CN108982385A - 枸杞叶多糖内源性矿质元素吸收率测定方法 - Google Patents

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CN108982385A CN201810854187.XA CN201810854187A CN108982385A CN 108982385 A CN108982385 A CN 108982385A CN 201810854187 A CN201810854187 A CN 201810854187A CN 108982385 A CN108982385 A CN 108982385A
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范俊峰
张柏林
王梦泽
王立英
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Abstract

本发明涉及一种枸杞叶多糖内源性矿质元素吸收率测定方法。其特点是,包括如下步骤:取枸杞叶粉末经过热水提取得到的粗多糖,对该粗多糖进行去蛋白,柱纯化操作,将纯化后的精多糖对大鼠进行喂养,收集经该精多糖喂养的大鼠粪便和尿液,并用火焰原子吸收测定和计算其中钙、铁、锌的吸收率。本发明提供了一种基于不同枸杞叶多糖的喂养量准确测定多糖中内源性矿质元素在大鼠体内的吸收情况的方法,为内源性矿质元素的吸收提供切实可行的依据。

Description

枸杞叶多糖内源性矿质元素吸收率测定方法
技术领域
本发明涉及一种枸杞叶多糖内源性矿质元素吸收率测定方法。
背景技术
矿质元素是维持人体生理活动和健康的重要活性物质,作为辅酶因子可参与代谢和免疫调节作用,还可以减轻包括癌症在内的一些疾病。钙是人体含量最多的矿质元素,是血液凝固、肌肉收缩和神经传递的必需元素。健康成人体内钙总量约占体重的1.5%到2.0%,总量约为1.3kg;99%的钙存在于牙齿和骨骼中,剩下的1%存在于血液和体液里。铁是人体必需的微量元素,人体内铁的总量约4-5g,60-70%存在于血红蛋白;铁是细胞色素酶、血红蛋白、过氧化物酶等重要组成部分,可促进人体发育和增加人体对疾病的抵抗力。正常成人体内锌的总量为2-3g,60%存在于肌肉,30%存在于骨骼,身体中锌含量最多的器官是眼睛和胰腺;锌被医学界和营养界学者称为“智能元素”,具有增强人体免疫力,参与能量和物质代谢,促进伤口和创伤的愈合等功能。
世界卫生组织和联合国粮农组织把膳食中缺乏钙、铁、锌等这些矿质元素称为“隐性饥饿”,全世界有27-87%的成年人缺钙。就我国而言,矿质元素钙、铁、锌缺乏仍然是一个比较严峻的问题。根据营养调查显示,我国居民钙摄入量普遍偏低,平均每人每天钙摄入量仅为400mg。医学研究表明人体缺钙除了会导致骨质疏松外,也会导致高血压、肥胖症等疾病。缺铁性贫血是世界范围内普遍存在的问题,困扰着16.2亿人,学龄前儿童的发病率高达47%,孕妇的发病率为42%,老年人的发病率为24%。缺铁除了会引起贫血,还会导致人体的免疫功能下降,儿童缺铁会影响儿童智力和运动能力的发展。锌的缺乏同样困扰着世界各国人民,发展中国家尤为突出,据调查,约17-20%的人存在锌缺乏症状,45%的人因为锌摄入量不足而缺锌,缺锌会导致异食癖、伤口愈合缓慢、儿童发育缓慢等问题。
常见的矿质元素补充剂可分为三代:无机矿质元素补充剂,有机矿质元素补充剂和新型矿质元素补充剂。无机类的补充剂对人体肠胃刺激较大,造成一些如呕吐等不良反应;有机类的补充剂虽然对肠胃刺激较小,部分矿质元素的补充剂存在起效慢,治疗周期长,成本高等缺点;新型的补充剂具有起效快,无副作用等优点,现在被广泛应用。目前市场上最常见的以多糖为载体的补充药物为多糖铁,多糖铁是以外源性的铁加入多糖中螯合得到,而枸杞叶多糖中含有丰富的内源性矿质元素,根据前人的报道发现枸杞叶多糖还具有降血糖等功效。
