CN109053919B - 一种降解银耳多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种采用电Fenton法降解银耳多糖的方法，将浓度为200mg/mL的银耳多糖多糖溶液通入设有阴、阳极的电解槽中，调节溶液为酸性，按照20.8L空气/L多糖溶液的量向阴极通入氧气，向阴极通入氧气，通入直流电并控制阴极电流密度为12mA/cm2，降解，收集电解液，即得。该方法对含银耳多糖具有良好的选择性，且工艺操作简单，省时高效，反应条件温和，对环境污染小，有利于扩大规模生产；重要的是，与酸法降解和过氧化氢降解法相比，电Fenton法对多糖的降解率高，且得到的低分子量多糖分子量范围更窄。

Description

一种降解银耳多糖的方法
本申请是申请日为2016年7月19日，申请号为201610571395.X，发明名称为“一种降解含α-1,3-糖苷键的大分子量多糖的方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及医药原料生产领域，具体涉及一种降解含α-1,3-糖苷键的大分子量多糖的方法。
背景技术
多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质，活性多糖是指某种具有特殊生理活性的多糖化合物，具有调节人体生理节奏的功能。多糖中的单糖以糖苷键连接，糖苷键包括β-1,4-糖苷键，α-1,3-糖苷键，β-1,3-糖苷键等。
研究表明，多糖的生物活性与其分子量密切相关，分子量越大，分子体积越大，且溶解性差，随着分子量的增大，多糖溶液的粘度增高，不利于多糖跨越多重细胞膜障碍进入生物体内发挥生物学活性。因此，对大分子量多糖进行降解获得低分子量多糖，使其更好的发挥生物学活性，具有重要的价值。
现有技术报道的多糖降解方法有物理降解法、化学降解法和酶降解法。物理降解法如超声波法，可以把大分子量的多糖降解，但此法对设备要求较高，无法达到工业化生产。酶降解法是用专一性的糖苷酶断开多糖分子中的一个糖苷键来达到降解多糖的目的，或用非专一性的其他酶对多糖进行降解。酶降解法反应条件温和，无需加入其他反应试剂，且没有副产物生成，但目前没有成熟的酶，能够用于工业化降解；化学降解法主要包括酸降解法和过氧化氢降解法。酸降解法是利用酸性条件下多糖分子的糖苷键水解而造成糖链断裂的方法，一般采用盐酸，硫酸水解，此外，也有用三氟乙酸，乙酸，氢氟酸等水解多糖，是较为经典的降解多糖的方法。但是，酸降解法糖苷键断裂是随机的，产物分子量分布范围较广，对产物的结构和活性具有破坏性。过氧化氢降解法需要使用过氧化氢，过氧化氢在贮存和运输过程中存在着潜在的危险、且降解率低，不适宜工业化扩大生产。
因此，针对特定的单糖连接方式，如α-1,3-糖苷键，提出一种较通用的多糖降解方法很有意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提供一种降解含α-1,3-糖苷键的大分子量多糖的方法，该方法能够很好的克服现有技术存在的缺陷，具有易于工业化，降解率高，降解得到的产物分子量范围分布窄的优势。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种降解含α-1,3-糖苷键的大分子量多糖的方法，采用电Fenton法降解，所述电Fenton法的操作为：
将浓度为60-200mg/mL的含α-1,3-糖苷键的大分子量多糖溶液通入设有阴、阳极的电解槽中，调节溶液为酸性，按照4.0-7.0L氧气/L多糖溶液的量向阴极通入氧气，向阴极通入氧气，通入直流电并控制阴极电流密度为10-12mA/cm2，在此条件下，进行降解，收集电解液，即得。
优选地，所述α-1,3-糖苷键的大分子量多糖溶液通过如下方法配制而成：用相当于所述α-1,3-糖苷键的大分子量多糖0.8-2.0倍重量的乙醇分散多糖，然后加入水使多糖相对于水的浓度为60-200mg/mL，即得。
本发明先将多糖分散在乙醇中，可以形成均匀的多糖悬浊液，然后再加入水，此种情况下，多糖能够均匀分散在水中，解决了由于多糖分子量大、粘度大造成的溶解度低的问题，极大促进了后续电解的进行。
采用本发明的电Fenton法条件对60-200mg/mL浓度范围内的多糖溶液具有良好的降解效果，浓度高于该范围时，降解率较低，且所得低分子量多糖的平均分子量较该浓度范围降解得到的产品平均分子量大；浓度低于该范围时，虽然能够得到低分子量多糖，但降解效率较低，企业能耗较大，成本较高。
