 제시된 바와 같이, EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4)은 4.5 mg/kg에서 종양 성장 억제를 나타냈다. 종양 성장 억제를 11마리 종양 보유 동물에서의 종양 크기의 평균 ± SEM으로 플롯팅하였다. 도 39b는 4.5 mg/kg으로 투여된 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) 군에서의 11마리 개별 종양 보유 마우스에 대한 종양 성장 억제 곡선을 제시한다. 4.5 mg/kg 군에서의 종양 퇴행은 완전하였으며, 연구의 종료 시 (34일)에 11마리 마우스 중 9마리 (82%)에서 지속되었다.
23.4: 부위 특이적 EDB ADC의 약동학 (PK)
통상적으로 접합된 EDB-L19-vc-0101 (ADC1) 및 부위-특이적 접합된 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4) 접합된 항체 약물 접합체의 노출을 각각 시노몰구스 원숭이에서 5 또는 6 mg/kg의 정맥내 (IV) 볼루스 용량 투여 후에 결정하였다. 총 항체 (총 Ab; 접합된 mAb 및 미접합 mAb 둘 다의 측정), ADC (적어도 1종의 약물 분자에 접합된 mAb)의 농도를 리간드 결합 검정 (LBA)을 사용하여 측정하고, 방출된 페이로드 0101의 농도를 질량 분광측정법을 사용하여 측정하였다. 총 Ab 및 ADC 농도의 정량화를 형광 검출이 구비된 기로랩(Gyrolab)® 워크스테이션을 사용하여 리간드 결합 검정 (LBA)에 의해 달성하였다. 사용된 비오티닐화 포획 단백질은 양 항-hIgG였고, 검출 항체는 총 항체에 대해 알렉사 플루오르 647 염소 항-hIgG 또는 ADC에 대해 알렉사 플루오르 647 항-0101 mAb였다 (데이터는 왓슨 v 7.4 LIMS 시스템에 의해 처리됨). 미접합 페이로드 분석을 위해 단백질 침전을 사용하여 생체내 샘플을 제조하고, 이를 양성 터보 이온분무 전기분무 이온화 (ESI) 및 다중 반응 모니터링 (MRM) 모드를 사용하여 에이비 사이엑스 API5500 (QTRAP) 질량 분광계 상으로 주사하였다. 743.6→188.0 및 751.6→188.0의 전이를 각각 분석물 및 중수소화 내부 표준에 사용하였다. 데이터 획득 및 처리를 애널리스트 소프트웨어 버전 1.5.2 (어플라이드 바이오시스템즈/엠디에스 사이엑스, 캐나다)로 수행하였다.
EDB-L19-vc-0101 ADC (5 mg/kg) 및 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 ADC (6 mg/kg) 투여된 시노몰구스 원숭이로부터의 총 Ab, ADC 및 방출된 페이로드의 약동학이 표 38에 제시된다. 부위-특이적 접합된 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 ADC의 노출은 통상적인 접합체와 비교하였을 때 증가된 노출 (용량 정규화 AUC에 의해 측정된 바와 같은 ~2.3X 증가) 및 증가된 접합 안정성 둘 다를 나타냈다. 접합 안정성은 각각 통상적인 EDB-L19-vc-0101 ADC와 비교하여 부위-특이적 접합된 EDB-mut2(κK183C-K290C)-vc-0101 ADC에서 더 높은 ADC/Ab 비 (75%에 비해 84%) 및 더 낮은 방출된 페이로드 노출 (용량 정규화 AUC; 0.0082에 비해 0.0058 μg*h/mL) 둘 다로 평가되었다. NA=적용가능하지 않음.
표 38. 비-인간 영장류에서 약동학의 개요.
Figure pct00083
23.5: 부위 특이적 EDB ADC에 대한 독성 연구
통상적인 EDB-L19-vc-0101 (ADC1) 및 부위-특이적 접합된 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4)의 비임상 안전성 프로파일을 위스타-한 래트 및 시노몰구스 원숭이에서 탐색적 반복-용량 (Q3Wx3) 연구에 의해 특징화하였다. 래트 및 시노몰구스 원숭이는 인간 EDB+ FN과의 100% 단백질 서열 상동성, 뿐만 아니라 실시예 2에서 입증된 바와 같이 비아코어 검정에 의해 래트, 인간 및 원숭이에 대한 항체 EDB-L19 (Ab1) 및 EDB-mut1(κK183C-K290C) (Ab4)의 유사한 결합 친화도로 인해 독성 평가에 대해 약리학상 관련된 비임상 종인 것으로 간주되었다.
