CN108998454A - 一种与菊花脑抗蚜性相关的miRNA160a及其应用 - Google Patents

一种与菊花脑抗蚜性相关的miRNA160a及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108998454A
CN108998454A CN201810916726.8A CN201810916726A CN108998454A CN 108998454 A CN108998454 A CN 108998454A CN 201810916726 A CN201810916726 A CN 201810916726A CN 108998454 A CN108998454 A CN 108998454A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
seq
sttm160a
trv
aphid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810916726.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108998454B (zh
Inventor
陈素梅
夏小龙
李菲
张皖皖
邵亚峰
蒋甲福
陈发棣
房伟民
管志勇
王银杰
张倩丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN201810916726.8A priority Critical patent/CN108998454B/zh
Publication of CN108998454A publication Critical patent/CN108998454A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108998454B publication Critical patent/CN108998454B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种与菊花脑抗蚜性相关的miRNA160a及其应用，所述的miRNA160a具有序列表中SEQ ID NO.1所示的序列特征，可利用该miRNA进行抗蚜转基因植物的培育，进而提高植物的抗蚜性；通过TRV‑VbMS技术，在菊花脑中过表达含有SEQ ID NO.2所示的内源目的miR160a结合位点的STTM序列片段的TRV2e病毒沉默表达载体质粒，借助抽真空法瞬时转化菊花脑，诱导菊花脑内源目的miR160a发生沉默，从而鉴定该内源目的miR160a的功能。本发明方法提供了一种提高植物抗蚜性的miRNA160a，并提供了TRV‑VbMS沉默菊花脑内源miRNA从而鉴定miRNA功能的体系，其具有快速，高通量，易于操作等优势，为开展菊花脑miRNA功能研究提供了新途径。

Description

一种与菊花脑抗蚜性相关的miRNA160a及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术及应用领域，具体涉及一种与菊花脑抗蚜性相关的miRNA160a；本发明还涉及基于TRV-VbMS技术沉默菊花脑内源miRNA从而鉴定其功能的技术。
背景技术
菊花脑(Chrysanthemum nankingense)为菊科菊属二倍体野生种，原产我国(张莉俊等，2009)，在功能基因组研究中占据重要的位置，然而菊花脑缺乏稳定的遗传转化体系，严重制约了基因功能研究。蚜虫是一种常见的刺吸式昆虫，主要取食植物韧皮部汁液，消耗植物养分，直接影响植物生长；其分泌的蜜露还诱发煤污病，影响光合作用，此外蚜虫还传播病毒。上述危害严重影响菊花脑观赏品质及食用价值。
miRNA是近几年来较受关注的一类调控基因表达的非编码RNA。miRNA是由大约22个核苷酸组成的小RNA分子(Berezikov et al.,2006)，调控着植株生长发育的各个方面，包括叶片形态建成、花器官发育等(Chen et al.,2005)。另外，miRNA在植物响应逆境胁迫反应中也发挥着不可替代的作用。miRNA的作用机制主要表现为与靶基因mRNA近乎完美地互补结合，介导对其的剪切降解和翻译抑制，植物中大多表现为前者(Bartel et al.,2004)。
基于病毒的miRNA沉默(Virus-based MicroRNA Silencing，VbMS)，是指携带一段寄主植物目的miRNA模拟靶标STTM序列的病毒载体侵染植株引发寄主内源miRNA的沉默，从而实现对该miRNA的功能鉴定(Senthil-Kumar&Mysore,2011)。STTM含有两个target-mimic序列，其间由一段48至88个核苷酸长的序列连接(Sha et al.,2014)。STTM的表达可针对性使两个miRNA降解。
近年来VbMS技术已成为一种重要的反向遗传学工具用于miRNA功能的研究，与稳定遗传相比，VbMS技术快速有效，能及时大量地搜索、查找与研究目的有关的miRNA，并能在短时间内(2-4周)产生表型(Sha et al.,2014)；其次，不需要经过费时费力的植物转基因过程，特别是有助于对那些敲除后可能引起细胞死亡的miRNA功能的鉴定，以及无法进行转基因的植物种类；第三，TRV病毒(烟草脆裂病毒)能感染的植物范围相对较广(Macfarlaneet al.,1999)，已成功应用于多种植物基因功能研究中，如烟草中，利用VbMS技术瞬时沉默miR165/166后，植株顶端优势丧失，而miR172瞬时沉默后引起不同程度的花发育缺陷；番茄中，VbMS介导的miR319瞬时沉默后，植株叶片变小，且叶型简化(Sha et al.,2014)。
参考文献：
张莉俊，戴思兰.菊花种质资源研究进展[J].植物学报,2009,44(5):526-535.
