CN109055468B - 桑蚕蛹抗癌活性肽bpp-1及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桑蚕蛹抗癌活性肽BPP‑1及其制备方法与应用。将鲜茧缫丝后的桑蚕蛹处理获得桑蚕蛹粉，取桑蚕蛹粉脱脂后，先后在碱性和酸性条件下处理，再透析袋透析，获得桑蚕蛹蛋白。取桑蚕蛹蛋白用alcalase碱性蛋白酶酶解，酶解液进行超滤分离，取分子质量5‑10kDa超滤液，过滤膜后上Sephadex G‑50凝胶，用超纯水进行洗脱，收集第1个洗脱峰对应的洗脱液，冷冻真空干燥后得到所述产物BPP‑1。本发明制备产物纯度均一，对人胃癌细胞SGC‑7901的生长具有抑制作用，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长均无不良影响，可用于抗癌产品开发。
Description
技术领域
本发明涉及活性肽制备领域，尤其是涉及了一种桑蚕蛹抗癌活性肽BPP-1及其制备方法与应用。
背景技术
活性肽是具有生物活性的多肽，对促进机体的生长发育与新陈代谢以及抗病、提高免疫功能等起着十分重要的作用，并且易消化吸收与毒副作用小。从天然蛋白质中提取具有营养或治疗功能的活性肽，并将其应用到保健食品、医疗药品等领域中，是当前深受国内外研究者高度关注的研究课题。
桑蚕蛹是桑蚕(Bombyx mori)的蛹，在我国已有1400多年的食用与药用历史，是被卫生部列入“作为普通食品管理的食品资源名单”中的唯一昆虫类食品。桑蚕蛹富含蛋白质，其蛋白质含量占到蚕蛹干重的45-50％，并且多为优质蛋白。我国是世界上最大的蚕丝生产国，年产鲜茧约65万吨，缫丝后可产蚕蛹约30万吨，桑蚕蛹资源非常丰富。但当前极大部分桑蚕蛹直接作为畜禽饲料和营养添加剂，有些还被当作肥料或直接废弃，造成资源浪费。分离制备桑蚕蛹抗癌活性肽，对于推进桑蚕蛹药用开发以及桑蚕蛹资源高值化利用等具有积极的现实意义。
发明内容
为了解决背景技术中的问题，本发明提供了一种桑蚕蛹抗癌活性肽BPP-1及其制备方法与应用，采用蛋白酶酶解、超滤分离、Sephadex G-50凝胶纯化的方法，制备得到了桑蚕蛹抗癌活性肽BPP-1，桑蚕蛹抗癌活性肽BPP-1是发明人从桑蚕蛹中分离提取的一种新型活性肽并将其命名为BPP-1。
本发明采用的技术方案如下：
一、一种桑蚕蛹抗癌活性肽BPP-1的制备方法
1)将鲜茧缫丝后的桑蚕蛹处理获得桑蚕蛹粉；
2)桑蚕蛹粉脱脂后依次在碱性和酸性条件下处理获得桑蚕蛹蛋白；
3)桑蚕蛹蛋白用alcalase碱性蛋白酶进行酶解，离心处理后收集上清液，上清液冷冻干燥后再溶解于超纯水中得到桑蚕蛹蛋白酶解液；
4)桑蚕蛹蛋白酶解液进行超滤分离，收集分子质量5-10kDa超滤液；
5)超滤液过滤膜后上Sephadex G-50凝胶柱进行分离洗脱，收集第1个洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥后得到均一的桑蚕蛹活性肽组分BPP-1。
所述的制备方法具体工艺条件如下：
步骤1)：鲜茧缫丝后的桑蚕蛹于-50℃下真空干燥36h，于-15℃下超微粉碎5min，得到桑蚕蛹粉；
步骤2)：取桑蚕蛹粉加入石油醚溶液中，在25℃下重复浸泡脱脂3次，每次脱脂时间为24h，抽滤，滤渣于40℃烘干并过80-100目筛得到滤渣粉，将滤渣粉加入超纯水后进行磁力搅拌充分溶解，用1M NaOH调pH至9.5，搅拌1h，在5000rpm的转速下离心10min后收集上清液，然后用1M HCl调节上清液pH至4，静置30min后在5000rpm的转速下离心10min，收集沉淀，沉淀用超纯水溶解后，用14000Da透析袋透析48h，获得桑蚕蛹蛋白；
步骤3)：桑蚕蛹蛋白用alcalase碱性蛋白酶进行酶解，酶解结束后，迅速置于沸水15min终止酶解反应，冷却至室温，在5000rpm的转速下离心10min后收集上清液，上清液在-50℃下真空干燥后溶解于超纯水中，得到质量体积百分比为0.6％(g/mL)的桑蚕蛹蛋白酶解液；