EDB-L19-vc-0101 (ADC1)을 위스타 한 래트 및 시노몰구스 원숭이에서 각각 최대 10 및 5 mg/kg/용량으로 평가하고, EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4)을 시노몰구스 원숭이에서 최대 12 mg/kg/용량으로 평가하였다. 래트 또는 원숭이에게 3주마다 1회 (제1일, 제22일 및 제43일) 정맥내로 투여하고, 제46일 (제3 용량으로부터 3일 후)에 안락사시켰다. 동물을 임상 징후, 체중 변화, 먹이 소비, 임상 병리상태 파라미터, 기관 중량, 육안 및 현미경 관찰에 대해 평가하였다. 어떤 사멸 또는 동물의 임상 상태의 유의한 변화도 이들 연구에서 주목되지 않았다.
래트 및 원숭이에서의 EDB+ FN 발현 조직/기관에서 표적-의존성 독성의 어떤 징후도 존재하지 않았다. 두 종에서, 주요 독성은 연관된 혈액 변화를 갖는 가역적 골수억제였다. 원숭이에서, 표 39 및 도 40에 제시된 바와 같이, 5 mg/kg/용량의 통상적으로 접합된 EDB-L19-vc-0101 (ADC1)에서 현저한 일시적 호중구감소증이 관찰되었으며, 반면에 6 mg/kg/용량의 부위-특이적 접합된 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4)에서 호중구 수에 대한 단지 최소의 효과만이 관찰되었다. 점은 평균을 나타내고, 오차 막대는 평균으로부터의 ±1 표준 편차 (SD)를 나타낸다.
데이터는 부위-특이적 접합에 의한 골수억제의 유의한 완화를 입증한다. EDB-L19-vc-0101 (ADC1) 및 EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101 (ADC4)의 독성 프로파일은 이들 접합체의 표적-독립적 효과와 일치하였고, EDB-L19-vc-0101 (ADC1) 및 EDB-mut1(κK183C- K290C)-vc-0101 (ADC4)에 대한 최고 비-중증 독성 용량 (HNSTD)은 각각 ≥ 5 mg/kg/용량 및 ≥ 12 mg/kg/용량인 것으로 결정되었다.
표 39. 연구 지속기간에 걸친 시노몰구스 원숭이에서의 절대 호중구 수.
Figure pct00084
실시예 24: 종양 항원을 표적화하는 항체를 갖는 부위-특이적 ADC
24.1. 부위-특이적 ADC 접합체의 생성
24.1.1 이중 cyc 돌연변이체 (kK183C+K290C)의 생성.
이중 cys 돌연변이체인 kK183C+K290C 매개된 부위-특이적 약물 접합이 통상적인 항체-약물 접합체와 비교하여 유의한 이익을 부여하는지 확인하기 위해, 종양-연관 항원에 대한 또 다른 항체인 항체 X (이하 X)를 조사하였다. 항체 X는 그의 마우스 모 항체로부터 인간화된 것이었다. 아우리스타틴 0101을 갖는 부위 특이적 항체 약물 접합체를 제조하기 위해, 본 발명자들은 카파 경쇄 내 kK183C 돌연변이 및 hIgG1 중쇄 불변 영역 내 K290C 돌연변이를 갖는 X-hIgG1/카파를 생성하였다. 항체 X 및 그의 이중 cys 돌연변이체 버전 X(kK183C+K290C) 둘 다에 대한 단백질 제제를 생성하고, 그의 표적 항원과의 상대 결합 활성을 경쟁 ELISA에서 평가하였다. 본 검정에서, 항체 X 및 cys 돌연변이체 X(kK183C+K290C) 둘 다를 ELISA 플레이트 상에 고정화된 표적 항원에의 결합에 대해 그의 공통 모 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 도 41에 제시된 바와 같이, 항체 X 및 X(kK183C+K290C)는 표적 항원에 대한 동등한 경쟁적 결합 활성을 가졌으며, 이는 중쇄 및 경쇄의 불변 영역 내 cys 돌연변이가 표적 항원에 대한 항체의 결합 활성에 영향을 미치지 않았다는 것을 나타낸다.
방법.
경쟁 ELISA. 96 웰 플레이트 (hi-결합 코스타 플레이트)를 표적 항원-Fc 융합 단백질로 코팅하였다. 차단 완충제 (PBST 중 1% 소 혈청 알부민) 중 1 내지 3회 연속 희석된 항체 X 및 cys 돌연변이체 X(kK183C+K290C) 용액을 일정한 농도의 비오티닐화 모 항체의 존재 하에 플레이트에 적용하였다. 2시간 동안의 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고, 차단 완충제 중에 1:5000 희석된 HRP-접합 스트렙타비딘 (서던 바이오테크)을 적용하였다. 스트렙타비딘과의 인큐베이션을 40분 동안 실시한 후, 플레이트를 TMB 용액으로 10분 동안 발색시켰다. 이어서, 0.18M H2SO4를 첨가함으로써 발색 반응을 정지시키고, 450nm에서의 흡광도를 측정하였다. 마이크로소프트 엑셀 및 그래프패드-프리즘 소프트웨어를 사용하여 데이터 플롯팅 및 분석을 수행하였다.
