CN109006476A - 一种粗梗水蕨的组培快繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种粗梗水蕨的组培快繁方法，包括以下步骤：(1)将粗梗水蕨的外植体洗净后切断，用75％乙醇处理8‑15s和0.1％氯化汞处理6‑10min进行消毒，接种于添加有N6‑呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基中进行培养，MS培养基中N6‑呋喃甲基腺嘌呤的浓度为1‑3mg/L；(2)粗梗水蕨的叶柄培养至长出丛生芽后，转接到添加有吲哚丁酸的MS培养基中进行培养，MS培养基中吲哚丁酸的浓度为1‑1.5mg/L，培养至长出2‑4片叶片，得到试管苗；(3)将试管苗取出，移栽后进行培养，得到粗梗水蕨植株。接种在添加了N6‑呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基中，丛生芽诱导率高，达到了90％以上；可缩短育苗周期，获得大量组培苗。

Description

一种粗梗水蕨的组培快繁方法
技术领域
本发明涉及一种粗梗水蕨的组培快繁方法，属于水生植物培育领域。
背景技术
水蕨科(Ceratopteridaceae)所有植物均为二级保护植物，其叶二型，形态变化较大，同时可食用和药用，具独特的景观价值和生态学意义。但由于水蕨类对其生活环境的水质要求较高，在污染较多的水域无法生长，因此野生水蕨植株越来越少见。
水蕨(Ceratopteris thalictroides(L.)Brongn.)已有快繁方法的报道，申请号为CN201210075022.5的发明专利《濒危蕨类植物水蕨的繁育方法》公布了一种通过水蕨孢子采集、接种于培养皿，在人工气候箱中培养获得幼苗的人工繁育方法，申请号为CN201410734844.9的发明专利《一种快速繁殖水蕨种苗的方法》公布了一种将水蕨的孢子接种到萌发培养基培养成幼苗、将幼苗切段后插入培养基中培养出幼芽，再将幼芽切成段进行继代培养，将幼芽接种到生根培养基培养至生根获得水蕨种苗的方法。
目前水蕨已有少量人工繁育苗在市场流通，但粗梗水蕨(Ceratopterispteridoides(Hook.)Hieron.)相对水蕨更为少见，处于野生状态，尚未被人工繁育开发。粗梗水蕨孢子叶可产生大量孢子，但孢子成熟时间不定，成熟后迅速飘散，难以采集，孢子寿命短，自然环境下萌发率低；粗梗水蕨幼苗冬季耐寒性差，极易冻死，而且对污染物、农药等较为敏感，多种原因导致幼苗成苗率低，野生粗梗水蕨种群量逐渐减少，濒临灭绝，因此做好粗梗水蕨迁地保护和人工繁育具有重要的意义。
发明内容
本发明解决的技术问题是，粗梗水蕨孢子叶材料难以获取、孢子成熟度无法保证的问题。因此，为扩繁培育更多粗梗水蕨种苗，针对粗梗水蕨进行组织培养实验研究，筛选出适宜该植物的快繁培养基以及培养方法。
本发明的技术方案是，提供一种粗梗水蕨的组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)将粗梗水蕨的外植体洗净后切断，进行消毒，接种于添加有N6-呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基中进行培养；
(2)粗梗水蕨的叶柄培养至长出丛生芽后，转接到添加有吲哚丁酸的MS培养基中进行培养，培养至长出2-4片叶片，得到试管苗，MS培养基中吲哚丁酸的浓度为1-1.5mg/L；
(3)将试管苗取出，移栽后进行培养，得到粗梗水蕨植株。
优选地，MS培养基中，N6-呋喃甲基腺嘌呤的浓度为1-3mg/L。
优选地，步骤(1)中，所述外植体为营养叶叶柄，将叶柄以上未伸展的叶片剪去，保留叶柄并切段，再进行消毒。
优选地，步骤(1)中，MS培养基中，N6-呋喃甲基腺嘌呤的浓度为2mg/L。
优选地，步骤(3)中，将试管苗移栽至经过消毒的培养土中，所述培养土由以下组分组成：65-75wt％泥炭、15-25wt％稻壳炭、8-12wt％蛭石。
优选地，采取浸盆给水的方式，控制培养土的湿度在75％～95％。
优选地，步骤(3)的培养过程中，采用8-12mg/L的纳米硅肥溶液进行叶面喷施，每周喷施一次。
优选地，步骤(1)和(2)中，培养条件为27.5-28.5℃，光照度2000～2500lx，光照12～14小时/天。
优选地，步骤(1)中，消毒的具体条件为：将粗梗水蕨的营养叶叶柄在体积分数70-75％的乙醇中浸泡8-15s，再在质量分数0.05-0.15％的氯化汞中浸泡6-10min。粗梗水蕨营养叶叶柄体积小，选用毒性较强的消毒剂或消毒时间过长均会影响其活性。采用乙醇10s+氯化汞8min的处理方法能有效消毒。
MS培养基：MS培养基由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分组成，其组成是已知的。在MS培养基添加碳源和琼脂。碳源使用蔗糖，浓度为8-12g/L，优选如10g/L；琼脂的浓度6-9g/L，优选如7g/L。