Bartel,D.P.(2004a)MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction.Cell,116,281–297.
Berezikov E.,Cuppen E.,Plasterk R.H..(2006)Approaches to microRNAdiscovery.Nature genetics,38,S2-S7.
Chen X..(2005)MicroRNA biogenesis and function in plants.FEBSletters,579,5923-5931.
Macfarlane S.A.,Vassilakos N.,Brown D.J..(1999)Similarities in thegenome organization of tobacco rattle virus and pea early-browning virusisolates that are transmitted by the same vector nematode.Journal of GeneralVirology,80(Pt 1),273-276.
Senthil-Kumar M.,Mysore K.S..(2011)New dimensions for VIGS in plantfunctional genomics.Trends in plant science,16,656-65.
Sha A.,Zhao J.,Yin K.,Tang Y.,Wang Y.,Wei X.,Hong Y.,Liu Y..(2014)Virus-based microRNA silencing in plants.Plant Physiology,164,36.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种与植物抗蚜性相关的miR160a，并提供TRV-VbMS技术沉默菊花脑内源miRNA的方法，并利用此miRNA及TRV-VbMS技术提高菊花脑的抗蚜性。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种与菊花脑抗蚜性相关的miR160a，具有如SEQ ID NO.1所示的序列。
上述的与菊花脑抗蚜性相关的miR160a在提高植物抗蚜性或培育抗蚜转基因植物中的应用。
STTM160a序列片段，具有如下(a)～(c)中任一所述的核苷酸序列：
(a)如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
(b)如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的互补序列；
(c)具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸所获得的核苷酸序列，且与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
上述的STTM160a序列片段在构建基于烟草脆裂病毒诱导miRNA沉默载体中的应用。
含有上述STTM160a序列片段的重组表达载体、转基因细胞系或转基因工程菌。
上述的重组表达载体，该重组表达载体是基于烟草脆裂病毒诱导miRNA沉默的载体，为将上述的STTM160a序列片段插入到TRV2e载体的Pst I位点间通过LIC方法得到的植物表达载体TRV2e-STTM160a。
上述的转基因工程菌，该转基因工程菌通过将上述的植物表达载体TRV2e-STTM160a转化农杆菌感受态获得。
上述的STTM160a序列片段、重组表达载体和转基因工程菌在提高植物抗蚜性、培育抗蚜性转基因作物或快速鉴定菊花脑miR160a功能中的应用。
一种培育抗蚜转基因植物的方法，通过沉默植物中的miR160a增强植物对蚜虫的抗性。所述的抗蚜转基因植物为菊花脑。优选的，该方法为将含有内源目的miR160a结合位点的如SEQ ID No.2所示STTM160a序列片段的TRV2e病毒沉默表达载体质粒瞬时转化植株，诱导植株内源目的miRNA发生沉默，培育出具有抗蚜性的转基因植物。所述的内源目的miRNA为如SEQ ID NO.1所示的miR160a。
一种快速鉴定菊花脑miRNA功能的方法，将含有内源目的miRNA结合位点的STTM序列片段的TRV2e-STTM160a病毒沉默表达载体质粒瞬时转化菊花脑，诱导菊花脑内源目的miRNA发生沉默，从而鉴定该内源目的miRNA的功能。
优选的，所述的含有内源目的miRNA结合位点的STTM序列片段的TRV2e病毒沉默表达载体质粒为上述的植物表达载体TRV2e-STTM160a；通过植株抽真空法将上述的植物表达载体TRV2e-STTM160a瞬时转化菊花脑，诱导菊花脑内源目的miRNA发生沉默，从而鉴定该内源目的miRNA的功能，统计目的miRNA沉默植株虫口数目。
上述的快速鉴定菊花脑miRNA功能的方法，具体包括如下步骤：