24.1.2 X-vc0101 및 X(kK183C+K290C)-vc0101 접합체의 생성
24.1.2.1 통상적인 ADC (X-vc0101)의 생성
트리스 (2-카르복시에틸) 포스핀 (TCEP)을 사용한 항체 X의 부분적 환원에 이어서 환원된 시스테인 잔기와 말레이미드 관능화 링커-페이로드 vc0101과의 반응을 통해 통상적인 ADC를 제조하였다. 특히, 항체를 37℃에서 2시간 동안 100 mM HEPES 완충제, pH 7.0 및 1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 중 2.2 몰 과량의 TCEP의 첨가를 통해 환원시켰다. 이어서, vc0101을 7:1의 링커-페이로드/항체 비로 반응 혼합물에 첨가하고, 15% v/v의 디메틸아세트아미드 (DMA)의 존재 하에 25℃에서 추가의 1시간 동안 반응시켰다. N-에틸말레이미드 (NEM)를 첨가하여 미반응 티올을 캡핑하고, 이어서 L-시스테인을 첨가하여 임의의 미반응 링커-페이로드를 켄칭하였다. 반응 혼합물을 PBS, pH 7.4 중 4℃에서 밤새 투석하고, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC; AKTA 아반트, 슈퍼덱스 200 수지)에 의해 정제하였다. 정제된 ADC를 20 mM 히스티딘, 85 mg/mL 수크로스, pH5.8로 완충제 교환하고, -70℃에서 저장하였다. ADC를 순도에 대한 분석 SEC; HIC 및 약물-항체 비 (DAR)를 계산하기 위한 LC-ESI MS를 통해 특징화하였다. 단백질 농도를 UV 분광광도계를 통해 결정하였다.
24.1.2.2 부위-특이적 ADC X (kK183C+K290C)-vc0101의 생성
조작된 이중 cys 돌연변이체 X(kK183C+K290C)를 37℃에서 6시간 동안 100 mM HEPES 완충제, pH 7.0 및 1 mM DTPA 중 12배 몰 과량의 TCEP로 완전히 환원시키고, 이어서 탈염시켜 과량의 TCEP를 제거하였다. 환원된 항체를 4℃에서 16시간 동안 2 mM 데히드로 아스코르브산 (DHA) 중에서 인큐베이션하여 쇄간 디술피드 결합을 재형성시켰다. 탈염 후에, 말레이미드 관능화 링커-페이로드 vc0101을 10:1의 링커-페이로드/항체 몰비로 첨가하고, 15% v/v의 디메틸아세트아미드 (DMA)의 존재 하에 25℃에서 추가의 2시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 탈염시키고, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC, AKTA 아반트, 부틸 HP 수지)를 통해 정제하였다. 정제된 ADC를 20 mM 히스티딘, 85 mg/mL 수크로스, pH5.8로 완충제 교환하고, -70℃에서 저장하였다. ADC를 순도에 대한 SEC; HIC, 역상 UPLC 및 DAR을 계산하기 위한 LC-ESI MS를 통해 특징화하였다. 단백질 농도를 UV 분광광도계를 통해 결정하였다.
24.1.2.3 ADC 약물 분포
샘플을 PBS에 의해 대략 1 mg/ml로 희석하여 HIC 분석을 위해 화합물을 제조하였다. 샘플을 TSK-겔 부틸 NPR 칼럼 (4.6 x 3.5 mm, 2.5 μm 세공 크기; 도소 바이오사이언스 부품 #14947)이 구비된 애질런트 1200 HPLC 상에 15 μl의 자동-주사에 의해 분석하였다. 시스템은 온도조절장치가 구비된 오토-샘플러, 칼럼 가열기 및 UV 검출기를 포함한다. 구배 방법을 하기와 같이 사용하였다: 이동상 A: 1.5 M 황산암모늄, 50 mM 이염기성 인산칼륨 (pH7); 이동상 B: 20% 이소프로필 알콜, 50 mM 이염기성 인산칼륨 (pH 7); T=0분 100% A; T=12분 0% A.
약물 분포 프로파일은 표 40에 제시된다. 두 ADC가 유사한 평균 DAR을 특색으로 하지만, 부위-특이적 접합을 사용하는 ADC (X(κK183C+K290C)-vc0101)는 주로 1개의 피크를 나타냈고 (94%가 4 DAR임), 통상적인 접합을 사용하는 ADC (X-vc0101)는 차등적으로 로딩된 접합체의 혼합물을 나타냈다 (51%가 4 DAR임). 이 균질한 약물 분포 프로파일은 통상적인 ADC에 비해 부위-특이적 ADC의 주요 장점이다.