发明内容
本发明的目的是提供一种枸杞叶多糖内源性矿质元素吸收率测定方法,能够为内源性矿质元素的吸收提供切实可行的判断依据。
一种枸杞叶多糖内源性矿质元素吸收率测定方法,其特别之处在于,包括如下步骤:取枸杞叶粉末经过热水提取得到的粗多糖,对该粗多糖进行去蛋白,柱纯化操作,将纯化后的精多糖对大鼠进行喂养,收集经该精多糖喂养的大鼠粪便和尿液,并用火焰原子吸收测定和计算其中钙、铁、锌的吸收率。
进一步的,包括如下步骤:
(1)取枸杞叶粉末经过热水提取得到的粗多糖;
(2)将步骤(1)得到的粗多糖进行去蛋白,柱纯化操作;
(3)将步骤(2)中收集得到的精多糖用0.1mol/L的NaCl洗脱液进行进一步洗脱;
(4)用步骤(3)得到的精多糖对大鼠进行喂养;
(5)同时对步骤(4)的大鼠采用低钙、低铁、低锌的饮食配方饲料进行喂养;
(6)收集步骤(5)中大鼠的粪便和尿液,用火焰原子吸收法分别测定步骤(3)得到的精多糖中钙、铁、锌的含量和步骤(5)大鼠的粪便和尿液中钙、铁、锌的含量,计算出钙、铁、锌在大鼠体内的吸收率。
步骤(3)中粗多糖和NaCl洗脱液用量比为1g:5mL。
步骤(5)中低钙、低铁、低锌的饮食配方饲料具体是指不含碳酸钙、柠檬酸铁和碳酸锌的AIN-93G饮食。
步骤(3)中得到的提取物中精多糖含量为75-80%,蛋白含量为3-5%,植酸含量为5-10mg/100g,钙含量为100-105mg/g,铁含量为1-1.5mg/g,锌含量为0.2-0.6mg/g。
本发明提供了一种基于不同枸杞叶多糖的喂养量准确测定多糖中内源性矿质元素在大鼠体内的吸收情况的方法,为内源性矿质元素的吸收提供切实可行的依据。其提取枸杞叶多糖中含有丰富的内源性矿质元素,可适用于妇女、儿童、老人等不同钙、铁、锌缺乏人群用以补充矿质元素,可作为一种天然的矿质元素补充剂,并且可增强人体免疫力。符合新型的补充剂特点,具有起效快,无副作用等优点。
具体实施方式
本发明方法涉及一种成分特征和内源性矿质元素吸收机制明晰的枸杞叶多糖提取物,所述的枸杞叶多糖和内源性矿质元素是从枸杞叶中提取分离的。本发明提供了一种成分特征和内源性矿质元素吸收机制明晰的枸杞叶多糖提取物,利用Wistar大鼠模型对枸杞叶多糖内源性矿质元素钙、铁、锌吸收的影响进行了测定。
本发明方法提取的同时含有大量矿质元素和枸杞叶多糖的提取物可适用于妇女、儿童、老人等不同钙、铁、锌缺乏人群用以补充矿质元素,提取物可作为一种天然的矿质元素补充剂,并且可增强人体免疫力。通过大鼠模型可以用于矿质元素的吸收实验,本发明利用Wistar大鼠模型对枸杞叶多糖内源性矿质元素钙、铁、锌吸收的影响进行了测定,为判断人体对枸杞叶多糖内源性矿质元素的吸收情况提供了一种有效、可靠地方法。
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1:
一种成分特征和内源性矿质元素吸收机制明晰的枸杞叶多糖提取物,依次进行以下步骤:
(1)称取100g枸杞叶粉末溶解于2000mL的去离子水中,120℃提取1h,过滤,滤液70℃旋转蒸发,然后用四倍体积的无水乙醇过夜醇沉,离心得到沉淀物,冷冻干燥得到粗多糖。