(1)构建植物表达载体TRV2e-STTM160a：以人工合成的一段由48个核苷酸组成的link序列SEQ ID NO.3为模板，以STTM序列引物STTM160a-F:SEQ ID NO.4和STTM160a-R:SEQ ID NO.5为引物进行PCR扩增反应，得到目的片段，将纯化产物和TRV2e载体分别进行PstI(Fermentas,USA)单酶切，然后在T4DNA(TaKaRa,Japan)聚合酶作用下，分别对酶切后的TRV2e载体和STTM160a进行dTTP和dATP加尾处理，回收目的片段之后进行LIC法连接，将连接产物转化DH5α感受态，提取阳性质粒，测序验证，植物表达载体TRV2e-STTM160a构建成功，将TRV2e-STTM160a通过电转化转入农杆菌GV3101；
(2)制备侵染液：从添加了100mg/L Rif和50mg/L Kan的LB平板上挑取含有植物表达载体TRV2e-STTM160a、TRV2e-GFP对照载体、TRV1载体的阳性农杆菌GV3101单克隆，分别在添加了100mg/L Rif，10mM MES，20μM acetosyringone(乙酰丁香酮)和50mg/L Kan的LB液体培养基中进行培养至OD600为1.5，然后离心去上清收集各菌体，采用等体积侵染缓冲液重悬各菌体并调节OD600至1.5，黑暗静置后将TRV1与TRV2e-GFP或TRV2e-STTM160a悬浮菌液等体积混合，用作菊花脑幼苗侵染液；所述侵染缓冲液的配方为10mMMES，200μMacetosyringone，10mM MgCl2水溶液，pH＝5.6；
(3)将步骤(2)制备的侵染液利用抽真空方式侵染菊花脑播种苗，直至植株被农杆菌菌液完全浸润；
(4)转化后培养：将侵染的植株用自来水冲洗后定植，并用保鲜膜保湿，置于黑暗中培养1d后，于光照培养箱中正常管理(16h/8h光周期、23℃/18℃昼夜温度、相对湿度70％)；
(5)转化株表型观察：侵染后1周，在Tanon UV-100手提式紫外灯(CatalogNo.200-1300(365/365nm))照射下进行真叶中GFP荧光信号检测，筛选阳性苗，并拍照记录。筛选出的阳性植株用于进一步实验；
(6)内源目的片段CP(编码病毒外壳蛋白)和STTM160a序列的RT-PCR检测：取在紫外灯照射下有绿色荧光信号的菊花脑植株真叶提取RNA，并消化基因组DNA，用TRV特异反转录引物(TRV-RT):SEQ ID NO.6进行反转录得到cDNA，然后以CP-F：SEQ ID NO.7和CP-R：SEQID NO.8为CP引物检测CP基因的表达；以sttm160a-F:SEQ ID NO.9和sttm160a-R:SEQ IDNO.10为STTM qRT-PCR检测引物检测STTM160a序列的表达，取样植株用于下一步实验。
(7)内源miRNA表达的qRT-PCR检测：将步骤(6)提取的RNA用反转录引物oligo(dT)18:SEQ ID NO.11和目标miRNA特异反转录引物miR160a-RT:SEQ ID NO.12进行反转录，以miR160a-F:SEQ ID NO.13和miR160a-R:SEQ ID NO.14为miR160a qRT-PCR检测引物检测目标miRNA的表达量，以CnEF1α-F:SEQ ID NO.15和CnEF1α-R:SEQ ID NO.16为CnEF1α引物检测内参基因CnEF1α的表达量。
上述的快速鉴定菊花脑miRNA在提高抗蚜性应用的鉴定方法，优选为选取长势一致的3～4片叶龄的TRV2e-STTM160a阳性植株和TRV2e-GFP对照植株进行蚜虫接种，每株接种5头菊姬长管蚜2龄若虫，两周后统计植株上蚜虫的数目。
本发明的实验证明，在蚜虫敏感植株菊花脑中，蚜虫取食前期(3h、6h和12h)，miR160a表达量上升，说明miR160a的表达响应蚜虫取食，在抗蚜性提高的TRV2e-STTM160a阳性植株中miR160a表达水平显著低于TRV2e-GFP对照阳性植株，说明miR160a在菊花脑的抗蚜性中担任重要作用。
本发明的优点在于，将含有内源目的miRNA结合位点的STTM序列片段通过TRV-VbMS技术法沉默菊花脑内源miRNA，采用播种苗抽真空法将上述的植物表达载体TRV2e-STTM瞬时转化菊花脑，其具有快速，高通量，低成本，易于操作与实现等优势，为规模化开展菊花脑miRNA功能研究提供依据，避免了因缺乏稳定的遗传转化体系而严重制约的基因功能研究。本发明miR160a的表达受到蚜虫取食的调节，说明其在菊花脑的抗蚜性中担任重要作用，基于此，可利用该miRNA进行抗蚜转基因作物的培育，进而对于提高作物的抗蚜性。
附图说明
图1：蚜虫取食下菊花脑中miR160a的表达模式。
图2：植物重组表达质粒TRV2e-STTM160a片段图谱。
图3：qRT-PCR检测TRV2e-GFP对照和TRV2e-STTM160a阳性植物中miR160a表达水平。
TRV2e-GFP：空载对照阳性株系；TRV2e-STTM160a：miR160a沉默阳性株系
图4：miR160a沉默植株抗蚜性鉴定。
TRV2e-GFP：空载对照阳性株系；TRV2e-STTM160a：miR160a沉默阳性株系
具体实施方式
下面对发明的具体实施例进行详细的说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，其具体实施方式如下：
在以下实施例中，除非特殊说明，所涉及的载体和实验材料均为本领域技术人员所公知的。
实施例1：菊花脑在蚜虫取食下miR160a表达模式分析