표 40: ADC의 약물 분포 (HIC에 의해 분석됨)
Figure pct00085
24.2. 인간 비-소세포 폐암 세포주인 Calu-6 이종이식편 모델에서 단일 작용제로서의 J145 ADC의 평가
ADC X-vc0101 (통상적인 접합체) 및 ADC X(kK183C+K290C)-vc0101의 종양-보유 동물에 3 mg/kg의 투여는 약물 후보의 마지막 용량 후 제15일까지 두 군에서 종양 퇴행을 유발하였으며, 이때 평균 종양 부피는 각각 60 mm3 및 53 mm3이었다. 연구 제26일까지, 비히클 군을 안락사시켰을 때, 두 처리군은 일관된 종양 퇴행을 나타냈다. 제47일에서 제58일까지, 통상적인 접합체 군에서 5마리 동물 중 2마리는 치료 효과를 벗어났고, 신속하게 성장하는 것으로 나타났지만, 그러나 X(kK183C+K290C)-vc0101은 일관되게 종양 퇴행을 나타냈다. 제58일에 통상적인 접합체 및 ADC X(kK183C+K290C)-vc0101에 대한 평균 종양 부피는 각각 825 mm3 및 23 mm3였다 (표 41 및 도 42).
연구 제61일까지, 통상적인 ADC 군은 3520 mm3를 초과하는 종양 부피를 기준으로 한 희생으로 인해 동물을 잃었다. X(kK183C+K290C)-vc0101 군은 제82일까지 일관된 종양 퇴행을 나타냈고, 이후 종양의 재성장을 나타냈으며, 연구의 종료 시에 존재하는 가장 큰 덩이는 연구 제111일에 1881 mm3였다 (표 41 및 도 42).
ADC X(kK183C+K290C)-vc0101은 연구의 제82일까지 3 mg/kg의 Q4DX4 투여 요법에서 Calu-6 인간 NSCLC CDX 모델에 대한 일관된 항종양 효과를 나타냈다. 연구의 초기 시점에 ADC X-vc0101은 필적하는 종양 세포 사멸을 나타냈지만, 그러나 연구 과정에 걸쳐 종양은 제47일까지 치료 효과를 벗어났고, 크기가 신속하게 증가하였다.
결론적으로, ADC X(kK183C+K290C)-vc0101은 제111일까지 보다 많은 동물이 생존하는, Calu-6 인간 NSCLC CDX 모델에 대한 보다 우수한 항종양 활성을 갖는다.
표 41: ADC 또는 비히클 대조군으로 처리된 개별 마우스의 종양 부피.
(개별 종양 부피는 제111일까지 각각의 처리군당 n=5 동물로부터의 mm3로 나타냄; Ave: 평균)
Figure pct00086
방법.
종양 이종이식편을 7마리의 5-8주령 암컷 무흉선 누드 마우스의 코호트에서, 10% 태아 소 혈청을 함유하는 이글 최소 필수 배지 (ATCC, Cat#30-2003) 배양 배지 (하이클론#SH30088.03HI)와 함께 제조된 50% 매트리겔 (비디 바이오사이언시스, Cat#356234) 중에 현탁시킨 마우스당 0.1 ml의 부피 중 5 x 106개 Calu-6 (ATCC, Cat#HTB-56) 인간 폐 종양 세포를 우측 측복부 내에 피하 주사함으로써 개시하였다. 시험 물품의 투여는 평균 종양 크기가 100 - 150 mm3에 도달하였을 때 개시하였으며, 여기서 종양 부피는 다음과 같이 계산하였다: (mm3) = (a x b2/2) (여기서 'b'는 가장 작은 직경이고 'a'는 가장 큰 직경임). 종양 부피 및 체중 데이터를 매주 2회 수집하였다. 혈액 샘플 (각각 10μl)을 각각의 군에서 2마리 마우스로부터, 제1 용량 30시간 후 및 마지막 (제4) 용량 30시간 후에 수집하였다. 혈액을 190μL의 HBS-EP 완충제 중에 희석하고, -80℃에서 즉시 저장하였다. 종양 덩이는 혈액을 수집한 동물과 동일한 동물에서 마지막 (제4) 용량 30시간 후에 부검으로 수집하고, 순간 동결시켰다.
ADC X(kK183C+K290C)-vc0101을 6mg/kg, 3 mg/kg, 1 mg/kg 및 0.3 mg/kg의 용량으로 Q4D x 4 투여 스케줄 (4일마다 4회 용량 투여)로 종양-보유 동물에 정맥내로 투여하였다.
ADC X-vc0101 (통상적인 접합체)를 3 mg/kg의 용량으로 Q4D x 4 투여 스케줄 (4일마다 4회 용량 투여)로 종양-보유 동물에 정맥내로 투여하였다.
24.3. 약동학적 연구.
X-vc0101 및 X(kK183C+K290C)-vc0101은 6 mg/kg의 동일한 용량 수준에서 Cmax, 노출 (AUC) 및 반감기 (t1/2)를 포함한 유사한 PK/TK 프로파일을 나타냈다 (표 42). 총 Ab 및 ADC의 유사한 노출 수준 (즉, AUC)이 6mg/kg의 X-vc0101 및 X(kK183C+K290C)-vc0101 둘 다에서 및 노출이 훨씬 더 높은 수준에 도달하였을 때 9 및 12mg/kg의 추가의 보다 높은 용량의 X(kK183C+K290C)-vc0101에서 관찰되었다. 이것은 동물에 투여된 ADC가 두 화합물에 대한 실험 과정 내내 대부분 무손상으로 남아있었다는 것 및 두 화합물이 유사한 생체내 안정성을 가졌다는 것을 나타낸다.