发明人进一步研究发现，pH值对含α-1,3-糖苷键的多糖的降解有重要影响，pH值偏高或偏低时，多糖降解率低。当pH为2-4时，降解率较高；当pH为2.5-3.5，尤其为3时，降解效率最高，因此，本发明优选的pH值为2-4，进一步优选为2.5-3.5，最优选为3。
在生产过程中，可以采用曝气装置向电解槽中鼓入氧气。优选地，采用含有至少一个通气孔的曝气装置向所述阴极通入氧气，通气孔的数量依据电解的规模而定，即当电解的多糖溶液量大时，可采用多个通气孔同时鼓入氧气的方式，电解的多糖溶液少时，可采用较少通气孔同时鼓入氧气的方式。多个通气孔同时鼓气有助于氧气均匀分布在阴极极片周围均匀产生HO·。进一步优选地，每个通气孔中氧气的通入速度为0.2-1.0L/min(优选0.6-0.8L/min，最优选0.7L/min)。
本领域技术人员可以理解，用空气替代氧气同样可以实现上述目的，在具体应用时，可采用增大空气通入量的手段达到与通入纯氧气量相同的目的。
优选地，在电解时，可在所述多糖溶液中加入电解质，加入电解质可增加溶液的导电性，有助于电解的顺利进行。针对于本发明60-200mg/mL酸性含α-1,3-糖苷键的多糖溶液，优选采用硫酸钠或氯化钠作为电解质，且当电解质的浓度为0.01-0.3mol/L(优选0.02-0.1mol/L)时，电解效果最佳。
优选地，所述阳极材质为铁，所述阴极材质为石墨。阴极材质进一步优选为多孔石墨。
优选地，上述电Fenton操作在搅拌条件下进行，搅拌状态有助于多糖分子更充分的与HO·接触，促进降解。搅拌速度优选为100-600rpm。
本发明较佳的电Fenton操作包括如下步骤：
(1)配制多糖溶液：先用相当于所述α-1,3-糖苷键的大分子量多糖0.8-2.0倍重量的乙醇分散多糖，然后加入水使多糖相对于水的浓度为60-200mg/mL，调节pH值为2-4，即得；
(2)电解：以铁为阳极，石墨为阴极，将配制好的多糖溶液加入电解槽中，加入硫酸钠或氯化钠，并调节其浓度为0.02-0.1mol/L；按照4.0-7.0L氧气/L多糖溶液的量向阴极通入氧气，并控制阴极电流密度为10-12mA/cm2，搅拌状态下，进行电解，收集电解液，即得。
本发明所述的方法适用于降解任何含有α-1,3-糖苷键的大分子量多糖，尤其对银耳多糖有极佳的降解效果。银耳多糖是从银耳子实体中得到的一种酸性杂多糖，其主链结构是由α-1，3-糖苷键连接的甘露聚糖，支链由葡糖醛酸和木糖组成。现有研究表明，银耳多糖有改善机体免疫功能及提升白细胞的作用；有抗氧化作用，可清除自由基对机体的破坏，防老抗衰；银耳多糖在治疗高血脂，高胆固醇症方面也有很好的效果；能明显延长血栓的形成时间，降低血小板粘附率和血液粘度，有防治心血管疾病的作用。因此，得到分子量分布更窄的低分子量银耳多糖，对于疾病的预防和治疗具有极大的意义。
本发明所述的多糖可采用普通市售产品，或者，可按照现有技术公开的手段提取得到。一般而言，本发明所述的电Fenton法条件对多糖的分子量没有特殊限制，对普通市售产品或按照现有技术公开手段提取得到的产品具有的分子量均具有良好的降解效果。特别地，本发明所述的电Fenton法条件对分子量为400-560KDa的多糖具有良好的降解效果，具有降解率高，降解得到的低分子量多糖的分子量分布窄，药理活性好的特点。更特别地，本发明所述的方法对分子量为400-560KDa的银耳多糖有极佳的降解效果。
发明人经过大量研究发现，针对不同的多糖类型，通过对反应条件的进一步优化，能够取得最佳的降解效果。例如，对于银耳多糖而言，电解时，控制多糖溶液浓度为180-200mg/mL，通入氧气的量为：4.0-7.0L/L多糖溶液，阴极电流密度为10-12mA/cm2，能够得到最佳的电解效果。
本发明所述的方法还包括从电解液中提取低分子量多糖的步骤，所述“提取”可采用本领域常规技术手段，本发明优选采用超滤膜过滤法进行提取，进一步优选采用截留分子量10KDa-50KDa的超滤膜超滤所述电解液。超滤过后，收集浓缩液，经冷冻干燥，即得。
优选地，为了降低损耗，在超滤提取前，首先调节电解液为中性。
本发明针对含α-1,3-糖苷键的多糖，通过对其降解方法的摸索，确定了最佳的降解方法，该方法工艺操作简单，省时高效，有利于扩大规模生产；且反应条件温和，对环境污染小；重要的是，与酸法降解和过氧化氢降解法相比，电Fenton法对多糖的降解率可达30-32％，降解分子量相当的多糖的情况下，得到的低分子量多糖的分子量范围更窄，生理活性更好。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实施例。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。涉及到的原料或试剂均为已知物质，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