(1)蚜虫处理：取长势一致的菊花脑6～8叶龄播种苗，在每株植株从上往下数第二片全展叶上接种20头菊姬长管蚜2龄若虫，接种蚜虫前预先饥饿处理3h，接种后叶片罩上高2cm，直径5cm的微虫笼，以防蚜虫逃逸，取样时间点为接种后0h、3h、6h、12h、24h。每个时间点每个生物学重复取3株植物的叶片，3次生物学重复。取样后叶片用液氮速冻，并于-80℃保存，分别提取叶片的RNA。
(2)荧光定量PCR检测：将步骤(1)提取的RNA用oligo(dT)18:SEQ ID NO.11和目标miRNA特异反转录引物miR160a-RT:SEQ ID NO.12进行反转录，以miR160a-F:SEQ ID NO.13和miR160a-R:SEQ ID NO.14为引物检测目标miR160a的表达量(经测序miR160a的序列如SEQ ID NO.1所示)，以CnEF1α-F:SEQ ID NO.15和CnEF1α-R:SEQ ID NO.16为引物检测内参基因CnEF1α的表达量。
实施例2：菊花脑miR160a瞬时沉默转化
(1)构建植物表达载体TRV2e-STTM160a：以人工合成的一段由48个核苷酸组成的link序列SEQ ID NO.3为模板，以STTM160a-F:SEQ ID NO.4和STTM160a-R:SEQ ID NO.5为引物进行PCR扩增反应，得到目的片段STTM160a序列片段(如SEQ ID NO.2所示)，将纯化产物和TRV2e载体分别进行Pst I(Fermentas,USA)单酶切，然后在T4DNA(TaKaRa,Japan)聚合酶作用下，分别对酶切后的TRV2e载体和STTM160a进行dTTP和dATP加尾处理，回收目的片段之后进行LIC法连接，将连接产物转化DH5α感受态，提取阳性质粒，测序验证，植物表达载体TRV2e-STTM160a构建成功，将TRV2e-STTM160a通过电转化转入农杆菌GV3101；
(2)制备侵染液：从添加了100mg/L Rif和50mg/L Kan的LB平板上挑取含有植物表达载体TRV2e-STTM160a、TRV2e-GFP对照载体、TRV1载体的阳性农杆菌GV3101单克隆分别在添加了100mg/L Rif，10mM MES，20μM acetosyringone(乙酰丁香酮)和50mg/L Kan的LB液体培养基中进行培养至OD600为1.5，然后离心去上清收集各菌体，采用等体积侵染缓冲液重悬各菌体并调节OD600至1.5，黑暗静置后将TRV1与TRV2e-GFP或TRV2e-STTM160a悬浮菌液等体积混合，用作菊花脑幼苗侵染液。侵染液为两组混合液：对照组为TRV2e-GFP+TRV1的混合液；处理组为TRV2e-STTM160a+TRV1的混合液。所述侵染缓冲液的配方为10mM MES，200μMacetosyringone，10mM MgCl2水溶液，pH＝5.6；
(3)将步骤(2)制备的侵染液利用抽真空方式侵染菊花脑播种苗(只含两片子叶)，直至植株被农杆菌菌液完全浸润；
(4)转化后培养：将侵染的植株用自来水冲洗后定植，并用保鲜膜保湿，置于黑暗中培养1d后，于光照培养箱中正常管理(16h/8h光周期、23℃/18℃昼夜温度、相对湿度70％)；
(5)转化株表型观察：侵染后1周，在Tanon UV-100手提式紫外灯(CatalogNo.200-1300(365/365nm))照射下进行真叶中GFP荧光信号检测，筛选阳性苗，并拍照记录。筛选出的阳性植株用于进一步实验；
(6)内源目的片段CP(编码病毒外壳蛋白)和STTM160a序列的RT-PCR检测：取在紫外灯照射下有绿色荧光信号的菊花脑植株真叶提取RNA，并消化基因组DNA，用TRV特异引物(TRV-RT):SEQ ID NO.6进行反转录得到cDNA，然后以CP-F：SEQ ID NO.7和CP-R：SEQ IDNO.8为引物检测CP基因的表达；以sttm160a-F:SEQ ID NO.9和sttm160a-R:SEQ ID NO.10为引物检测STTM160a序列的表达，取样植株用于下一步实验。
(7)内源miR160a表达的qRT-PCR检测：将步骤(6)提取的RNA用oligo(dT)18:SEQ IDNO.11和目标miRNA特异反转录引物miR160a-RT:SEQ ID NO.12进行反转录，以miR160a-F:SEQ ID NO.13和miR160a-R:SEQ ID NO.14为引物检测目标miR160a的表达量，以CnEF1α-F:SEQ ID NO.15和CnEF1α-R:SEQ ID NO.16为引物检测内参基因CnEF1α的表达量。
(8)抗蚜性鉴定：选取长势一致的3～4片叶龄的沉默株系接种蚜虫，进行抗蚜性鉴定。结果显示，接种5头菊姬长管蚜2龄若虫的TRV2e-GFP对照和TRV2e-STTM160a阳性植株，两周后植株上的蚜虫数目显著差异，TRV2e-GFP对照阳性植株上蚜虫数目平均为48.1头，而TRV2e-STTM160a阳性植株上的蚜虫数目平均为24.3头，表明沉默miR160a使菊花脑对蚜虫的抗性增强。
