CN109006476A - 一种粗梗水蕨的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种粗梗水蕨的组培快繁方法,包括以下步骤:(1)将粗梗水蕨的外植体洗净后切断,用75%乙醇处理8‑15s和0.1%氯化汞处理6‑10min进行消毒,接种于添加有N6‑呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基中进行培养,MS培养基中N6‑呋喃甲基腺嘌呤的浓度为1‑3mg/L;(2)粗梗水蕨的叶柄培养至长出丛生芽后,转接到添加有吲哚丁酸的MS培养基中进行培养,MS培养基中吲哚丁酸的浓度为1‑1.5mg/L,培养至长出2‑4片叶片,得到试管苗;(3)将试管苗取出,移栽后进行培养,得到粗梗水蕨植株。接种在添加了N6‑呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基中,丛生芽诱导率高,达到了90%以上;可缩短育苗周期,获得大量组培苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种粗梗水蕨的组培快繁方法,属于水生植物培育领域。
背景技术
水蕨科(Ceratopteridaceae)所有植物均为二级保护植物,其叶二型,形态变化较大,同时可食用和药用,具独特的景观价值和生态学意义。但由于水蕨类对其生活环境的水质要求较高,在污染较多的水域无法生长,因此野生水蕨植株越来越少见。
水蕨(Ceratopteris thalictroides(L.)Brongn.)已有快繁方法的报道,申请号为CN201210075022.5的发明专利《濒危蕨类植物水蕨的繁育方法》公布了一种通过水蕨孢子采集、接种于培养皿,在人工气候箱中培养获得幼苗的人工繁育方法,申请号为CN201410734844.9的发明专利《一种快速繁殖水蕨种苗的方法》公布了一种将水蕨的孢子接种到萌发培养基培养成幼苗、将幼苗切段后插入培养基中培养出幼芽,再将幼芽切成段进行继代培养,将幼芽接种到生根培养基培养至生根获得水蕨种苗的方法。
目前水蕨已有少量人工繁育苗在市场流通,但粗梗水蕨(Ceratopterispteridoides(Hook.)Hieron.)相对水蕨更为少见,处于野生状态,尚未被人工繁育开发。粗梗水蕨孢子叶可产生大量孢子,但孢子成熟时间不定,成熟后迅速飘散,难以采集,孢子寿命短,自然环境下萌发率低;粗梗水蕨幼苗冬季耐寒性差,极易冻死,而且对污染物、农药等较为敏感,多种原因导致幼苗成苗率低,野生粗梗水蕨种群量逐渐减少,濒临灭绝,因此做好粗梗水蕨迁地保护和人工繁育具有重要的意义。
发明内容
本发明解决的技术问题是,粗梗水蕨孢子叶材料难以获取、孢子成熟度无法保证的问题。因此,为扩繁培育更多粗梗水蕨种苗,针对粗梗水蕨进行组织培养实验研究,筛选出适宜该植物的快繁培养基以及培养方法。
本发明的技术方案是,提供一种粗梗水蕨的组培快繁方法,包括以下步骤:
(1)将粗梗水蕨的外植体洗净后切断,进行消毒,接种于添加有N6-呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基中进行培养;
(2)粗梗水蕨的叶柄培养至长出丛生芽后,转接到添加有吲哚丁酸的MS培养基中进行培养,培养至长出2-4片叶片,得到试管苗,MS培养基中吲哚丁酸的浓度为1-1.5mg/L;
(3)将试管苗取出,移栽后进行培养,得到粗梗水蕨植株。
优选地,MS培养基中,N6-呋喃甲基腺嘌呤的浓度为1-3mg/L。
优选地,步骤(1)中,所述外植体为营养叶叶柄,将叶柄以上未伸展的叶片剪去,保留叶柄并切段,再进行消毒。
优选地,步骤(1)中,MS培养基中,N6-呋喃甲基腺嘌呤的浓度为2mg/L。
优选地,步骤(3)中,将试管苗移栽至经过消毒的培养土中,所述培养土由以下组分组成:65-75wt%泥炭、15-25wt%稻壳炭、8-12wt%蛭石。
优选地,采取浸盆给水的方式,控制培养土的湿度在75%~95%。
优选地,步骤(3)的培养过程中,采用8-12mg/L的纳米硅肥溶液进行叶面喷施,每周喷施一次。