(2)将步骤(1)中的粗提物(粗多糖)配成5%的水溶液,加入1/3体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇=4:1,V/V),充分振摇30min,5000g离心10min,将下层变性蛋白丢弃。分离上清液,并用四倍体积的乙醇过夜沉淀,离心后将沉淀物冷冻干燥。DEAE-52层析柱吸附后,调节流体速度为1mL/min,依次用去离子水、0.05mol/L的NaCl溶液、0.1mol/L的NaCl溶液洗脱,收集0.1mol/L洗脱液。
(3)提取物中多糖含量为76.6%,蛋白含量为3.3%,植酸含量为6.5mg/100g,钙含量为104.7mg/g,铁含量为1.2mg/g,锌含量为0.3mg/g。
(4)将大鼠随机分成5组,每组8只进行饲养六周。饲料配方为:酪蛋白20%,糊精13.2%,蔗糖10.0%,豆油7.0%,纤维素5.0%,维生素1.0%,L-胱氨酸0.3%,胆碱酒石酸盐0.25%,玉米淀粉40.94%,枸杞叶多糖0.11%,矿质元素2.2%。空白对照组配方中不包含枸杞叶多糖,矿质元素含量为3.5%,玉米淀粉含量为39.75%。
(5)在步骤(3)中大鼠饲养的最后三天,将所有大鼠转移至专用代谢笼,记录大鼠饲料摄入量,并收集每只大鼠的粪便和尿液。
(6)精确称取粪便1g,放入干燥的100mL锥形瓶中,加入10mL浓硝酸,放置过夜,次日在电炉上加热消解至固体消失,再加入10mL浓硝酸和5mL高氯酸进一步消解,电炉加热至溶液澄清透亮冒白烟为止,冷却后转移至50mL容量瓶,用0.5%的硝酸定容至刻度,采用火焰原子吸收法采用火焰原子吸收法测定钙、铁、锌的含量;尿液用0.5%的硝酸定容在50mL容量瓶,采用火焰原子吸收法采用火焰原子吸收法测定钙、铁、锌的含量。
相关指标的计算公式如下:
对照组中钙摄入量=饲料中钙含量;
实验组中钙摄入量=饲料中的钙量(低钙饮食)+灌胃的钙量;
吸收钙=摄入钙量–粪便钙量;
钙表观吸收率=(吸收钙/摄入钙)×100%;
钙储留量=摄入钙–粪钙量–尿钙量;
钙储留率=(钙储留量/摄入钙量)×100%;
铁和锌的计算公式与钙相同。
本实例中测定的钙表观吸收率和储留率分别为:83.10%和84.63%;铁表观吸收率和储留率分别为65.46%和60.75%;锌表观吸收率和储留率分别为68.16%和60.79%。
实施例2:
一种成分特征和内源性矿质元素吸收机制明晰的枸杞叶多糖提取物,依次进行以下步骤:
(1)称取100g枸杞叶粉末溶解于2000mL的去离子水中,120℃提取1h,过滤,滤液70℃旋转蒸发,然后用四倍体积的无水乙醇过夜醇沉,离心得到沉淀物,冷冻干燥得到粗多糖。
(2)将步骤(1)中的粗提物配成5%的水溶液,加入1/3体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇=4:1,V/V),充分振摇30min,5000g离心10min,将下层变性蛋白丢弃。分离上清液,并用四倍体积的乙醇过夜沉淀,离心后将沉淀物冷冻干燥。DEAE-52层析柱吸附后,调节流体速度为1mL/min,依次用去离子水、0.05、0.1mol/L的NaCl溶液洗脱,收集0.1mol/L洗脱液。
(3)提取物中多糖含量为76.6%,蛋白含量为3.3%,植酸含量为6.5mg/100g,钙含量为104.7mg/g,铁含量为1.2mg/g,锌含量为0.3mg/g。
(4)将大鼠随机分成5组,每组8只进行饲养六周。饲料配方为:酪蛋白20%,糊精13.2%,蔗糖10.0%,豆油7.0%,纤维素5.0%,维生素1.0%,L-胱氨酸0.3%,胆碱酒石酸盐0.25%,玉米淀粉40.83%,枸杞叶多糖0.22%,矿质元素2.2%。空白对照组配方中不包含枸杞叶多糖,矿质元素含量为3.5%,玉米淀粉含量为39.75%。
(5)在步骤(3)中大鼠饲养的最后三天,将所有大鼠转移至专用代谢笼,记录大鼠饲料摄入量,并收集每只大鼠的粪便和尿液。