所述miR160a的序列如SEQ ID NO.1所示；所述STTM160a序列片段如SEQ ID NO.2所示；所述的Link序列片段如SEQ ID No.3所示；所述的STTM序列引物包括上游引物STTM160a-F:SEQ ID NO.4和下游引物STTM160a-R:SEQ ID NO.5；所述的TRV反转录引物TRV-RT:SEQ ID NO.6；所述的CP引物包括上游引物CP-F:SEQ ID NO.7和下游引物CP-R:SEQID NO.8；所述的STTM qRT-PCR检测引物包括上游引物sttm160a-F:SEQ ID NO.9和下游引物sttm160a-R:SEQ ID NO.10；所述的反转录引物oligo(dT)18:SEQ IDNO.11；所述的miRNA反转录引物miR160a-RT:SEQ ID NO.12；所述的miR160a qRT-PCR检测引物包括上游引物miR160a-F:SEQ ID NO.13和下游引物miR160a-R:SEQ ID NO.14；所述的CnEF1α引物包括上游引物CnEF1α-F：SEQ ID NO.15和下游引物CnEF1α-R:SEQ ID NO.16。其中基因片段的序列如下所示：
miR160a序列(SEQ ID No.1)：TGGCATACAGGGAGCCAGGCA。
STTM160a序列片段核苷酸序列为SEQ ID No.2(5’---3’):
CGACGACAAGACCCTTGGCATACAGGCTAGAGCCAGGCAGTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAATTGGCATACAGGCTAGAGCCAGGCAAGGGCTCTTCTCCTC。
Link序列片段核苷酸序列为SEQ ID No.3(5’---3’)：
GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT。
STTM160a-F:SEQ ID NO.4(5’---3’)：
CGACGACAAGACCCTTGGCATACAGGctaGAGCCAGGCAGTTGTTGTTGTTATGG。
STTM160a-R:SEQ ID NO.5(5’---3’)：
GAGGAGAAGAGCCCTTGCCTGGCTCtagCCTGTATGCCAATTCTTCTTCTTTAGACCATRV-RT:SEQID NO.6(5’---3’)：GGGCGTAATAACGCTTACGTAGGC
CP-F:SEQ ID NO.7(5’---3’)：CTGACTTGATGGACGATTCTT
CP-R:SEQ ID NO.8(5’---3’):TGTTCGCCTTGGTAGTAGTA
sttm160a-F:SEQ ID NO.9(5’---3’):GGTCTAAAGAAGAAGAATATGTCCC
sttm160a-R:SEQ ID NO.10(5’---3’):GCCTTTGTAACCATCATCACT
oligo(dT)18:SEQ ID NO.11(5’---3’):tttttttttttttttttt
miR160a-RT:SEQ ID NO.12(5’---3’):gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacTGGCAT
miR160a-F:SEQ ID NO.13(5’---3’):atgttTGCCTGGCTCCCTGT
miR160a-R:SEQ ID NO.14(5’---3’):agtgcagggtccgaggtat
CnEF1α-F:SEQ ID NO.15(5’---3’):TTTTGGTATCTGGTCCTGGAG
CnEF1α-R:SEQ ID NO.16(5’---3’):CCATTCAAGCGACAGACTCA
本发明的技术方案为通过蚜虫接种与荧光定量发掘抗蚜性相关miR160a，及基于TRV-VbMS技术快速鉴定菊花脑miRNA160a功能的方法，通过使用真空泵对菊花脑播种苗进行抽真空，通过植株抽真空法将含有内源目的miRNA结合位点的STTM序列的TRV病毒沉默表达载体质粒如TRV2e-STTM载体瞬时转化菊花脑，诱导菊花脑内源miRNA发生沉默，从而鉴定miRNA功能。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种与菊花脑抗蚜性相关的miRNA160a及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcatacag ggagccaggc a 21
<210> 2
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgacgacaag acccttggca tacaggctag agccaggcag ttgttgttgt tatggtctaa 60
tttaaatatg gtctaaagaa gaagaattgg catacaggct agagccaggc aagggctctt 120
ctcctc 126
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttgttgttg ttatggtcta atttaaatat ggtctaaaga agaagaat 48
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgacgacaag acccttggca tacaggctag agccaggcag ttgttgttgt tatgg 55
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaggagaaga gcccttgcct ggctctagcc tgtatgccaa ttcttcttct ttagacca 58