표 42: IV 투여 후 원숭이에서 X-vc0101 및 X(kK183C+K290C)-vc0101 총 항체 및 ADC에 대한 평균 약동학 파라미터
Figure pct00087
Cmax = 최대 약물 농도; Tmax = Cmax까지의 시간, AUC = 농도-시간 곡선하 면적; t½ = 반감기; AUC는 0-504시간에 계산함
방법
통상적인 (X-vc0101) 또는 부위 특이적 (X(kK183C+K290C)-vc0101) 항체 약물 접합체 (ADC)의 노출을 시노몰구스 원숭이에게의 6 mg/kg의 X-vc0101 또는 6, 9 및 12 mg/kg의 X(kK183C+K290C)-vc0101의 IV 볼루스 투여 후에 결정하였다. 혈장 샘플을 투여전, 각각의 용량의 IV 투여로부터 0.25, 6, 24, 72, 168, 336 및 504시간 후에 수집하였다. 총 항체 (총 Ab; 접합된 mAb 및 미접합 mAb 둘 다의 측정) 및 ADC (적어도 1종의 약물 분자에 접합된 mAb)의 농도를 리간드 결합 검정 (LBA)을 사용하여 결정하였다. 각각의 용량에서의 약동학 (PK)/독성동태학 (TK) 파라미터를 X-vc0101 및 X(kK183C+K290C)-vc0101 둘 다에 대해 총 Ab 및 ADC의 농도 대 시간 프로파일로부터 계산하였다 (표 42).
24.4. 독성 연구
2개의 독립적 탐색적 독성 연구에서, 수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이에게 3주마다 1회 IV 투여하였다 (연구 제1일, 제22일 및 제43일). 연구 제46일 (제3 용량 투여로부터 3일 후)에 동물을 안락사시키고, 프로토콜 명시된 혈액 및 조직 샘플을 수집하였다. 임상 관찰, 임상 병리상태, 육안 및 현미경 병리상태 평가를 생존시 및 부검후 수행하였다. 해부 병리학 평가를 위해, 조직병리학 발견의 중증도를 주관적, 상대적, 연구 특이적 기준으로 기록하였다.
이들 연구 중 하나에서, 시노몰구스 원숭이 (2/성별/군)에게 6 mg/kg/용량의 비히클 또는 X-hIgG1-vc0101을 투여하였다. 다른 연구에서, 원숭이 (1/성별/군)에게 6, 9 및 12 mg/kg/용량의 비히클 또는 X(kK183C+K290C)-vc0101을 투여하였다. 6 mg/kg/용량의 X-hIgG1-vc0101이 투여된 1마리 수컷 및 1마리 암컷을, 중증 열성 호중구감소증을 시사하는 임상 징후 및 임상 병리상태 데이터 때문에 연구 제11일에 선택적으로 안락사시켰다. 대조적으로, 동일한 투여량 수준에서 유사한 노출이 관찰되었을 때 (이전 섹션 참조) X(kK183C+K290C)-vc0101이 투여된 모든 시노몰구스 원숭이는 연구 제46일에 스케줄링된 부검시까지 생존하였다. 6 mg/kg에서 골수 내 현미경검사에 의해, X-hIgG1-vc0101이 투여된 모든 시노몰구스 원숭이 (총 4마리)는 모든 세포 유형 (골수 및 적혈구)의 화합물-관련된 최소 내지 중간의 감소된 세포충실성을 가졌으며, 반면에 X(kK183C+K290C)-vc0101이 투여된 시노몰구스 원숭이 (총 2마리)의 골수에서는 어떤 현미경적 발견도 존재하지 않았다. 훨씬 더 높은 노출 수준이 관찰되었을 때인 9 및 12mg/kg의 더 높은 투여량에서, 주로 성숙 호중구의 증가된 수 및 적혈구 계통 세포의 감소된 수로부터 생성되는 골수/적혈구 (M/E) 비의 단지 최소 내지 경도 증가만이 9 mg/kg/용량의 X(kK183C+K290C)-vc0101이 투여된 시노몰구스 원숭이 (총 2마리)의 골수에서 발견되었지만, 12 mg/kg/용량의 X(kK183C+K290C)-vc0101이 투여된 원숭이 (총 2마리)에서는 발견되지 않았다.
표 43: 사멸률 및 골수에서의 현미경적 발견
Figure pct00088
따라서, 사멸률 및 현미경 데이터는 부위-특이적-돌연변이 기술에 기반한 ADC 접합체인 X(kK183C+K290C)-vc0101이 X-hIgG1-vc0101-유도된 골수 독성 및 호중구감소증을 분명히 개선시켰다는 것을 입증하였다.