步骤4)：采用截留分子质量为10kDa的超滤膜对桑蚕蛹蛋白酶解液进行超滤，取透过液，再用截留分子质量为5kDa的超滤膜对透过液进行超滤，取截留液，即得到分子质量5-10kDa的组分，在-50℃下真空干燥后充分溶解于超纯水中配置成质量浓度为3mg/mL的溶液，12000rpm离心10min，取上清超滤液；
步骤5)：将步骤4)所得上清超滤液过0.22μm滤膜，上Sephadex G-50凝胶柱，上样量为1mL，用超纯水进行洗脱，洗脱流速为0.5-0.7mL/min，用自动收集器收集，利用分光光度计在280nm下检测每管吸光度值，绘制洗脱曲线，收集第1个洗脱峰的洗脱液，-50℃下真空冷冻干燥，得到均一的桑蚕蛹活性肽组分，取名为BPP-1。
所述步骤2)中桑蚕蛹粉与石油醚溶液的质量体积比(W：V)为1:3，滤渣粉与超纯水的质量体积比(W：V)为1:10。
所述步骤3)的酶解条件为：桑蚕蛹蛋白的质量浓度为10mg/mL、酶解时间为160～180min、酶解温度为60℃、酶解pH为9.0、加酶量为3500U/g桑蚕蛹蛋白质量。
所述步骤4)的超滤条件为：3L桑蚕蛹蛋白酶解液、1.30MPa进膜压力、0.30MPa出膜压力以及25℃工作温度。
二、一种桑蚕蛹抗癌活性肽BPP-1的应用
所述桑蚕蛹抗癌活性肽BPP-1用于制备抗癌药物。
所述抗癌药物用于抗击人胃癌细胞SGC-7901。
本发明的有益效果是：
本发明分离纯化制备的桑蚕蛹抗癌活性肽BPP-1，纯度均一，对人胃癌细胞SGC-7901的生长表现出明显的抑制作用，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长均无不良影响，可用于抗癌产品的开发，这对于提升桑蚕蛹药用价值，具有积极的社会效益和经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施之前，先将鲜茧缫丝后的桑蚕蛹于-50℃下真空干燥36h，于-15℃下超微粉碎5min，得到桑蚕蛹粉；取桑蚕蛹粉，按1：3质量体积比(W：V)加入石油醚溶液，混匀后，在25℃下回流脱脂3次，每次24h，用抽滤机进行抽滤处理，取滤渣于40℃烘干。烘干滤渣用于以下各个实施例。
本发明实施例采用MTT法检测BPP-1对人胃癌细胞SGC-7901的生长情况，采用Lowry法测蛋白质含量，用于验证本发明制备产物在具体实施中的技术效果。
实施例1：
取烘干滤渣过80目筛，滤渣粉按1:10质量体积比(W：V)加入超纯水，磁力搅拌充分溶解后，用1M NaOH调pH＝9.5，搅拌1h后5000rpm离心10min，收集上清液，上清液用1M HCl调节pH＝4，静置30min后5000rpm离心10min，收集沉淀，沉淀用少量超纯水溶解后，用14000Da透析袋透析48h，得到桑蚕蛹蛋白液。
用Lowry法测定桑蚕蛹蛋白液的蛋白浓度并用超纯水和1M NaOH调质量浓度为10mg/mL和pH＝9.0，加alcalase碱性蛋白酶量为3500U/g桑蚕蛹蛋白质量，于60℃下酶解180min，酶解结束后，迅速置于沸水中15min终止酶解反应，冷却至室温，5000rpm离心10min，取上清液在-50℃下真空干燥，再溶解于超纯水中，得到质量体积百分比为0.6％(g/mL)的桑蚕蛹蛋白酶解液。
在进膜压力1.30MPa、出膜压力0.30MPa、工作温度25℃的工作条件下，先用截留分子质量为10kDa的超滤膜对0.6％桑蚕蛹蛋白酶解液进行超滤，取透过液，再用截留分子质量为5kDa的超滤膜进行超滤，取截留液，得到分子质量5-10kDa组分，-50℃下真空干燥，再按质量浓度为3mg/mL充分溶解于超纯水中，12000rpm离心10min，取上清超滤液；
上清超滤液过0.22μm滤膜，上Sephadex G-50凝胶柱，用超纯水于0.6mL/min流速洗脱，自动收集器收集，用分光光度法检测，收集具有蛋白质的第1个洗脱峰的洗脱液，-50℃下真空冷冻干燥，得到桑蚕蛹活性肽BPP-1。
实施结果：BPP-1纯度均一(蛋白质含量99.38％)，在浓度1.28mg/mL时，对人胃癌细胞SGC-7901的抑制率为92.52％，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长无不良影响。