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggcgtaata acgcttacgt aggc 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgacttgat ggacgattct t 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgttcgcctt ggtagtagta 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtctaaaga agaagaatat gtccc 25
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcctttgtaa ccatcatcac t 21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tttttttttt tttttttt 18
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactggcat 50
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgtttgcct ggctccctgt 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agtgcagggt ccgaggtat 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttttggtatc tggtcctgga g 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccattcaagc gacagactca 20

Claims (10)

1.一种与菊花脑抗蚜性相关的miR160a，具有如SEQ ID NO.1所示的序列。
2.权利要求1所述的与菊花脑抗蚜性相关的miR160a在提高植物抗蚜性或培育抗蚜转基因植物中的应用。
3.STTM160a序列片段，其特征在于：具有如下(a)～(c)中任一所述的核苷酸序列：
(a)如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
(b)如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的互补序列；
(c)具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸所获得的核苷酸序列，且与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
4.权利要求3所述的STTM160a序列片段在构建基于烟草脆裂病毒诱导miRNA沉默载体中的应用。
5.含有权利要求3所述STTM160a序列片段的重组表达载体、转基因细胞系或转基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体是基于烟草脆裂病毒诱导miRNA沉默的载体，为将权利要求3所述的STTM160a序列片段插入到TRV2e载体的Pst I位点间通过LIC方法得到的植物表达载体TRV2e-STTM160a。
7.根据权利要求5所述的转基因工程菌，其特征在于：该转基因工程菌通过将权利要求6所述的植物表达载体TRV2e-STTM160a转化农杆菌感受态获得。
8.权利要求3所述的STTM160a序列片段、权利要求5～7中任一所述的重组表达载体和转基因工程菌在提高植物抗蚜性、培育抗蚜性转基因作物或快速鉴定菊花脑miR160a功能中的应用。
9.一种培育抗蚜转基因植物的方法，其特征在于，通过沉默植物中的miR160a增强植物对蚜虫的抗性。
10.根据权利要求9所述的培育抗蚜转基因植物的方法，其特征在于：将含有内源目的miR160a结合位点的如SEQ ID No.2所示STTM160a序列片段的TRV2e病毒沉默表达载体质粒瞬时转化植株，诱导植株内源目的miRNA发生沉默，培育出具有抗蚜性的转基因植物。
CN201810916726.8A 2018-08-13 2018-08-13 一种与菊花脑抗蚜性相关的miRNA160a及其应用 Active CN108998454B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810916726.8A CN108998454B (zh) 2018-08-13 2018-08-13 一种与菊花脑抗蚜性相关的miRNA160a及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810916726.8A CN108998454B (zh) 2018-08-13 2018-08-13 一种与菊花脑抗蚜性相关的miRNA160a及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108998454A true CN108998454A (zh) 2018-12-14