실시예 25: 항체 1.1을 갖는 부위-특이적 ADC
25.1. 부위-특이적 접합을 위한 항체 1.1의 제조
반응성 시스테인 잔기를 통한 부위-특이적 접합을 위한 1.1 항체를 제조하는 방법을 PCT 공개 WO2013/093809에 기재된 바와 같이 일반적으로 수행하였다. 카파 경쇄 불변 영역 상의 1개의 잔기 (카바트 넘버링 스킴을 사용하는 K183) 및 IgG1 중쇄 불변 영역 상의 1개 (카바트의 EU 인덱스를 사용하는 K290)를 부위-지정 돌연변이유발에 의해 시스테인 (C) 잔기로 변경시켰다.
25.2. Her2-PT 조작된 시스테인 변이체 항체를 발현하는 안정하게 형질감염된 세포의 생산
접합 연구를 위한 1.1-κK183C-K290C를 생산하기 위해, CHO 세포를 1.1-κK183C-K290C를 코딩하는 DNA로 형질감염시키고, 안정한 고 생산 풀을 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 절차를 사용하여 단리하였다. 3-칼럼 과정, 즉 단백질-A 친화도 포획에 이어서 TMAE 칼럼 및 그 다음 CHA-TI 칼럼을 사용하여 농축된 CHO 풀 출발 물질로부터 1.1-κK183C-K290C를 단리하였다. 이들 정제 과정을 사용하여, 1.1-κK183C-K290C 제제는 분석 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정된 바와 같은 98.6% 관심 피크 (POI)를 함유하였다 (표 44). 표 44에 제시된 결과는 단백질 A 수지로부터의 1.1-κK183C+K290C의 용리 후 허용되는 수준의 고분자량 종 (HMMS)이 검출되었다는 것 및 이 바람직하지 않은 HMMS 종은 TMAE 및 CHA-TI 크로마토그래피를 사용하여 제거될 수 있다는 것을 입증한다. 데이터는 또한 인간 IgG1 불변 영역 내 단백질 A 결합 부위가 위치 290 (EU 인덱스 넘버링)에서의 조작된 시스테인 잔기의 존재로 인해 변경되지 않았다는 것을 입증하였다.
표 44: 1.1-κK183C-K290 항체의 생산 요약
Figure pct00089
25.3. 항체 1.1의 부위-특이적 접합
1.1-κK183C-K290C에 대한 말레이미드 관능화 링커-페이로드의 접합은 37℃에서 6시간 동안 100 mM HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 완충제), pH 7.0 및 1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 중 15배 몰 과량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP)로 항체를 완전 환원시키고 이어서 탈염시켜 과량의 TCEP를 제거함으로써 달성하였다. 환원된 1.1-κK183C-K290C 항체를 4℃에서 16시간 동안 1.5 mM 데히드로 아스코르브산 (DHA), 100 mM HEPES, pH 7.0 및 1mM DTPA 중에서 인큐베이션하여 쇄간 디술피드 결합을 재형성시켰다. 목적하는 링커-페이로드를 7의 링커-페이로드/항체 몰비로 반응 혼합물에 첨가하고, 15% v/v의 디메틸아세트아미드 (DMA)의 존재 하에 25℃에서 추가의 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 인큐베이션 기간 후에, 6배 과량의 L-Cys를 첨가하여 임의의 미반응 링커-페이로드를 켄칭하였다. 반응 혼합물을 부틸-세파로스 HP 칼럼 (지이 라이프사이언시스)을 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 통해 정제하였다. 방법은 결합을 위해 1M KPO4, 50mM 트리스 pH 7.0을 이용하였으며, ADC를 10 CV에 걸쳐 50mM 트리스, pH 7.0으로 용리시켰다. ADC를 순도에 대한 크기-배제 크로마토그래피 (SEC), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 및 약물-항체 비 (로딩 또는 DAR)를 계산하기 위한 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI MS) 또는 역상 크로마토그래피 (RP)를 통해 추가로 특징화하였다. ADC는 ADC의 HIC 체류 시간을 각 항체의 HIC 체류 시간으로 나눈 비인 상대 체류 시간 (RRT)을 계산함으로써 그의 각 항체와 비교될 수 있다. 단백질 농도를 UV 분광광도계를 통해 결정하였다. 표 45에 제시된 결과는 1.1-κK183C-K290C 조작된 시스테인 항체가 말레이미드 관능화 링커-페이로드 vc0101에 효율적으로 접합되어 예측된 및 바람직한 수의 페이로드 (즉, DAR 3.9)를 갖는 동종 ADC를 생산한다는 것을 제시한다.
표 45: 1.1-κK183C+K290C-vc0101 부위-특이적 접합체의 특성.