(6)精确称取粪便1g,放入干燥的100mL锥形瓶中,加入10mL浓硝酸,放置过夜,次日在电炉上加热消解至固体消失,再加入10mL浓硝酸和5mL高氯酸进一步消解,电炉加热至溶液澄清透亮冒白烟为止,冷却后转移至50mL容量瓶,用0.5%的硝酸定容至刻度,采用火焰原子吸收法采用火焰原子吸收法测定钙、铁、锌的含量;尿液用0.5%的硝酸定容在50mL容量瓶,采用火焰原子吸收法采用火焰原子吸收法测定钙、铁、锌的含量。
相关指标的计算公式如下:
对照组中钙摄入量=饲料中钙含量;
实验组中钙摄入量=饲料中的钙量(低钙饮食)+灌胃的钙量;
吸收钙=摄入钙量–粪便钙量;
钙表观吸收率=(吸收钙/摄入钙)×100%;
钙储留量=摄入钙–粪钙量–尿钙量;
钙储留率=(钙储留量/摄入钙量)×100%;
铁和锌的计算公式与钙相同。
本实例中测定的钙表观吸收率和储留率分别为:82.64%和81.64%;铁表观吸收率和储留率分别为62.54%和59.42%;锌表观吸收率和储留率分别为67.15%和59.17%。
实施例3:
一种成分特征和内源性矿质元素吸收机制明晰的枸杞叶多糖提取物,依次进行以下步骤:
(1)称取100g枸杞叶粉末溶解于2000mL的去离子水中,120℃提取1h,过滤,滤液70℃旋转蒸发,然后用四倍体积的无水乙醇过夜醇沉,离心得到沉淀物,冷冻干燥得到粗多糖。
(2)将步骤(1)中的粗提物配成5%的水溶液,加入1/3体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇=4:1,V/V),充分振摇30min,5000g离心10min,将下层变性蛋白丢弃。分离上清液,并用四倍体积的乙醇过夜沉淀,离心后将沉淀物冷冻干燥。DEAE-52层析柱吸附后,调节流体速度为1mL/min,依次用去离子水、0.05、0.1mol/L的NaCl溶液洗脱,收集0.1mol/L洗脱液。
(3)提取物中多糖含量为76.6%,蛋白含量为3.3%,植酸含量为6.5mg/100g,钙含量为104.7mg/g,铁含量为1.2mg/g,锌含量为0.3mg/g。
(4)将大鼠随机分成5组,每组8只进行饲养六周。饲料配方为:酪蛋白20%,糊精13.2%,蔗糖10.0%,豆油7.0%,纤维素5.0%,维生素1.0%,L-胱氨酸0.3%,胆碱酒石酸盐0.25%,玉米淀粉40.72%,枸杞叶多糖0.33%,矿质元素2.2%。空白对照组配方中不包含枸杞叶多糖,矿质元素含量为3.5%,玉米淀粉含量为39.75%。
(5)在步骤(3)中大鼠饲养的最后三天,将所有大鼠转移至专用代谢笼,记录大鼠饲料摄入量,并收集每只大鼠的粪便和尿液。
(6)精确称取粪便1g,放入干燥的100mL锥形瓶中,加入10mL浓硝酸,放置过夜,次日在电炉上加热消解至固体消失,再加入10mL浓硝酸和5mL高氯酸进一步消解,电炉加热至溶液澄清透亮冒白烟为止,冷却后转移至50mL容量瓶,用0.5%的硝酸定容至刻度,采用火焰原子吸收法采用火焰原子吸收法测定钙、铁、锌的含量;尿液用0.5%的硝酸定容在50mL容量瓶,采用火焰原子吸收法采用火焰原子吸收法测定钙、铁、锌的含量。
相关指标的计算公式如下:
对照组中钙摄入量=饲料中钙含量;
实验组中钙摄入量=饲料中的钙量(低钙饮食)+灌胃的钙量;
吸收钙=摄入钙量–粪便钙量;
钙表观吸收率=(吸收钙/摄入钙)×100%;
钙储留量=摄入钙–粪钙量–尿钙量;
钙储留率=(钙储留量/摄入钙量)×100%;
铁和锌的计算公式与钙相同。
本实例中测定的钙表观吸收率和储留率分别为:81.90%和90.34%;铁表观吸收率和储留率分别为63.89%和58.33%;锌表观吸收率和储留率分别为66.67%和58.33%。