实施例2：
取烘干滤渣，过90目筛，滤渣粉按1:10质量体积比(W：V)加入超纯水，磁力搅拌充分溶解后，用1M NaOH调pH＝9.5，搅拌1h后5000rpm离心10min，收集上清液，上清液用1MHCl调节pH＝4，静置30min后5000rpm离心10min，收集沉淀，沉淀用少量超纯水溶解后，用14000Da透析袋透析48h，得到桑蚕蛹蛋白液。
用Lowry法测定桑蚕蛹蛋白液的蛋白浓度并用超纯水和1M NaOH调质量浓度为10mg/mL和pH＝9.0，加alcalase碱性蛋白酶量为3500U/g桑蚕蛹蛋白质量，于60℃下酶解160min，酶解结束后，迅速置于沸水中15min终止酶解反应，冷却至室温，5000rpm离心10min，取上清液在-50℃下真空干燥，再溶解于超纯水中，得到质量百分比为0.6％(g/mL)的桑蚕蛹蛋白酶解液。
在进膜压力1.30MPa、出膜压力0.30MPa、工作温度25℃的工作条件下，先用截留分子质量为10kDa的超滤膜对0.6％桑蚕蛹蛋白酶解液进行超滤，取透过液，再用截留分子质量为5kDa的超滤膜进行超滤，取截留液，得到分子质量5-10kDa组分，-50℃下真空干燥，再按质量浓度为3mg/mL充分溶解于超纯水中，12000rpm离心10min，取上清超滤液；
上清超滤液过0.22μm滤膜，上Sephadex G-50凝胶柱，用超纯水于0.5mL/min流速洗脱，自动收集器收集，用分光光度法检测，收集具有蛋白质的第1个洗脱峰的洗脱液，-50℃下真空冷冻干燥，得到桑蚕蛹活性肽BPP-1。
实施结果：BPP-1纯度均一(蛋白质含量99.30％)，在浓度1.28mg/mL时，对人胃癌细胞SGC-7901的抑制率为91.18％，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长无不良影响。
实施例3：
取烘干滤渣，过100目筛，滤渣粉按1:10质量体积比(W：V)加入超纯水，磁力搅拌充分溶解后，用1M NaOH调pH＝9.5，搅拌1h后5000rpm离心10min，收集上清液，上清液用1MHCl调节pH＝4，静置30min后5000rpm离心10min，收集沉淀，沉淀用少量超纯水溶解后，用14000Da透析袋透析48h，得到桑蚕蛹蛋白液。
用Lowry法测定桑蚕蛹蛋白液的蛋白浓度并用超纯水和1M NaOH调质量浓度为10mg/mL和pH＝9.0，加alcalase碱性蛋白酶量为3500U/g桑蚕蛹蛋白质量，于60℃下酶解170min，酶解结束后，迅速置于沸水中15min终止酶解反应，冷却至室温，5000rpm离心10min，取上清液在-50℃下真空干燥，再溶解于超纯水中，得到质量百分比为0.6％(g/mL)的桑蚕蛹蛋白酶解液。
在进膜压力1.30MPa、出膜压力0.30MPa、工作温度25℃的工作条件下，先用截留分子质量为10kDa的超滤膜对0.6％桑蚕蛹蛋白酶解液进行超滤，取透过液，再用截留分子质量为5kDa的超滤膜进行超滤，取截留液，得到分子质量5-10kDa组分，-50℃下真空干燥，再按质量浓度为3mg/mL充分溶解于超纯水中，12000rpm离心10min，取上清超滤液；
超滤液过0.22μm滤膜，上Sephadex G-50凝胶柱，用超纯水于0.7mL/min流速洗脱，自动收集器收集，用分光光度法检测，收集具有蛋白质的第1个洗脱峰的洗脱液，-50℃下真空冷冻干燥，得到桑蚕蛹活性肽BPP-1。
实施结果：BPP-1纯度均一(蛋白质含量99.41％)，在浓度1.28mg/mL时，对人胃癌细胞SGC-7901的抑制率为92.28％，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长无不良影响。
按照本发明方法进行了不限于上述实施例的多次实施，所有实验获得平均数据：多次制备得到的桑蚕蛹活性肽组分BPP-1，采用Lowry法测得蛋白质含量为99.33％。采用MTT法检测BPP-1对人胃癌细胞SGC-7901的生长表现出明显的抑制作用，在浓度1.28mg/mL时的抑制率91.36％(如表1所示)，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长均无不良影响，在浓度1.28mg/mL时，相对于对照组细胞活力分别为104.71％和103.67％(如表2所示)。