优选地,步骤(1)和(2)中,培养条件为27.5-28.5℃,光照度2000~2500lx,光照12~14小时/天。
优选地,步骤(1)中,消毒的具体条件为:将粗梗水蕨的营养叶叶柄在体积分数70-75%的乙醇中浸泡8-15s,再在质量分数0.05-0.15%的氯化汞中浸泡6-10min。粗梗水蕨营养叶叶柄体积小,选用毒性较强的消毒剂或消毒时间过长均会影响其活性。采用乙醇10s+氯化汞8min的处理方法能有效消毒。
MS培养基:MS培养基由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分组成,其组成是已知的。在MS培养基添加碳源和琼脂。碳源使用蔗糖,浓度为8-12g/L,优选如10g/L;琼脂的浓度6-9g/L,优选如7g/L。
下面对本发明作进一步解释:
1、采集相对幼嫩的营养叶片,用无菌水洗净,将叶柄以上未伸展的叶片剪去,叶柄剪成小段。
2、消毒。将营养叶叶柄用75%乙醇处理10s和0.1%氯化汞处理8min消毒,无菌水冲洗。
3、无菌接种。配置添加2mg/L N6-呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基,接种灭菌营养叶叶柄,诱导产生丛生芽;培养条件设置为28℃,光照强度2000~2500lx,光照12~14小时/天。
4、生根诱导。待外植体长出丛生芽后,取出分离转接至添加1mg/L吲哚丁酸的MS培养基,培养成试管苗。培养条件设置为28℃,光照度2000~2500lx,光照12~14小时/天。
5、出瓶炼苗。待长出2-4片真叶,将试管苗取出,根部洗净,种植于经过消毒处理的特定培养土(泥炭+稻壳炭+蛭石,用1%多菌灵消毒)中。移栽前期要适当遮阴,采取浸盆给水的方式,控制土壤湿度在75%~95%。其中,稻壳炭即稻壳经过炭化后的产物。
6、施肥管理。采用叶面喷施纳米硅肥,每周喷施一次,提高抗性和存活率。
本发明的有益效果是,接种在添加了2mg/L左右的N6-呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基中,营养叶叶柄诱导率高,达到了90%以上;诱导芽数多,可实现大量快速扩繁。
附图说明
图1叶柄节及珠芽照片。
图2丛生芽照片。
图3试管苗照片。
图4出瓶炼苗照片。
图5出瓶炼苗放大照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
在MS培养基中添加蔗糖、琼脂。添加琼脂是为了使培养基凝固,添加量少会无法凝固,添加过多会使培养基过硬,不利于后期生根,6-9g/L的适宜浓度范围有利于外植体培养诱导和后期生根。蔗糖作为常用碳源,其浓度虽然对培养有一定影响,过低可能会营养不足,过高造成试剂浪费,8-12g/L范围为适宜浓度。经过初步试验发现蔗糖、琼脂浓度与激素浓度变化相比,对诱导率影响程度可忽略不计。所以,实施例的培养基中将蔗糖、琼脂的浓度固定为10g/L和7g/L。
实施例
本实施例提供一种粗梗水蕨的组培快繁方法,包括以下具体步骤:
采集相对幼嫩的营养叶片,用无菌水洗净,将珠芽或叶柄上未伸展的叶片剪去,叶柄剪成小段。
将营养叶叶柄用75%乙醇处理10s和0.1%氯化汞处理8min消毒,无菌水冲洗。
配置添加2mg/L N6-呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基,接种灭菌营养叶叶柄,诱导产生丛生芽;培养条件设置为28℃,光照强度2000~2500lx,光照12~14小时/天。
待外植体长出丛生芽后,取出分离转接至添加1mg/L吲哚丁酸的MS培养基,培养成试管苗。培养条件设置为28℃,光照度2000~2500lx,光照12~14小时/天。
待长出2-4片真叶,将试管苗取出,根部洗净,种植于经过消毒处理的特定培养土(泥炭+稻壳炭+蛭石,用1%多菌灵消毒)中。移栽前期要适当遮阴,采取浸盆给水的方式,控制土壤湿度在75%~95%。其中,稻壳炭即稻壳经过炭化后的产物。
采用叶面喷施纳米硅肥,每周喷施一次,提高植物抗性。