实施例4:
一种成分特征和内源性矿质元素吸收机制明晰的枸杞叶多糖提取物,依次进行以下步骤:
(1)称取100g枸杞叶粉末溶解于2000mL的去离子水中,120℃提取1h,过滤,滤液70℃旋转蒸发,然后用四倍体积的无水乙醇过夜醇沉,离心得到沉淀物,冷冻干燥得到粗多糖。
(2)将步骤(1)中的粗提物配成5%的水溶液,加入1/3体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇=4:1,V/V),充分振摇30min,5000g离心10min,将下层变性蛋白丢弃。分离上清液,并用四倍体积的乙醇过夜沉淀,离心后将沉淀物冷冻干燥。DEAE-52层析柱吸附后,调节流体速度为1mL/min,依次用去离子水、0.05、0.1mol/L的NaCl溶液洗脱,收集0.1mol/L洗脱液。
(3)提取物中多糖含量为76.6%,蛋白含量为3.3%,植酸含量为6.5mg/100g,钙含量为104.7mg/g,铁含量为1.2mg/g,锌含量为0.3mg/g。
(4)将大鼠随机分成5组,每组8只进行饲养六周。饲料配方为:酪蛋白20%,糊精13.2%,蔗糖10.0%,豆油7.0%,纤维素5.0%,维生素1.0%,L-胱氨酸0.3%,胆碱酒石酸盐0.25%,玉米淀粉40.39%,枸杞叶多糖0.66%,矿质元素2.2%。空白对照组配方中不包含枸杞叶多糖,矿质元素含量为3.5%,玉米淀粉含量为39.75%。
(5)在步骤(3)中大鼠饲养的最后三天,将所有大鼠转移至专用代谢笼,记录大鼠饲料摄入量,并收集每只大鼠的粪便和尿液。
(6)精确称取粪便1g,放入干燥的100mL锥形瓶中,加入10mL浓硝酸,放置过夜,次日在电炉上加热消解至固体消失,再加入10mL浓硝酸和5mL高氯酸进一步消解,电炉加热至溶液澄清透亮冒白烟为止,冷却后转移至50mL容量瓶,用0.5%的硝酸定容至刻度,采用火焰原子吸收法采用火焰原子吸收法测定钙、铁、锌的含量;尿液用0.5%的硝酸定容在50mL容量瓶,采用火焰原子吸收法采用火焰原子吸收法测定钙、铁、锌的含量。
相关指标的计算公式如下:
对照组中钙摄入量=饲料中钙含量;
实验组中钙摄入量=饲料中的钙量(低钙饮食)+灌胃的钙量;
吸收钙=摄入钙量–粪便钙量;
钙表观吸收率=(吸收钙/摄入钙)×100%;
钙储留量=摄入钙–粪钙量–尿钙量;
钙储留率=(钙储留量/摄入钙量)×100%;
铁和锌的计算公式与钙相同。
本实例中测定的钙表观吸收率和储留率分别为:79.63%和77.15%;铁表观吸收率和储留率分别为61.64%和57.53%;锌表观吸收率和储留率分别为63.64%和54.55%。
实施例5:
一种成分特征和内源性矿质元素吸收机制明晰的枸杞叶多糖提取物,依次进行以下步骤:
(1)称取100g枸杞叶粉末溶解于2000mL的去离子水中,120℃提取1h,过滤,滤液70℃旋转蒸发,然后用四倍体积的无水乙醇过夜醇沉,离心得到沉淀物,冷冻干燥得到粗多糖。
(2)将步骤(1)中的粗提物配成5%的水溶液,加入1/3体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇=4:1,V/V),充分振摇30min,5000g离心10min,将下层变性蛋白丢弃。分离上清液,并用四倍体积的乙醇过夜沉淀,离心后将沉淀物冷冻干燥。DEAE-52层析柱吸附后,调节流体速度为1mL/min,依次用去离子水、0.05、0.1mol/L的NaCl溶液洗脱,收集0.1mol/L洗脱液。