Figure pct00090
25.4. 1.1-kK183C-K290C 항체 및 1.1-kK183C-K290C-vc0101 ADC의 생분석 특징화
25.4.1 열적 안정성
시차 주사 열량측정법 (DCS)을 사용하여 1.1-kK183C-K290C 항체 및 상응하는 Aur-06380101 부위-특이적 접합체의 열적 안정성을 결정하였다. 이 분석을 위해, 20 mM 히스티딘 pH 5.8, 8.5% 수크로스, 0.05 mg/ml EDTA 중에 제제화된 샘플을 오토샘플러가 구비된 마이크로칼 VP-모세관 DSC (지이 헬스케어 바이오-사이언시스, 뉴저지주 피스카타웨이)의 샘플 트레이 내로 분배하고, 10℃에서 5분 동안 평형화시킨 다음, 시간당 100℃의 속도로 110℃까지 스캐닝했다. 16초의 여과 기간을 선택하였다. 미가공 데이터를 기준선 보정하고, 단백질 농도를 정규화하였다. 오리진 소프트웨어 7.0 (오리진랩 코포레이션, 매사추세츠주 노샘프턴)을 사용하여 데이터를 적절한 수의 전이를 수반하는 MN2-스테이트 모델에 피팅하였다.
1.1-kK183C-K290C 항체는 72.78℃에서 제1 용융 전이 (Tm1)를 갖는 탁월한 열적 안정성을 나타냈고, 생성된 1.1-kK183C-K290C-vc0101 부위-특이적 접합체 (SSC)는 제1 용융 전이 (Tm1) >65℃에 의해 결정된 바와 같이, 양호하면서도 본원에 기재된 T-kK183C-K290C-vc0101 및 EDB-(kK183C-K94R-K290C)-vc0101 SSC 둘 다와 필적하는 안정성을 나타냈다 (표 46). 종합하면, 이들 결과는 조작된 시스테인 1.1-(kK183C- K94R-K290C) 항체가 열적으로 안정하였다는 것 및 vc 링커를 통한 0101의 부위-특이적 접합이 양호한 열적 안정성을 갖는 접합체를 생성하였다는 것을 입증하였다.
표 46: 1.1-kK183C-K290C 항체 및 상응하는 부위-특이적 아우리스타틴 0101 접합체의 열적 안정성
Figure pct00091
25.4.2 1.1-kK183C-K290C 항체 및 상응하는 부위-특이적 아우리스타틴 0101 접합체의 완전성
비-환원 캘리퍼 모세관 겔 전기영동 (캘리퍼 랩칩 GXII: 퍼킨 엘머, 매사추세츠주 월섬) 분석을 수행하여 1.1-kK183C-K290C 항체 및 상응하는 vc0101 부위-특이적 접합체의 순도 및 완전성을 결정하였다. 결과는 시스테인 조작된 1.1-kK183C-K290C 항체가 >96%의 %IgG를 갖는 양호한 완전성 및 <8% 단편화 ADC를 함유하는 유사한 부위-특이적 접합체 제제를 나타냈다는 것을 제시한다. 1.1-kK183C-K290C-vc0101 부위-특이적 접합체의 완전성은, 대안적 방법 (즉, 크기-배제 크로마토그래피 대 소수성 상호작용 크로마토그래피)을 사용하여 정제하고 표 47에 제시된 바와 같은 통상적인 접합 방법론을 사용하여 제조된 ADC (즉, EDB-L19-vc-0101)에 비해 유의하게 개선된 EDB-(kK183C-K94R-K290C)-vc0101에 대해 관찰된 것보다 더 높았다. 이들 결과는 각각 IgG1 및 카파 불변 영역 내 조작된 시스테인 K290C 및 K183C를 통한 부위-특이적 접합이 항체 불변 영역 내 내인성 시스테인에 통상적인 접합 방법론을 사용하여 제조된 것과 비교하여 유의하게 개선된 완전성을 갖는 ADC를 생성한다는 것을 지지한다.
표 47: 1.1-kK183C-K290C 항체 및 부위-특이적 vc0101 접합체의 완전성
Figure pct00092
ND = 결정되지 않음
25.5. 1.1-kK183C-K290C-vc0101의 약동학 (PK)
부위-특이적으로 접합된 1.1-κK183C+K290C-vc0101 ADC의 노출을 시노몰구스 원숭이에게의 6 또는 12 mg/kg의 IV 볼루스 용량 투여 후에 결정하였다. 총 항체 (총 Ab; 접합된 Ab 및 미접합 Ab 둘 다의 측정) 및 ADC (적어도 1종의 약물 분자에 접합된 Ab)의 농도를 리간드 결합 검정 (LBA)을 사용하여 측정하였다.
총 Ab 및 1.1-κK183C+K290C-vc0101 부위-특이적 ADC의 농도 대 시간 프로파일 및 약동학/독성동태학은 표 48에 제시된다. 1.1-κK183C+K290C-vc0101 ADC의 노출은 대략 용량 의존성 방식으로 증가하였다. 추가적으로 κK183C+K290C-vc0101 ADC의 노출은, 통상적으로 접합된 ADC와 비교하였을 때 증가된 노출 및 안정성 둘 다를 갖는 본원에 기재된 트라스투주맙 부위-특이적 접합체 T(kK183C+K290C)와 유사하면서도 필적하였다 (표 44).