实施例1
一种采用电Fenton法降解银耳多糖的方法：称取3000g银耳多糖(分子量560KDa)，分散到3.0Kg无水乙醇中，加入到15L蒸馏水中，制成浓度为200mg/ml的糖溶液，装入体积为24L的电解槽中，称取149.1g硫酸钠溶解于多糖溶液中，用1mol/L盐酸调pH至3，以30cm×30cm铁丝网为阳极，30cm×30cm多孔石墨为阴极，两极间距离为5cm，通入12V直流电，电流密度为12mA/cm2，并用曝气装置以1.74L/min的速度通入净化空气(或以0.58L/min的速度通入氧气，曝气装置含三个通气孔，三个通气孔同时鼓入氧气)，每升银耳多糖溶液通入空气的量约为20.8L(每升银耳多糖溶液通入空气的量约为6.96L)，搅拌器以250rpm的速度搅拌，室温条件下电解60min后，停止通电通气，将电解液用1M的氢氧化钠溶液中和至中性后用截留分子量30KDa-50KDa的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，得银耳多糖973.5g，用凝胶排阻色谱法测定平均分子量为33.6KDa，降解率为32.45％。
实施例2
一种采用电Fenton法降解银耳多糖的方法：称取900g银耳多糖(分子量400KDa)，分散到3.0Kg无水乙醇中，加入到15L蒸馏水中，制成浓度为60mg/ml的糖溶液，装入体积为24L的电解槽中，称取106.5g硫酸钠溶解于多糖溶液中，用1mol/L盐酸调pH至3，以30cm×30cm铁丝网为阳极，30cm×30cm多孔石墨为阴极，两极间距离为8cm，通入10V直流电，电流密度为10mA/cm2，并以0.6L/min的速度通入氧气(曝气装置含两个通气孔，两个通气孔同时鼓入氧气)，每升银耳多糖溶液通入空气的量约为4.0L，搅拌器以250rpm的速度搅拌，室温条件下电解50min后，停止通电通气，将电解液用1M的氢氧化钠溶液中和至中性后用截留分子量10KDa-30KDa的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，得银耳多糖278.28g，用凝胶排阻色谱法测定平均分子量为14.7KDa，降解率为30.92％。
对比例1酸法降解银耳多糖
称取银耳多糖225g(分子量560KDa)，分散到225g无水乙醇中，加入到15L蒸馏水中，制成浓度为15mg/ml的糖溶液，用1mol/L的盐酸调节溶液pH至2，室温条件下搅拌水解3.5h，溶液粘度显著降低后，用截留分子量10KDa-50KDa的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，用凝胶排阻色谱法测定平均分子量。
对比例2过氧化氢法降解银耳多糖
称取银耳多糖225g(分子量560KDa)，分散到300g无水乙醇中，加入到15L蒸馏水中，制成浓度为20mg/ml的糖溶液，加入66.05g抗坏血酸，过氧化氢45.15ml(密度为1.13g/ml)，硫酸亚铁104.26g，室温条件下搅拌反应2h，用截留分子量10KDa-50KDa的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，用凝胶排阻色谱法测定平均分子量。
对比例3
一种采用电Fenton法降解银耳多糖的方法：称取300g银耳多糖(分子量560KDa)，分散到3.0Kg无水乙醇中，加入到15L蒸馏水中，制成浓度为20mg/ml的糖溶液，装入体积为24L的电解槽中，称取149.1g硫酸钠溶解于多糖溶液中，用1mol/L盐酸调pH至3，以30cm×30cm铁丝网为阳极，30cm×30cm多孔石墨为阴极，两极间距离为5cm，通入12V直流电，电流密度为12mA/cm2，并用曝气装置以1.74L/min的速度通入净化空气(或以0.58L/min的速度通入氧气，曝气装置含三个通气孔，三个通气孔同时鼓入氧气)，每升银耳多糖溶液通入空气的量约为20.8L(每升银耳多糖溶液通入空气的量约为6.96L)，搅拌器以250rpm的速度搅拌，室温条件下电解60min后，停止通电通气，将电解液用1M的氢氧化钠溶液中和至中性后用截留分子量5000Da的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，银耳多糖15.03g，用凝胶排阻色谱法测定平均分子量为6.4KDa，降解率为5.01％。
对比例4