下面对本发明作进一步解释：
1、采集相对幼嫩的营养叶片，用无菌水洗净，将叶柄以上未伸展的叶片剪去，叶柄剪成小段。
2、消毒。将营养叶叶柄用75％乙醇处理10s和0.1％氯化汞处理8min消毒，无菌水冲洗。
3、无菌接种。配置添加2mg/L N6-呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基，接种灭菌营养叶叶柄，诱导产生丛生芽；培养条件设置为28℃，光照强度2000～2500lx，光照12～14小时/天。
4、生根诱导。待外植体长出丛生芽后，取出分离转接至添加1mg/L吲哚丁酸的MS培养基，培养成试管苗。培养条件设置为28℃，光照度2000～2500lx，光照12～14小时/天。
5、出瓶炼苗。待长出2-4片真叶，将试管苗取出，根部洗净，种植于经过消毒处理的特定培养土(泥炭+稻壳炭+蛭石，用1％多菌灵消毒)中。移栽前期要适当遮阴，采取浸盆给水的方式，控制土壤湿度在75％～95％。其中，稻壳炭即稻壳经过炭化后的产物。
6、施肥管理。采用叶面喷施纳米硅肥，每周喷施一次，提高抗性和存活率。
本发明的有益效果是，接种在添加了2mg/L左右的N6-呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基中，营养叶叶柄诱导率高，达到了90％以上；诱导芽数多，可实现大量快速扩繁。
附图说明
图1叶柄节及珠芽照片。
图2丛生芽照片。
图3试管苗照片。
图4出瓶炼苗照片。
图5出瓶炼苗放大照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
在MS培养基中添加蔗糖、琼脂。添加琼脂是为了使培养基凝固，添加量少会无法凝固，添加过多会使培养基过硬，不利于后期生根，6-9g/L的适宜浓度范围有利于外植体培养诱导和后期生根。蔗糖作为常用碳源，其浓度虽然对培养有一定影响，过低可能会营养不足，过高造成试剂浪费，8-12g/L范围为适宜浓度。经过初步试验发现蔗糖、琼脂浓度与激素浓度变化相比，对诱导率影响程度可忽略不计。所以，实施例的培养基中将蔗糖、琼脂的浓度固定为10g/L和7g/L。
实施例
本实施例提供一种粗梗水蕨的组培快繁方法，包括以下具体步骤：
采集相对幼嫩的营养叶片，用无菌水洗净，将珠芽或叶柄上未伸展的叶片剪去，叶柄剪成小段。
将营养叶叶柄用75％乙醇处理10s和0.1％氯化汞处理8min消毒，无菌水冲洗。
配置添加2mg/L N6-呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基，接种灭菌营养叶叶柄，诱导产生丛生芽；培养条件设置为28℃，光照强度2000～2500lx，光照12～14小时/天。
待外植体长出丛生芽后，取出分离转接至添加1mg/L吲哚丁酸的MS培养基，培养成试管苗。培养条件设置为28℃，光照度2000～2500lx，光照12～14小时/天。
待长出2-4片真叶，将试管苗取出，根部洗净，种植于经过消毒处理的特定培养土(泥炭+稻壳炭+蛭石，用1％多菌灵消毒)中。移栽前期要适当遮阴，采取浸盆给水的方式，控制土壤湿度在75％～95％。其中，稻壳炭即稻壳经过炭化后的产物。
采用叶面喷施纳米硅肥，每周喷施一次，提高植物抗性。
不同灭菌方式对无菌接种的污染率和营养叶叶柄活性有很大影响，采用75％乙醇处理10s和0.1％氯化汞处理8min消毒方式时，污染率相对较低，如下表所示。
序号 灭菌方式 污染率
1 75％乙醇(10s)+2％次氯酸钠(5min) 33％
2 75％乙醇(10s)+2％次氯酸钠(10min) 25％
3 75％乙醇(10s)+2％次氯酸钠(15min) 20％
4 75％乙醇(10s)+0.1％氯化汞(6min) 15％
5 75％乙醇(10s)+0.1％氯化汞(8min) 8％
6 75％乙醇(10s)+0.1％氯化汞(10min) 8％
在接种前期，改变培养条件(培养基与添加的激素)后，营养叶叶柄诱导分化率有较大的变化，在添加2mg/L N6-呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基中，诱导分化率最高，达90.5±3.3％，如下表所示。
在后期生根诱导时，改变激素浓度，根系长度有较大差别，在添加1mg/L吲哚丁酸的MS培养基中，平均根长有最大值，达2.8±0.5cm，如下表所示。
出瓶炼苗时，施用不同浓度的纳米硅分散剂对叶片叶绿素含量有较大影响，以10mg/L浓度处理效果最佳，叶绿素含量最高，超过该浓度时无显著提升，如下表所示。
序号 硅肥浓度(mg/L) 叶绿素含量(SPAD)
1 0 28.32±3.41
2 2 28.45±2.25
3 4 30.23±2.63
4 6 31.67±2.14
5 8 33.74±1.29
6 10 35.82±1.17
7 12 35.35±1.75