표 48: 약동학
Figure pct00093
표 49. 잔기 넘버링 차트
Figure pct00094
Figure pct00095
표 50: 핵산 서열
Figure pct00096
Figure pct00097
상기 개별 섹션에서 언급된 본 발명의 다양한 특색 및 실시양태는 적절한 경우에 필요한 변경을 가하여 다른 섹션에 적용한다. 결과적으로, 한 섹션에 명시된 특색은 다른 섹션에 명시된 특색과 적절하게 조합될 수 있다. 특허, 특허 출원, 논문, 교재 및 인용된 서열 수탁 번호를 포함한 본원에 인용된 모든 참고문헌, 및 그에 인용된 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 정의된 용어, 용어 용법, 기재된 기술 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 포함된 문헌 및 유사한 자료 중 하나 이상이 본 출원과 상이하거나 모순되는 경우에, 본 출원이 우선한다.
SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc. <120> ANTIBODIES AND ANTIBODY FRAGMENTS FOR SITE-SPECIFIC CONJUGATION <130> PC72296A <150> 62/260,854 <151> 2015-11-30 <150> 62/289,744 <151> 2016-02-01 <150> 62/409,323 <151> 2016-10-17 <160> 84 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 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Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 6 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Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Cys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 78 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 78 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Cys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 79 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 79 gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacatgcc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc cccgggt 987 <210> 80 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 80 cggaccgtgg ccgctccctc cgtgttcatc ttcccaccct ccgacgagca gctgaagtcc 60 ggcaccgcct ccgtcgtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag 120 tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aactcccagg aatccgtcac cgagcaggac 180 tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc accctgaccc tgtcctgcgc cgactacgag 240 aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag 300 tccttcaacc ggggcgagtg c 321 <210> 81 <211> 1335 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 81 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agtttttcga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatct attagtggta gttcgggtac cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaagac acggccgtat attactgtgc gaaaccgttt 300 ccgtattttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcgagtgc gtcgaccaag 360 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 720 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc ataatgccaa gacatgcccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320 tccctgtctc cgggt 1335 <210> 82 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 82 gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacatgcc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 987 <210> 83 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 83 gaaattgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctttt tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat tatgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagacgggtc gtattccgcc gacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagct gcgcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 84 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 84 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagctgcgc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321

Claims (22)

  1. 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 위치 290에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 불변 도메인이 IgG 중쇄 CH2 도메인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  3. 항체 중쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 61과 정렬되는 경우에 서열식별번호: 61의 잔기 60에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, 치환된 시스테인 잔기가 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른, IgG CH2 도메인의 위치 290에 위치하는 것인 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 118, 246, 249, 265, S267, 270, 276, 278, 283, 292, 293, 294, 300, 302, 303, 314, 315, 318, 320, 332, 333, 334, 336, 345, 347, 354, 355, 358, 360, 362, 370, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 390, 392, 393, 401, 404, 411, 413, 414, 416, 418, 419, 421, 428, 431, 432, 437, 438, 439, 443, 444 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 118, 334, 347, 373, 375, 380, 388, 392, 421, 443 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 조작된 시스테인 잔기를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불변 도메인이 카바트의 EU 인덱스의 넘버링에 따른 위치 334에 조작된 시스테인 잔기를 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. (a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 및
    (b) (i) 카바트의 넘버링에 따른 위치 183에 조작된 시스테인 잔기; 또는 (ii) 항체 경쇄 불변 도메인이 서열식별번호: 63과 정렬되는 경우에 서열식별번호: 63의 잔기 76에 대응하는 위치에 조작된 시스테인 잔기를 포함하는 항체 경쇄 불변 영역
    을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역이 카파 경쇄 불변 도메인 (CLκ)을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. 제9항에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역이 람다 경쇄 불변 도메인 (CLλ)을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 폴리펩티드 또는 항체는 상기 조작된 시스테인 부위를 통해 치료제에 접합되는 것인 화합물.
  13. 제12항에 있어서, 치료제가 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비-천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 치료제가 링커를 통해 폴리펩티드 또는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 접합되는 것인 화합물.
  15. 제14항에 있어서, 링커가 절단가능한 것인 화합물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 링커가 vc, mc, MalPeg6, m(H20)c, m(H20)cvc 또는 그의 조합을 포함하는 것인 화합물.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 vc인 화합물.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 아우리스타틴 또는 튜부리신인 화합물.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 아우리스타틴인 화합물.
  20. 제19항에 있어서, 아우리스타틴이 0101, 8261, 6121, 8254, 6780, 0131, MMAD, MMAE 및 MMAF로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항의 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  22. 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제21항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환을 치료하는 방법.
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