(3)提取物中多糖含量为76.6%,蛋白含量为3.3%,植酸含量为6.5mg/100g,钙含量为104.7mg/g,铁含量为1.2mg/g,锌含量为0.3mg/g。
(4)将大鼠随机分成5组,每组8只进行饲养六周。饲料配方为:酪蛋白20%,糊精13.2%,蔗糖10.0%,豆油7.0%,纤维素5.0%,维生素1.0%,L-胱氨酸0.3%,胆碱酒石酸盐0.25%,玉米淀粉40.805%,枸杞叶多糖1.0%,矿质元素2.2%。空白对照组配方中不包含枸杞叶多糖,矿质元素含量为3.5%,玉米淀粉含量为39.75%。
(5)在步骤(3)中大鼠饲养的最后三天,将所有大鼠转移至专用代谢笼,记录大鼠饲料摄入量,并收集每只大鼠的粪便和尿液。
(6)精确称取粪便1g,放入干燥的100mL锥形瓶中,加入10mL浓硝酸,放置过夜,次日在电炉上加热消解至固体消失,再加入10mL浓硝酸和5mL高氯酸进一步消解,电炉加热至溶液澄清透亮冒白烟为止,冷却后转移至50mL容量瓶,用0.5%的硝酸定容至刻度,采用火焰原子吸收法采用火焰原子吸收法测定钙、铁、锌的含量;尿液用0.5%的硝酸定容在50mL容量瓶,采用火焰原子吸收法采用火焰原子吸收法测定钙、铁、锌的含量。
相关指标的计算公式如下:
对照组中钙摄入量=饲料中钙含量;
实验组中钙摄入量=饲料中的钙量(低钙饮食)+灌胃的钙量;
吸收钙=摄入钙量–粪便钙量;
钙表观吸收率=(吸收钙/摄入钙)×100%;
钙储留量=摄入钙–粪钙量–尿钙量;
钙储留率=(钙储留量/摄入钙量)×100%;
铁和锌的计算公式与钙相同。
本实例中测定的钙表观吸收率和储留率分别为:73.34%和71.19%;铁表观吸收率和储留率分别为60.50%和57.14%;锌表观吸收率和储留率分别为64.71%和55.88%。

Claims (5)

1.一种枸杞叶多糖内源性矿质元素吸收率测定方法,其特征在于,包括如下步骤:取枸杞叶粉末经过热水提取得到的粗多糖,对该粗多糖进行去蛋白,柱纯化操作,将纯化后的精多糖对大鼠进行喂养,收集经该精多糖喂养的大鼠粪便和尿液,并用火焰原子吸收测定和计算其中钙、铁、锌的吸收率。
2.如权利要求1所述的枸杞叶多糖内源性矿质元素吸收率测定方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)取枸杞叶粉末经过热水提取得到的粗多糖;
(2)将步骤(1)得到的粗多糖进行去蛋白,柱纯化操作;
(3)将步骤(2)中收集得到的精多糖用0.1mol/L的NaCl洗脱液进行进一步洗脱;
(4)用步骤(3)得到的精多糖对大鼠进行喂养;
(5)同时对步骤(4)的大鼠采用低钙、低铁、低锌的饮食配方饲料进行喂养;
(6)收集步骤(5)中大鼠的粪便和尿液,用火焰原子吸收法分别测定步骤(3)得到的精多糖中钙、铁、锌的含量和步骤(5)大鼠的粪便和尿液中钙、铁、锌的含量,计算出钙、铁、锌在大鼠体内的吸收率。
3.如权利要求1所述的枸杞叶多糖内源性矿质元素吸收率测定方法,其特征在于:步骤(3)中粗多糖和NaCl洗脱液用量比为1g:5mL。
4.如权利要求1所述的枸杞叶多糖内源性矿质元素吸收率测定方法,其特征在于:步骤(5)中低钙、低铁、低锌的饮食配方饲料具体是指不含碳酸钙、柠檬酸铁和碳酸锌的AIN-93G饮食。
5.如权利要求1所述的枸杞叶多糖内源性矿质元素吸收率测定方法,其特征在于:步骤(3)中得到的提取物中精多糖含量为75-80%,蛋白含量为3-5%,植酸含量为5-10mg/100g,钙含量为100-105mg/g,铁含量为1-1.5mg/g,锌含量为0.2-0.6mg/g。
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