Claims (8)

1.一种粗梗水蕨的组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将粗梗水蕨的外植体洗净后切断，消毒，接种于添加有N6-呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基中进行培养；
(2)粗梗水蕨的叶柄培养至长出丛生芽后，转接到添加有吲哚丁酸的MS培养基中进行培养，MS培养基中吲哚丁酸的浓度为1-1.5mg/L，培养至长出2-4片叶片，得到试管苗；
(3)将试管苗取出，移栽后进行培养，得到粗梗水蕨植株。
2.如权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，MS培养基中，N6-呋喃甲基腺嘌呤的浓度为1-3mg/L。
3.如权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，步骤(1)中，所述外植体为营养叶叶柄，将叶柄以上未伸展的叶片剪去，保留叶柄并切段，再进行消毒。
4.如权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，步骤(3)中，将试管苗移栽至经过消毒的培养土中，所述培养土由以下组分组成：65-75wt％泥炭、15-25wt％稻壳炭、8-12wt％蛭石。
5.如权利要求4所述的组培快繁方法，其特征在于，采取浸盆给水的方式，控制培养土的湿度在75％～95％。
6.如权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，步骤(3)的培养过程中，采用8-12mg/L的纳米硅肥溶液进行叶面喷施，每周喷施一次。
7.如权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，培养条件为27.5-28.5℃，光照度2000～2500lx，光照12～14小时/天。
8.如权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，步骤(1)中，消毒的具体条件为：将叶柄在体积分数70-75％的乙醇中浸泡8-15s，再在质量分数0.1％的氯化汞中浸泡6-10min。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105724246A (zh) * 2014-12-08 2016-07-06 张秀国 一种快速繁殖水蕨种苗的方法

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蒋中海: "蕨类植物组织培养研究进展", 《江苏农业科学》 *
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