不同灭菌方式对无菌接种的污染率和营养叶叶柄活性有很大影响,采用75%乙醇处理10s和0.1%氯化汞处理8min消毒方式时,污染率相对较低,如下表所示。
序号 | 灭菌方式 | 污染率 |
1 | 75%乙醇(10s)+2%次氯酸钠(5min) | 33% |
2 | 75%乙醇(10s)+2%次氯酸钠(10min) | 25% |
3 | 75%乙醇(10s)+2%次氯酸钠(15min) | 20% |
4 | 75%乙醇(10s)+0.1%氯化汞(6min) | 15% |
5 | 75%乙醇(10s)+0.1%氯化汞(8min) | 8% |
6 | 75%乙醇(10s)+0.1%氯化汞(10min) | 8% |
在接种前期,改变培养条件(培养基与添加的激素)后,营养叶叶柄诱导分化率有较大的变化,在添加2mg/L N6-呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基中,诱导分化率最高,达90.5±3.3%,如下表所示。
在后期生根诱导时,改变激素浓度,根系长度有较大差别,在添加1mg/L吲哚丁酸的MS培养基中,平均根长有最大值,达2.8±0.5cm,如下表所示。
出瓶炼苗时,施用不同浓度的纳米硅分散剂对叶片叶绿素含量有较大影响,以10mg/L浓度处理效果最佳,叶绿素含量最高,超过该浓度时无显著提升,如下表所示。
序号 | 硅肥浓度(mg/L) | 叶绿素含量(SPAD) |
1 | 0 | 28.32±3.41 |
2 | 2 | 28.45±2.25 |
3 | 4 | 30.23±2.63 |
4 | 6 | 31.67±2.14 |
5 | 8 | 33.74±1.29 |
6 | 10 | 35.82±1.17 |
7 | 12 | 35.35±1.75 |
Claims (8)
1.一种粗梗水蕨的组培快繁方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将粗梗水蕨的外植体洗净后切断,消毒,接种于添加有N6-呋喃甲基腺嘌呤的MS培养基中进行培养;
(2)粗梗水蕨的叶柄培养至长出丛生芽后,转接到添加有吲哚丁酸的MS培养基中进行培养,MS培养基中吲哚丁酸的浓度为1-1.5mg/L,培养至长出2-4片叶片,得到试管苗;
(3)将试管苗取出,移栽后进行培养,得到粗梗水蕨植株。
2.如权利要求1所述的组培快繁方法,其特征在于,MS培养基中,N6-呋喃甲基腺嘌呤的浓度为1-3mg/L。
3.如权利要求1所述的组培快繁方法,其特征在于,步骤(1)中,所述外植体为营养叶叶柄,将叶柄以上未伸展的叶片剪去,保留叶柄并切段,再进行消毒。
4.如权利要求1所述的组培快繁方法,其特征在于,步骤(3)中,将试管苗移栽至经过消毒的培养土中,所述培养土由以下组分组成:65-75wt%泥炭、15-25wt%稻壳炭、8-12wt%蛭石。
5.如权利要求4所述的组培快繁方法,其特征在于,采取浸盆给水的方式,控制培养土的湿度在75%~95%。
6.如权利要求1所述的组培快繁方法,其特征在于,步骤(3)的培养过程中,采用8-12mg/L的纳米硅肥溶液进行叶面喷施,每周喷施一次。
7.如权利要求1所述的组培快繁方法,其特征在于,步骤(1)和(2)中,培养条件为27.5-28.5℃,光照度2000~2500lx,光照12~14小时/天。
8.如权利要求1所述的组培快繁方法,其特征在于,步骤(1)中,消毒的具体条件为:将叶柄在体积分数70-75%的乙醇中浸泡8-15s,再在质量分数0.1%的氯化汞中浸泡6-10min。
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Non-Patent Citations (2)
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蒋中海: "蕨类植物组织培养研究进展", 《江苏农业科学》 * |
蔡汉权等: "水蕨的组织培养和快速繁殖", 《植物生理学通讯》 * |
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