表1不同浓度BPP-1对人胃癌细胞SGC-7901生长的抑制率
表2正常细胞在不同浓度的BPP-1下相对于对照组的细胞活力
由此可见，本发明分离纯化制备的桑蚕蛹抗癌活性肽BPP-1，纯度均一，对人胃癌细胞SGC-7901的生长表现出明显的抑制作用，对正常细胞人胚胎肾细胞HEK293和小鼠巨噬细胞RAW264.7生长均无不良影响，具有突出显著的技术效果。
Claims (4)
1.一种桑蚕蛹抗癌活性肽BPP-1组分的制备方法，其特征在于：
1)将鲜茧缫丝后的桑蚕蛹处理获得桑蚕蛹粉；
2)桑蚕蛹粉脱脂后依次在碱性和酸性条件下处理获得桑蚕蛹蛋白；
3)桑蚕蛹蛋白用alcalase碱性蛋白酶进行酶解，离心处理后收集上清液，上清液冷冻干燥后再溶解于超纯水中得到桑蚕蛹蛋白酶解液；
4)桑蚕蛹蛋白酶解液进行超滤分离，收集分子质量5-10kDa超滤液；
5)超滤液过滤膜后上Sephadex G-50凝胶柱进行分离洗脱，收集第1个洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥后得到均一的桑蚕蛹活性肽组分BPP-1；
所述制备方法的具体工艺条件如下：
步骤1)：鲜茧缫丝后的桑蚕蛹于-50℃下真空干燥36h，于-15℃下超微粉碎5min，得到桑蚕蛹粉；
步骤2)：取桑蚕蛹粉加入石油醚溶液中，在25℃下重复浸泡脱脂3次，每次脱脂时间为24h，抽滤，滤渣于40℃烘干并过80-100目筛得到滤渣粉，将滤渣粉加入超纯水后进行磁力搅拌充分溶解，用1M NaOH调pH至9.5，搅拌1h，在5000rpm的转速下离心10min后收集上清液，然后用1M HCl调节上清液pH至4，静置30min后在5000rpm的转速下离心10min，收集沉淀，沉淀用超纯水溶解后，用14000Da透析袋透析48h，获得桑蚕蛹蛋白；
所述步骤2)中桑蚕蛹粉与石油醚溶液的质量体积比为1:3，滤渣粉与超纯水的质量体积比为1:10；
步骤3)：桑蚕蛹蛋白用alcalase碱性蛋白酶进行酶解，酶解结束后，迅速置于沸水15min终止酶解反应，冷却至室温，在5000rpm的转速下离心10min后收集上清液，上清液在-50℃下真空干燥后溶解于超纯水中，得到质量体积百分比为0.6％的桑蚕蛹蛋白酶解液；
所述步骤3)的酶解条件为：桑蚕蛹蛋白的质量浓度为10mg/mL、酶解时间为160～180min、酶解温度为60℃、酶解pH为9.0、加酶量为3500U/g桑蚕蛹蛋白质量；
步骤4)：采用截留分子质量为10kDa的超滤膜对桑蚕蛹蛋白酶解液进行超滤，取透过液，再用截留分子质量为5kDa的超滤膜对透过液进行超滤，取截留液，即得到分子质量5-10kDa的组分，在-50℃下真空干燥后充分溶解于超纯水中配置成质量浓度为3mg/mL的溶液，12000rpm离心10min，取上清超滤液；
步骤5)：将步骤4)所得上清超滤液过0.22μm滤膜，上Sephadex G-50凝胶柱，上样量为1mL，用超纯水进行洗脱，洗脱流速为0.5-0.7mL/min，用自动收集器收集，利用分光光度计在280nm下检测每管吸光度值，绘制洗脱曲线，收集第1个洗脱峰的洗脱液，-50℃下真空冷冻干燥，得到均一的桑蚕蛹活性肽组分，取名为BPP-1。
2.根据权利要求1所述的桑蚕蛹抗癌活性肽BPP-1组分的制备方法，其特征在于，所述步骤4)的超滤条件为：3L桑蚕蛹蛋白酶解液、1.30MPa进膜压力、0.30MPa出膜压力以及25℃工作温度。
3.根据权利要求1-2任一项制备方法得到的桑蚕蛹抗癌活性肽BPP-1组分的应用，其特征在于：所述桑蚕蛹抗癌活性肽BPP-1用于制备抗胃癌药物。
4.根据权利要求3所述的桑蚕蛹抗癌活性肽BPP-1组分的应用，其特征在于：所述抗胃癌药物用于抗击人胃癌细胞SGC-7901。
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