一种采用电Fenton法降解银耳多糖的方法：称取3000g银耳多糖(分子量560KDa)，分散到3.0Kg无水乙醇中，加入到15L蒸馏水中，制成浓度为200mg/ml的糖溶液，装入体积为24L的电解槽中，称取149.1g硫酸钠溶解于多糖溶液中，用1mol/L盐酸调pH至5，以30cm×30cm铁丝网为阳极，30cm×30cm多孔石墨为阴极，两极间距离为5cm，通入12V直流电，电流密度为12mA/cm2，并用曝气装置以1.74L/min的速度通入净化空气(或以0.58L/min的速度通入氧气，曝气装置含三个通气孔，三个通气孔同时鼓入氧气)，每升银耳多糖溶液通入空气的量约为20.8L(每升银耳多糖溶液通入空气的量约为6.96L)，搅拌器以250rpm的速度搅拌，室温条件下电解60min后，停止通电通气，将电解液用1M的氢氧化钠溶液中和至中性后用截留分子量30KDa-50KDa的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，银耳多糖44.4g，用凝胶排阻色谱法测定平均分子量为46.9KDa，降解率为1.48％。
对比例5
一种采用电Fenton法降解银耳多糖的方法：称取3000g银耳多糖(分子量560KDa)，分散到3.0Kg无水乙醇中，加入到15L蒸馏水中，制成浓度为200mg/ml的糖溶液，装入体积为24L的电解槽中，称取149.1g硫酸钠溶解于多糖溶液中，用1mol/L盐酸调pH至3，以30cm×30cm铁丝网为阳极，30cm×30cm多孔石墨为阴极，两极间距离为5cm，通入12V直流电，电流密度为12mA/cm2，并用曝气装置以1.74L/min的速度通入净化空气(或以0.58L/min的速度通入氧气，曝气装置含一个通气孔)，每升银耳多糖溶液通入空气的量约为6.93L(每升银耳多糖溶液通入空气的量约为2.32L)，搅拌器以250rpm的速度搅拌，室温条件下电解60min后，停止通电通气，将电解液用1M的氢氧化钠溶液中和至中性后用截留分子量30KDa-50KDa的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，银耳多糖754.2g，用凝胶排阻色谱法测定平均分子量为44.2KDa，降解率为25.14％。
将实施例1-2，对比例1-5的结果如表1所示：
表1：实施例1-2，对比例1-5的结果数据对比
Figure BDA0001721741270000071
从上述结果可以看出：相对于酸法降解和过氧化氢法降解，本发明所得的多糖降解率高，平均分子量低，且用时较短，有更好的工业应用价值。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种降解银耳多糖的方法，其特征在于：称取3000g银耳多糖，分散到3.0Kg无水乙醇中，加入到15L蒸馏水中，制成银耳多糖相对于蒸馏水的浓度为200mg/ml的糖溶液；
装入体积为24L的电解槽中，称取149.1g硫酸钠溶解于多糖溶液中，用1mol/L盐酸调pH至3，以30cm×30cm铁丝网为阳极，30cm×30cm多孔石墨为阴极，两极间距离为5cm，通入12V直流电，电流密度为12mA/cm2，并用曝气装置以1.74L/min的速度通入净化空气，每升银耳多糖溶液通入空气的量为20.8L，搅拌器以250rpm的速度搅拌，室温条件下电解60min后，停止通电通气；
将电解液用1M的氢氧化钠溶液中和至中性后用截留分子量30KDa -50KDa的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，得银耳多糖，用凝胶排阻色谱法测定平均分子量为33.6KDa。
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CN104530254A (zh) * 2014-12-16 2015-04-22 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种应用褐藻生产海藻酸钠的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Reactive oxygen species responsible for beta-glucan degradation";Audrey M. Faure等;《Food Chemistry》;20130307;第141卷;589-596页 *

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