CN108998454B CN108998454B (zh) 2021-11-12

Family

ID=64594673

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810916726.8A Active CN108998454B (zh) 2018-08-13 2018-08-13 一种与菊花脑抗蚜性相关的miRNA160a及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108998454B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113930445A (zh) * 2021-09-24 2022-01-14 南京农业大学 一种在头状花序中实现基因瞬时转染的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102864146A (zh) * 2012-09-18 2013-01-09 中国科学院遗传与发育生物学研究所 ath-eTM160在抑制microRNA160功能中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102864146A (zh) * 2012-09-18 2013-01-09 中国科学院遗传与发育生物学研究所 ath-eTM160在抑制microRNA160功能中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAOLONG XIA等: "MicroRNA Expression Profile during Aphid Feeding in Chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium)", 《PLOS ONE》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113930445A (zh) * 2021-09-24 2022-01-14 南京农业大学 一种在头状花序中实现基因瞬时转染的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108998454B (zh) 2021-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103695438B (zh) 拟南芥MYB家族转录因子AtMYB17基因、编码序列及其应用
CN103740731B (zh) 紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用
CN110117320A (zh) 棉花GhCAL-D07基因在促进植物开花中的应用
CN109384837B (zh) 一种杨树抗旱基因及其应用
CN106754948A (zh) 褐飞虱NlMLP基因、编码蛋白及其应用
CN110468150B (zh) Rgs1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用
CN109021084A (zh) 枳抗寒基因PtrERF109及其在植物抗寒遗传改良中的应用
CN103710357B (zh) 紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2及其应用
CN103627716B (zh) 一种用于改良玉米株型和提高玉米产量的基因的获得方法和应用
CN105524933B (zh) OsJMJ714影响水稻籽粒大小以及盐胁迫耐性的功能及其应用
CN103589722A (zh) 拟南芥jav1蛋白及其编码基因在调控植物抗病和抗虫性中的应用
CN108998454A (zh) 一种与菊花脑抗蚜性相关的miRNA160a及其应用
CN103451225A (zh) 水稻WRKY转录因子基因OsWRKY21在培育植物抗病品种中的应用
CN105950632A (zh) 棉花纤维发育相关的GhFSN1基因鉴定及应用
CN103805613B (zh) 一种锌指蛋白及其应用
CN105802931A (zh) Crk4蛋白及其编码基因在调控植物茎叶生长中的应用
CN102911941B (zh) 根特异性启动子及其应用
CN103898155B (zh) 利用基因枪获得转基因小麦的方法及其专用培养基
CN104928301B (zh) 大丽轮枝菌硫胺素转运蛋白病程关键靶基因及其干扰载体和应用
CN107904238A (zh) 厚藤高盐、干旱诱导型启动子IpLEA‑PRO及其应用
CN104120134B (zh) GsHSFB2b蛋白在培育耐逆性转基因植物中的应用
CN106397558A (zh) 蛋白质及其编码基因在调控植物抗黄萎病性中的应用
CN106282200B (zh) 海岛棉GbNAC1在抗黄萎病中的应用
CN104962563A (zh) 白桦BpMYB106基因、其氨基酸序列及应用
CN103243114B (zh) 一种融合基因及其所表达的蛋白和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant